Антикоагулянтное средство на основе биологически активного комплекса из коры кедра сибирского

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к антикоагулянтному средству, обладающему ингибиторной активностью по отношению к тромбину и фактору Ха. Антикоагулянтное средство, обладающее ингибиторной активностью по отношению к тромбину и фактору Ха, представляет собой биологически активный комплекс из коры кедра сибирского, полученный путем экстракции неполярным растворителем измельченной коры кедра с последующей экстракцией этилацетатом. Вышеописанное антикоагулянтное средство обладает эффективной ингибиторной активностью по отношению к тромбину и фактору Ха. 5 табл.

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективного средства для профилактики и лечения тромботических состояний (инфаркты, инсульты различной локализации).

Применяемый в нашей стране антикоагулянт прямого типа действия нефракционированный гепарин (НФГ) является полисахаридом с молекулярной массой 2-40 кД, в среднем 15 кД, и обладает рядом побочных нежелательных эффектов (остеопорозы, тромбоцитопении, повышение функциональной активности тромбоцитов, геморрагические осложнения). С целью разработки новых антикоагулянтных средств, лишенных побочных эффектов гепаринов, разрабатывают сульфатированные полисахариды (СП) растительного происхождения (выделенные из водорослей, лишайников, грибов, высших растений), а также выделенные из тканей морских беспозвоночных, членистоногих или млекопитающих [1-3]. Для придания молекулам полисахаридов необходимых свойств их деполимеризуют [4], в них встраивают функциональные группы [5], объединяют [коньюгируют] с молекулами других полисахаридов [6]. Структура макромолекулы СП играет важную роль при проявлении антикоагулянтной активности (АА). Так, под действием модифицированного аргинином хитозана (коньюгат хитозан-аргинин) происходят конформационные изменения молекулы тромбина [7]. Введение функциональных групп для получения химически модифицированного N-propanoyl-, N-hexanoyl- и N,О-quaternary substituted сульфата хитозана приводит к увеличению АА [8]. При изменении положительного заряда поверхности полимерного биоматериала на основе хитозана с боковыми цепями из полиэтиленгликоля и гексанала на нейтральный или отрицательный при добавлении SO₃ - групп снижается адгезия тромбоцитов и возрастает биосовместимость с кровью, которая положительно коррелирует с содержанием полиэтиленгликоля внутри полимера [9]. Известно использование коры кедра для получения биологически активного соединения резвератрола [10]. Известен способ получения препарата Pycnogenol из коры сосны приморской, который является эффективным антиоксидантом, антикоагулянтом, капилляропротектором, а также проявляет противовирусный эффект и противовоспалительную активность [11].

Наиболее близким к заявляемому антикоатулянтному средству, по сути, является нефракционированный гепарин. Так, композиция, содержащая гепарин со средней величиной молекулярной массы, представляющая собой смесь сульфированных олигосахаридов, имеющих молекулярные массы от ~6000 до ~12000 Да ингибирует тромбин, связанный с фибрином, и тромбин, находящийся в жидкой фазе, катализируя антитромбин, и ингибирует образование тромбина, катализируя инактивацию фактора Ха антитромбином [12].

Недостатком гепарина является то, что он обладает рядом побочных эффектов [13] и то, что его выделяют из тканей млекопитающих.

Задачи изобретения:

1. Расширение сырьевой базы для получения растительных антикоагулянтов, свободных от вирусов и прионов.

2. Частичная утилизации коры кедра сибирского.

Для получения биологически активного комплекса из коры кедра используют экстракцию измельченной коры кедра неполярным растворителем и последующую экстракцию этилацетатом. Обессоленную кору кедра экстрагируют этилацетатом в аппарате проточного типа при температуре кипения растворителя.

Исследовали влияние экстракта коры кедра на изменение времени свертывания плазмы крови человека в коагулологических тестах активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, влияние на внутренний путь свертывания крови), РеаКлот НПО "Ренам"(влияние на активность фактора Ха) [14]. Лиофильно высушенную плазму человека приобретали в НПО «Ренам». Ингибирование амидолитической активности тромбина и фактора Ха исследуемыми образцами изучали по изменению скорости расщепления хромогенных субстратов S-2238 или S-2222 при λ=405 нм Для расчета специфических антитромбиновой (анти-фактор IIа, aIIa) и анти-фактор Ха (аХа) активностей использовали калибровочные кривые 5-го Международного стандарта нефракционированного гепарина ((NIBSC).

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. 100 г измельченной коры кедра влажностью до 5% подвергали экстракции неполярным растворителем (гексаном) в аппарате типа Сокслета для отделения хвойного воска в течение 6 часов. Обессмоленную кору кедра экстрагировали этилацетатом в аппарате Сокслета в течение 10 часов при температуре кипения растворителя. Этилацетат отгоняли, остаток высушивали на воздухе. Выход продукта составил 2,3%.

Пример 2. К смеси 0,06 мл плазмы и 0,06 мл аЧТВ-реагента (НПО "Репам") добавляли 0,02 мл раствора экстракта коры кедра в конечных концентрациях 0,2-1,0 мг/мл. Через 3 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,025 М раствора СаСl₂ и фиксировали время (с) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с ростом концентрации экстракта коры кедра (Таблица 1). Концентрация, при которой время свертывания плазмы увеличивалось в 2 раза (2аЧТВ), в сравнении с контрольным (31,5±2,3) составила 0,54±0,017 мг/мл (Таблица 5). Для нефракционированного гепарина, выбранного в качестве стандарта, подобная величина составила 0,33±0,1 мкг/мл. Антитромбиновая активность (aIIa), рассчитанная по гепарину составила 0,2 ЕД/мг и коррелировала с величиной 2аЧТВ.

Таблица 1 Влияние экстракта коры кедра на внутренний путь свертывания крови в тесте активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, с)
образец	Конечная концентрация, мг/мл
0	0,2	0,33	0,4	0,5	0,67	0,8	1
Экстракт коры кедра	31,5±2,3	44,2±3,5 *	52,9±5 **	54,4±4,8 **	58,9±4,4***	100±11***	189±15***	265,9±21 ***
* - р<0.05, ** - р<0.01 и *** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл

Пример 3. К смеси 0,069 мл плазмы и 0,035 мл раствора фактора Ха (РеаКлот, НПО "Ренам" - определение влияния исследуемых веществ на активность фактора Ха в коагулологическом тесте) добавляли 0,01 мл раствора экстракта коры кедра в конечных концентрациях 0,067-1,340 мг/мл. Через 2 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,035 М раствора CaCl₂ и фиксировали время (с) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с ростом концентрации образца (Таблица 2). Концентрация, при которой время свертывания плазмы увеличивалось в 2 раза (2РеаКлот), в сравнении с контрольным (20,9±1,7 с) составила 1,30±0,19 мг/мл (Таблица 5). Активности против фактор Ха (аХа) для образца, рассчитанная по гепарину, составила 0,044 ЕД/мг и коррелировала с величиной 2РеаКлот (Таблица 5).

Таблица 2 Влияние экстракта коры кедра на активность фактора Ха в тесте РеаКлот (с)
образец	Конечная концентрация, мг/мл
0	0,067	0,13	0,22	0,27	0,34	0,45	0,67	1.34
Экстракт коры кедра	20,9±1,7	20,6±1,4	20,7±1,3	20,9±1,9	21±1,1	22,5±2,2	23,4±3,5 **	27,8±2,8**	44,8±5 ***
* - р<0.05, ** - р<0.01 и *** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл

Пример 4. К 250 мкл раствора антитромбина «Behring», Германия (1 ЕД/мл 0,05 М Трис-НСl буфера с 0,0075 М Nа₂-ЭДТА и 0,175 М NaCl, pH 7,4) добавляли экстракт коры кедра в конечных концентрациях 0,042-0,060 мг/мл и проинкубировали 3 мин при 37°С. Затем добавляли 100 мкл раствора бычьего тромбина фирмы «Behring», Германия (2 NIH ЕД/мл Трис-ЭДТА буфера). Через 30 сек добавляли 200 мкл раствора хромогенного субстрата для тромбина - S-2238 фирмы «Behring» (2 мМ Трис-ЭДТА буфера). По изменению оптической плотности раствора за минуту при длине волны 405 нм судили об активности исследуемого образца. Образец снижал скорость гидролиза тромбином хромогенного субстрата (Таблица 3). Концентрация IC 50 составила 0,32±0,054 мг/мл. Отмечали корреляцию с антитромбиновой активностью экстракта коры кедра, рассчитанной по стандарту гепарина.

Таблица 3 Ингибирование экстрактом коры кедра амидолитической активности тромбина (А 405/мин)
образец	Конечная концентрация, мг/мл
0	0,042	0,084	0,21	0,42	0,6
Экстракт коры кедра	0,195±0,023	0,202±0,022	0,184±0,017	0,142±0,017*	0,064±0,006***	0,05±0,007***
* - р<0,05, ** - р<0.01 и *** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл

Пример 5. К 250 мкл раствора антитромбина «Behring», Германия (1 ЕД/мл 0,05 М Трис-ЭДТА буфера с 0,0075 М Nа₂-ЭДТА и 0,175 М NaCl, pH 8,4) добавляли экстракт коры кедра в конечных концентрациях 0,11- 2,40 мкг/мл и 250 мкл смеси фактора Ха фирмы «Behring» (8 ЕД/мл Трис-ЭДТА буфера) с сульфатом декстрана фирмы «Boehringer Manhame», Австрия (0,02 мг/мл). После трехминутной инкубации при 37°С определяли остаточную активность фактора Ха, добавляя 50 мкл хромогенного субстрата-S 2222 фирмы Behring (4 мМ). Активность определяли по изменению оптической плотности раствора при длине волны 405 нм. Ингибирование амидолитической активности фактора Ха исследуемым образцом показано в Таблице 4. Концентрация IC₅₀ для образца составила 1,71±0,22 мг/мл (Таблица 5) и коррелировали с аХа активностью, рассчитанной по гепарину.

Таблица 4 Ингибирование экстрактом коры кедра амидолитической активности фактора Ха (А 405/мин)
образец	Конечная концентрация, мг/мл
	0	0,11	0,55	1,1	1,9	2,4
Экстракт коры кедра	0,27± 0,018
0,272± 0,015	0,198± 0,024*	0,175± 0,019**	0,132± 0,011***	0,066± 0,009***
* - р<0.05, ** - р<0.01 и *** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл

Таблица 5 Специфическая антикоагулянтная активность экстракта коры кедра
образец	Коагулологические методы исследования	Амидолитические методы исследования
2 АЧТВ, мг/мл	2 РеаК-лот, мг/мл	aIIa, ЕД/мг	аХа, ЕД/мг	IC 50 aIIa, мг/мл	IC 50 аХа, мг/мл	aIIa, ЕД/мг	аХа, ЕД/мг
Экстракт коры кедра	0,54±0,017		0,2±0,05				0,0091±0,0007
				0,044±0,006	0,32±0,054	1,71±0,22		0,01±0,0024
1,3±0,19

Таким образом, исследованный экстракт коры кедра обладает антикоагулянтной активностью in vitro. Антитромбиновая активность при анализе влияния на свертывание плазмы крови человека выше (по эффективным концентрациям и по активностям, рассчитанным по стандартам гепарина), чем активность против фактора Ха. Способность ингибировать амидолитическую активность тромбина выше при сравнении эффективных концентраций и равна способности ингибировать фактор Ха при расчете активности по стандарту гепарина. Снижение антикоагулянтных активностей образца в амидолитических тестах (присутствует плазменный ингибитор сериновых протеиназ - антитромбин), рассчитанных по стандартам гепарина, свидетельствует о том, что для проявления антитромбиновой активности экстракта коры кедра необходимо наличие и другого плазменного ингибитора сериновых протеиназ - кофактора гепарина II.

Список литературы

1. Imberty A, Lortat-Jacob H, Perrez S Structural view of glycosaminoglycan-protein interactions Carbohydrate Research 342 (2007) 430-438.

2 Volpi N., Therapeutic applications ofglycosaminoglycans. Curr Med Chem, 2006; 13(15):1799-810.

3. Криштанова Н.А., Сафонова М.Ю., Болотова В.Ц., Павлова Е.Д., Саканян Е.И. Перспективы использования растительных полисахаридов в качестве лечебных и лечебно-профилактических средств. Вестник ВГУ, серия: Биология. Химия. Фармация. 2005, Т1, с.212-221.

4. С.Noti, P.Seeberger. Chemical Approaches to Define the Structure-Activity Relationship of Heparin-like Glycosaminoglycans. Chemistry & Biology, Vol.12, 731-756, 2005.

5. Martin de Kort, Rogier C.Buijsman and Constant A.A.van Boeckel Synthetic heparin derivatives as new anticoagulant drugs, DDT, V 10, №11, 2005.

6. J. Du, S. Zhang, R. Sun, L. Zhang, C.-D. Xiong, Y.-X. Peng, Novel Polyelectrolyte Carboxy-methyl Konjac Glucomannan-Chitosan Nanoparticles for Drug Delivery. II. Release of Albumin In Vitro. Appi Biomater 72B: 299-304, 2005.

7. Liu WG, Zhang JR, Cao ZQ, Xu FY, Yao KD. J Mater Sci Mater Med. 2004 Nov; 15(11):1199-203A Chitosan-argimne conjugate as a novel anticoagulation biomaterial.

8. Carbohydr Res. 2003 Mar 14; 338(6):483-9. Influence of functional groups on the in vitro anti-coagulant activity of chitosan sulfate. Huang R, Du Y, Yang J, Fan L.

9. Colloids Surf В Biointerfaces. 2005 May 10;42(2):147-55. Chitosan based surfactant polymers designed to improve blood compatibility on biomaterials. Sagnella S, Mai-Ngam К.

10. RU 2294919, опубл. 10.03.2007.

11. Pat. USA №4698360.

12. RU №2002100908 "Композиции, содержащие гепарин, которые обладают способностью ингибировать образование сгустка, связанное с факторами свертывания крови", опубликован 20.09.2003.

13. Holzheimer RG. Low-molecular-weight heparin (LMWH) in the treatment of thrombosis Eur J Med Res. 2004 Apr 30; 9(4):225-39.

14. Bates SM, Weitz Л // Circulation. 2005. V 112. №4. P 53-60.

Антикоагулянтное средство, обладающее ингибиторной активностью по отношению к тромбину и фактору Ха, отличающееся тем, что представляет собой биологически активный комплекс из коры кедра сибирского, полученный путем экстракции неполярным растворителем измельченной коры кедра с последующей экстракцией этилацетатом, причем его конечная концентрация 0,32-0,54 мг/мл является эффективной для ингибирования активности тромбина и конечная концентрация 1,30-1,71 мг/мл является эффективной для ингибирования активности фактора свертываемости крови Ха.