Cпособ доращивания in vitro растений ягодных и декоративных кустарников в нестерильных условиях
Владельцы патента RU 2366153:
Федеральное государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева (ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева) (RU)
Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к питомниководству. В способе пересаживают микрорастения из пробирок в кассеты, заполненные искусственным субстратом. В качестве субстрата используют обезвоженные стабилизированные осадки городских сточных вод и нейтрализованный верховой торф в соотношении 1:4. Пересадку осуществляют в начале января. Пересаженные в кассеты микрорастения доращивают под герметичным пленочным укрытием в течение двух недель. Способ позволяет осуществлять более раннюю пересадку микрорастений в нестерильные условия, увеличивать приживаемость, усиливать рост и развитие регенерантов с увеличением качественного посадочного материала ягодных и декоративных кустарников. 1 з.п. ф-лы, 9 табл.
Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к питомниководству, и может быть использовано в технологии микроклонального размножения ягодных и декоративных кустарников.
Известны способы адаптации и доращивания микрорастений в условиях повышенной влажности воздуха на искусственных субстратах, состоящих из органической основы (кора хвойных пород, торф, компост, льняная костра, почва, древесные опилки) (Pocock S. Procedures and problems associated with the transfer of tissue-cultured plants /Comb. Proc./ Intern. Plant Propagators Soc, 1984; Т. 33, - p. 316-320; Orlikowska Т. Rozmnazanie pigwy S 1 w kulturach in vitro /Ogrodnictwo, 1988; Т. 25. N 4, - s.6-8; Цветков И., Кръстанова С. Адаптация на хризантема, получена в различни видови субстрати / Растениевъдни науки, 1991; Т.28. N 3-6, - с.44-49) и инертных материалов (песок, вермикулит, минеральная вата, перлит, цеолит) (Дженеев С.Ю., Литвак А.И., Солдатов B.C., Насимов А.З. Использование искусственной ионитной почвы БИОНА при адаптации растений винограда, клонированных in vitro. 1990, - 14 с. Рукопись деп. во ВНИИТЭИагропром 31.10 1990; Ялта; 1990. - Библиогр. 23; Youn Y., Ishil К., Saito A., Ohba K. In vitro plantlet regeneration from axillary buds of mature trees of Tilia cordata J. Japan. Forestry Soc, 1988; Т.70. N 7, - p.315-317; Wainwright H., Scrace J. Influence of in vitro preconditioning with carbohydrates during the rooting of microcuttings on in vivo establishment /Sc. hortic, 1989; Т.38. N 3/4, - р.261-267; Eduardo da Costa Nunes, Carolina Volkmer de Castilho, Fabio Netto Moreno and Ana Maria Viana. In vitro culture of Cedrela fissilis Vellozo (Meliaceae), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2002, V.70, N.3).
Как правило, такие субстраты нуждаются в обеззараживании или обработке горячим паром. Чтобы этого избежать проводят адаптацию пробирочных растений в инертных материалах, таких как цеолит, вермикулит, грубый перлит, минеральная вата (Батукаев А.А., Садаева М.А. Использование цеолита при адаптации и доращивании растений винограда in vitro в условиях in vivo. Пути интенсификации и кооперации в селекции садовых культур и винограда. - Краснодар, 2002, - с.212-215; Einset J.W., Alexander J.H. Multiplication of Syringa species and cultivars in tissue culture/ Comb. Proc. /Intern. Plant Propagators Soc, 1985; Т. 34, - p.628-636; R.L.M. Pierik, H.H.M. Steagmans, P.F.Sprenkels Micropropagation of Lilac (Syringa vulgaris L.) Biotechnology and Forestry, 1992, V. 20, H. 407-426). Такие искусственные субстраты не надо стерилизовать, но они не содержат элементов питания, необходимых для роста и развития растений.
В технологии клонального микроразмножения наиболее часто используют смесь перлита и низинного торфа, которую обеззараживают 0,1% раствором бенлата, эупарена (Михальчик Л.С., Деменко В.И. Размножение яблони и вишни методом in vitro/Tpуды научной конференции молодых ученых 14-17 июня 1988 г, 1988, - с.649-657 Рукопись деп. во ВНИИТЭИагропром 05.01 1989), противомикробными растворами с добавлением терразола (Pocock S. Procedures and problems associated with the transfer of tissue-cultured plants /Comb. Proc./Intern. Plant Propagators Soc, 1984; Т.33, - p. 316-320) или обрабатывают горячим паром (Orlikowska Т. Propagation of quince S 1 (Cydonia blonga Mill.) in vitro Fruit Sc. Rep. Skierniewice, 1988; Т.15. N 4, - p.157-165).
Наиболее близким, по существу, к изобретению по совокупности существенных признаков является способ адаптации регенерантов плодовых и декоративных культур в нестерильных условиях на субстратах, содержащих торф низинный и перлит в равном соотношении (Леонтьев-Орлов О.А. Получение посадочного материала яблони методом культуры тканей. М., 1986, - 24 с.; Мирзаев М.М. Эффективные способы выращивания меристемных растений гвоздики в почвенных субстратах. Тр. НИИ садоводства, виноградарства и виноделия им. Шредера, 1988; Т.50, - с.31-34; Catherine A. Offord and Lindsay C. Campbell Micropropagation of Telopea speciosissima R. Br. (Proteaceae). Rhizogenesis and acclimatisation to ex vitro conditions, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1992, V.29, Number 3). По этому способу микрорастения садовых культур в марте-апреле переносят в обогреваемые теплицы на искусственные субстраты и на 4-5 недель помещают в закрытые пластиковые ящики или под пленочные укрытия, где поддерживается высокая относительная влажность воздуха 65-80% и температура 25-28°С, после чего растения акклиматизируют в условиях теплицы при досвечивании в течение 16 часов с марта до начала мая (Einset J.W., Alexander J.H. Multiplication of Syringa species and cultivars in tissue culture/ Comb. Proc. /Intern. Plant Propagators Soc, 1985; Т.34, - p.628-636; Refouvelet E., Le Nours S., talon C., Daguin F. A new method for in vitro propagation of lilac: regrowth and storage conditions for axillary buds encapsulated in alginate beads, development of a pre - acclimatization stage. Scientia Horticulturae, 1998, 74, 233-241).
Недостатками указанного способа являются: необходимость пропаривания или обеззараживания субстрата; поздние сроки пересадки для акклиматизации и доращивания, большие выпады (до 30-40%) in vitro растений в нестерильных условиях (переувлажнение, недостаточное содержание питательных веществ), медленный начальный рост и медленный рост после пересадки растений из кассет в контейнеры, слабое развитие надземной части и корневой системы, что не дает возможность вырастить посадочный материал с закрытыми корнями к началу периода вегетации - весенней реализации или закладке многолетних насаждений.
Заявляемое изобретение направлено на более раннюю (первая половина января) пересадку микрорастений в нестерильные условия для адаптации и доращивания, увеличение приживаемости, усиление роста и развития регенерантов в условиях ex vitro, увеличение выхода жизнеспособного качественного посадочного материала ягодных и декоративных кустарников с закрытой корневой системой к началу периода вегетации за счет благоприятных физико-химических, асептических свойств и высокой гормональной активности используемого субстрата.
Для решения указанной задачи экспланты ягодных растений и сирени вводят в стерильную культуру в марте, в первой половине января микрорастения пересаживают из пробирок в пластиковые кассеты с ячейками небольшого объема (d 4 см, V - 10 см3) на искусственные субстраты, состоящие из обезвоженных стабилизированных осадков городских сточных вод (ОГСВ), не более одного года хранения и нейтрализованного (рН 6-6,5) верхового торфа в соотношении 1:4. Субстраты предварительно не обеззараживают и не пропаривают, готовят простым перемешиванием компонентов. Первые две недели после пересадки микрорастения содержат в кассетах под герметичными пленочными укрытиями на стеллажах с насыпным слоем керамзита (2-3 см) при температуре 22-26°С и досвечивании с начала января до конца февраля (освещенность 2000 лк, 16 часов). В начале апреля микрорастения с неповрежденным корневым комом пересаживают из ячеек в контейнеры объемом 1,6 л (d 11 см).
Предлагаемый способ доращивания in vitro растений на субстратах, содержащих ОГСВ и нейтрализованный верховой торф, имеет ряд преимуществ перед прототипом:
- на 2,5 месяца раньше пробирочные растения пересаживают в нестерильные условия для адаптации и доращивания;
- выращивание на субстрате с ОГСВ обеспечивает высокую (до 95-100%) приживаемость и сохраняемость in vitro растений в нестерильных условиях;
- микрорастения быстро трогаются в рост и отличаются высокими темпами роста и развития;
- формируется значительная листовая поверхность и прирост, что наряду с более мощным развитием корневой системы (увеличиваются число и масса корней, их суммарная длина) делает возможным пересадку in vitro растений с закрытой корневой системой на постоянное место без доращивания в питомнике;
- в 1,5-1,8 раза увеличивается общий выход жизнеспособных in vitro растений, сокращается период от введения эксплантов в стерильную культуру до пересадки растений на постоянное место, повышается эффективность использования дорогостоящего защищенного грунта;
- благодаря асептическим свойствам верхового торфа и отсутствию патогенной микрофлоры в свежих ОГСВ нет необходимости в предварительном обеззараживании или пропаривании субстрата, что экономит затраты ручного труда, средств и предотвращает загрязнение окружающей среды;
- применение ОГСВ в составе субстратов для адаптации и доращивания микрорастений - один из способов их утилизации.
Существенными признаками, характеризующими изобретение, являются пересадка регенерантов в нестерильные условия в первой половине января, использование искусственного субстрата, содержащего стабилизированные осадки городских сточных вод (ОГСВ), не более года хранения и нейтрализованный верховой торф в соотношении 1:4 без предварительного обеззараживания или пропаривания.
Причинно-следственные связи заключаются в том, что обезвоженные стабилизированные осадки городских сточных вод (ОГСВ), полученные путем механической очистки и термофильного анаэробного сбраживания, в котором принимают участие более 30 систематических групп микроорганизмов, представляют собой органоминеральную суспензию, органическая часть которых состоит из углеводов, белков (бактериальная масса), липидов, лигнина, гуминовых веществ, воска и хитина.
Сброженный механически обезвоженный осадок содержит высокое количество основных макро- и микроэлементов и является ценным органическим удобрением, эквивалентным навозу и сапропелям. Осадок, полученный на московских станциях аэрации, характеризуется нейтральной реакцией среды, высокой степенью насыщенности основаниями и влажностью 50-85%. Он стабилизирован, оструктурен, имеет рассыпчатую консистенцию, отличается высоким содержанием гумифицированного органического вещества (57-75% на сухое в-во), азота (N общий - 2,5-4% на сухое в-во) и фосфора (Р2О5 - 2,5-5% на сухое в-во), средним содержанием калия (0,2-0,5%) и низкой водоудерживающей способностью.
Механически обезвоженный осадок по своему составу соответствует санитарным нормам (СанПиН 2.1.7.573-96), и его можно использовать в сельском хозяйстве, как это делается во многих индустриально развитых странах. Во всем мире утилизация отходов и защита окружающей среды - насущная проблема. С фильтров-прессов обезвоженные осадки сточных вод вывозят за пределы городов и складируют на полигонах. Накапливаясь в огромных количествах, они создают большую экологическую и экономическую проблему для мегаполисов. Только в Москве ежегодно это количество составляет более полумиллиона тонн. В нашей стране в сельском хозяйстве используется не более 4-6% ОГСВ.
Препятствием к широкому использованию осадка в качестве органо-минерального удобрения может быть высокое содержание тяжелых металлов в виде карбонатов, сульфидов, органических комплексов, связанных с бактериальной биомассой (Чеботарев Н.Т. Проблемы очистки осадка сточных вод г. Москвы // Химия в сельском хозяйстве. - 1994. - №4. - С.21-22). Однако согласно заключению Всероссийского НИИ удобрений и агропочвоведения (ВИУА) ОГСВ Москвы могут быть использованы в качестве органического удобрения без риска загрязнения почвы и растениеводческой продукции тяжелыми металлами (кадмий, марганец, медь, мышьяк, никель, ртуть, свинец, хром, цинк) (табл.1) (Седых Э.М., Аджиенко В.Е., Старшинова Н.П., Банных Л.Н., Таций Ю.Г., Гулько Н.И. Анализ осадков городских стоков // РИА Стандарты и качество. Партнеры и конкуренты. - 2001. - №1. - С.16-20).
| Таблица 1 | ||
| Содержание микроэлементов и тяжелых металлов в осадках сточных вод Курьяновской станции аэрации | ||
| Элементы | Содержание в ОГСВ, мг/кг, сухого вещества | ПДК |
| Марганец | 128-600 | 2000 |
| Мышьяк | 3,7-4,2 | 20 |
| Ртуть | 0,17 | 15 |
| Свинец | 72-84 | 1000 |
| Медь | 344-439 | 1500 |
| Никель | 48-64 | 400 |
| Цинк | 244-800 | 40000 |
| Хром | 304-682 | 1200 |
| Кадмий | 3-5 | 30 |
| Молибден | 2-8 | не нормируется |
| Кобальт | 4-20 | не нормируется |
| Селен | 2-8 | не нормируется |
Современные технологии очистки городских сточных вод устраняют также и эпидемиологическую опасность. В настоящее время ОГСВ рекомендуются к использованию под зерновые на фураж, кормовые и технические культуры, в лесных и плодопитомнических хозяйствах, в луговодстве, семеноводстве, цветоводстве, где вероятность попадания тяжелых металлов и болезнетворных микроорганизмов в пищевые цепи минимальная (Воробьева Р.П., Додолина В.Т., Мерзлая Г.Е. Экологически безопасные методы использования отходов. - Барнаул: Изд-во МСХ РФ, 2000. - 555 с.; Романов Е.М. Экологические аспекты утилизации осадков сточных вод в лесных питомниках // Проблемы охраны окружающей среды от промышленных, бытовых, биологических и медицинских отходов, осадков сточных вод: матер. международ, науч.-практ. конф. - Пенза, 1997. - С.147-150).
Благодаря деятельности термофильных бактерий, которые активны при высоких температурах, свежие осадки практически стерильны, что сводит к минимуму воздействие патогенной микрофлоры на микрорастения. При температуре 55-65°С преобладают термофильные микроорганизмы и протекает процесс биофизического обеззараживания компоста. При повышении температуры в компосте до 65-80°С и выше начинается его термическая дезинфекция (Strauch D. Gesetzliche hygienische Anfordeungen an Komposte aus Abfallstoffen / VDLUFA-Schriftenreihe - Verbandt Dt. Landwirtschaftlicher Untersuchungs - und Forschungsanstalten, Darmstadt, 1988; Т.23, - S.983-1002).
Как показали наши исследования, положительное действие ОГСВ на рост и развитие садовых растений связано также с наличием гормональной активности этого субстрата благодаря наличию продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, которые накапливаются в осадке при микробиологической очистке сточных вод (табл.2).
| Таблица 2 | ||||
| Содержание гормонов в обезвоженных осадках сточных вод, РГАУ-МСХА, 2006 г. | ||||
| Срок хранения ОГСВ | ИУК нг/г массы | ЦК нг/г массы | ГА нг/г массы | АБК нг/г массы |
| (Контроль) Тн:П=1:1 | 0,05 | - | - | - |
| Свежие ОГСВ | 1,86 | 60,7 | 57,4 | 14,2 |
| ОГСВ после хранения в течение 1 года | 0,65 | 40,4 | 67,1 | 1,9 |
| ОГСВ после хранения в течение 7 лет | 0,62 | 13,5 | - | - |
| Тн - торф низинный; П - перлит |
Свежие осадки после фильтров-прессов отличаются самым высоким содержанием ауксинов (ИУК), цитокининов (ЦК) и гиббереллинов (ГК), гормонов, стимулирующих рост делением и растяжением, и контролируют морфогенез в целом. При хранении осадков на полигонах более одного года снижается содержание ЦК в 1,5, ИУК - в 3 раза, однако высокие значения отношения суммы ЦК + ИУК к АБК и содержания гиббереллинов положительно сказываются на формировании придаточной корневой системы и ассимиляционной поверхности. После длительного выдерживания на иловых площадках (до 7-и лет) содержание гормонов в образцах ОГСВ существенно снижается, субстрат вновь заселяется патогенной микрофлорой, ухудшается его структура.
Высокая питательная ценность субстратов, содержащих свежие ОГСВ, наличие в среде гормонов, синтезированных микроорганизмами на этапе термофильного сбраживания, низкий уровень патогенной микрофлоры обеспечивают высокую ценность смесей для адаптации и доращивания регенерантов.
Другой компонент опытного субстрата - нейтрализованный верховой сфагновый торф (торф верхового типа моховой группы, рН 5,5-6,5;
производитель - торфопредприятие «Пельгорское-М») как нельзя лучше подходит для малообъемных технологий. Он характеризуется высоким содержанием сфагновых мхов (более 80%), органических веществ (96-97,7%), отсутствием тяжелых металлов, хорошими физическими свойствами: однородностью, рыхлостью, сыпучестью, небольшой насыпной плотностью (130-180 кг/м3), длинной волокнистой однородной структурой с минимальной долей пылевой фракции, высокой газо- и водопоглотительной способностью, теплоизоляционными свойствами. Сфагновый торф обладает значительной буферностью и высокой сорбционной и ионообменной способностью.
Высокие пористость (90-95%) и влагоемкость выгодно отличают верховой торф от низинного и переходного. Даже при обильном поливе верховой торф содержит в порах до 20% воздуха, поэтому переувлажнения не происходит. Это является важным условием успешной адаптации регенерантов, т.к. избыток влаги может вызвать корневые гнили, подопревание стеблей и отмирание корней.
Оптимальные физические свойства, благоприятный водно-воздушный режим, высокая водоудерживающая и поглотительная способность создают уникальные условия в корнеобитаемой среде для успешной приживаемости, роста и развития in vitro растений. Кроме того, сфагновый торф продуцирует углекислый газ, необходимый для нормального развития регенерантов в ограниченном замкнутом объеме и в условиях теплиц (Кузнецова Л.М., Галактионов А.А. Торфяные грунты. Л., Труды ВНИИТП, вып.55, С.-99-108.; Кузнецова Л.М., Булганин В.Н., Симонова Г.П., Щербаков В.А. Обоснование параметров торфяного сырья, используемого в растениеводстве. Переработка и использование торфа. Л., Сб. научных трудов ВНИИТП, вып.59, С.5-12).
Верховой торф содержит также природные гуминовые кислоты, оказывающие положительное влияние на растение и микоризу, а также аминокислоты, необходимые для перевода элементов питания в доступную форму.
Добавление в субстрат верхового торфа не только улучшает его физические свойства, но также подавляет деятельность патогенной микрофлоры Streptomyces spp., Penicillium spp., Mortierella spp., Trichoderma viride spp, Fusarium spp., Rhizoctonia spp., Pythium spp., Alternaria spp. и Botrytis spp. (R.Tahvonen The diseas suppressiveness of light-coloured sphagnum peat and biocontral of plant diseases with Streptomyces sp/ Acta Horticulturae 342: International Symposium on Horticultural Substrates other than Soil in situ). Верховой торф обладает асептическими бактерицидными свойствами благодаря высокой кислотности среды и наличию фенольных соединений (Л.М. Кузнецова Использование торфа в защищенном грунте. Торф в сельском хозяйстве Нечерноземной зоны: справочник / В.Н.Ефимов, И.Н.Донских, Л.М.Кузнецова и др. Сост. В.Н.Ефимов. - Л.: Агропромиздат. Ленингр. Отд-ние, 1987. - С.109-130), не содержит технических загрязнений, вредителей и семян сорных растений.
Совокупность перечисленных признаков дает возможность создать благоприятные условия для адаптации и доращивания микрорастений ex vitro.
Содержание ОГСВ в субстрате оптимально для достижения поставленной задачи. При более низком или более высоком содержании ОГСВ в субстрате эффект от его применения менее значимый.
Примеры конкретного использования
Исследования по адаптации сирени и ягодных кустарников выполняли в лаборатории плодоводства РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева в 2005-2007 г.г. Результаты, представленные в таблицах 3-11 свидетельствуют о значительном положительном влиянии условий адаптации, в т.ч. искусственных субстратов, на сроки пересадки, приживаемость регенерантов, биометрические показатели и выход качественного посадочного материала с закрытой корневой системой в сжатые сроки.
Пример №1
В начале - середине февраля микрорастения сирени пересаживают в рассадные кассеты с ячейками (d 40 мм), заполненными субстратом, содержащим осадки городских сточных вод (ОГСВ), не более одного года хранения и торф верховой нейтрализованный (рН 6-6,5). Первые две недели микрорастения в кассетах содержат под герметичными пленочными укрытиями на стеллажах с керамзитом (слой 2-3 см) при температуре 22-26°С и досвечивании с начала января до середины марта (освещенность 2000 лк, 16 часов) с последующей пересадкой растений в контейнеры (V 1,6 л) в начале мая. Контрольный субстрат перед посадкой микрорастений обрабатывают 1% раствором эупарена; опытные субстраты предварительно не обеззараживают и не пропаривают; все субстраты готовят простым перемешиванием компонентов в следующем соотношении:
в контроле - торф низинный и перлит в равном соотношении;
в опытных вариантах - ОГСВ 100%; торф верховой 50-80% и ОГСВ 20-50%; перлит 50-80% и ОГСВ 20-50%; торф верховой 25-40%, перлит 25-40% и ОГСВ 20-50%.
| Таблица 3 | |||||
| Развитие микрорастений сирени (сорт Лебедушка) при их адаптации в нестерильных условиях на субстратах, содержащих ОГСВ, 2005 | |||||
| Вид субстрата | Соотношение компонентов | Доля ОГСВ в субстрате, % | Средняя длина побегов, см | Общая площадь листьев, см2 | Суммарная длина корней, см |
| Контроль Тн П | 1:1 | - | 6,2 | 15,4 | 74,2 |
| О | - | 100 | 8.7 | 16,3 | 308,1 |
| О П | 1:1 | 50 | 10,2 | 34,1 | 296,6 |
| О П | 1:3 | 30 | 9,9 | 76,4 | 305,5 |
| О П | 1:4 | 20 | 7,4 | 30,2 | 215,1 |
| О Тв | 1:1 | 50 | 9,2 | 104,4 | 347,5 |
| О Тв | 1:3 | 30 | 12,2 | 145,1 | 416,8 |
| О Тв | 1:4 | 20 | 14,4 | 168,9 | 496,9 |
| О ТвП | 2:1:1 | 50 | 8,1 | 52,6 | 112,1 |
| О ТвП | 1:1:1 | 30 | 7,5 | 77,2 | 254,3 |
| О ТвП | 1:2:2 | 20 | 10,3 | 63,8 | 142,1 |
| О - ОГСВ; Тн - торф низинный; Тв - торф верховой; П - перлит |
Лучшими для адаптации и доращивания микрорастений сирени в нестерильных условиях оказались субстраты, содержащие торф верховой и ОГСВ (20-30%). На таких субстратах отмечен самый высокий выход жизнеспособных регенерантов, лучшее развитие надземной части и корневой системы: в 2,3 раза увеличивается длина побегов, в 11 раз - общая площадь листьев, в 6,7 раза - суммарная длина корней.
В дальнейшем уточняли оптимальное содержание ОГСВ в субстрате для адаптации и доращивания in vitro растений ягодных культур (табл.4, 5, 6).
Пример №2
Микрорастения ежевики (сорт Торнфри) в начале февраля пересаживают в рассадные кассеты с ячейками (d 40 мм), заполненными субстратом, содержащим осадки городских сточных вод (ОГСВ) не более одного года хранения и торф верховой нейтрализованный (рН 6-6,5). Первые две недели микрорастения в кассетах содержат под герметичными пленочными укрытиями на стеллажах с керамзитом (слой 2-3 см) при температуре 22-26°С и досвечивании (освещенность 2000 лк, 16 часов) с начала февраля до середины марта с последующей пересадкой растений в контейнеры (V 1,6 л) в начале мая. Контрольный субстрат перед посадкой микрорастений обрабатывают 1% раствором эупарена; опытные субстраты предварительно не обеззараживают и не пропаривают; все субстраты готовят простым перемешиванием компонентов в соотношении: ОГСВ:торф верховой = 1:20, 1:9, 1:4, 1:3, 2:3 с долей осадков в субстрате, соответственно, 5, 10, 20, 30, 40%; (в контроле - торф низинный и перлит в равном соотношении).
Отмечена высокая (95-100%) приживаемость пробирочных растений в нестерильных условиях на субстратах, содержащих 10-30% ОГСВ (ОГСВ:Тв 1:9, 1:4, 1:3). Микрорастения отличаются высокой жизнеспособностью и выровненностью. Существенно (в 1,7-2,5 раза) возрастают длина побегов, их облиственность и суммарная длина корней. Лучшие результаты получены при соотношении ОГСВ и верхового торфа 1:4.
Эффект от использования субстратов, содержащих ОГСВ и торф верховой в этом же соотношении, подтверждается на желтой малине (Желтый гигант) и на малино-ежевичном гибриде Тайберри (табл.5, 6).
Пример №3
В начале февраля микрорастения малины (сорт Желтый гигант) пересаживают в рассадные кассеты с ячейками (d 40 мм), заполненными субстратом, содержащим осадки городских сточных вод (ОГСВ) не более одного года хранения и торф верховой нейтрализованный (рН 6-6,5). Первые две недели микрорастения в кассетах содержат под герметичными пленочными укрытиями на стеллажах с керамзитом (слой 2-3 см) при температуре 22-26°С и досвечивании с начала февраля до середины марта (освещенность 2000 лк, 16 часов) с последующей пересадкой растений в контейнеры (V 1,6 л) в начале мая. Контрольный субстрат перед посадкой микрорастений обрабатывают 1% раствором эупарена; опытные субстраты предварительно не обеззараживают и не пропаривают; все субстраты готовят простым перемешиванием компонентов в соотношении: ОГСВ:торф верховой=1:20, 1:9, 1:4, 1:3, 2:3 с долей осадков в субстрате соответственно 5, 10, 20, 30, 40%; (в контроле - торф низинный и перлит в равном соотношении).
Пример №4
Микрорастения малино-ежевичного гибрида (сорт Тайберри) в начале февраля пересаживают в рассадные кассеты с ячейками (d 40 мм), заполненными субстратом, содержащим осадки городских сточных вод (ОГСВ) не более одного года хранения и торф верховой нейтрализованный (рН 6-6,5). Первые две недели микрорастения в кассетах содержат под герметичными пленочными укрытиями на стеллажах с керамзитом (слой 2-3 см) при температуре 22-26°С и досвечивании (освещенность 2000 лк, 16 часов) с начала февраля до середины марта и с пересадкой растений в контейнеры (V 1,6 л) в начале мая. Контрольный субстрат перед посадкой микрорастений обрабатывают 1% раствором эупарена; опытные субстраты предварительно не обеззараживают и не пропаривают; все субстраты готовят простым перемешиванием компонентов в соотношении: ОГСВ:торф верховой=1:20, 1:9, 1:4, 1:3, 2:3 с долей осадков в субстрате соответственно 5,10,20, 30, 40%; (в контроле - торф низинный и перлит в равном соотношении).
| Таблица 6 Приживаемость, рост и развитие микрорастений малино-ежевичного гибрида (сорт Тайберри) при адаптации в субстратах, содержащих торф верховой и ОГСВ (посадка на адаптацию 1.02; измерения 1-10. 06. 2006 г.) |
|||||||||
| Соотношение компонентов | Доля ОГСВ в субстрате, % | Приживаемость, % | Доля хорошо развитых in vitro растении, % | Высота растений, см | Число листьев, шт. | Число побегов, шт. | Суммарная площадь листовой поверхности одного растения, см2 | Диаметр корневой шейки, мм | Суммарная длина корней, см |
| ТП 1:1 | контроль | 60,7 | 100 | 23,2 | 13,5 | 1,0 | 424,5 | 3,1 | 100,0 |
| ОТв | |||||||||
| 1:20 | 5 | 95,9 | 100 | 40,6 | 20,1 | 1,5 | 725,6 | 3,2 | 131,1 |
| 1:9 | 10 | 100 | 100 | 108,2 | 29,9 | 2,2 | 1392,6 | 3,6 | 226,2 |
| 1:4 | 20 | 100 | 100 | 140,4 | 30,6 | 2,1 | 2835,8 | 3,9 | 311,9 |
| 1:3 | 30 | 100 | 100 | 120,3 | 28,1 | 2,1 | 1700,2 | 3,8 | 267,4 |
| 2:3 | 40 | 100 | 100 | 60,7 | 23,5 | 2,0 | 752,6 | 3,0 | 135,0 |
Соотношение ОГСВ и верхового торфа оптимально. При более низкой и более высокой доле ОГСВ в искусственном субстрате ниже биометрические показатели, характеризующие качество регенерантов, их рост и развитие.
Следующей задачей было определить оптимальные сроки пересадки in vitro растений на опытные субстраты.
Пример №5
В первой декаде января микрорастения ежевики пересаживают в рассадные кассеты с ячейками (d 40 мм), заполненными субстратом, содержащим осадки городских сточных вод (ОГСВ) не более одного года хранения и торф верховой нейтрализованный (рН 6-6,5). Первые две недели микрорастения в кассетах содержат под герметичными пленочными укрытиями на стеллажах с керамзитом (слой 2-3 см) при температуре 22-26°С и досвечивании с начала января до конца февраля (освещенность 2000 лк, 16 часов) с последующей пересадкой регенерантов в контейнеры (V 1,6 л) в середине марта. Контрольный субстрат перед посадкой микрорастений обрабатывают 1% раствором эупарена; опытные субстраты предварительно не обеззараживают и не пропаривают; все субстраты готовят простым перемешиванием компонентов в контроле: ОГСВ:перлит и торф низинный в равном соотношении; в опытных вариантах: ОГСВ и торф верховой в соотношении 1:4.
Пример №6
В первой декаде января микрорастения ежевики пересаживают в рассадные кассеты с ячейками (d 40 мм), заполненными субстратом, содержащим осадки городских сточных вод (ОГСВ) не более одного года хранения и торф верховой нейтрализованный (рН 6-6,5). Первые две недели микрорастения в кассетах содержат под герметичными пленочными укрытиями на стеллажах с керамзитом (слой 2-3 см) при температуре 22-26°С и досвечивании с начала января до конца февраля (освещенность 2000 лк, 16 часов) с последующей пересадкой регенерантов в контейнеры (V 1,6 л) в середине марта. Контрольный субстрат перед посадкой микрорастений обрабатывают 1% раствором эупарена; опытные субстраты предварительно не обеззараживают и не пропаривают; все субстраты готовят простым перемешиванием компонентов в контроле: ОГСВ:перлит и торф низинный в равном соотношении; в опытных вариантах: ОГСВ и торф верховой в соотношении 1:4.
Пример №7
В первой декаде января микрорастения ежевики пересаживают в рассадные кассеты с ячейками (d 40 мм), заполненными субстратом, содержащим осадки городских сточных вод (ОГСВ) не более одного года хранения и торф верховой нейтрализованный (рН 6-6,5). Первые две недели микрорастения в кассетах содержат под герметичными пленочными укрытиями на стеллажах с керамзитом (слой 2-3 см) при температуре 22-26°С и досвечивании с начала января до конца февраля (освещенность 2000 лк, 16 часов) с последующей пересадкой регенерантов в контейнеры (V 1,6 л) в середине марта. Контрольный субстрат перед посадкой микрорастений обрабатывают 1% раствором эупарена; опытные субстраты предварительно не обеззараживают и не пропаривают; все субстраты готовят простым перемешиванием компонентов в соотношении: ОГСВ: в контроле - перлит торф низинный в равном соотношении; в опытных вариантах: ОГСВ и торф верховой в соотношении 1:4.
| Таблица 9 | ||||||||
| Приживаемость, рост и развитие микрорастений малино-ежевичного гибрида (сорт Тайберри) при адаптации в субстратах, содержащих торф верховой и ОГСВ в зависимости от сроков пересадки в нестерильные условия (измерения 1-10.06.2007 г.) | ||||||||
| Посадка на адаптацию | Приживаемость, % | Доля хорошо развитых in vitro растений, % | Высота растений, см | Число листьев, шт. | Число побегов, шт. | Суммарная площадь листовой поверхности одного растения, см2 | Диаметр корневой шейки, мм | Суммарная длина корней, см |
| контроль ТнП 1:1 | ||||||||
| 1 января | 30,6 | 29,8 | 25,1 | 5,1 | 1,0 | 35,8 | 2,8 | 75,4 |
| 15 января | 34,8 | 30,1 | 30,8 | 7,4 | 1,0 | 350,6 | 2,8 | 88,5 |
| 1 февраля | 59,9 | 35,2 | 28,4 | 7,0 | 1,0 | 349,5 | 2,9 | 92,3 |
| 15 февраля | 66,2 | 40,1 | 30,2 | 8,5 | 1,5 | 380,5 | 2,8 | 93,5 |
| 28 февраля | 87,6 | 55,4 | 38,6 | 8,1 | 1,0 | 400,6 | 3,1 | 96,2 |
| 1 марта | 85,4 | 55,2 | 45,2 | 11,2 | 1,0 | 415,4 | 3,0 | 106,4 |
| 15 марта | 90,2 | 65,4 | 55,1 | 13,0 | 1,5 | 410,2 | 3,4 | 121,5 |
| опытный субстрат - O:Тв 1:4 | ||||||||
| 1 января | 75,2 | 87,4 | 100,3 | 23,2 | 1,5 | 1350,0 | 3,5 | 215,4 |
| 15 января | 73,7 | 88,3 | 104,5 | 25,6 | 1,5 | 1355,4 | 3,5 | 216,8 |
| 1 февраля | 80,5 | 99,4 | 108,5 | 26,1 | 1,5 | 1352,6 | 3,5 | 219,5 |
| 15 февраля | 100 | 98,9 | 115,4 | 25,3 | 2,0 | 1368,2 | 4,2 | 230,8 |
| 28 февраля | 100 | 100 | 120,3 | 30,8 | 2,0 | 1370,6 | 4,3 | 250,8 |
| 1 марта | 100 | 100 | 119,4 | 28,4 | 2,2 | 1385,4 | 4,1 | 248,5 |
| 15 марта | 100 | 100 | 108,5 | 25,1 | 2,2 | 1356,2 | 4,0 | 230,4 |
Применение в составе субстратов ОГСВ и нейтрализованного верхового торфа в соотношении 1:4 позволяет осуществлять пересадку in vitro растений в нестерильные условия в более ранние сроки (начало января), чем по обычной технологии (начало-середина марта). Из-за наличия в среде гиббереллинов регенеранты на коротком дне активно растут и развиваются. Забег (2,5 месяца) в росте и развитии дает возможность в середине марта пересаживать меристемные растения в контейнеры, и к началу периода вегетации (начало мая) получать качественный посадочный материал с закрытой корневой системой.
1. Способ доращивания in vitro растений ягодных и декоративных кустарников в нестерильных условиях, включающий пересадку микрорастений из пробирок в кассеты, заполненные искусственным субстратом, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют обезвоженные стабилизированные осадки городских сточных вод и нейтрализованный верховой торф в соотношении 1:4, при этом пересадку осуществляют в начале января.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пересаженные в кассеты микрорастения доращивают под герметичным пленочным укрытием в течение двух недель.
