Питательная среда для выделения возбудителя сапа
Владельцы патента RU 2371476:
ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения возбудителя сапа. Питательная среда содержит пептон, дрожжевой экстракт, хлористый натрий, агар, ванкомицин, полимиксин В, кристаллвиолет, глицерин, кровь чувствительного к сапу животного - золотистого хомячка и мясную воду. Изобретение позволяет повысить селективность питательной среды. 1 табл.
Изобретение относится к медицине, а более конкретно к микробиологии особо опасных инфекций, проблеме выделения возбудителя сапа из объектов внешней среды или из организма животных, зараженных этим возбудителем.
Несмотря на то, что возбудители сапа и мелиоидоза считаются относительно неприхотливыми микроорганизмами, при исследовании материала на возбудитель сапа приходится обращать особое внимание на полноценный состав используемой питательной среды, так как возбудитель сапа является более требовательным к ее составу, чем возбудитель мелиоидоза.
Известны следующие наиболее часто применяемые среды: мясопептонный агар с добавлением кристаллвиолета (Miller et al., 1948), транспортная среда на основе кровезаменителей и глицерина с добавлением ампициллина, полимиксина В и генцианвиолета (Жога Л.К. с соавт., 1995).
Наиболее близким аналогом для выделения возбудителя сапа является простая питательная среда, содержащая мясопептонный агар с 3% глицерина (Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.: Медицина, 1982, с.282-283).
Состав аналога - мясопептонного агара с глицерином (г/л): пептон 10,0, хлористый натрий 5,0, агар 25,0, глицерин 30,0 мл, мясная вода до 1 л, pH 7,0-7,2.
Недостатком среды прототипа является отсутствие в среде ингибиторных компонентов, которые бы тормозили или задерживали рост посторонней контаминирующей микрофлоры.
Целью настоящего изобретения является конструирование селективной питательной среды, обеспечивающей благоприятные условия для культивирования возбудителя сапа и подавляющей рост сопутствующей контаминирующей микрофлоры при выделении искомого возбудителя из объектов внешней среды или из организма больных или погибших животных.
Поставленная цель достигается тем, что заявленная питательная среда для выделения возбудителя сапа содержит пептон, дрожжевой экстракт, хлористый натрий, глицерин, кровь чувствительного к сапу животного - золотистого хомячка, агар, ванкомицин, полимиксин В, кристаллвиолет и мясную воду при следующем содержании компонентов, г/л:
| пептон | 5,5-6,5 |
| дрожжевой экстракт | 2,5-3,5 |
| хлористый натрий | 4,5-5,5 |
| агар | 11,5-12,5 |
| ванкомицин | 0,01-0,015 |
| полимиксин В | 0,01-0,015 |
| кристаллвиолет | 0,002-0,0025 |
| а также глицерин | 40,0-55,0 мл |
| кровь чувствительного к сапу | |
| животного - золотистого хомячка | 50,0-100,0 мл |
| мясная вода | до 1 л |
| pH | 6,7-6,9 |
Использование предложенных компонентов в питательной среде позволяет выделить возбудитель сапа из объектов внешней среды или из организма животных, зараженных этим возбудителем, даже когда они имеются в незначительном числе в среде, где количество посторонней контаминирующей микрофлоры значительно превосходит их.
Примеры конкретного применения.
Пример 1. Оптимальный состав среды. Среду готовят следующим образом:
в 850 мл мясной воды добавляют 6,0 г пептона, 5,0 г хлористого натрия, 50,0 мл глицерина, 3,0 г дрожжевого экстракта, 12,0 г агара, кипятят до растворения компонентов, устанавливают pH 6,7-6,9 с помощью 4% раствора едкого натрия или 4% раствора соляной кислоты. Разливают мерно по флаконам и стерилизуют при 110°С в течение 30 минут.
В охлажденную после автоклавирования среду ex temporae добавляют:
100 мл крови золотистого хомячка, ванкомицин 0,01, полимиксин В 0,01, кристаллвиолет 0,002.
Оптимальный состав среды состоит из следующих объемов жидкостей (1 л): мясная вода 850 мл, глицерин 50 мл, кровь золотистого хомячка 100 мл.
Тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри по 20,0 мл.
Пример 2. Возможны низкие пределы концентрации ингредиентов.
Среду готовят по примеру 1, но ингредиенты используют в следующих количествах г/л:
| пептон | 5,5 |
| дрожжевой экстракт | 2,5 |
| хлористый натрий | 4,5 |
| агар | 11,5 |
| ванкомицин | 0,01 |
| полимиксин В | 0,01 |
| кристаллвиолет | 0,002 |
| а также глицерин | 40,0 мл |
| кровь золотистого хомячка | 50,0 мл |
| мясная вода | до 1 л |
| pH | 6,7-6,9 |
Пример 3. Возможны высшие пределы концентрации ингредиентов. Готовят среду по примеру 1, но ингредиенты используют в следующих количествах г/л:
| пептон | 6,5 |
| дрожжевой экстракт | 3,5 |
| хлористый натрий | 5,5 |
| агар | 12,5 |
| ванкомицин | 0,015 |
| полимиксин В | 0,015 |
| кристаллвиолет | 0,0025 |
| а также глицерин | 55,0 мл |
| кровь золотистого хомячка | 100,0 мл |
| мясная вода | до 1 л |
| pH | 6,7-6,9 |
Пример 4. Практическое использование среды для выделения возбудителя сапа из объектов внешней среды и из органов загнившего животного. Готовят питательную среду в соответствии с примером 1. В качестве контрольной среды используют прототип - мясопептонный агар с 5% глицерина.
В качестве объекта внешней среды приготавливают «болтушку» из почвы, для этого в 100 мл забуференного раствора хлористого натрия pH 7,0 помещают 1,0 г почвы.
Делают взвесь из внутренних органов загнившей мыши, хранившейся при комнатной температуре в течение 24 ч после гибели животного.
В эти объекты вносят возбудитель сапа (В.mallei 10230) таким образом, чтобы в объеме 1,0 мл их содержалось 103 микробных клеток (м.к.) искомого патогенного возбудителя.
Производят посев по 0,1 мл на чашки Петри с опытной и контрольной средами. Посевы помещают в термостат при 37°С. Просмотр засеянных чашек осуществляют каждые 24 ч.
На контрольных чашках Петри с мясопептонным агаром и 5% глицерина спустя 48 ч инкубации посевов при 37°С при посеве всех объектов вырастали сплошные газоны посторонней микрофлоры.
На чашках Петри с предложенной опытной питательной средой при посеве всех объектов наблюдался рост практически чистой культуры возбудителя сапа. Рост посторонних контаминирующих микроорганизмов на питательной среде ингибировался.
Таким образом, предлагаемая питательная среда может быть использована для выделения возбудителя сапа из материала, загрязненного посторонней контаминирующей микрофлорой, через 48 ч инкубации посевов при 37°С при наличии искомого возбудителя в количестве 10 м.к. в посевной дозе 0,1 мл.
Результаты испытания питательной среды для выделения возбудителя сапа
| Посевной материал | Количество КОЕ при посеве 100 м.к. | |
| на опытную среду | на контрольную среду | |
| 1. B.mallei 10230 | 56±9 | 42±7 |
| 2. Почва + B.mallei 10230 | 49±8 | спл. рост посторонних микроорганизмов |
| 3. Органы загнившего животного + В.mallei 10230 | 54±8 | спл. рост посторонних микроорганизмов |
| 4. Почва | - | спл. рост посторонних микроорганизмов |
| 5. Органы загнившего животного | - | спл. рост посторонних микроорганизмов |
Питательная среда для выделения возбудителя сапа, содержащая пептон, дрожжевой экстракт, хлористый натрий, глицерин, кровь чувствительного к сапу животного - золотистого хомячка, агар, ванкомицин, полимиксин В, кристаллвиолет и мясную воду при следующем содержании компонентов, г/л:
| пептон | 5,5-6,5 |
| дрожжевой экстракт | 2,5-3,5 |
| хлористый натрий | 4,5-5,5 |
| агар | 11,5-12,5 |
| ванкомицин | 0,01-0,015 |
| полимиксин В | 0,01-0,015 |
| кристаллвиолет | 0,002-0,0025 |
| глицерин | 40,0-55,5 |
| кровь чувствительного к сапу | |
| животного - золотистого хомячка | 50,0-100,0 |
| мясная вода pH 6,7-6,9 | до 1 л |
