Питательная среда для выделения листерий

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и может быть использовано для выделения листерий из инфицированного материала. Питательная среда содержит панкреатический гидролизат речной рыбы, панкреатический гидролизат отходов производства мясной воды, агар-агар, хлорид натрия, карбонат натрия, хлорид лития, витамин B₁, эскулин, цитрат аммонийного железа, полимиксин В сульфат, цефтазидим, акрифлавина гидрохлорид и дистиллированную воду. Изобретение позволяет повысить ингибирующие и дифференцирующие свойства среды, сократить сроки выделения листерий. 3 табл.

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для выделения листерий из инфицированного материала.

Совершенствование лабораторной диагностики листериоза связано с применением различных дифференциально-диагностических питательных сред для выделения листерий. Но сроки роста возбудителя на применяемых средах достаточно длительны, и поэтому существует необходимость в разработке питательных сред, обеспечивающих рост колоний листерий, имеющих характерные для определения признаки через 24-42 ч при посеве 10 микробных клеток с одновременным подавлением роста посторонней микрофлоры.

Известна дифференциально-диагностическая среда для выделения листерий, содержащая гидролизат казеина панкреатический, гидролизат рыбной муки панкреатический, экстракт пекарных дрожжей, полимиксин В сульфат, акрифлавин, эскулин, соль железа, хлорид лития, хлорид натрия, агар-агар, налидиксовую кислоту и дистиллированную воду (патент RU 2223313, С12N 1/20, С12Q 1/04, опубликован 10.04.2004).

Недостаток известной среды заключается в невысокой скорости роста листерий и позднем появлении дифференцирующих признаков - рост колоний диаметром 0,3-0,5 мм, имеющих дифференцирующие признаки (оливковый цвет и черный ореол вокруг колоний), наблюдается только через 42-48 ч. Кроме того, ингибирующие свойства среды не позволяют подавить рост Staphylococcus aureus при посеве 500 микробных клеток.

Целью изобретения является повышение ингибирующих и дифференцирующих свойств среды, а также увеличение скорости роста листерий, культивируемых на ней.

Эта цель достигается тем, что питательная среда для выделения листерий содержит питательную основу (гидролизат речной рыбы панкреатический, гидролизат отходов производства мясной воды панкреатический), минеральные соли (хлорид натрия, карбонат натрия, хлорид лития), витамин B₁, эскулин, цитрат амммонийного железа, агар-агар, полимиксин В сульфат, цефтазидим, акрифлавина гидрохлорид и дистиллированную воду при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

гидролизат речной рыбы панкреатический	11,0-11,5
гидролизат отходов производства мясной
воды панкреатический	9,0-9,5
хлорид натрия	5,0-5,5
карбонат натрия	0,65-0,68
хлорид лития	10,0-10,5
витамин B1	0,05-0,06
цитрат амммонийного железа	0,5-0,55
эскулин	0,8-0,85
агар-агар	9,0-9,5
полимиксин В сульфат	0,03-0,035
цефтазидим	0,015-0,02
акрифлавина гидрохлорид	0,0015-0,002
вода дистиллированная	до 1 л

Сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемая питательная среда отличается от известной тем, что она содержит гидролизаты речной рыбы и отходов производства мясной воды, натрий углекислый, витамин B₁, цитрат амммонийного железа, цефтазидим в предлагаемых количествах. Таким образом, данная питательная среда соответствует критерию изобретения "новизна".

Проведенный анализ патентной и научно-технической литературы показал, что предлагаемое техническое решение отличается не только от прототипа, но и от других технических решений в данной и смежных областях. Так, авторами не найдена питательная среда для выделения листерий, которая содержала бы предлагаемые компоненты в предлагаемом количественном соотношении. Данный состав среды позволяет усилить ее ингибирующие и дифференцирующие свойства, а также повысить скорость роста листерий и сократить время появления дифференцирующих листерий признаков. Качественный и количественный состав компонентов предлагаемой среды позволяет полностью ингибировать рост сопутствующей микрофлоры, при этом не угнетая роста непосредственно листерий, а даже ускоряя его. Среда обеспечивает при посеве 10 микробных клеток тест-штамма L. monocytogenes 766 через 18 ч инкубации при температуре 37°С формирование круглых, выпуклых, светло-серых росинчатых колоний листерий, окруженных черным ореолом. Через 24 ч колонии диаметром до 0,3 мм приобретают оливковую окраску, а через 42 ч диаметром 1,2-1,3 мм - углубление центра.

Кроме того, на среде полностью подавляется рост Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris 14, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Salmonella cholerae suis 424, Streptococcus viridans 41 при посеве 10000 микробных клеток.

Данная среда может быть использована в медицинской микробиологии для выделения листерий при контроле пищевых продуктов на загрязненность патогенными микроорганизмами в порядке осуществления санитарно-эпидемиологического надзора согласно СанПиН 2.3.2.1078-01.

Таким образом, предлагаемая питательная среда соответствует критериям «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Питательную среду готовят смешиванием компонентов в следующем количественном соотношении, г/л:

гидролизат речной рыбы панкреатический	11,0-11,5
гидролизат отходов производства мясной воды
панкреатический	9,0-9,5
хлорид натрия	5,0-5,5
карбонат натрия	0,65-0,68
хлорид лития	10,0-10,5
витамин В1	0,05-0,06
цитрат амммонийного железа	0,5-0,55
эскулин	0,8-0,85
агар-агар	9,0-9,5
полимиксин В сульфат	0,03-0,035
цефтазидим	0,015-0,02
акрифлавина гидрохлорид	0,0015-0,002
вода дистиллированная	до 1 л

Среду готовят следующим образом: навеску, содержащую в указанных выше количественных соотношениях гидролизат речной рыбы панкреатический, гидролизат отходов производства мясной воды панкреатический, хлорид натрия, карбонат натрия, хлорид лития, витамин B₁, эскулин, цитрат амммонийного железа, агар-агар, размешивают в 950 мл дистиллированной воды, доводят до кипения при помешивании, кипятят в течение 5-7 мин, охлаждают до температуры 35-40°С, затем вносят селективную добавку, содержащую в указанных выше количествах полимиксин В сульфат, цефтазидим, акрифлавина гидрохлорид, предварительно растворенную в 5 мл стерильной дистиллированной воды, тщательно взбалтывают, доводят до 1 литра стерильной дистиллированной водой и разливают в стерильные чашки Петри. Для удаления конденсата чашки Петри со средой приоткрывают и выдерживают в течение (40±5) мин при температуре (21±2)°С.

При этом гидролизат речной рыбы панкреатический получали следующим образом: в качестве субстрата использовали речную рыбу (сорогу), в качестве источника протеолитических ферментов использовали поджелудочную железу крупного рогатого скота при соотношении фермент - субстрат 1:10. Гидролиз рыбы проводили реакторным способом при периодическом или постоянном перемешивании при температуре 45°С, рН - 8,0, в течение 6-7 суток. Для консервации добавляли один процент хлороформа (по объему). Содержание аминного азота в полученном гидролизате - 500-560 мг%.

Гидролизат отходов производства мясной воды панкреатический получали в соответствии с промышленным регламентом №01898090-03-06 (регистрационный номер ГИСК им. Л.А.Тарасевича №1733-06): в реактор заливали 128 л питьевой воды, добавляли в нее 1,2 л 20% раствора натрия гидроокиси (для доведения рН до 7,8-8,0), 32 кг измельченных отходов производства мясной воды, 11,7 кг измельченной поджелудочной железы и 1,28 кг хлороформа. Гидролиз проводили при температуре 43±2°С в течение 7 суток. После фильтрации (для консервации) к готовому гидролизату на 122 л гидролизата добавляли 2,28 л хлороформа. Содержание аминного азота 6,0±0,25 мг/мл.

Скорость роста листерий на предлагаемой среде и ее дифференцирующие свойства оценивают путем посева 10 и 100 микробных клеток суточной агаровой культуры штамма L. monocytogenes 766. Выросшие колонии подсчитывают через 18-24-42 ч инкубации при температуре (37±1)°С. Одновременно отмечают появление дифференцирующих признаков у колоний листерий (оливковый цвет, черный ореол, углубление центра).

Ингибирующие свойства предлагаемой среды определяют путем посева на среду 10000 микробных клеток штаммов - ассоциантов (Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris 14, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Salmonella cholerae suis 424, Streptococcus viridans 41). Через 48 ч инкубации при температуре (37±1)°С отмечают наличие или отсутствие роста колоний ассоциантов.

Пример 1. Питательную среду готовят, как описано выше, при этом используют следующее соотношение компонентов, г/л:

гидролизат речной рыбы панкреатический	11,0
гидролизат отходов производства мясной воды
панкреатический	9,0
хлорид натрия	5,0
карбонат натрия	0,65
хлорид лития	10,0
витамин В1	0,05
цитрат амммонийного железа	0,5
эскулин	0,8
агар-агар	9,0
полимиксин В сульфат	0,03
цефтазидим	0,015
акрифлавина гидрохлорид	0,0015
вода дистиллированная	до 1 л

Через 18 ч инкубации на предлагаемой среде отмечен росинчатый рост листерий светло-серого цвета с одним дифференцирующим признаком - черным ореолом.

Через 24 ч инкубации на предлагаемой среде сформировалось 9 колоний листерий, окруженных черным ореолом. Отмечено появление второго дифференцирующего признака - оливкового цвета колоний.

Через 42 ч инкубации на предлагаемой среде у колоний листерий появился третий дифференцирующий признак - углубление центра.

Через 48 ч инкубации на предлагаемой среде не было роста ни одного из пяти штаммов - ассоциантов.

Пример 2. Питательную среду готовят, как описано выше, при этом используют следующее соотношение компонентов, г/л:

гидролизат речной рыбы панкреатический	11,5
гидролизат отходов производства мясной воды
панкреатический	9,5
хлорид натрия	5,5
карбонат натрия	0,68
хлорид лития	10,5
витамин В1	0,06
цитрат амммонийного железа	0,55
эскулин	0,85
агар	9,5
полимиксин В сульфат	0,035
цефтазидим	0,02
акрифлавина гидрохлорид	0,002
вода дистиллированная	до 1 л

Через 18 ч инкубации на предлагаемой среде отмечен росинчатый рост листерий светло-серого цвета с одним дифференцирующим признаком - черным ореолом.

Через 24 ч инкубации на предлагаемой среде сформировалось 11 колоний листерий, окруженных черным ореолом. Отмечено появление второго дифференцирующего признака - оливкового цвета колоний.

Через 42 ч инкубации на предлагаемой среде у колоний листерий появился третий дифференцирующий признак - углубление центра.

Через 48 ч инкубации на предлагаемой среде не было роста ни одного из пяти штаммов - ассоциантов.

Проведено испытание предлагаемой среды в лабораторных условиях в сравнении со средой - прототипом

Ростовые свойства питательных сред приведены в табл.1.

Таблица 1 Ростовые свойства питательных сред для L. monocytogenes (инкубация 18-42 ч при температуре (37±1)°С)
Питательная среда	Посевная доза (микробные клетки)	Количество выросших колоний
18 ч	24 ч	42 ч	48 ч
Предлагаемая	10 100	росинчатый рост	10 77	10 77	10 77
Прототип	10	-	-	2	2
	100	-	-	9	9
Примечание: (-) отсутствие видимого роста.

Таким образом, предлагаемая питательная среда для выделения листерий имеет значительное преимущество, так как позволяет обнаружить через 18 ч росинчатый рост, а через 24 ч - сформировавшиеся колонии листерий, тогда как на среде - прототипе рост колоний появляется только через 42 ч.

Дифференцирующие свойства питательных сред приведены в табл.2

Таблица 2 Дифференцирующие свойства питательных сред (инкубация 18-42 ч при температуре (37±1)°С).
Питательная среда	Дифференцирующий признак
	Цвет колоний	Черный ореол	Углубление центра колоний
18 ч	24 ч	42 ч	18 ч	24 ч	42 ч	18 ч	24 ч	42 ч
Предлагаемая	светло-серый	оливковый	олив ковый	+	+	+	-	-	+
Прототип	-	-	олив ковый	-	-	+	-	-	-
Примечание: (-) отсутствие признака.

По дифференцирующим свойствам предлагаемая питательная среда для выделения листерий также имеет существенное преимущество в сравнении со средой - прототипом по времени появления и количеству дифференцирующих признаков. Первый дифференцирующий признак - черный ореол - отмечается на предлагаемой питательной среде через 18 ч инкубации, второй - оливковый цвет колоний - через 24 ч инкубации. На среде - прототипе в эти сроки роста нет. Третий дифференцирующий признак - углубление центра колоний - регистрируется на предлагаемой питательной среде через 42 ч инкубации. На среде - прототипе к этому сроку формируются выпуклые колонии листерий оливкового цвета с черным ореолом.

Ингибирующие свойства питательных сред приведены в табл.3

Таблица 3 Ингибирующие свойства питательных сред (инкубация 48 ч при температуре (37±1)°С).
Питательная среда	Количество выросших колоний (посевная доза 10000 м.к.)
Е. coli	S. cholerae suis	St. viridans	P.vulgaris	St. aureus
Предлагаемая	-	-	-	-	-
Прототип					Сплошной рост
Примечание: (-) отсутствие видимого роста.

По ингибирующим свойствам предлагаемая питательная среда для выделения листерий также имеет существенное преимущество в сравнении со средой - прототипом, так как на среде полностью ингибируется рост Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris 14, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Salmonella cholerae suis 424, Streptococcus viridans 41 при посеве 10000 микробных клеток, тогда как на среде - прототипе наблюдается рост Staphylococcus aureus ATCC 6538.

Ингибирующие свойства испытуемой среды определялись в отношении смесей пяти указанных выше ассоциантов и листерий. Посевная доза ассоциантов в 100 раз превышала дозу L. monocytogenes.

Смеси микробов готовили путем соединения 1 мл взвеси L. monocytogenes концентрацией 2000 м.к. и 1 мл взвеси одного из микробов-ассоциантов концентрацией 200000 м.к. Из указанных смесей проводили посев по 0,1 мл смеси на предлагаемую среду и среду-прототип. Предварительно все ассоцианты были проверены на чистоту роста на элективных для них питательных средах, на которых обнаруживали рост типичных для них колоний.

Через 18 часов инкубации на предлагаемой среде зафиксировано появление роста колоний с черным ореолом. Через 24 ч инкубации колонии приобрели характерный для листерий оливковый цвет, а через 42 ч отмечено углубление центра колоний.

На среде-прототипе в двух случаях наблюдался рост двух видов колоний: при высеве из смеси L. monocytogenes и Р. vulgaris - газон плоских и на их фоне единичные выпуклые оливкового цвета; при высеве из смеси L. monocytogenes и St. aureus - в толще газона золотисто-желтой культуры появились отдельные колонии (в среднем 11 на чашке), в области роста которых агар приобрел черное окрашивание. При высеве из смесей L. monocytogenes и Е. coli, L. monocytogenes и St. viridans, и L. monocytogenes и S. cholerae suis формирование выпуклых колоний оливкового цвета отмечено только через 42 ч инкубации.

Таким образом, предлагаемая питательная среда для выделения листерий позволяет в короткие сроки (через 18 ч) выделить L. monocytogenes и, тем самым, ускорить обнаружение листерий в инфицированном материале.

Питательная среда для выделения листерий, содержащая питательную основу, хлорид натрия, хлорид лития, цитрат аммонийного железа, эскулин, агар-агар, полимиксин В сульфат, акрифлавина гидрохлорид, дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит карбонат натрия, витамин B₁ и цефтазидим, а в качестве питательной основы - гидролизат речной рыбы панкреатический и гидролизат отходов производства мясной воды панкреатический при следующем соотношении компонентов, г/л:

гидролизат речной рыбы панкреатический	11,0-11,5
гидролизат отходов производства мясной воды
панкреатический	9,0-9,5
хлорид натрия	5,0-5,5
карбонат натрия	0,65-0,68
хлорид лития	10,0-10,5
витамин В1	0,05-0,06
цитрат аммонийного железа	0,5-0,55
эскулин	0,8-0,85
агар-агар	9,0-9,5
полимиксин В сульфат	0,03-0,035
цефтазидим	0,015-0,02
акрифлавина гидрохлорид	0,0015-0,002
вода дистиллированная	до 1 л