Способ получения биологически активной суммы кислот в комплексной экстракционной переработке древесной зелени пихты сибирской (abies sibirica)

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Воздушно-сухую измельченную древесную зелень пихты экстрагируют трет-бутилметиловым эфиром двукратно. Экстракт отделяют от хвои и обрабатывают 2%-ным раствором NaOH с последующим разделением органического и водного слоев. Водно-щелочной слой подкисляют и отделяют формирующуюся органическую фазу, представляющую собой сумму тритерпеновых кислот. Органический слой концентрируют отгонкой экстрагента, обрабатывают горячей водой и гидродистиллируют летучие компоненты пихтового масла при разряжении 0,1-0,3 ата и температуре не выше 50°С. Кубовый остаток гидролизуют кипячением с водно-спиртовой щелочью и выделяют нейтральные компоненты гидролизата отгонкой растворителя при пониженном давлении и температуре не выше 80°С с последующей двукратной экстракцией метил-трет-бутиловым эфиром, 2-3-кратной отмывкой полученного органического слоя водой до нейтральной реакции и упариванием. Водно-спиртовый слой подкисляют 5-10%-ным раствором соляной кислоты до pH 2 и экстрагируют трет-бутилметиловым эфиром. Экстракт промывают водой до нейтрального pH и отгоняют эфир при разряжении 0,1-0,3 ата и температуре не выше 80°С с получением продукта. Изобретение позволяет реализовать указанное назначение. 7 табл.

 

Изобретение относится к способам получения биологически активных веществ (БАВ) экстракцией возобновляемого растительного сырья и последующей химической модификацией экстрактивных. Конкретно, к переработке древесной зелени (ДЗ) пихты сибирской (Abies Sibirica) - многотоннажного отхода при заготовке древесины - комплексной экстракционной технологией с получением нового биологически активного продукта (суммы высших алифатических, арилкарбоновых и фенолкарбоновых кислот) наряду с известными ранее: пихтовым маслом, суммой тритерпеновых кислот (действующим веществом росто- и иммуностимулятора с/х растений «Новосил» [RU 2108803]), исчерпывающе гидролизованной липидной фракцией (действующим веществом провитаминной добавки к корму с/х птицы [RU 2006138542]), фракцией биоактивных моно- и олигосахаров, полисахаридовов и флавоноидов (действующим веществом провитаминной добавки к корму с/х птицы [RU 2007123376]).

Задачей изобретения является получение новых биологически активных веществ из древесной зелени пихты при ее комплексной переработке.

Поставленная задача решается тем, что целевой продукт - сумму биологически активных веществ - получают из остатка гидролизата, образующегося в качестве отхода после выделения исчерпывающе гидролизованной липидной фракции из суммы продуктов омыления фракции нейтральных липидов водно-спиртовой щелочью по [RU 2006138542]. Установлено, что получаемая сумма кислот является росто- и иммуностимулятором с/х растений с фунгицидной активностью.

Прототип заявляемому - способ получения биологически активных веществ из древесной зелени пихты сибирской [RU 2006138542]. Прототип предусматривает измельчение воздушно-сухой ДЗ пихты, обработку ее несмешивающимся с водой экстрагентом - метил-трет-бутиловым эфиром, отделение органического экстракта от ДЗ пихты, промывку его водным раствором щелочного агента, разделение водно-щелочного и органического слоев, выделение из органического слоя фракции нейтральных липидов последовательно отгонкой экстрагента и летучих компонентов (пихтового масла) в вакууме при остаточном давлении 0,1-0,3 ата и температуре 50-90°С, а из водно-щелочного слоя - суммы тритерпеновых кислот подкислением с последующими экстракцией метил-трет-бутиловым эфиром и упариваем экстракта. Далее по способу-прототипу проводят частичный или исчерпывающий гидролиз фракции нейтральных липидов кипячением с водно-спиртовой щелочью и выделение нейтральных компонентов гидролизата - исчерпывающе гидролизованной липидной фракции - двукратной экстракцией метил-трет-бутиловым эфиром с последующей 2-3-кратной отмывкой полученного органического слоя водой до нейтральной реакции и упариванием.

Кипячение фракции нейтральных липидов с водно-спиртовой щелочью приводит к исчерпывающему гидролизу сложных эфиров алифатических, арилкарбоновых и фенолкарбоновых кислот и высвобождение из них в свободном состоянии алифатических, ди- и тритерпеновых спиртов, стеринов, а также собственно кислот и фенолов. Продукт, получаемый по способу-прототипу, содержит лишь ту часть из этих соединений, которые при взаимодействии со щелочью не образуют водорастворимые продукты солевой или иной природы. Действительно, выход исчерпывающе гидролизованной липидной фракции составляет 59% от первоначального веса подвергнутой омылению фракции нейтральных липидов. Таким образом, недостатком способа-прототипа является неполное извлечение из гидролизата омыленных экстрактивных веществ ДЗ пихты - потеря в отходах веществ кислого характера.

Целевой продукт настоящего изобретения - биологически активные соединения (сумму кислот) - получают из остатка гидролизата фракции нейтральных липидов после извлечения из него исчерпывающе гидролизованной липидной фракции по прототипу [RU 2006138542]. Для этого остаток (щелочной водно-спиртовый раствор кислот и фенолов) подкисляют до значения pH 2, двукратно экстрагируют метил-трет-бутиловым эфиром, объединенный органический экстракт промывают водой до нейтральной реакции и отгоняют экстрагент в вакууме при остаточном давлении 0,1-0,3 ата и температуре 50-90°С. Таким образом, основное отличие от прототипа заключается в получении дополнительно суммы кислот в количестве 35% от веса фракции подвергнутых гидролизу нейтральных липидов. В совокупности, в заявляемом способе с использованием простого приема и задействованного в экстракционной технологии оборудования получен дополнительно к известным новый продукт и установлена его биоактивность, чем достигнута полезная утилизация всего количества экстрактивных веществ, извлекаемых из ДЗ пихты экстрагентом органической природы.

Целевой продукт, получаемый по примеру 1, представляет собой нелетучую зелено-коричневую мазеобразную массу, содержащую, по данным ХМС, смесь алифатических высших кислот с примесью ди- и тритерпеновых соединений и других природных веществ.

Целевой продукт образует эмульсии различных концентраций в воде с эмульгаторами, разрешенными к применению в сельском хозяйстве. Эмульсии легко дозируются и удобны для предпосевной обработки посадочного материала замачиванием, а также опрыскиванием растений в любой фазе периода вегетации. Лабораторные и расширенные испытания (см. примеры 2-7) показали, что целевой продукт обладает полезной биоактивностью и может использоваться в качестве действующего вещества ростостимулирующих и иммуномодулирующих препаратов с фунгицидными свойствами в растениеводстве, обеспечивая по отношению к контролю увеличение всхожести семян сельскохозяйственных культур на 15-35%, общую и товарную урожайность на 15-50%, снижение зараженности фитопатогенной микрофлорой, т.е. по полезной биологической активности сопоставим с используемым в практике препаратом «Новосил», действующим веществом которого являются природные тритерпеновые кислоты из ДЗ пихты.

Таким образом, предлагаемое изобретение способствует:

- совершенствованию комплексности, повышению рентабельности и экологической целесообразности экстракционной технологии переработки ДЗ пихты путем выделения нового БАВ из отходов производства исчерпывающе гидролизованной липидной фракции (остатка гидролизата фракции нейтральных липидов);

- диверсификации направлений использования в сельском хозяйстве БАВ, получаемых в комплексной экстракционной технологии переработки ДЗ пихты, путем установления специфической биоактивности новых продуктов, образующихся при технологически простой обработке (гидролизе) экстрактивных природных веществ.

Способ получения суммы кислот и эффективность ее применения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Воздушно-сухую измельченную зелень пихты (80 кг) в мешках из бязи помещают в экстрактор, приливают трет-бутилметиловый эфир (350 л) из мерника и настаивают при комнатной температуре в течение 8 час. Экстракт сливают (220 л), приливают свежий трет-бутилметиловый эфир (260 л) и вновь настаивают в течение 8 час. Сливают вторую порцию экстракта (260 л). Экстракты объединяют и обрабатывают 2%-ным водным раствором едкого натра (150 л) при перемешивании в аппарате с мешалкой. Смесь перемещают в делительную воронку-отстойник, дожидаются полного расслоения и разделяют слои.

Органический экстракт порциями загружают в перегонный аппарат и отгоняют трет-бутилметиловый эфир при разрежении 0,1-0,3 ата (вакуум водокольцевого насоса) и температуре в кубе не выше 50°С. Получают липидную фракцию экстракта (4,8 кг), освобожденную от экстрагента и содержащую летучие компоненты (пихтовое масло).

Водно-щелочной слой в делительной воронке подкисляют 5%-ной соляной кислотой до pH 2, отделяют формирующуюся органическую фазу, концентрированием (сушкой) которой в техническом вакууме получают сумму тритерпеновых кислот (4,9 кг) в виде серо-зеленой стекловидной массы после охлаждения.

Накапливают липидную фракцию экстракта (48 кг), помещают в емкостной аппарат для гидродистилляции, добавляют воду (48 л), при перемешивании нагревают до 50-80°С и в течение 1-3 часов отгоняют летучие компоненты с водяным паром при разрежении 0,1-0,3 ата (вакуум водокольцевого насоса). Гидродистиллят разделяют на водный и органический (пихтовое масло, 12 кг) слои, а из куба сливают горячей частично гидролизованную липидную фракцию зелено-коричневого цвета (31 кг).

Частично гидролизованную липидную фракцию (31 кг) растворяют в этиловом спирте (39 л), добавляют водный раствор КОН (10 кг в 11 л воды) или NaOH (7.8 кг на 11 л воды), нагревают при перемешивании в аппарате с обратным холодильником и кипятят (т.кип. ~78°С) в течение 2 час, затем массу концентрируют отгонкой водно-спиртовой смеси на роторном испарителе в вакууме водокольцевого насоса при температуре не выше 80°С, остаток экстрагируют дважды трет-бутилметиловым эфиром (по 150 л), объединенный экстракт промывают водой до pH 7-8 и концентрируют полной отгонкой азеотропа воды и эфира в вакууме водоструйного насоса. Получают 18,3 кг (выход 59%) исчерпывающе гидролизованной фракции консистенции густого меда желто-коричневого или темно-оранжевого цвета.

Объединенный остаток (водно-спиртовый слой после экстракции и промывные воды) подкисляют 5÷10%-ным раствором соляной кислоты до pH 2 и экстрагируют дважды трет-бутилметиловым эфиром (по 75 л), объединенный экстракт промывают водой (2×50 л), расслаивают и органическую фазу концентрируют полной отгонкой азеотропа воды и эфира в вакууме водокольцевого насоса при температуре не выше 80°С. Получают 10.9 кг (выход 35%) целевого продукта мазеобразной консистенции зелено-коричневого цвета.

ХМС-анализ полученного продукта показал наличие в нем следующих кислот: тетрадекановой, пентадекановой, гексадекановой, 14-метилгексадекановой, гептадекановой, олеиновой, линолевой (включая изомеры), линоленовой (включая изомеры), 14-октадеценовой, стеариновой, нонадекановой, эйкозатриеновой, 5, 11, 14, 17-эйкозатетраеновой, 11,14-эйкозадиеновой, 11-эйкозеновой, эйкозановой, левопимаровой, абиетиновой, дегидроабиетиновой, генэйкозановой, докозановой, трикозановой, тетракозановой, гексакозановой, октакозановой, триаконтановой, дотриаконтановой, тетратриаконтановой. Основными являются олеиновая (до 25%) и линолевая (до 20%, включая изомеры). Продукт содержит относительно высокое (в сумме до 10%) количество кислот с 20 атомами углерода и от 0 до 4 двойных связей, а также предельных кислот с числом атомов углерода от 23 до 34 (до 15%). Кроме того, обнаружены небольшие количества (до 3%) нейтральных компонентов: β-ситостерина, токоферола и фитола, а также неидентифицированные компоненты (до 5%), спектры которых отсутствуют в базах данных.

Испытания эффективности применения целевого продукта, полученного по примеру 1, в качестве росто- и иммуностимулятора с фунгицидными свойствами проведены совместно с ГНУ СибНИИРС СО РАСХН в сравнении с контролем, а также эталоном - препаратом «Новосил», действующим веществом которого является выделенная из ДЗ пихты сибирской сумма тритерпеновых кислот [RU 2108803]. Целевой продукт испытывали в препаративной форме (в примерах 2-7 условное наименование препарата КЛИПС - кислые липиды пихты сибирской), включающей эмульгатор и воду, при этом концентрация действующего вещества испытуемого препарата и «Новосила» были равны. Исследовано влияние применения испытуемого препарата на лабораторную всхожесть семян (пример 2), показатели урожайности сельскохозяйственных культур (примеры 3, 4, 7) и подавление грибковых заболеваний (примеры 5, 6, 7).

Пример 2.

Объекты исследования: горох сорта Новосибирец зернового направления, листочкового морфотипа с индетерминантным типом роста стебля и пшеница сорта Скала.

Вариант обработки: замачивание семян в растворах препаратов (5 мл 5%-ного раствора препарата на литр воды), время экспозиции - 15 мин.

Контроль - вода.

Таблица 1.
Влияние препарата КЛИПС на всхожесть семян гороха и пшеницы.
Препарат	Лабораторная всхожесть
горох	пшеница
КЛИПС	135,3	116.0
Новосил	99,6	108.3
Контроль	100	100

Пример 3.

Объект исследования: чеснок яровой (богар).

Вариант обработки: замачивание посадочного материала в растворах препаратов (5 мл 5%-ного раствора препарата на литр воды), время экспозиции - 15 мин, посадка - 6 мая) и опрыскивание растений в фазу массового образования и нарастания листьев.

Контроль - вода.

Таблица 2.
Влияние препарата КЛИПС на продуктивность ярового чеснока.
Препарат	Товарный урожай, % к контролю	Общий урожай, % к контролю
КЛИПС	150	115
Новосил	200	150
Контроль	100	100

Пример 4.

Объект исследования: картофель сорта Эскорт.

Варианты обработки: предпосевное замачивание посадочного материала и опрыскивание. Контроль - вода.

Таблица 3.
Влияние препарата КЛИПС на продуктивность картофеля сорта Эскорт
Препарат	Товарный урожай, % контролю	Общий урожай, % контролю
Замачивание	Опрыскивание	Замачивание	Опрыскивание
КЛИПС	133	133	129	121
Новосил	117	100	114	100
Контроль	100	100	100	100

Пример 5.

Объект исследования: картофель сорта Эскорт, инфицированный патогенным грибом Phytoftora Infestans.

Вариант обработки: замачивание.

Контроль (К-1) - зараженные клубни без обработки.

Примечание: значение 0-1 - высокая устойчивость, 1-1.7 - средняя устойчивость, выше 2.0 - низкая устойчивость.

Таблица 4.
Влияние препарата КЛИПС на развитие Phytoftora Infestans на картофеле сорта Эскорт
Препарат	Развитие фитофторы
КЛИПС	0.8
Новосил	2.65
К-1	2.0

Пример 6.

Объект исследования: пшеница яровая сорта Новосибирская 20.

Листовые болезни оценивали в фазу колошения растений (период проявления пятнистостей).

Вариант обработки: опрыскивание растений в фазу кущения (вторая декада июня). Норма расхода 5%-ных растворов препаратов составляет 100 мл/300 л воды/га. Результаты усреднены по трем параллельным опытам.

Контроль - вода.

Таблица 5.
Влияние препарата КЛИПС на поражение пшеницы мучнистой росой.
Препарат	Мучнистая роса, % поражения
КЛИПС	45
Новосил	58
Контроль	58

Пример 7.

Объекты исследования: картофель сортов Адретта (среднеустойчивый к фитофторе) и Алена (неустойчивый к фитофторе).

Инфекционный фон для проведения исследований создавали с помощью местной популяции Phytoftora Infestans. Учет развития болезни производили на 3, 12, 24 и 42 день после обработки. В конце вегетации учтен урожай с делянки и с одного куста.

Вариант обработки: опрыскивание растений в фазу активного цветения (первая декада июля). Норма расхода 5%-ного растворов препаратов - 2 л/1000 л воды/га. Результаты усреднены по трем параллельным опытам.

Контроль - вода.

Таблица 6.
Влияние препарата КЛИПС на заражение картофеля фитофторой
Препарат	Сорт Адретта, % поражения	Сорт Алена, % поражения
	Дни учета	Дни учета
3	12	24	42	3	12	24	42
КЛИПС	10	30	50	50	20	60	80	100
Новосил	10	50	60	70	25	60	80	100
Контроль	25	60	70	100	30	60	100	100

Таблица 7.
Влияние препарата КЛИПС на урожайность картофеля, зараженного фитофторой (% к контролю).
	Сорт Адретта	Сорт Алена
Препарат	104.8	117.2
КЛИПС	104.1	121.1
Новосил	100	100
Контроль

Способ получения биологически активного вещества из экстракта древесной зелени пихты сибирской (Abies Sibirica), включающий двукратную экстракцию воздушно-сухой измельченной древесной зелени пихты трет-бутилметиловым эфиром, объединение экстрактов, промывание экстракта 2%-ным водным раствором едкого натра, разделение водно-щелочной и органической фазы, подкисление водно-щелочной фазы до pH 2 с выделением суммы тритерпеновых кислот, отгонку экстрагента из органической фазы, при этом из органического экстракта отгоняют трет-бутилметиловый эфир при разрежении 0,1-0,3 ата и температуре не выше 50°С с получением липидной фракции, далее полученную липидную фракцию гидролизуют водой при температуре 50-80°С и освобождают от летучих компонентов гидродистилляцией при остаточном давлении 0,1-0,3 ата, получают частично гидролизованную липидную фракцию, которую обрабатывают водно-спиртовой щелочью при кипячении, концентрируют путем отгонки растворителей при пониженном давлении и температуре не выше 80°С, экстрагируют дважды трет-бутилметиловым эфиром, раствор концентрируют и получают исчерпывающе гидролизованную липидную фракцию, отличающийся тем, что остаток гидролизата (водно-щелочную фазу от получения исчерпывающие гидролизованной липидной фракции) подкисляют 5÷10%-ным раствором соляной кислоты до pH 2 и экстрагируют дважды трет-бутилметиловым эфиром, экстракт промывают водой и отгоняют трет-бутилметиловый эфир при разрежении 0,1-0,3 ата и температуре не выше 80°С с получением суммы кислот.