Способ определения биотоксичности питьевой минеральной воды

Изобретение относится к санитарной микробиологии и может быть использовано при оценке качества (интегральной биотоксичности) питьевых минеральных вод с использованием жизнеспособных люминесцирующих (спонтанно светящихся) бактерий. Способ предусматривает отбор проб с последующей ее дегазацией. После чего, в случае внесения в исследуемую и контрольные пробы морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum В-17677f, определяют уровень минерализации исследуемой пробы и вносят в нее NaCl до конечного значения общей минерализации 30 г/л. Подготавливают контрольные пробы. Далее в исследуемые и контрольные пробы вносят 0,01 н. раствор НСl до достижения рН 7,5. Затем в исследуемые и контрольные пробы вносят морские люминесцирующие бактерии Photobacterium phosphoreum В-17677f или рекомбинантные люминесцирующие бактерии Esherichia coli К 12 TG1 с генами люминесцентной системы Photobacterium leognathi. После чего измеряют уровень люминесценции, рассчитывают индекс токсичности по формуле Т=((I_k-I₀)/I_k)*100%, где I_k - интенсивность свечения в контроле, I₀ - интенсивность свечения в опыте. При этом при величинах Т<20% воду оценивают как нетоксичную, при Т от 20 до 50% - как токсичную и при Т>50% - как сильно токсичную. Изобретение позволяет повысить точность способа. 2 н.п. ф-лы, 2 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области токсикологии и санитарно-гигиенических измерительных технологий, а именно к способам измерения и испытания с использованием жизнеспособных микроорганизмов.

В частности, изобретение предназначено для определения острой интегральной токсичности (биотоксичности) питьевых минеральных бутилированных вод с использованием люминесцирующих (светящихся) бактерий.

Задача тестирования биотоксичности подобных вод определяется необходимостью оценки уровня их биологической опасности, определяющей возможность использования человеком для питьевых целей в качестве столовых, лечебно-столовых или лечебных вод. В этой связи определение биотоксичности минеральных вод внесено в перечень исследований, предусмотренных для оценки качества бутилированных, в т.ч. минеральных, вод [1].

Таким образом, заявляемый способ предназначен для использования в лабораториях центров гигиены, санитарии и эпидемиологии и специальных служб федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих ведомственный санитарно-эпидемиологический надзор, а также в производственных лабораториях, осуществляющих внутренний контроль качества питьевых минеральных вод.

Уровень техники

Среди разнообразных методов анализа токсичности питьевой воды, направленных на выявление ее опасности для здоровья человека, все большее место занимает биотестирование, основанное на исследовании влияния воды на живые организмы [2]. В отличие от методов химического анализа, ориентированных на количественное обнаружение в воде отдельных химических токсикантов с последующим сравнением выявленных концентраций с нормативными значениями - предельно допустимыми концентрациями (ПДК), методы биотестирования не позволяют судить о химической природе загрязнения воды, но дают возможность сформировать интегральное представление о суммарной токсичности всей присутствующей в ней совокупности химических веществ и соединений, наиболее часто характеризуемой величинами 20% или 50% летальности (LD20, LD50) или подавления какой-либо из сторон жизнедеятельности (ЕС20, ЕС50) используемых организмов. При этом важными преимуществами биотестирования являются возможность интегральной оценки токсичности всей совокупности присутствующих химических веществ и соединений, в том числе и тех, для которых методы количественного выявления и значения ПДК не разработаны.

В качестве объектов для проведения биотестирования воды наибольшее распространение получили мелкие ракообразные - дафнии [3, 4], простейшие - парамеции, а также бактерии [5, 6]. В свою очередь простота организации, высокая скорость обмена веществ и энергии, а также некоторые другие физиологические особенности делают наиболее удобным и распространенным инструментом для проведения биотестирования именно бактерии.

Среди бактерий одним из наиболее востребованных вариантов являются люминесцирующие (спонтанно светящиеся) бактерии, что объясняется следующими основными моментами: 1) ферментная система генерации свечения таких бактерий тесно интегрирована с основными энергетическими потоками бактериальной клетки, в связи с чем она быстро и чувствительно изменяет свою активность при появлении в среде химических поллютантов [7], 2) интенсивность свечения может с высокой точностью количественно оцениваться в режиме реального времени, что позволяет быстро и качественно определять показатели биотоксичности большого количества анализируемых проб.

Одной из первых тест-систем для биолюминесцентного биотестирования токсичности воды, базирующихся на этих принципах, является "Microtox", производимый компанией AZUR Environmental (США) и включающий в свой состав лиофилизированные морские бактерии вида Photobacterium phosphoreum NRRL В-111 77 (Vibrio fischeri NRRL B-11177) [8]. В России аналогичная тест-система выпускается Институтом биофизики СО РАН под названием "Микробиосенсор B-17677f'' [9]. Процедура биотестирования с их использованием предусматривает внесение в анализируемую пробу воды NaCl до конечной концентрации 3%, а также создание контрольной пробы на основе очищенной (дистиллированной) воды с аналогичным содержанием NaCl. При этом необходимость внесения данной соли определяется экологическими особенностями микроорганизма Photobacterium phosphoreum, в природе обитающего в морской воде. На следующем этапе в опытную и контрольную пробу вносят одинаковые количества регидратированного из лиофилизированного состояния биосенсора, перемешивают и после 30-минутной (в экспрессном варианте 5-минутной) инкубации при 22-24°C измеряют интенсивность свечения в опытной (I_о) и контрольной (I_k) кюветах на одном из доступных биолюминометров. По результатам измерения рассчитывают коэффициенты токсичности анализируемой пробы (7), в процентах, по формуле Т=((I_k-I_o) / I_k) * 100%, где I_k - интенсивность свечения в контрольной кювете, I_о - интенсивность свечения в опытной кювете. При величинах Т<20% воду оценивают как нетоксичную, при Т от 20 до 50% - как токсичную и при Т>50% - как сильно токсичную.

Другим инструментом для исследования биотоксичности могут являться рекомбинантные люминесцирующие микроорганизмы, в частности рекомбинантный штамм Escherichia coli К 12 TG1 с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi, разработанный в МГУ им. М.В.Ломоносова под коммерческим названием "Эколюм-9" [10]. При этом процедура проведения биотестирования не имеет существенных отличий от описанных выше за исключением того, что не предусматривает внесения в анализируемые образцы дополнительных количеств NaCl с соответствующим использованием в качестве контроля дистиллированной воды [11].

По совокупности данных признаков описанные выше способы должны быть признаны наиболее близкими к заявляемому. Однако они предназначены для определения химической токсичности пресных питьевых, поверхностных, грунтовых, сточных и очищенных сточных вод, а также атмосферных осадков, в то время как попытки включения в данный спектр питьевых минеральных (непресных) вод наталкиваются на существенные препятствия. При этом основной причиной, препятствующей получению требуемого результата при использовании известных способов, является выраженное влияние на бактериальную биолюминесценцию не только токсических, но и нормальных компонентов минеральных вод - растворенных газов, катионов [12, 13] и анионов [14], способных имитировать эффекты химических токсикантов и тем самым искажать результаты биотестирования.

Альтернативные подходы, ведущие к устранению данного недостатка, в доступной нам литературе не описаны.

Таким образом, заявляемый способ не известен из уровня техники, т.е. является новым.

Сущность изобретения

Основной задачей, на решение которой направлен заявляемый способ, является исключение влияния нормального компонентного (газового и солевого) состава минеральных вод на результаты их биолюминесцентного биотестирования и определяемое этим повышение точности определения биотоксичности.

Сущностью заявляемого способа, сформулированной на уровне функционального обобщения и лежащей в его основе, являются следующие положения:

- Основными факторами, присутствующими в составе минеральных вод и способными оказать на уровень свечения бактериальных люминесцирующих биосенсоров влияние, искажающее результаты исследования биотоксичности, являются присутствие растворенных газов, минеральных солей и определяемые некоторыми из них высокие (щелочные) значения рН.

- Для устранения нежелательного эффекта названных факторов на результаты биотестирования предлагается проведение предварительной пробоподготовки исследуемой воды путем ее дегазации и внесения NaCl и НСl в количествах, зависящих от исходно определенных в ней значений общей минерализации и рН.

- Использование предложенной пробоподготоеки должно быть адекватно экологическим особенностям бактериальных люмипесцирующих биосенсоров: морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum B-17677f или рекомбинантной люминесцирующей бактерии Escherichia coli K12 TG1 с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi.

Соответственно, при реализации заявляемого способа определения биотоксичности питьевых минеральных вод с использованием люминесцирующих бактерий характеристика действий, порядок их выполнения и условия осуществления в сравнении со способом-прототипом представляются следующим образом (таблица 1).

После отбора пробы минеральной воды на первом этапе определения ее биотоксичности проводят три последовательных действия: дегазацию, дифференцированную минерализацию и нормализацию рН, что в совокупности исключает влияние нормального компонентного состава исследуемой воды на результат ее последующего анализа с использованием люминесцирующих бактериальных биосенсоров.

При этом по п.1 формулы изобретения в случае использования морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum B-17677f осуществляется: 1) дегазация исследуемой воды путем ее центрифугирования при 6000 об/мин в течение 5 мин или отстаивания в плоскодонных сосудах в течение 3-4 ч при интенсивном перемешивании 300 об/мин на шейкере; 2) определение уровня общей минерализации с последующим внесением в исследуемую пробу навески соли NaCl в количествах, так чтобы итоговая суммарная минерализация после сложения величин исходного содержания солей и внесенных количеств NaCl равнялась 30 г/л; 3) внесение 0.01 н. раствора НСl до достижения конечного значения рН 7.5.

В свою очередь по п.2 формулы изобретения в случае использования рекомбннантной люмннесцирующей бактерии Escherichia coli K12 TG1 с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi осуществляется: 1) дегазация исследуемой воды путем ее центрифугирования при 6000 об/мин в течение 5 мин или отстаивания в плоскодонных сосудах в течение 3-4 ч при интенсивном перемешивании 300 об/мин на шейкере; 2) внесение 0.01 н. раствора НСl до достижения конечного значения рН 7.5.

Содержание этапа принципиально отличается от известного способа биотестирования, не предусматривающего какой-либо пробоподготовки исследуемых вод по параметрам содержания в них растворенных газов и установлению нормативного уровня рН, а также тем, что при реализации известного способа предусматривается внесение во все анализируемые пробы идентичных количеств NaCl безотносительно к исходной минерализации исследуемых вод. В результате предложенной пробоподготовки создаются условия для выявления присутствия в пробах истинных химических поллютантов, эффект которых при реализации известного способа может быть замаскирован или имитирован действием нормальных компонентов минеральных вод.

Таблица 1 Сравнительная характеристика действий, порядка их выполнения и условий осуществления при определении биотоксичности минеральной воды с использованием известного и заявляемого способов
Сравниваемые характеристики	Известный способ	Заявляемый способ
I этап - пробоподготовка исследуемых минеральных вод с целью устранения факторов, способных оказать негативное влияние на результаты биотестирования	-	+
	Дегазация	нет	Центрифугирование при 6000 об/мин в течение 5 мин или отстаивание в плоскодонных сосудах в течение 3-4 ч при интенсивном перемешивании 300 об/мин на шейкере
	Внесение дополнительных количеств NaCl (в случае использования морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum B-17677f)	В концентрации 30 г/л	Дифференцированное внесение в количествах, зависящих от предварительного значения общей минерализации, так чтобы конечная концентрация солей, равная 30 г/л, складывалась из их исходного присутствия и экзогенно вносимого NaCl
Приведение значения рН к единому нормативному значению	нет	Внесение 0.01 н. раствора НСl до итогового значения рН 7.5 ед.
II этап - формирование токсического эффекта присутствующих в пробе поллютантов в отношении бактериального биосенсора	+	+
	Используемый люминесцирующий микроорганизм	Photobacterium phosphoreum B-17677f или Escherichia coli K12 TG1 с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi	То же
	Время инкубирования	5-30 мин	То же
Температура инкубирования	22-24°С	То же
III этап - регистрация результата реакции, расчет и оценка уровня биотоксичности исследуемой пробы	+	+
	Метод регистрации	Биолюминометрия	То же
	Формула расчета	T=((Ik-Io)/Ik)*100%	То же
Критерии биотоксичности	Т<20% - вода нетоксичная; Т=20-50% - вода токсичная; Т>50% - вода сильно токсичная	То же

На втором этапе определения биотоксичности минеральных вод формируют серии из трех опытных и трех контрольных проб в объеме 900-950 мкл, последние из которых представляют собой 3% раствор NaCl в дистиллированной воде (в случае проведения биотестирования с использованием морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum В-17677f) или саму дистиллированную воду (в случае проведения биотестирования с использованием рекомбинантной люминесцирующей бактерии Escherichia coli K12 TG1 с генами люминесцентной системы Photoobacterium leiognathi). В данные пробы вносят идентичные количества (по 50-100 мкл) одного из названных бактериальных люминесцирующих биосенсоров. Образцы выдерживают в течение 30 минут (в экспрессном варианте - 5 мин) при 22-24°С.

Содержание этапа - формирование токсического эффекта присутствующих в пробе поллютантов в отношении бактериального биосенсора, проявляющегося в снижении уровня его биолюминесценции - принципиально не отличается от такового в известном способе.

На третьем этапе кюветы помещают в измерительную ячейку люминометра и замеряют уровень свечения бактериальной суспензии в видимой сине-зеленой области спектра 420-600 нм. В качестве измерительного прибора при реализации заявляемого способа могут использоваться БЛМ 8802 М (СКТБ «Наука», Красноярск), «Биотокс-10» (ООО «Нера», Москва»), а также прочие отечественные и зарубежные люминометры, работающие в обозначенной области спектра и обеспечивающие соответствующую дискретность измерений. По результатам измерения вычисляют средние значения интенсивности свечения в опытных (I_о) и контрольных (I_k) пробах, после чего рассчитывают относительный коэффициент токсичности (Т) анализируемой пробы по формуле Т=((I_k-I_o) / I_k)* 100%. При величинах Т<20% воду оценивают как нетоксичную, при Т от 20 до 50% - как токсичную и при Т>50% - как сильно токсичную.

Содержание этапа - регистрация результата реакции и расчет уровня биотоксичности исследуемой пробы - также не имеет существенных отличий от такового в известном способе.

Возможность получения технического результата при выполнении перечисленных действий в указанных интервалах значений определяется следующим комплексом причинно-следственных связей:

1) Испытание 22 питьевых минеральных бутилированных вод, представленных мировыми (Aqua Minerale (США), Apollinaris (Германия), Bon Aqua (США), Evian (Франция), Donat (Словения), Perrier (Франция), San Pellegrino (Италия), Vichy Celestins (Франция) и российскими брендами (Архыз, Ессентуки-2, Ессентуки-4, Ессентуки-17, Нарзан и др.) с использованием способа-прототипа показало, что 100% из них характеризуются индексами токсичности Т>50% (таблица 2), что в соответствии с существующими нормативами заставляло оценивать их как сильно токсичные. Вместе с тем изучение данных вод на присутствие наиболее значимых химических поллютантов (в соответствии с СанПиН 2.1.4.1116-02) свидетельствовало об их полной безвредности для здоровья человека. Таким образом, полученные данные свидетельствовали о неприменимости способов-прототипов для заявленных целей, обусловленной эффектами нормальных компонентов исследуемых минеральных вод.

2) Выполнение процедуры дегазации исследуемых минеральных вод позволяло снизить определяемые значения их токсичности до величин Т<20% у 6-8 и до значений Т=20-50% у 10 из 22 исследуемых минеральных вод (таблица 2). Полученные результаты свидетельствуют о важности удаления из анализируемых вод СO₂, находящегося в растворенном состоянии в виде соединения Н₂СО₃ и способного оказать на используемые бактериальные люминесцирующие биосенсоры прямое бактерицидное действие, а также выступать в качестве конкурента молекулярного кислорода в ведущей к появлению свечения биохимической реакции.

3) Исследование причин подавления биолюминесценции используемых бактериальных биосенсоров дегазированными минеральными водами позволило констатировать развитие подобного эффекта преимущественно в группе среднеминерализованных (1-10 г/л) и сильноминерализованных (10-15 г/л) минеральных вод. При этом изучение эффекта основных катионов, присутствующих в данных водах в виде хлоридов и сульфатов, позволило сформировать ряды увеличения биотоксичности Са²⁺>Na⁺>Mg²⁺>K⁺. Соответственно, присутствие значительных названных катионов в составе исследуемых минеральных вод, особенно на фоне недифференцированного (независимого от исходного уровня общей минерализации) внесения дополнительных количеств NaCl может вести к подавлению биолюминесценции, имитирующему эффект химических поллютантов.

Устранение данного фактора возможно при проведении биотестирования с использованием морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum B-17677f, предусматривающего внесение в исследуемую пробу дополнительных количеств NaCl из расчета 30 г/л. При этом предварительное определение уровня исходной минерализации исследуемых вод и последующее дифференцированное внесение в анализируемые пробы NaCl в количествах, равных разнице между итоговым значением 30 г/л и определенным значением общей минерализации, позволило снизить определяемые значения токсичности до величин Т<20% у 15 из 22 исследуемых минеральных вод и до значений Т=20-50% у 7 из 22 исследуемых минеральных вод (таблица 2). Однако положительные эффекты от подобной процедуры формировались преимущественно в группе слабоминерализованных и среднеминерализованных вод, несущественно сказываясь на результатах биотестирования сильноминерализованных вод.

4) Окончательный анализ причин подавления биолюминесценции бактериальных биосенсоров сильноминерализованными водами после их дегазации и дифференцированного (зависящего от исходного уровня "минерализации) внесения дополнительных количеств NaCl позволил констатировать, что сохранение подобных эффектов определяется присутствием значительного количества растворенных солей в виде гидрокарбонатов (НСО₃ ^-), сдвигающих уровень рН анализируемых вод в зону высоких (щелочных) значений.

С целью устранения подобного препятствия была проведена нормализация значений рН исследуемых минеральных вод путем контролируемого добавления к ним 0.01 н. раствора НСl с пошаговым повышением регистрируемого значения рН на 0.5 ед.

Реализация подобного подхода, применимого как при использовании морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum В-17677f, так и рекомбинантной люминесцирующей бактерии Escherichia coli K12 TG1 с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi, позволила констатировать, что оптимальным значением рН, при достижении которого нивелируется отрицательное влияние данного фактора на уровень биолюминесценции бактериальных биосенсоров, является значение рН 7.5. При этом значения индексов токсичности Т<20% были достигнуты у 20 из 22 исследуемых вод (таблица 2). Проведение же полной процедуры пробоподготовки "дегазация → дифференцированная минерализация → нормализация рН", доступной при осуществлении биотестирования с использованием морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum B-17677f, как нетоксичные были оценены все 22 из 22 изученных минеральных вод, что приводило данные биолюминесцентного биотестирования в соответствие с результатами их химического анализа (в соответствии с СанПиН 2.1.4.1116-02).

5) Заявляемая последовательность действий "дегазация → дифференцированная минерализация → нормализация рН" определяется следующими соображениями. Во-первых, удаление растворенных газов, ведущим из которых является CO₂, позволяет перевести жидкости в обычное (невспененное) состояние, необходимое для осуществления всех следующих действий и измерений. Во-вторых, удаление СО₂, находящегося в растворенном состоянии в виде соединения Н₂СО₃, является необходимым условием для исследования рН, в определение значения которого данная слабая кислота может внести погрешность. В-третьих, внесение дополнительных количеств NaCl может следовать за дегазацией, но должно предшествовать нормализации рН, так как внесение даже нейтральных соединений может оказать на уровень данного параметра т.н. «солевой эффект», заключающийся в изменении степени диссоциации отдельных катионов и анионов.

6) Принципиально важно, что описанная выше пробоподготовка, имеющая своей целью исключение неспецифических ингибирующих эффектов нормального компонентного состава минеральных вод на люминесцирующие биосенсоры, одновременно не сказывается на чувствительности последних к воздействию истинных токсикантов.

В пользу данного утверждения свидетельствуют результаты тестирования образцов сильноминерализованной воды Ессентуки-17, в которые предварительно был внесен один из модельных токсикантов - органическое соединение бензол, являющееся одним из приоритетных загрязнителей водной среды, относящееся ко 2-му классу опасности и в этой связи наиболее часто используемое при оценке чувствительности различных методов биотестирования. В проведенной серии экспериментов конечные концентрации бензола в анализируемых пробах варьировали от 0.5 до 5 г/л. В последующем данные образцы были исследованы в соответствии со способом-прототипом и заявляемым способом на предмет соответствия определенным в контроле нормативным значениям биотоксичности ЕС₂₀ и EC₅₀ использованного токсиканта, соответствующим его концентрациям, обуславливающим 20% и 50% тушение бактериальной биолюминесценции.

Определенные для бензола параметры ЕС₂₀ и EC₅₀ составили соответственно 3.10±0.32 и 5.20±0.54 г/л, что примерно соответствовало значениям, ранее определенным для одного из используемых биосенсоров [11]. В то же время при проведении аналогичных исследований в минеральной воде Ессентуки-17 с использованием известного способа названные расчетные параметры оказывались значительно ниже, что объяснялось тушением люминесценции бактериальных биосенсоров не только как результата воздействия поллютанта, но и вследствие сонаправленного эффекта нормальных компонентов данной минеральной воды. В свою очередь проведение пробоподготовки в соответствии с заявляемым способом результировалось в повышении значений определяемых параметров, перестающих достоверно отличаться от нормативных величин.

В целом, резюмируя приведенные выше материалы о сущности заявляемого способа, характеристике действий, порядке их выполнения и условия осуществления, можно констатировать, что заявляемый способ не следует из уровня техники и по этому показателю должен быть оценен как соответствующий критерию «изобретательский уровень».

Таблица 2 Значения индексов токсичности при биотестировании минеральных вод с использованием морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum В-17677f и рекомбинантной люминесцирующей бактерии Escherichia coli K12 TG1 с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi в различных вариантах пробоподготовки
Исследованные минеральные воды	Значения индексов токсичности
	при использовании Р. phosphoreum В-17 677f"	при использовании Е. coli K.12 TG1 с генами люминесцентной системы Р. leiognathi
способ-прототип	после дегазации	после дегазации и нормирования минерализации	после дегазации и нормирования рН≤7.5	заявляемый способ по п.1 формулы изобретения	способ-прототип	после дегазации	заявляемый способ по п.2 формулы изобретения
Aqua minerale	67.1±0.29**	5.89±0.07	1.6±0.05	<0	<0	98.3±0.01**	<0	<0
Apollinaris	79.8±0.07**	29.4±0.06*	<0	17.8±0.06	<0	93.0±0.01**	83.5±0.03**	1.7±0.11
Bonaqua	66.1±0.30**	<0	0.8±0.04	18.1±0.30	<0	98.4±0.01**	<0	<0
Donat	72.9±0.15**	72.9±0.03**	31.0±0.04*	24.5±0.02*	13.4±0.07	87.0±0.01**	95.7±0.01**	14.8±0.12
Evian	73.1±0.03**	43.4±0.21*	<0	17.3±0.29	<0	64.3±0.03**	<0	<0
Perrier	75.1±0.07**	17.3±0.08	<0	5.2±0.06	<0	98.3±0.01**	38.3±0.11*	14.9±0.13
San Pellegrino	89.6±0.02**	<0	44.9±0.03*	<0	1.7±0.03	88.7±0.02**	22.6±0.05*	<0
Vichy Celestina	86.1±0.01**	33.3±0.01*	<0	18.1±0.01	<0	81.7±0.02**	71.3±0.09**	13.3±0.02
Архыз	93.6±0.02**	26.7±0.11*	2.0±0.03	18.2±0.01	5.6±0.02	91.3±0.02**	44.3±0.14*	15.4±0.03
Волжанка	79.8±0.01**	<0	25.3±0.01*	<0	0.8±0.02	86.1±0.02**	17.3±0.02	8.2±0.01
Ессентуки-2	83.5±0.14**	55.8±0.07**	17.9±0.02	<0	0.7±0.04	58.3±0.02**	61.3±0.48**	<0
Ессентуки-4	92.2±0.03**	62.5±0.06**	26.0±0.06*	17.5±0.01	11.1±0.02	68.7±0.01**	68.4±0.07**	<0
Ессентуки-17	83.5±0.07**	76.1±0.05**	35.6±0.08*	20.9±0.02*	11.6±0.01	74.8±0.01**	86.9±0.05**	13.3±0.10
Живая вода	76.1±0.21**	21.5±0.12*	19.8±0.11	18.2±0.11	18.6±0.01	96.5±0.01**	24.5±0.13*	8.1±0.13
Красноглинская	88.7±0.04**	<0	<0	<0	<0	80.9±0.01**	31.3±0.02*	31.3±0.06*
Мензелинская	85.2±0.07**	28.7±0.05*	<0	18.1±0.02	<0	86.2±0.02**	18.1±0.29	12.1±0.04
Нарзан	68.7±0.28**	24.3±0.07*	17.6±0.06	<0	<0	71.3±0.02**	18.2±0.16	<0
Рамено	60.9±0.36**	18.2±0.09	8.1±0.07	8.1±0.10	13.6±0.01	94.8±0.01**	24.2±0.14*	13.8±0.29
Святой источник	76.1±0.21**	20.2±0.07	19.1±0.08	0.8±0.03	<0	86.1±0.02**	25.5±0.19*	13.1±0.06
Славяновская	91.3±0.02**	24.4±0.17*	20.9±0.02*	1.2±0.01	1.9±0.02	80.8±0.03**	44.9±0.07*	25.5±0.02*
Сулак	66.1±0.20**	21.4±0.07*	17.3±0.07	0.9±0.08	1.7±0.01	78.9±0.04**	31.3±0.08*	<0
Яик	58.3±0.20**	31.7±0.11*	20.9±0.06*	0.9±0.02	1.5±0.01	73.9±0.02**	24.3±0.06*	1.7±0.01
Примечание ** - вода оценивается как сильно токсичная;
* - вода оценивается как токсичная, без обозначений - вода оценивается как нетоксичная

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Для определения биотоксичности питьевой минеральной воды методом биолюминесцентного биотестирования в стерильную стеклянную емкость отбирают пробу объемом 100-200 мл.

В дальнейшем последовательность выполнения действий при осуществлении заявляемого способа, их условия и режимы являются следующими:

1) для достижения дегазации исследуемую воду центрифугируют при 6000 об/мин в течение 5 мин или отстаивают в плоскодонных сосудах в течение 3 - 4 ч при интенсивном перемешивании 300 об/мин на шейкере;

2) при выполнении способа по п.1 формулы изобретения в части пробы объемом 100 мл определяют уровень общей минерализации (ОМ) путем ее выпаривания и взвешивания сухого остатка на весах, позволяющих оценить величину последнего с точностью до ±0.001 г;

3) при выполнении способа по п.1 формулы изобретения в оставшуюся часть пробы в объеме 100 мл вносят навеску соли NaCl категории х.ч. в количестве Х г из расчета Х=30 - ОМ и тщательно перемешивают до ее полного растворения, так чтобы итоговый уровень минерализации пробы равнялся 30 г/л;

4) измеряют значения рН в пробе с использованием рН-метра, позволяющего оценить значения данного показателя с точностью до 0.1 ед.;

5) в пробу по каплям вносят 0.01 н. раствор соляной кислоты НСl, динамически замеряя динамику сдвига рН; после достижения значения рН 7.5 ед. внесение кислоты прекращают;

6) формируют серии из трех опытных и трех контрольных проб: 3% раствора NaCl в химически чистой дистиллированной воде в объеме 950 мкл (в случае проведения исследований по п.1 формулы изобретения) или химически чистой дистиллированной воде в объеме 900 мкл (при проведении исследований по п.2 формулы изобретения);

7) при выполнении способа в соответствии с п.1 формулы изобретения флакон с охлажденной лиофилизированной культурой морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum B-17677f реактивируют путем добавления 2 мл 1.5% раствора NaCl. Полученную суспензию бактерий несколько раз встряхивают до однородного раствора, после чего выдерживают в течение 30 мин в холодильной установке при 2-4°С для стабилизации уровня свечения, доводят температуру суспензий бактерий до комнатной 22-24°С. При выполнении способа по п.2 формулы изобретения реактивацию лиофилизированного рекомбинантного штамма Escherichia coli К 12 TG1 с клонированными luxCDABE генами P.leiognathi проводят путем добавления 10 мл дистиллированной воды. Полученную суспензию бактерий несколько раз встряхивают до однородного раствора, после чего выдерживают в течение 30 мин в холодильной установке при 2-4°С для стабилизации уровня свечения, доводят температуру суспензий бактерий до комнатной 22-24°С;

8) в опытные и контрольные пробы вносят идентичные количества одной из названных люминесцирующих бактерий: в объеме 50 мкл при выполнении способа в соответствии с п.1 формулы изобретения и в объеме 100 мкл при выполнении способа в соответствии с п.2 формулы изобретения;

9) кюветы с опытными и контрольными пробами выдерживают в идентичных условиях в течение 30 минут (в экспрессном варианте - 5 мин) при 22-24°С;

10) кюветы последовательно помещают в измерительную ячейку биолюминометра и замеряют уровень свечения в видимой сине-зеленой области спектра при 420-600 нм в течение 30-60 сек, значения интенсивности свечения в трех опытных (I_о) и трех контрольных (I_k) пробах усредняют;

11) производят расчет биотоксичности Т исследуемой питьевой минеральной воды по формуле Т=((I_k-I_o) / I_k) * 100%;

12) при величинах Т<20% воду оценивают как нетоксичную, при Т от 20 до 50% - как токсичную и при Т>50% - как сильно токсичную.

Пример

Предприятие, выпускающее питьевые бутилированные воды, разработала новую минеральную воду "Уральские родники", разливаемую в потребительскую тару и предназначенную для использования в качестве лечебно-столовой воды. Данная вода соответствует требованиям технических условий и производится по действующей технологической инструкции с соблюдением "Санитарных правил для предприятий по обработке и розливу питьевых минеральных вод". По органолептическим, микробиологическим показателям, перманганатной окисляемости, содержанию токсичных элементов и радионуклеотидов лечебно-столовая вода "Уральские родники" соответствует требованиям ГОСТ 13273-88 и СанПиН 2.3.560 "Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов".

Для исследования лечебно-столовой воды "Уральские родники" методом биолюминесцентного анализа по известному способу было отобрано несколько бутылей минеральной воды из разных партий. Исследования проводили по существующим методикам с использованием морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum B-17677f (производится ИБСО РАН под коммерческим названием "Микробиосенсор B-17677F') и рекомбинантнои люмитесцирующей бактерии Escherichia coli K12 TG1 с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi (производится МГУ им. М.В.Ломоносова под коммерческим названием "Эколюм-9"). При выполнении данного исследования брали 950 мкл минеральной воды, предварительно засоленной из расчета 300 мг NaCl на 10 мл минеральной воды (при использовании "Микробиосенсор В-17677f) или 900 мкл минеральной воды (при использовании "Эколюм-9") и вносили в измерительные кюветы, туда же добавляли 50 или 100 мкл суспензии люминесцирующих бактерий "Микробиосенсор В-17677f и "Эколюм-9" соответственно. В контрольные измерительные кюветы помещали 950 мкл 3% раствора NaCl при использовании "Микробиосенсора В-17677f или 900 мкл дистиллированной воды при использовании "Эколюм-9" и 50 или 100 мкл суспензии тех же люминесцирующих бактерий. После 30-минутной инкубации при 22-24°С кюветы с образцами помещали в прибор регистрирующий биологическое свечение биолюминометр БЛМ 8802 (СКТБ "Наука", Красноярск) и замеряли уровень люминесценции в контроле и опыте. Индекс токсичности (Т) рассчитывался по формуле Т=((I_k-I_o) / I_k) * 100%, где I_k - интенсивность свечения в контрольной кювете, I_о - интенсивность свечения в опытной кювете.

Результаты, полученные с использованием известного способа, свидетельствовали о том, что данная минеральная вода характеризуется индексами токсичности, равными 89% и 92% (Т>50%), что в соответствии с существующими нормативами заставляло оценивать ее как сильно токсичную. Вместе с тем изучение данной воды на присутствие наиболее значимых химических поллютантов свидетельствовало об их отсутствии или присутствии в количествах значительно ниже установленных ПДК. Таким образом, при проведении исследований по известному способу был получен ошибочный результат, противоречащий результатам других исследований.

При определении биотоксичности исследуемой минеральной воды в соответствии с заявляемым способом была проведена ее предварительная трехэтапная пробоподготовка. Исследуемую воду разливали в пробирки по 10 мл, центрифугировали при 6000 об/мин в течение 5 мин или путем отстаивания в плоскодонных сосудах в течение 3-4 ч при интенсивном перемешивании 300 об/мин на шейкере, после чего дегазированные образцы объединяли. При исследовании биотоксичности с использованием "Микробиосенсора В-17677f 100 мл объединенной дегазированной пробы выпаривали, после чего определяли вес сухого остатка, оказавшийся равным 732 мг (т.е. общая минерализация исследуемой воды равнялась 7.32 г/л). На основании данных расчетов в другие 100 мл, отобранные из объединенной дегазированной пробы, внесли 2268 мг соли NaCl, так что установленный таким образом итоговый уровень минерализации равнялся 30 г/л. Далее в данной дегазированной и дифференцирование засоленной (при использовании "Микробиосенсора B-17677f"), а также только дегазированной (при использовании "Эколюм-9") пробах измерили значения рН с использованием анализатора жидкости Эксперт-001 (ООО "Эконикс-эксперт", Москва), оказавшиеся равными 8.7 ед. и 8.8 ед. После этого в обе пробы по каплям внесли 0.01 н. раствор соляной кислоты НСl, динамически замеряя динамику сдвига рН до достижения значения рН 7.5 ед. В дальнейшем подготовленные подобным образом пробы вносили в измерительные кюветы в объемах 950 мкл (дегазированная, дифференцированно засоленная и нормализованная по рН вода) или 900 мкл (дегазированная и нормализованная по рН вода), после чего туда же добавляли 50 или 100 мкл суспензии люминесцирующих бактерий "Микробиосенсор В-17677f" и "Эколюм-9" соответственно. В контрольные измерительные кюветы было помещено 950 мкл 3% раствора NaCl при использовании "Микробиосенсора B-17677f или 900 мкл дистиллированной воды при использовании "Эколюм-9" и 50 или 100 мкл суспензии тех же люминесцирующих бактерий. После 30-минутной инкубации при 22-24°С кюветы с образцами помещали в прибор, регистрирующий биологическое свечение, - биолюминометр БЛМ 8802 (СКТБ «Наука», Красноярск), замеряли уровень люминесценции в контроле и опыте, после чего проводили расчет индекса токсичности (7) по приведенной выше формуле.

Заявляемая последовательность действий "дегазация → дифференцированная минерализация → нормализация рН" (в случае использования "Микробиосенсора В-17677f") и "дегазация → нормализация рН" (в случае использования "Эколюм-9") позволила исключить действие неспецифических ингибирующих эффектов нормального компонентного состава минеральной воды на люминесцирующие биосенсоры, что результировалось в снижении определенных величин токсичности до 7,6% и 9,2% (Т<20), свидетельствующих о ее нетоксичности и согласующихся с прочими данными исследований по СанПиН 2.3.560.

Источники информации

1. Методическое указание по внедрению и применению санитарно-эпидемиологических правил и нормативов СанПиН 2.1.4.1116-02 Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды, расфасованной в емкости. Контроль качества. МУ 2.1.4.1184-03. М.: Федеральный центр госсанэпидемнадзора Минздрава России, 2003. 65 с.

2. Рожнов Г.И., В.А.Пройнова, Х.П.Тирас., Моисеева M.B., Иванов Н.Г. Перспективы использования биотестирования в качестве альтернативных методов оценки токсичности. // 1-й съезд токсикологов России. Тезисы докладов 17-20 ноября 1998. Москва. 313 с.

3. Патент RU №2279072. Способ экологической оценки острой токсичности воды. Опубл. 27.06.2006.

4. Патент RU №2283489. Способ экологической оценки хронической токсичности воды. Опубл. 10.09.2006.

5. Патент RU №2281495. Способ определения биологической активности (токсичности) компонентов твердых материалов и ее воздействия на особи живых организмов. Опубл. 10.08.2006.

6. Патент RU №2281496. Способ определения биологической активности (токсичности) компонентов газовых сред и ее воздействия на особи живых организмов. Опубл. 10.08.2006.

7. Strachan G., Preston S., Maciel H et al. Use of bacterial biosensors to interpret the toxicity and mixture toxicity of herbicides in freshwater. // Wat. Res. 2001. Vol.35. №14. P.3490-3495.

8. Ribo M.I., Kaiser K.Z. Photobacterium phosphoreum toxicity bioassay. // Toxicity Assement and Interatioval Guarterty. 1987. №2. -P.305-323.

9. Кратасюк В.А., Гительзон И.И. Использование светящихся бактерий в биолюминесцентном анализе. //Успехи микробиологии. 1987. №21. С.3-30.

10. Данилов B.C., Зарубина А.П., Ерошников Г.Е. и др. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий. // Веста. Моск. ун-та. Сер.16. Биология. 2002. №3. С.20-24.

11. Методика экспрессного определения токсичности воды с помощью люминесцентного бактериального теста "Эколюм". - Методические рекомендации №11-1/133-09 Госсанэпиднадзора Минздрава России от 08 июня 2000 г.

12. Кудряшова Н.С., Зюзикова Е.В., Гутник Г.В. Механизм действия солей на бактериальную биолюминесценцию in vitro. // Биофизика. 1999. Том 44. №2. С.244-250.

13. Витухновская Л. А., Исмаилов А.Д. Влияние ионов Na⁺ и К⁺ на люминесцентную активность инактивных клеток Vibrio harveyi при различных рН. // Микробиология. 2001. Том 70. №4. С.525-530.

14. Боядин А.Н., Попова Л.Ю. Зависимое от минеральных солей ингибирование свечения люимнесцирующего микроорганизма Escherichia coli Z9051. // Биофизика. 2001. Том46. №2. С.251-255.

1. Способ определения биотоксичности питьевой минеральной воды, предусматривающий отбор пробы, ее дегазацию, определение уровня общей минерализации, внесение в исследуемую пробу NaCl до конечного значения общей минерализации 30 г/л с последующим внесением 0,01 н. раствора НСl до достижения конечного значения рН 7,5, подготовку контрольной пробы, внесение в исследуемую и контрольную пробы морской люминесцирующей бактерии Photobacterium phosphoreum В-17 677f, измерение уровня люминесценции, расчет индекса токсичности по формуле T=((I_k-I_o)/I_k)·100%, где I_k - интенсивность свечения в контроле, I_о-интенсивность свечения в опыте, при этом при величинах Т<20% воду оценивают как нетоксичную, при Т от 20 до 50% как токсичную, при Т>50% как сильно токсичную.

2. Способ определения биотоксичности питьевой минеральной воды, предусматривающий отбор пробы, ее дегазацию, внесение 0,01 н. раствора НСl до достижения конечного значения рН 7,5, подготовку контрольной пробы, внесение в исследуемую и контрольную пробы рекомбинантной люминесцирующей бактерии Escherichia coli К 12 TG1 с генами люминесцентной системы Photobacterium leiognathi, измерение уровня люминесценции, расчет индекса токсичности по формуле T=((I_k-I_o)/I_k)·100%, где I_k - интенсивность свечения в контроле, I_о- интенсивность свечения в опыте, при этом при величинах Т<20% воду оценивают как нетоксичную, при Т от 20 до 50% - как токсичную, при Т>50% - как сильно токсичную.