Получение экстрактов хмеля, обладающих эстрогенной и антипролиферативной биоактивностью
Изобретение относится к медицине. Хмель или хмель-продукт подвергают реакции изомеризации в присутствии воды в щелочной среде и по меньшей мере одной экстракции, проводимой по меньшей мере одним органическим растворителем, выбранным из группы спиртов, водосодержащих спиртов, кетонов, водосодержащих кетонов или эфиров либо их смесей, или подщелоченной водой. Реакцию изомеризации и по меньшей мере одну экстракцию продолжают до тех пор, пока не будет получен экстракт, содержащий 8-пренилнарингенин, у которого отношение (8-пренилнарингенин×100%)/
(8-пренилнарингенин+6-пренилнарингенин) составляет по меньшей мере 50%. Указанным способом получают экстракт хмеля, обладающего эстрогенной и антипролиферативной биоактивностью. Применяют экстракт хмеля для изготовления медикамента, у которого возможная пролиферативная активность, вызванная эстрогенной активностью 8-пренилнарингенина, ингибируется или уравновешивается антипролиферативной активностью ксантогумола. Применяют экстракт хмеля для изготовления медикамента для лечения или профилактики одного из состояний, симптомов, жалоб или заболеваний, вызванных нарушением гормонального баланса эстрогенной природы. Изобретение позволяет реализовать указанное назначение. 4 н. и 21 з.п. ф-лы, 2 табл.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается способа получения экстрактов хмеля, обогащенных 8-пренилнарингенином по отношению к 6-пренилнарингенину в соответствии с преамбулой первого пункта формулы изобретения.
Предшествующий уровень техники
Хмель содержит три основных класса вторичных метаболитов, а именно: хмелевые (горькие) кислоты, эфирное масло хмеля и полифенолы хмеля. Хмелевые кислоты и эфирное масло хмеля, а также в малом количестве и низкомолекулярные полифенолы являются самыми важными компонентами хмеля в целях пивоварения. Экстракты хмеля для пивоварения обычно получают путем экстрагирования хмеля или хмель-продукта жидким или сверхкритическим CO2 с тем, чтобы получить экстракты хмеля, содержащие вышеупомянутые вторичные метаболиты в нужных пропорциях.
В последнее время значительные исследования были сосредоточены на биологической активности прениловых (пренилированных) флавоноидов, которые составляют особый класс полифенолов. Наиболее важными прениловыми флавоноидами в свежем хмеле являются хальконы, в частности ксантогумол и десметилксантогумол. Эти хальконы являются предшественниками таких флаванонов, как изоксантогумол (который образуется из ксантогумола), 8-пренилнарингенин и 6-пренилнарингенин (которые образуются из десметилксантогумола) (см. фиг.1). 8-пренилнарингенин был идентифицирован как действующее начало эстрогенной активности хмеля, обладающее большей активностью, чем другие известные фитоэстрогены (Milligan et al., 1999). Кроме 8-пренилнарингенина, другие подобные соединения из хмеля, такие как 6-пренилнарингенин, изоксантогумол, 6,8-дипренилнарингенин и 8-геранилнарингенин (Milligan et al., 2000), оказались лишь слабо эстрогенными. Высокая эстрогенная активность 8-пренилнарингенина была подтверждена при тестировании in vivo (Milligan et al., 2002).
Ксантогумол, с другой стороны, оказался очень сильным химиопрофилактическим соединением против рака in vitro, которое обладает исключительно широким спектром механизмов ингибирования канцерогенеза на стадиях возникновения, развития и прогрессирования рака (Gerhauser et al., 2002). В соответствии с его потенциалом против возникновения рака ксантогумол значительно модулирует активность ферментов, участвующих в метаболизме и детоксификации канцерогенов, например, ферментов CYP450 (Henderson et al., 2000; Miranda et al., 2000 с) и хинонредуктаз (Miranda et al., 2000a). Кроме того, как оказалось, ксантогумол способен поглощать химически активные формы кислорода, включая радикалы гидроксила и пероксила (Miranda et al., 2000b; Rodriguez et al., 2001), и ингибировать образование радикала супероксид-аниона и оксида азота (Zhao et al., 2003). В качестве потенциального противодействия развитию рака ксантогумол проявляет противовоспалительные свойства путем ингибирования активности циклооксигеназы-1 и циклооксигеназы-2 (Gerhauser et al., 2002). Антипролиферативные механизмы противодействия канцерогенезу на стадии прогрессирования включают ингибирование синтеза ДНК и индукцию остановки клеточного цикла в S-фазе, апоптоз и индукцию клеточной дифференцировки (Miranda et al., 1999; Gerhauser et al., 2002). Кроме того, ксантогумол оказался эффективным в наномолярных концентрациях против вызванных канцерогеном предраковых поражений в органной культуре молочной железы мыши, т.е. на модели, служащей связующим звеном между краткосрочными моделями канцерогенеза in vitro и долгосрочными моделями in vivo (Gerhauser et al., 2002).
Вышеописанные флавоноиды являются второстепенными продуктами в процессе пивоварения. В основном они остаются в остатке после экстрагирования нужных соединений из хмеля жидким или сверхкритическим CO2. При нормальных условиях пивоварения, при которых используется цельный хмель, хмель-продукты или определенные фракции хмеля, общая концентрация прениловых флавоноидов может составлять до 4 мг на литр пива (Stevens et al., 1999).
В DE 19939350 описан способ получения экстракта хмеля, обогащенного ксантогумолом, в соответствии с которым хмель-продукт экстрагируют органическим растворителем или подщелоченной водой. Перед такой экстракцией хмель-продукт может быть экстрагирован водой для удаления гидрофильных веществ. В качестве подходящего органического растворителя раскрыт раствор вода/этанол. Однако ничего не сообщается о присутствии прениловых флавоноидов в экстракте хмеля.
Согласно WO 03014287, эстрогенную активность экстрактов хмеля следует отнести на счет присутствия 8-пренилнарингенина, который оказался соединением, проявляющим наиболее значительную эстрогенную активность. Отмечается, что 6-пренилнарингенин также проявляет эстрогенную активность, хотя и меньшую, чем 8-пренилнарингенин, и что ксантогумол способен подавлять клеточный метаболизм и может рассматриваться как средство для профилактики рака. Описано, что экстракты хмеля по WO 03014287 подходят для применения при профилактике или лечении заболеваний, вызванных нехваткой эстрогенов или нарушениями метаболизма половых стероидных гормонов, в частности эстрогенов.
В WO 03014287 также описан способ получения экстракта хмеля, обогащенного такими хальконами и флаванонами, как ксантогумол, изоксантогумол, 6-пренилнарингенин и 8-пренилнарингенин. Способ включает стадии:
(1) экстрагирования хмеля или хмель-продукта с помощью С5-С7-алкана или сверхкритического CO2 для удаления гидрофобных веществ, содержащихся в хмеле;
(2) экстрагирования остатка, полученного на стадии (1), водой для того, чтобы удалить гидрофильные вещества, содержащиеся в хмеле; и
(3) экстрагирования остатка, полученного на стадии (2), органическим растворителем, выбранным из группы, состоящей из спиртов, водосодержащих спиртов, кетонов, водосодержащих кетонов или эфиров либо их смесей.
Концентрации изоксантогумола, 6-пренилнарингенина и 8-пренилнарингенина в полученном при этом экстракте хмеля, как оказалось, возрастают с повышением температуры во время экстракции водой на стадии (2). Однако во всех образцах весовое отношение 8-PN/(8-PN+6-PN) находится в пределах 18-25%.
Раскрытый в WO 02/085393 экстракт хмеля, как сообщается, содержит не менее 3 мас.% прениловых флавоноидов, в частности ксантогумола, изоксантогумола и 8-пренилнарингенина. Однако большая часть экстрактов по WO 02/085393 не проявляет увеличения эстрогенной активности по сравнению с традиционным, не подвергавшимся обогащению экстрактом. Кроме того, не отмечено корреляции между составом экстракта и эстрогенной активностью. К тому же эстрогенное действие не соотносится с 8-пренилнарингенином. Также заявлено, что эстрогенные свойства экстракта особенно хорошо выражены, если он содержит 1-30 мас.% ксантогумола, 0,01-50 мас.% изоксантогумола и 0,0005-10 мас.% 8-пренилнарингенина. Сказано, что экстракт хмеля по WO 02/085393 пригоден для производства медикаментов, обладающих эстрогенными свойствами, косметических композиций, пищевых добавок и диетических препаратов.
Hänsel and Schultz (1988) описали, что десметилксантогумол и ксантогумол, выделенные из свежесобранных шишек хмеля, подвергаются изомеризации в 5%-ном растворе гидроокиси калия в этаноле. Ксантогумол подвергался изомеризации в изоксантогумол с выходом в 80%, тогда как изомеризация десметилксантогумола давала как 6-пренилнарингенин, так и 8-пренилнарингенин, с выходом в 35% и 30% соответственно. Таким образом, можно получить соотношение 8-PN/(8-PN+6-PN), равное 46%, а это значит, что образование термодинамически более стабильного 6-пренилнарингенина предпочтительно.
С другой стороны, Milligan et al. (2002) описали получение 8-пренилнарингенина путем деметилирования изоксантогумола, который выделяли после изомеризации остатка из экстрагированных дихлорметаном высушенных шишек хмеля в 5%-ном растворе гидроокиси калия в этаноле. Процесс деметилирования проводили с помощью трихлорида бора в смеси из ацетонитрила и дихлорметана и обнаружили, что выход составил только 53%.
В ряде патентов, например US 5370897, US 3839588 и US 1246425, описано, что α-кислоты подвергаются процессу щелочной изомеризации при получении изо-α-кислот. Однако экстракты, пригодные для такой реакции изомеризации, в основном получают путем экстракции гексаном, сверхкритической или жидкой двуокисью углерода в качестве растворителей для экстракции. Поскольку такие экстракты не содержат ни ксантогумола, ни десметилксантогумола, подвергнутые изомеризации экстракты лишены соответствующих прениловых флаванонов. Более того, в US 1274678 раскрыто, что если исходный экстракт, содержащий α-кислоты, получен путем экстрагирования бензолом, то необходимо удалить прениловые флавоноиды - ксантогумол и изоксантогумол, так как они мешают процессу получения. Таким образом, эти результаты по изомеризации в щелочной среде не имеют отношения к настоящему изобретению.
Несмотря на то, что были разработаны способы обогащения экстрактов хмеля прениловыми флавоноидами, однако по сей день не найдены способы получения экстрактов хмеля, в которых будет преобладать сильно эстрогенный 8-пренилнарингенин по сравнению с его изомером - 6-пренилнарингенином.
Поэтому целью настоящего изобретения является разработка способа получения экстракта хмеля с лучшим выходом 8-пренилнарингенина, в частности способа, в котором будет происходить преимущественное обогащение 8-пренилнарингенином по сравнению с его изомером - 6-пренилнарингенином.
Следующей целью данного изобретения является получение экстрактов хмеля с определенным и оптимизированным составом по всем существенным прениловым флавоноидам или их производным с учетом их биологической активности.
Согласно настоящему изобретению это достигается при помощи способа, проявляющего технические признаки описательной части первого пункта формулы изобретения.
Краткое описание изобретения
Способ настоящего изобретения отличается тем, что хмель или хмель-продукт подвергается (1) реакции изомеризации в присутствии воды как растворителя и в присутствии некоторого количества основания и (2) по меньшей мере одной экстракции.
В способе настоящего изобретения предпочтительно применяется вода в качестве растворителя при реакции изомеризации.
Подразумевается, что хмель или хмель-продукт включает любые разновидности обработанного хмеля, например штабелированный хмель или любой экстракт хмеля или любые выжимки из хмеля, содержащие прениловые флавоноиды.
В изобретении установлено, что при проведении реакции изомеризации в присутствии воды в качестве растворителя может быть получен экстракт хмеля, дополнительно обогащенный прениловыми флавоноидами. В частности, по настоящему изобретению может быть получен экстракт, обогащенный 8-пренилнарингенином (и ксантогумолом) по отношению к 6-пренилнарингенину, по сравнению с современным уровнем техники, причем обогащение особенно хорошо выражено при использовании воды в качестве растворителя при реакции изомеризации. Вследствие обогащения 8-пренилнарингенином может быть получен экстракт хмеля с более высокой эстрогенной активностью, в котором, кроме того, возможная пролиферативная активность, вызванная присутствием 8-пренилнарингенина, уравновешивается антипролиферативной активностью ксантогумола (см. фиг.2). В этом отношении важно отметить, что ксантогумол проявляет исключительно широкий спектр механизмов ингибирования на всех стадиях канцерогенеза, т.е. возникновения, развития и прогрессирования рака (Gerhauser et al., 2002).
Последовательность, в которой проводится изомеризация и по меньшей мере одна экстракция, не имеет решающего значения для изобретения. На практике это значит, что сначала может проводиться либо изомеризация, либо по меньшей мере одна экстракция.
Реакция изомеризации
Известно, что при повышенной температуре как десметилксантогумол, так и ксантогумол - наиболее важные прениловые флавоноиды (хальконы) в хмеле или хмель-продукте - легко подвергаются термической изомеризации путем внутримолекулярной циклизации по типу Михаэля в соответствующие флаваноны. В то время, как ксантогумол практически полностью изомеризуется в изоксантогумол, изомеризация десметилксантогумола приводит к образованию смеси из 8-пренилнарингенина (8-PN) и 6-пренилнарингенина (6-PN) в молярном отношении, равном (8-PN×100%)/(8-PN+6-PN), которое обычно составляет от 15% до 20%, вероятнее всего, вследствие меньшей термодинамической стабильности 8-PN по сравнению с 6-PN. Неожиданно оказалось, что при проведении реакции изомеризации в присутствии воды и в определенных щелочных условиях соотношение (8-PN×100%)/(8-PN+6-PN) смещается в пользу термодинамически менее стабильного 8-PN, причем общий выход (8-PN+6-PN) остается почти неизменным. Поскольку 8-PN является соединением, обладающим большей эстрогенной активностью по сравнению с 6-пренилнарингенином или любым другим соединением из хмеля, эстрогенная активность полученного при этом экстракта хмеля может быть повышена в 3-5 раз по сравнению с известными экстрактами хмеля (например, при водноспиртовой экстракции при повышенной температуре). Отмечалось улучшение выхода 8-PN при использовании одной лишь воды в качестве растворителя при реакции изомеризации.
Предпочтительное воплощение способа данного изобретения отличается тем, что реакция изомеризации проводится в щелочных условиях, что соответствует концентрации КОН в воде по меньшей мере 0,5%, предпочтительно по меньшей мере 1%, более предпочтительно по меньшей мере 5 мас.%.
Проведение реакции изомеризации в более щелочных условиях позволяет сместить отношение (8-PN×100%)/(8-PN+6-PN) от 15-25%, как это известно на современном уровне техники, до более 50% и зачастую до более 60 и 75% при использовании воды в качестве растворителя и даже больше в пользу 8-PN, причем общий выход (8-PN+6-PN) остается практически неизменным. В результате этого может быть получен экстракт хмеля, сильно обогащенный 8-PN. Иными словами, по настоящему изобретению соотношение 6-PN/8-PN может быть обращено, а поскольку методами современного уровня техники получается избирательное обогащение 6-PN, то настоящее изобретение обеспечивает избирательное обогащение 8-PN, который является соединением, обладающим более высокой эстрогенной активностью. При условиях реакции, преобладающих в способе настоящего изобретения, приблизительно до 95% ксантогумола в хмель-продукте, подвергаемом реакции, может изомеризироваться в изоксантогумол. Как оказалось, процесс изомеризации протекает таким же образом и в тех экстрактах, в которых весь десметилксантогумол был предварительно количественно превращен до определенного отношения (8-PN×100%)/(8-PN+6-PN).
Следует отметить, что известная в данной области изомеризация хальконов в соответствующие флаваноны обычно проводится в спиртовом растворе гидроокиси калия (например, Hänsel and Schultz, 1988) при кипячении в течение 30 минут, что дает отношение (8-PN×100%)/(8-PN+6-PN), равное 40-46%. Однако по настоящему изобретению обогащение термодинамически менее стабильным 8-PN может быть значительно повышено при проведении реакции изомеризации в воде, в частности, при комнатной температуре.
Чтобы свести к минимуму опасность окисления реагентов или продуктов реакции, реакция изомеризации предпочтительно проводится в инертной атмосфере. Реагенты, в частности ксантогумол и десметилксантогумол, а также продукты реакции - изоксантогумол и 8-пренилнарингенин, содержат двойные связи и фенольные группы, которые подвержены окислению.
Температура, при которой проводится реакция изомеризации, не имеет решающего значения для изобретения и может находиться между температурой замерзания и температурой кипения реакционной смеси. Удобнее всего проводить реакцию при комнатной температуре, хотя температуры между 40 и 60°C, в особенности около 50°C, тоже считаются подходящими.
Изобретатели также обнаружили, что реакция изомеризации протекает с высокой скоростью и может завершиться практически менее чем за 15 минут, даже при комнатной температуре. Предпочтительно реакция изомеризации проводится в течение времени от 0,25 до 4 ч ввиду того, что это способствует образованию 8-пренилнарингенина. В общем, специалист в этой области сможет подобрать продолжительность и температуру, при которой будет проводиться реакция изомеризации, чтобы добиться оптимального превращения и селективности в отношении требуемых конечных продуктов и свести к минимуму опасность образования нежелательных побочных продуктов, которое может произойти в том случае, если реакция изомеризации продолжается в течение слишком длительного времени.
Способ экстракции
Для выделения требуемых соединений из хмеля или хмель-продукта до или после окончания реакции изомеризации хмель или хмель-продукт подвергается по меньшей мере одной экстракции.
Экстракция прениловых флавоноидов происходит при экстрагировании хмеля или хмель-продукта по меньшей мере одним органическим растворителем, выбранным из группы спиртов, водосодержащих спиртов, кетонов, водосодержащих кетонов или эфиров либо их смесей, или подщелоченной водой. Примерами органических растворителей, пригодных для применения, являются растворители промежуточной полярности, например этилацетат или ацетон, либо высокой полярности, например этанол или метанол, либо их смеси типа смеси, состоящей из этилацетата/метанола (90/10, об.) или водноспиртовой смеси этанол/вода (75/25, об.).
Предпочтительно, до или после по меньшей мере одного экстрагирования хмеля или хмель-продукта либо до или после проведения реакции изомеризации хмеля или хмель-продукта, его подвергают дополнительной операции экстрагирования водой и/или по меньшей мере одним неполярным органическим растворителем, а затем выделяют остаток или экстракт, обогащенный прениловыми флавоноидами. Дополнительная экстракция водой осуществляется с целью добиться большей степени обогащения прениловыми флавоноидами в обогащенном экстракте хмеля путем удаления, насколько возможно, любого нефункционального гидрофильного балластного материала, находящегося в обогащенном экстракте. Примеры такого нефункционального балластного материала включают белки. Дополнительная экстракция по меньшей мере одним неполярным органическим растворителем позволяет уменьшить содержание нефункционального гидрофобного (липофильного) балластного материала, что приводит к более сильному обогащению или концентрированию прениловых флавоноидов в экстракте, обогащенном прениловыми флавоноидами.
В том случае, когда концентрация гидрофобного балластного материала в исходном материале из хмеля или хмель-продукта, подвергаемого реакции изомеризации и экстракции, слишком высока, может быть предусмотрена дополнительная экстракция по меньшей мере одним неполярным органическим растворителем. Продукт, подвергаемый такой дополнительной экстракции, в основном представляет собой выжимки хмеля, оставшиеся после первичной экстракции хмеля жидким или сверхкритическим CO2, проведенной в неисчерпывающих условиях (умеренная температура и давление) для отделения соединений, представляющих интерес для пивоварения, от остатка, содержащего более полярные вторичные метаболиты, в том числе соответствующие прениловые флавоноиды.
Экстрагирование гидрофильного и гидрофобного балластного материала может осуществляться любым подходящим способом экстракции, известным специалистам в этой области. Подходящие методы экстракции включают экстракцию растворитель-растворитель (например, вода и этилацетат, гексан и водно-спиртовая смесь) или твердофазные экстракции (растворение гидрофильного и гидрофобного материала в воде и неполярном органическом растворителе соответственно либо применение двуокиси кремния или ее производных). Отделение фракции, содержащей прениловые флавоноиды, после экстракции водой и неполярным органическим растворителем соответственно может осуществляться, например, путем декантации, фильтрования и/или центрифугирования.
Вероятный способ экстракции, к примеру, включает экстрагирование хмеля жидким или сверхкритическим СО2 и извлечение полученного остатка с последующим подверганием его реакции изомеризации в щелочных условиях. После этого реакционную смесь, содержащую прокипяченный истощенный хмель, подкисляют до нейтрального значения рН и выделяют остаток, например, фильтрованием или центрифугированием после промывки водой. Затем из остатка можно избирательно экстрагировать прениловые флавоноиды с помощью подходящих растворителей или их смесей.
Предварительная обработка
В целях улучшения экономической осуществимости настоящего изобретения и дальнейшего концентрирования требуемых соединений, перед проведением реакции изомеризации и экстракции, хмель или хмель-продукт подвергают экстракции жидким или сверхкритическим СО2 или по меньшей мере одним практически неполярным органическим растворителем, а затем выделяют остаток, содержащий прениловые флавоноиды.
По сути это означает, что происходит выделение экстракта, представляющего интерес для пивоварения, тогда как остаток обогащается прениловыми флавоноидами и лишается большей части гидрофобного балластного материала при предварительной экстракции. Затем этот предварительно обогащенный остаток подвергается изомеризации и по меньшей мере одной экстракции в произвольном порядке.
Другая возможность включает экстракцию жидким или сверхкритическим СО2 спиртового так называемого "чистого смоляного экстракта", который смешивают с носителем (например, кизельгуром), и выделение остатка на носителе. Затем этот остаток, содержащий прениловые флавоноиды, может быть подвергнут изомеризации и по меньшей мере одной экстракции в любом порядке.
Возможные применения
Изобретатели обнаружили, что возможное пролиферативное действие обогащенного экстракта хмеля по настоящему изобретению, которое вызывается эстрогенной активностью 8-пренилнарингенина, может быть подавлено и даже нейтрализовано при наличии ксантогумола в обогащенном экстракте, так как ксантогумол, как оказалось, проявляет антипролиферативную активность. Однако изобретатели обнаружили, что такое ингибирование может быть получено только при условии, что весовое соотношение между ксантогумолом и 8-пренилнарингенином будет достаточно высоким. В частности, изобретатели обнаружили достаточное ингибирование при весовом отношении между ксантогумолом и 8-пренилнарингенином, равном по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 30. Такое соотношение может быть получено при добавлении избытка ксантогумола в обогащенный экстракт (см. фиг.2). Иными словами, при определенном весовом отношении между ксантогумолом и 8-пренилнарингенином можно добиться эффективного ингибирования пролиферативной активности, связанной с эстрогенным действием 8-пренилнарингенина, через антипролиферативную активность ксантогумола.
В этом плане из фиг.2 видно, что повышение концентрации 8-пренилнарингенина ведет к усилению пролиферации раковых клеток молочной железы MCF-7. Изобретатели неожиданно обнаружили, что при каждой концентрации 8-пренилнарингенина низкие концентрации ксантогумола (<1 мкМ) стимулируют пролиферацию, вызванную 8-пренилнарингенином. В частности, это те концентрации, при которых соотношение между ксантогумолом и 8-пренилнарингенином меньше 10, тогда как более высокие концентрации ксантогумола, не менее 5 мкМ, как оказалось, значительно ингибируют пролиферацию, вызванную 8-пренилнарингенином.
К сожалению, в условиях реакции, дающих наиболее эффективную изомеризацию десметилксантогумола в 8-пренилнарингенин и 6-пренилнарингенин и в то же время способствующих образованию 8-пренилнарингенина, ксантогумол, к сожалению, почти количественно изомеризуется в изоксантогумол. С другой стороны, экстракт хмеля, обогащенный ксантогумолом, может быть получен посредством по меньшей мере одной экстракции хмеля или хмель-продукта в условиях, не способствующих изомеризации (экстрагирование в нейтральных или кислых условиях при комнатной температуре). Поэтому способ настоящего изобретения предпочтительно включает стадию смешивания экстракта, полученного вышеописанным способом по методике комбинированной изомеризации-экстракции, со вторым экстрактом хмеля, обогащенным ксантогумолом. Таким образом можно получить экстракт хмеля, содержащий и ксантогумол, и 8-пренилнарингенин, в определенном весовом соотношении. Предпочтительно весовое отношение между ксантогумолом и 8-пренилнарингенином составляет по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 30, так как в этих пределах можно получить смесь, проявляющую надлежащее сочетание эстрогенной активности, обусловленной присутствием 8-пренилнарингенина, и химиопрофилактической активности против рака, обусловленной присутствием ксантогумола. При этом такое смешивание позволяет компенсировать любое уменьшение содержания ксантогумола в исходном продукте после по меньшей мере одной реакции изомеризации вследствие изомеризации ксантогумола в изоксантогумол. Путем смешивания экстракта, обогащенного 8-пренилнарингенином и полученного по методике комбинированной изомеризации-экстракции данного изобретения, с экстрактом, обогащенным ксантогумолом, настоящее изобретение позволяет получить экстракт хмеля с определенным весовым соотношением между 8-пренилнарингенином и ксантогумолом, независимо от степени превращения ксантогумола в изоксантогумол при реакции изомеризации.
Таким образом, по настоящему изобретению можно получить экстракт хмеля, содержащий по меньшей мере 0,15 мас.% 8-пренилнарингенина и по меньшей мере 3 мас.% ксантогумола, более предпочтительно по меньшей мере 0,33% 8-пренилнарингенина и по меньшей мере 10% ксантогумола.
Подходящий способ получения экстракта, обогащенного ксантогумолом, включает стадии по меньшей одной экстракции хмеля или хмель-продукта с помощью жидкого или сверхкритического CO2 либо по меньшей мере одного практически неполярного органического растворителя, а затем извлечение остатка, обогащенного ксантогумолом, и по меньшей мере еще одной экстракции остатка подходящими растворителями или их смесями с целью дополнительного концентрирования ксантогумола.
В качестве альтернативы экстракция жидким или сверхкритическим СО2 спиртового так называемого "чистого смоляного экстракта", смешанного с носителем (например, кизельгуром), приведет к получению остатка на носителе, обогащенного прениловыми флавоноидами. Затем этот остаток может быть подвергнут по меньшей мере одной экстракции подходящими растворителями или их смесями.
Повышение эстрогенной активности
В следующем предпочтительном воплощении способа получения экстракта хмеля по настоящему изобретению способ дополнительно включает стадии смешивания экстракта, полученного посредством по меньшей мере одной экстракции и реакции изомеризации, с некоторым количеством экстракта, обогащенного соединением, обладающим высокой эстрогенной активностью типа 8-алкилнарингенина, предпочтительно 8-изопентилнарингенином, представляющим собой гидрогенизированный 8-пренилнарингенин. Добавление 8-изопентилнарингенина объясняется тем, что изобретатели неожиданно обнаружили, что 8-изопентилнарингенин проявляет эстрогенную активность, и эта эстрогенная активность лишь в 3-4 раза меньше, чем эстрогенная активность 8-пренилнарингенина (см. фиг.4). Относительно 8-изопентилнарингенина следует отметить, что хотя его эстрогенная активность оказалась меньшей в 3-4 раза, чем у 8-пренилнарингенина, однако 8-изопентилнарингенин проявлял большую биодоступность и лучшую стабильность по сравнению с 8-пренилнарингенином, так как он менее подвержен метаболизму. По всей вероятности, это объясняется отсутствием двойной связи в боковой цепи.
Экстракт, обогащенный 8-изопентилнарингенином, может быть получен несколькими способами.
Первый возможный способ включает стадии:
а) подвергания экстракта хмеля, обогащенного ксантогумолом, реакции изомеризации для превращения ксантогумола в изоксантогумол;
b) подвергания экстракта, полученного на стадии (а), реакции каталитической гидрогенизации для превращения изоксантогумола в дигидроизоксантогумол. Каталитическая гидрогенизация предпочтительно проводится путем подачи Н2 в присутствии катализатора гидрогенизации типа Pt или Pd на носителе либо любого другого катализатора. Примером подходящего носителя является активированный уголь. Реакция гидрогенизации предпочтительно проводится в МеОН;
с) подвергания продукта реакции из стадии (b) реакции деметилирования. Это делается для превращения дигидроизоксантогумола в 8-изопентилнарингенин. Реакцию деметилирования, к примеру, можно проводить с помощью трибромида бора или любого другого реагента для деметилирования.
Итак, вышеописанным способом можно превратить не обладающий эстрогенной активностью ксантогумол в соединение, обладающее высокой эстрогенной активностью, а именно 8-изопентилнарингенин. Это является серьезным преимуществом, так как концентрация ксантогумола в хмеле (0,3-1,2 мас.%) значительно выше, чем концентрация десметилксантогумола (0,005-0,2 мас.%), предшественника 8-пренилнарингенина. Вышеописанным способом можно получить экстракт хмеля, обогащенный не только 8-PN, но и 8-изопентилнарингенином, в результате чего эстрогенная активность может значительно повыситься.
Второй возможный способ получения экстракта, содержащего 8-изопентилнарингенин, состоит в добавлении этого продукта, полученного путем синтеза. Несмотря на то, что замещение в положении 8 обычно протекает с низкой селективностью и выходом из-за большого числа стадий реакции, изобретатели разработали способ синтеза 8-изопентилнарингенин, включающий лишь ограниченное число стадий реакции и с высоким выходом.
В соответствии с этим способом, 2,4,6-триметоксибензальдегид (см. фиг.3) подвергается реакции алкилирования в присутствии металлоорганического реагента (например, изопентиллития) с последующим дезоксигенированием до 1-алкил-2,4,6-триметоксибензолов (например, 1-изопентил-2,4,6-триметоксибензола). Дезоксигенирование предпочтительно проводится в присутствии триэтилсилана в трифторуксусной кислоте. 1-алкил-2,4,6-триметоксибензол подвергается реакции ацетилирования с последующим деметилированием до образования 3-алкил-2,4,6-тригидроксиацетофенонов (например, 3-изопентил-2,4,6-тригидроксиацетофенона). Реакция ацетилирования предпочтительно проводится в присутствии ацетилхлорида и тетрахлорида. Деметилирование предпочтительно проводится в присутствии трибромида бора.
В ходе проведения этого синтеза предпочтительно следует блокировать две фенольные группы в виде метоксиметиловых эфиров (MOM). Третья фенольная группа, как оказалось, не поддается реакции из-за сильных внутримолекулярных водородных связей.
Полученный при этом продукт реакции деметилирования подвергается смешанной альдольной реакции с участием МОМ-блокированного бензальдегида с образованием хальконов, которые подвергаются внутримолекулярной циклизации по типу Михаэля в соответствующие флаваноны. При удалении защитных блокирующих групп в кислых условиях образуются 8-алкилнарингенины (например, 8-изопентилнарингенин).
Настоящее изобретение также касается экстракта хмеля как такового, который содержит смесь 8-пренилнарингенина и 6-пренилнарингенина, причем отношение (8-пренилнарингенин×100%)/(8-пренилнарингенин+6-пренилнарингенин) составляет по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 75%. При этом экстракт хмеля предпочтительно включает такое количество ксантогумола, что весовое соотношение между ксантогумолом и 8-пренилнарингенином составляет по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 20, более предпочтительно по меньшей мере 30. Предпочтительно экстракт хмеля содержит по меньшей мере 0,15 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 0,33% 8-пренилнарингенина, и по меньшей мере 3%, предпочтительно по меньшей мере 10 мас.% ксантогумола. Наиболее предпочтительно экстракт хмеля дополнительно содержит некоторое количество изоксантогумола, а также какое-то количество 8-алкилнарингенина, предпочтительно 8-изопентилнарингенина.
Показания
Экстракт хмеля по настоящему изобретению или экстракт хмеля, получаемый способами настоящего изобретения, может применяться для изготовления медикамента или фитофармацевтического препарата, обладающего комбинированной эстрогенной и химиопрофилактической активностью против рака, у которого возможная пролиферативная активность, вызванная присутствием фитоэстрогена 8-пренилнарингенина, уравновешивается антипролиферативной активностью ксантогумола. Кроме того, экстракт хмеля по настоящему изобретению или экстракт хмеля, получаемый способом настоящего изобретения, может применяться для медикамента или фитофармацевтического препарата для лечения или профилактики состояний или синдромов или жалоб или заболеваний, вызванных нарушением гормонального баланса эстрогенной природы.
Предпочтительно состояние или синдром, или жалоба, или заболевание, вызванное нарушением гормонального баланса эстрогенной природы, имеет отношение к менопаузе (включая предклимактерический период). При этом заболевание представляет собой остеопороз. В другом предпочтительном воплощении заболевание выбирают из группы, состоящей из зависимых от половых гормонов разновидностей рака, сердечно-сосудистых заболеваний, дисфункции простаты и рака толстой кишки.
Изобретение также касается пищевой композиции/добавки, включающей экстракт хмеля по настоящему изобретению или экстракт хмеля, получаемый способами настоящего изобретения.
Изобретение дополнительно касается косметической композиции, включающей экстракт хмеля по настоящему изобретению или экстракт хмеля, получаемый способами настоящего изобретения.
Экстракты хмеля, вытекающие из настоящего изобретения, могут быть заключены в различные лекарственные формы, в том числе таблетки, капсулы, гелеобразные пилюли, растворы и т.п., в то же время могут применяться обычные наполнители для наилучшего применения и биодоступности.
Дополнительные предпочтительные воплощения заявлены в зависимых пунктах формулы изобретения.
Примеры и чертежи
Далее изобретение иллюстрируется следующими примерами и чертежами.
Пример 1. Экстракция
Отработанный хмель, т.е. остаток после экстракции натурального хмеля жидким или сверхкритическим СO2, экстрагировали путем обработки при комнатной температуре 1 л смеси растворителей (90/10, об.) этилацетата и метанола с целью избирательного экстрагирования ксантогумола и десметилксантогумола из отработанного хмеля. Экстракт фильтровали и получали экстракт, обогащенный ксантогумолом и десметилксантогумолом (720 мл). После выпаривания растворителя при пониженном давлении остаток растворяли в 100 мл смеси гексан/метанол (1:1, об.) с целью экстрагирования липофильного балластного материала и переносили в делительную воронку. После добавления 30 мл подкисленной воды (1 N НСl) отбрасывали гексановый слой, содержащий липофильный балластный материал. Оставшийся метаноловый слой подвергали пониженному давлению для выпаривания растворителя. После добавления воды (70 мл) и этилацетата (100 мл) и разделения фаз высушивали органический слой, содержащий конечный экстракт хмеля.
Выход
| - конечный экстракт хмеля | 4,64 г (2,3%) |
| - десметилксантогумол | 2,41 мас.% |
| (по измерениям методом HPLC) | |
| - ксантогумол | 33,62 мас.% |
| (по измерениям методом HPLC) |
Пример 2. Изомеризация
0,5 г экстракта хмеля, полученного в примере 1, перемешивали в течение 1 ч в воде (40 мл), содержащей различные количества КОН (0 г, 0,2 г, 0,4 г и 2 г соответственно). После этого раствор подкисляли до рН=4-5 с помощью 6 N НСl. Получали экстракт путем экстрагирования этилацетатом и, после удаления растворителя, высушивали. Результаты количественного анализа методом HPLC представлены в Таблице 1. Следует отметить, что экстракт, полученный при перемешивании без добавления основания, содержит 8-пренилнарингенин и 6-пренилнарингенин в соотношении, очень близком к коммерчески доступным экстрактам хмеля, тогда как добавление основания в возрастающих количествах значительно повышало отношение (8-пренилнарингенин×100%)/(8-пренилнарингенин+6-пренилнарингенин) в пользу 8-пренилнарингенина.
| Таблица 1 | |
| Отношение (8-пренилнарингенин×100%)/(8-пренилнарингенин+6-пренилнарингенин) при различных щелочных условиях | |
| КОН (мас.%) | Отношение (%) |
| 0 | 22,4 |
| 0,5 | 34,7 |
| 1 | 58,6 |
| 5 | 74,8 |
Пример 3
Экстракт хмеля, содержащий 8-пренилнарингенин и 6-пренилнарингенин, подвергали реакции изомеризации в 5%-ном водном растворе КОН при комнатной температуре в течение 30 минут. Результаты количественного анализа методом HPLC представлены в Таблице 2. Как видно из Таблицы 2, отношение (8-пренилнарингенин×100%)/(8-пренилнарингенин+6-пренилнарингенин) повышалось с 23% в первоначальном экстракте до 73% после изомеризации в пользу 8-пренилнарингенина.
Сравнительный пример А
Повторяли реакцию изомеризации из примера 3 за исключением того, что вместо 5%-ного водного раствора КОН использовали 5%-ный спиртовый раствор КОН. Результаты количественного анализа методом HPLC, представленные в Таблице 2, свидетельствуют о том, что можно получить экстракт, у которого отношение (8-пренилнарингенин×100%)/(8-пренилнарингенин+6-пренилнарингенин) повышалось с 23% в первоначальном экстракте всего лишь до 43% в изомеризованном продукте.
| Таблица 2 | |||
| Состав экстракта хмеля до и после изомеризации в различных растворителях | |||
| Состав (в мас.%) | Экстракт до изомеризации | Экстракт после изомеризации в 5% КОН в этаноле | Экстракт после изомеризации в 5% КОН в воде |
| 8-пренилнарингенин (8-PN) | 0,17 | 0,31 | 0,52 |
| 6-пренилнарингенин (6-PN) | 0,58 | 0,41 | 0,19 |
| Отношение (8-PN×100%)/(8-PN+6-PN) | 23% | 43% | 73% |
| изоксантогумол | 0,60 | 2,37 | 14,29 |
| ксантогумол | 14,42 | 12,62 | 0,79 |
Возможные применения
На фиг.2 представлена стимуляция 8-пренилнарингенином роста раковых клеток молочной железы MCF-7 и ингибирование этой пролиферации в присутствии возрастающих концентраций ксантогумола.
Был разработан биологический метод для исследования пролиферации эстрогензависимых раковых клеток под действием 8-пренилнарингенина и для определения того, какие концентрации ксантогумола требуются для ингибирования этой вызванной 8-пренилнарингенином пролиферации. Для этого чувствительные к эстрогенам раковые клетки молочной железы MCF-7 культивировали на 96-луночных планшетах при фиксированной и стимулирующей рост концентрации 8-пренилнарингенина и различных концентрациях ксантогумола. При каждой концентрации 8-пренилнарингенина (1 нМ, 10 нМ и 100 нМ) концентрации ксантогумола составляли 0 мкМ, 0,1 мкМ, 1 мкМ, 5 мкМ, 10 мкМ и 25 мкМ соответственно.
Повышение эстрогенной активности
На фиг.4 представлены кривые доза-эффект для эстрогенной активности 17β-эстрадиола (Е2), 8-пренилнарингенина (8PN), 8-изопентилнарингенина (8PN-H2) и промежуточного соединения дигидроизоксантогумола (IsoX-H2) по измерениям на подверженном индукции эстрогенами штамме дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), экспресирующем эстрогеновый рецептор человека и содержащем экспрессионные плазмиды, несущие чувствительные к эстрогенам последовательности, контролирующие репортерный ген Lac-Z (Milligan et al., 2001). Дрожжевые клетки культивировали в среде, содержащей возрастающие концентрации 17β-эстрадиола (положительный контроль), 8-пренилнарингенина (8PN), 8-изопентилнарингенина (8PN-H2) или дигидроизоксантогумола (IsoX-H2). Экспрессию репортерного гена Lac-Z измеряли и количественно выражали спектрофотометрическим методом.
1. Способ получения экстракта хмеля, обогащенного 8-пренилнарингенином относительно 6-пренилнарингенина, отличающийся тем, что он включает стадии подвергания хмеля или хмель-продукта (1) реакции изомеризации в присутствии воды как растворителя и в щелочной среде и (2) по меньшей мере одной экстракции, проводимой по меньшей мере одним органическим растворителем, выбранным из группы спиртов, водосодержащих спиртов, кетонов, водосодержащих кетонов или эфиров, либо их смесей или подщелоченной водой, и в котором реакцию изомеризации и по меньшей мере одну экстракцию продолжают до тех пор, пока не будет получен экстракт, содержащий 8-пренилнарингенин и 6-пренилнарингенин, у которого отношение (8-пренилнарингенин×100%)/(8-пренилнарингенин+6-пренилнарингенин) составляет по меньшей мере 50%.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакция изомеризации проводится в воде в качестве растворителя.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что реакция изомеризации проводится в щелочной среде, соответствующей концентрации КОН (мас./об.%) по меньшей мере 0,1, предпочтительно по меньшей мере 0,5, более предпочтительно 1, наиболее предпочтительно по меньшей мере 5.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед тем, как подвергнуть хмель или хмель-продукт по меньшей мере одной экстракции и реакции изомеризации, хмель или хмель-продукт подвергают экстракции в присутствии жидкого или сверхкритического СО2 или по меньшей мере одного неполярного органического растворителя, после чего выделяют остаток, содержащий экстракт, обогащенный пренилированными флавоноидами.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает смешивание экстракта хмеля, полученного посредством по меньшей мере одной экстракции и реакции изомеризации, с экстрактом хмеля, обогащенным ксантогумолом.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что реакцию изомеризации и по меньшей мере одну экстракцию продолжают до тех пор, пока не будет получен экстракт, содержащий по меньшей мере 0,15 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 0,33 мас.% 8-пренилнарингенина и по меньшей мере 3 мас.%, предпочтительно по меньшей мере 10 мас.% ксантогумола.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что реакцию изомеризации и по меньшей мере одну экстракцию продолжают до тех пор, пока не будет получен экстракт, у которого соотношение ксантогумол/8-пренилнарингенин составляет по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 30.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию изомеризации и по меньшей мере одну экстракцию продолжают до тех пор, пока не будет получен экстракт, содержащий 6-пренилнарингенин и 8-пренилнарингенин, у которого отношение (8-пренилнарингенин×100%)/(8-пренилнарингенин+6-пренилнарингенин) составляет, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 75%.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве хмель-продукта применяется хмель-продукт, подвергнутый дополнительной стадии экстракции водой и/или по меньшей мере одним неполярным органическим растворителем, после чего выделяют остаток, содержащий экстракт, обогащенный пренилированными флавоноидами.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакция изомеризации проводится при температуре между температурой замерзания и температурой кипения реакционной смеси, предпочтительно при комнатной температуре.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что реакция изомеризации проводится при температуре между комнатной температурой и 60°C, предпочтительно примерно при комнатной температуре.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакция изомеризации проводится в инертной атмосфере.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакция изомеризации проводится в течение времени между 0,25 и 4 ч.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно включает стадию смешивания обогащенного экстракта хмеля, полученного посредством по меньшей мере одной экстракции и реакции изомеризации, с экстрактом хмеля, обогащенным 8-алкилнарингенином, предпочтительно 8-изопентилнарингенином.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что экстракт хмеля, обогащенный 8-изопентилнарингенином, получают способом, включающим стадии
(а) подвергания экстракт хмеля, обогащенного ксантогумолом, реакции изомеризации для превращения ксантогумола в изоксантогумол;
(b) подвергания экстракта, полученного на стадии (а), реакции каталитической гидрогенизации для превращения изоксантогумола в дигидроизоксантогумол;
(c) подвергания экстракта, полученного на стадии (b), реакции деметилирования для превращения дигидроизоксантогумола в 8-изопентилнарингенин.
16. Способ по п.14 или 15, отличающийся тем, что экстракт хмеля, обогащенный 8-алкилнарингенином, получают добавлением некоторого количества синтетического 8-алкилнарингенина, предпочтительно некоторого количества синтетического 8-изопентилнарингенина.
17. Экстракт хмеля, включающий смесь 8-пренилнарингенина и 6-пренилнарингенина, в котором отношение (8-пренилнарингенин×100%)/(8-пренилнарингенин+6-пренилнарингенин) составляет по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 75%.
18. Экстракт хмеля по п.17, отличающийся тем, что он включает смесь ксантогумола и 8-пренилнарингенина, в котором весовое отношение ксантогумола к 8-пренилнарингенину составляет по меньшей мере 10, предпочтительно по меньшей мере 20, более предпочтительно по меньшей мере 30.
19. Экстракт хмеля по п.17, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере 0,15% (мас./мас.), предпочтительно по меньшей мере 0,33% 8-пренилнарингенина и по меньшей мере 3%, предпочтительно по меньшей мере 10% (мас./мас.) ксантогумола.
20. Экстракт хмеля по любому из пп.17-19, отличающийся тем, что он дополнительно включает изоксантогумол.
21. Экстракт хмеля по любому из пп.17-19, отличающийся тем, что он дополнительно включает некоторое количество 8-алкилнарингенина, предпочтительно 8-изопентилнарингенина.
22. Применение экстракта хмеля по любому из пп.17-21 или экстракта хмеля, получаемого способом по любому из пп.1-16, для изготовления медикаментов или фармацевтического препарата, у которого возможная пролиферативная активность, вызванная эстрогенной активностью 8-пренилнарингенина, ингибируется или уравновешивается антипролиферативной активностью ксантогумола.
23. Применение экстракта хмеля по любому из пп.17-21 или экстракта хмеля, получаемого способом по любому из пп.1-16, для изготовления медикамента или фитофармацевтического препарата для лечения или профилактики одного из состояний, симптомов, жалоб или заболеваний, вызванных нарушением гормонального баланса эстрогенной природы.
24. Применение по п.23, в котором состояние, симптом, жалоба или заболевание, вызванное нарушением гормонального баланса эстрогенной природы, представляет собой менопаузу.
25. Применение экстракта хмеля по п.23, в котором заболевание выбрано из группы, состоящей из зависимых от половых гормонов разновидностей рака.
