Лизиний 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетат, проявляющий нейропротективное, ноотропное, кардиопротективное, эндотелиотропное, противоишемическое, антиоксидантное, противовоспалительное и противогипоксическое действие, обладающий низкой токсичностью
Владельцы патента RU 2370492:
Общество с ограниченной ответственностью "Научно-производственное объединение "Фарматрон" (НПО "Фарматрон") (UA)
Описывается новое биологически активное соединение - лизиний 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетат, являющийся основой для создания лекарственных препаратов с широким спектром биологической активности, для лечения заболеваний центральной нервной системы, в том числе острых нарушений мозгового кровообращения, а также сердечной недостаточности. 4 табл.
Изобретение относится к медицине и фармации, в частности к новым биологически активным соединениям, являющимся основой для создания лекарственных препаратов с широким спектром биологической активности, для лечения заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), в том числе острых нарушений мозгового кровообращения и других заболеваний.
Сосудистые и дегенеративные заболевания головного мозга сопровождаются ишемическим повреждением нервной ткани и ведут не только к тяжелым неврологическим расстройствам, таким как нарушение когнитивных, моторных, вербальных и других функций ЦНС, но и к ухудшению работы сердца, повреждению сосудистого эндотелия. Ежегодно в мире переносят инсульт около 6 млн. человек. Наблюдается увеличение частоты инсульта у лиц трудоспособного возраста. Согласно международным эпидемиологическим исследованиям в мире от инсульта ежегодно умирает 4,7 млн человек. В большинстве стран мира инсульт занимает 2-3 место в структуре общей смертности населения, а в Украине - 2 место, уступая лишь кардиоваскулярной патологии. Сосудистые и дегенеративные заболевания ЦНС занимают первое место, как причина стойкой утраты трудоспособности. При ишемическом поражении мозга, в результате снижения мозгового кровотока, происходит нарушение функций дыхательной цепи митохондрий и энергетического обмена, глутаматная «эксайтотоксичность», нарушение йонного гомеостаза клетки, с повышением внутриклеточного содержания йонов кальция, лактат-ацидозом; активацией внутриклеточных ферментов, с повышением синтеза NO; развитием оксидативного стресса; экспрессией генов; аноксической деполяризацией мембран и смертью клетки и острой сердечной недостаточности, что создает энергетический дефицит миокарда, развитие оксидативного стресса, активацию противовоспалительных цитокинов и формирование локального воспалительного очага. В комплексном лечении этой патологии применяют блокаторы кальциевых каналов, антиоксиданты, антигипоксанты, противовоспалительные средства и ноотропы.
Известно лекарственное средство пирацетам (Лекарственные препараты Украины. - К., 2000, т.2. - С.303-306). Пирацетам обладает ноотропным, нейропротективным, противоишемическим и противовоспалительным действиями. По результатам исследования пирацетама на модели мозгового инсульта установлено, что пирацетам способствует снижению повреждения мембран нейронов по снижению гиперферментемии нейроспецифического изоэнзима креатинфосфокиназы (ВВ-КФК), улучшению процессов памяти по сохранности УРПИ (условная реакция пассивного избегания), уменьшению смертности. Однако он не оказывает антиоксидантного действия и не эффективен в острый период заболевания. Известно лекарственное средство индометацин (Справочник Видаль, лекарственные препараты в России. - М.: «Астрафарм Сервис», 1995. - С.475-476). Индометацин является одним из наиболее эффективных нестероидных противовоспалительных средств и его применяют при лечении болезней ЦНС. Однако при заболеваниях нейродегенеративной природы он неэффективен. Кроме того, индометацин токсичен и вызывает головные боли, головокружение, диспепсию, сонливость, поражение слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и кровотечения. Известно применение изоптина в качестве блокатора кальциевых каналов и антиангинального средства (Машковский М.Д. Справочник лекарственных средств. - М.: Медицина, 2005. - С.427). Недостатком изоптина является узкий спектр биологической активности и отсутствие нейропротективного эффекта. Известно биологически активное соединение «Морфолиний 3-метил-1,2,4-триозолил-5-тиоацетат», проявляющий гепатозащитную, ранозаживляющую и противовоспалительную активность. Патент Украины №1988, кл. C07D 413/12, A61K 31/41. Лекарственные препараты с использованием этого соединения зарегистрированы Министерством здравоохранения Украины 31 мая 1994 г. (приказ №85, регистрационный №94/85), с названием «Тиотриазолин». По результатам клинических исследований установлено, что тиотриазолин, кроме указанных свойств, обладает антиоксидантной, кардиопротекторной, противоишемической, мембраностабилизирующей, иммуностабилизирующей, холатостимулирующей и другими формами активности. Однако тиотриазолин более предпочтителен в восстановительный период заболевания ЦНС, и он не обладает позитивным действием в отношении эндотелиоцитов мозговых сосудов. По химическому строению тиотриазолин принимаем в качестве структурного аналога. В основу изобретения поставлена задача создания нового биологически активного соединения, обеспечивающего при его использовании в лекарственных формах в качестве их активной основы максимальный эффект этих форм при лечении сосудистых и дегенеративных патологий ЦНС.
Решение поставленной задачи обеспечивает новое биологически активное соединение D,L-лизиний 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетат (М-1) следующей формулы:
проявляющее нейропротективное, ноотропное, кардиопротективное, эндотелиотропное, противоишемическое, антиоксидантное, противовоспалительное и противогипоксическое действия и обладающее низкой токсичностью.
Заявленное соединение отличается от структурного аналога тем, что вместо морфолина в нем используется лизин.
Фармакологический эффект от использования изобретения.
Заявленное соединение имеет более широкий спектр биологического действия в сравнении со структурным аналогом и исключает его недостаток, указанный выше.
В сравнении с референтными препаратами и структурным аналогом соединение и лекарственные формы на его основе нетоксичны. Назначение М-1 при остром нарушении мозгового кровообращения (ОНМК) приводит к уменьшению гибели нейронов и эндотелиоцитов капилляров коры головного мозга, улучшению энергообмена мозга, торможению свободнорадикального окисления (СРО), снижению маркеров повреждения нейронов, улучшению памяти.
При лечении инфаркта миокарда использование М-1 приводит к уменьшению зоны некроза миокарда, снижению маркеров повреждения кардиоцитов, улучшению показателей ЭКГ, уменьшению воспалительных процессов и снижению смертности в условиях гипоксии.
Применение М-1 по силе терапевтического эффекта превосходит эффективность референтных препаратов пирацетама, индометацина, изоптина и структурного аналога - тиотриазолина.
Сущность изобретения поясняется нижеприведенным описанием и примерами доклинических исследований на моделях ОНМК, острого инфаркта миокарда, воспаления и гипоксии. Результаты этих исследований приведены в таблицах.
Острую токсичность М-1 изучали при внутрибрюшинном введении крысам линии Вистар массой 140-160 г (Коваленко В.М., Стефанов А.В., Максимов Ю.М. Методичнi рекомендацiï по експериментальному вивченню токсичноi дiï потенцiйних лiкарських засобiв. - Киïв, 2000. - 26 с.), которое показало, что показатель токсичности соединения - ЛД50 составляет 2240 мг/кг.
Пример 1. Синтез лизиния 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетата (М-1).
К 88,2 г (0,50 М) 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетата прибавляют раствор 76,8 г (0,526 М) L-лизина или DL-лизина в 40 мл воды и 125 мл этанола. Реакционную смесь кипятят час, прибавляют 75-100 мл этанола, охлаждают. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают 20-30 мл холодного этанола и сушат. Выход 150,7-153,0 г (94,4-95,8%) целевого продукта. Белый кристаллический порошок с Т.пл. 202-206°С (из водного этанола), легко растворимый в воде, растворим в этаноле, не растворим в эфире и хлороформе.
Найдено, %: C 41,2; H 6,7; N 21,9; S 10,0.
C11H2lN5SO4
Вычислено, %: C 41,4; H 6,6; N 21,9; S 10,0.
ИК-спектр, см-1: 3429, 3130(√ NH); 1608(√ COO-); 1541 (√ C=N); 1393 (сим COO-).
Пример 2. Нейропротективная активность.
Нейропротективную, антиоксидантную, противоишемическую, ноотропную и эндотелитронную активность М-1 изучали (Стефанов А.В. Доклиническое изучение лекарственных средств. - Киев: Авицена, 2002. - 350 с.) на модели острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) у крыс линии Вистар массой 200-230 г (по 10 штук в каждой группе), которое вызывали двухсторонней перевязкой общих сонных артерий. О данных видах активности судили по снижению продукта свободнорадикального окисления (СРО) - малонового диальдегида (МДА) в головном мозге (по реакции с тиобарбитуровой кислотой); повышению макроэргического продукта - аденозинтрифосфата (АТФ) в головном мозге (хроматоспектрофотометрически); по повышению плотности нейронов и эндотелиоцитов (показатель выживаемости клеток) в коре головного мозга (изображение получали на микроскопе Axioskop (Zeiss, Germany) и с помощью 8-битной CCD-камеры COHU-4922 (COHU Inc., США) вводили в компьютерную систему анализа изображений VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Germany), морфометрический анализ клеток мозга и эндотелия осуществляли в автоматическом режиме с помощью макропрограммы, разработанной в специализированной среде программирования VIDAS-2,5 (Kontron Elektronik, Germany); no снижению активности церебрального изоинзима креатинфосфокиназы (ВВ-КФК) - маркера повреждения нейронов; по длительности УРПИ (условной реакции пассивного избегания). Препараты вводили внутрибрюшинно раз в сутки в течение всего срока наблюдения (4 суток) - М-1 50 мг/кг, пирацетам 500 мг/кг, тиотриазолин 50 мг/кг. Моделирование ОНМК у крыс приводило к активации СРО, о чем свидетельствовало повышение МДА; нарушению энергетического обмена, о чем свидетельствовало снижение АТФ; нарушению памяти, что выражалось в снижении латентного периода УРПИ; повышению гибели нейронов, о чем свидетельствовало снижение их плотности в коре мозга; повышению активности ВВ-КФК в плазме крови, повышению гибели эндотелиоцитов капилляров коры мозга, о чем свидетельствовало снижение их плотности. Как видно из табл.1, М-1 снижал образование МДА на 49% (препараты сравнения тиотриазолин и пирацетам на 39 и 29% соответственно), повышал латентное время УРПИ на 250% (тиотриазолин и пирацетам на 157 и 62%, соответственно) и увеличивал плотность нейронов и эндотелиоцитов на 26,7 и 38% соответственно (тиотриазолин на 11,5 и 14%, а пирацетам не оказывал действие), снижал активность ВВ-КФК на 55% (тиотриазолин и пирацетам на 46 и 26% соответственно). Таким образом, соединение М-1 по означенным видам активности превосходил базовый препарат терапии ОНМК - пирацетам и свой структурный аналог - тиотриазолин.
| Таблица 1 Влияние соединения М-1 и препаратов сравнения - тиотриазолина и пирацетама на показатели энергетического обмена, активности СРО, активности ВВ-КФК, выживаемости нейронов и эндотелиоцитов в мозге и крови и латентного периода УРПИ крыс с ОНМК |
||||||
| Группа крыс | АТФ, мкм/г | МДА, мкм/г | Плотность нейронов | Плотность эндотелиоцитов | ВВ-КФК, ммол/л/ч | УРПИ, с |
| Интактные (п=10) |
2,23±0,04 | 0,56±0,01 | 1352±43 | 1877±67 | 0,040±0,001 | 112,6 ±0,47 |
| ОНМК (п=10) | 1,0±0,02 | 1,37±0,06 | 1070±11 | 1078±32 | 0,130±0,001 | 21,4±0,72 |
| М-1 (п=10) | 1,82±0,02*1 (+82%) | 0,70±0,01*1 (-49%) | 1357±10*1 (+26,8%) | 1489±34*1 (+38%) | 0,05 8±0,001*1 (-55%) | 70,5±2,33*1 (250%) |
| Тиотриазолин (п=10) | 1,62±0,02* (+62%) | 0,83±0,01* (-39%) | 1193±21* (+11,5%) | 1233±33*1 (+14%) | 0,070±0,002* (-46%) | 54,3±1,17*1 (157%) |
| Пирацетам (п=10) | 1,47±0,02* (+47%) | 0,97±0,02* (-29%) | 1087±34 (+1,5%) | 1024±44 | 0,097±0,002* (-26%) | 34,3±1,00* (62%) |
| * - p<0,05 по отношению к контролю; 1 - p<0,05 по отношению к пирацетаму; + - p<0,05 по отношению к тиотриазолину. |
Пример 3. Кардиопротективная активность.
Кардиопротективную активность М-1 изучали на модели острого инфаркта миокарда у крыс. Инфаркт миокарда (ИМ), воспроизводимый с помощью питуитрина и изадрина (которые вводились по схеме: питуитрин - 0,5 Ед/кг - внутрибрюшинно, через 20 минут изадрин - 100 мг/кг - подкожно, спустя 6 часов инъекция изадрина повторялась, и через 24 часа вводились оба агента в тех же дозах). Данная модель воспроизводит распространенный мелкоочаговый инфаркт миокарда. На этой экспериментальной модели (по 10 животных в каждой группе) препараты вводились внутрибрюшинно: М-1 в дозе 50 мг/кг, тиотриазолин - 50 мг/кг, изоптин - 10 мг/кг. Оценка степени ишемического повреждения миокарда и кардиопротективного действия препаратов осуществлялась с использованием современных электрокардиографических биохимических и морфометрических методов исследования. В качестве биохимических критериев использовались - уровень активности кардиоспецифического изоинзима креатинфосфокиназы (МВ-КФК), выделяемых из сыворотки крови методом колоночной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе А-50, с последующим определением активности ферментов в элюате. В качестве электрокардиографического критерия эффективности противоишемического действия препарата использовался метод ЭКГ картирования, с расчетом показателей суммарной степени смещения сегмента ST относительно изолинии (ΣΔ ST). Этот принцип был использован в экспериментах на крысах после наложения 21 грудного электрода, с параллельной регистрацией ЭКГ в 3-х стандартных отведениях и расчетом показателя ΣΔ ST. Также проводилась морфометрия очагов ишемии, с расчетом суммарной площади поражения от общей площади срезов сердца, выраженной в процентах. Изображение миокарда получали на микроскопе Axioskop (Zeiss, Germany) и с помощью 8-битной CCD-камеры COHU-4922 (COHU Inc., США) вводили в компьютерную систему анализа изображений VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Germany). Морфометрический анализ кардиоцитов осуществляли в автоматическом режиме с помощью макропрограммы, разработанной в специализированной среде программирования VIDAS-2,5 (Kontron Elektronik, Germany).
| Таблица 2 Влияние М-1 и препаратов сравнения на площадь некроза, активность кардиоспецифического изоэнзина креатинфосфокиназы (МВ-КФК) и показателей суммарной степени смещения сегмента ST у крыс с ИМ |
|||
| Группа животных | Площадь некроза, % | МВ-КФК, ммол/л/ч | ΣΔ ST, мВ |
| Интактная | 0 | 0,05±0,001 | |
| Инфаркт (контроль) | 21,9±1,6 | 0,17±0,01 | 216±24 |
| Инфаркт + М-1 | 10,0±0,6*1 | 0,068±0,001*1 | 50±21 |
| (-54,5%) | (-60,0%) | (-77,7%) | |
| Инфаркт + тиотриазолин | 12,3±0,5* | 0,09±0,001* | 73±20* |
| (-42,0) | (-47,0%) | (-66,1%) | |
| Инфаркт + изонтин | 14,6±0,5* | 0,09±0,001* | 73±12* |
| (-33,6%) | (-47,0%) | (-66,1%) |
Как видно из данных, представленных в табл.2, препарат М-1, вводимый крысам в дозе 50 мг/кг параллельно формированию ИМ, оказывает выраженное кардиопротективное действие. Так, введение М-1 уменьшило: зону некроза миокарда на 54,5%, электрофизиологические проявления ишемии - суммарной степени смещения сегмента ST на 77,7% и активность маркерного фермента МВ-КФК на 60%. Оценивая фармакологические эффекты М-1 и препаратов сравнения на модели ИМ, можно сделать вывод о более высокой эффективности М-1, как кардиопротекторного средства по сравнению с тиотриазолином и изоптином.
Пример 4. Противовоспалительная активность.
Противовоспалительную активность М-1 определяли на модели формалинового отека лапки у крыс линии Вистар массой 220-250 г (по 6 в каждой группе). Животным М-1 и препарат сравнения (индометацин) вводили в дозе 50 мг/кг за 30 мин до введения формалина. Контрольная группа крыс оставалась без лечения. О наличии противовоспалительного эффекта судили по снижению отека лапки крысы, который измеряли в мл.
| Таблица 3 Противовоспалительная активность индометацина и М-1 при формалиновом отеке |
|||
| Группа животных | Объем отека (мл) через 3 ч | Объем отека (мл) через 6 ч | Объем отека (мл) через 12 ч |
| Контроль | 0,60±0,01 | 0,54±0,02 | 0,110±0,02 |
| М-1 (50 мг/кг) | 0,44±0,02* | 0,37±0,01* | 0,12±0,01* |
| (-26,7%) | (-32%) | (-37%) | |
| Индометацин (50 мг/кг) | 0,49±0,01 | 0,40±0,02 | 0,14±0,02* |
| (-16,7%) | (-26%) | (-26%) | |
| Примечание: * - p<0,05 по отношению к контролю. |
Как видно из представленных данных в табл.3, соединение М-1 проявляет достоверный противовоспалительный эффект, уменьшая выраженность отека лапки крыс, вызванного формалином. Необходимо отметить, что достоверный фармакологический эффект при назначении М-1 регистрируется на 3 часу эксперимента и на 10% превосходит противовоспалительное действие индометацина. Подобное действие М-1, превосходящее по эффективости индометацин, сохраняется на протяжении 12 часов наблюдения.
Пример 5. Противогипоксическая активность.
Противогипоксическую активность М-1 изучали на модели гипоксии замкнутого пространства, в герметической камере объемом 500 см3, по времени жизни крыс. Соединение М-1 вводили за 30 мин до эксперимента в дозах 25,0; 50,0; 100,0; 250,0 мг/кг внутрибрюшинно. Эталонный препарат сравнения - пирацетам в дозе 500 мг/кг внутрибрюшинно, а тиотриазолин в дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно за 30 мин до эксперимента.
| Таблица 4 Противогипоксическая активность М-1 и препаратов сравнения в условиях гипоксии замкнутого пространства |
||
| Группа животных | Количество животных | Время жизни, мин |
| Контроль | 6 | 7,23±0,68 |
| М-1 (25 мг/кг) | 6 | 12,34±1,22*1 (+78%) |
| М-1 (50 мг/кг) | 6 | 18,33±2,07*1 (+150%) |
| М-1 (100 мг/кг) | 6 | 15,43±2,11* (+114%) |
| M-1 (250 мг/кг) | 6 | 11,33±1,44 (+57%) |
| Пирацетам (500 мг/кг) | 6 | 10,22±1,87* (+41,6%) |
| Тиотриазолин (50 мг/кг) | 6 | 12,88±2,12*l (+78%) |
| Примечание: * - p<0,05 по отношению к контролю; 1 - p<0,05 по отношению к препарату сравнения. |
В результате проведенных исследований противогипоксического действия соединения M-1 было установлено, что данное соединение обладает выраженной дозозависимой противогипоксической активностью, в условиях гипоксии замкнутого пространства. Наиболее выраженное противогипоксическое действие M-1 наблюдалось при введении его в дозе 50 мг/кг (увеличивал время жизни на 150%). Пирацетам и тиотриазолин оказывали менее выраженное действие (повышали этот показатель на 41 и 78% соответственно).
Таким образом, представленные в описании результаты исследования являются экспериментальным обоснованием для создания на основе соединения M-1 (лизиний 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетат) нового малотоксичного лекарственного средства нейропротективного, ноотропного, кардипротективного, эндотелиотропного, противоишемического, антиоксидантного, противовоспалительного и противогипоксического действия в виде таблеток, капсул, инъекционного раствора и сиропа.
Лизиний 3-метил-1,2,4-триазолил-5-тиоацетат формулы,
проявляющий нейропротективное, кардиопротективное, эндотелиотропное, противоишемическое, антиоксидантное, противовоспалительное, противогипоксическое и ноотропное действия, обладающий низкой токсичностью.
