Инактивированная бивалентная вакцина против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота и способ профилактики вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота
Группа изобретений относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина включает антиген аденовируса первого серотипа В-10, инактивант, адъювант концентрированный ПЭГ-6000 в конечной концентрации 10%. Дополнительно вакцина содержит антиген вируса вирусной диареи «Оригон», концентрированный 8-9% ПЭГ-6000 в растворе 0,5-0,6 М NaCl. В качестве инактиванта вакцина содержит афицинальный формалин, а в качестве адъюванта афицинальную ГОА, при этом компоненты входят в состав вакцины в следующем соотношении (об.%): антиген аденовируса первого типа В-10 с инфекционным титром 6-7 lg ТЦД50/мл, концентрированный 5 раз ПЭГ-6000 в растворе 0,5-0,6 М NaCl - 30-37, антиген вируса вирусной диареи штамма «Оригон» с инфекционным титром 7-8 lg ТЦД50/мл, концентрированный 5 раз ПЭГ-6000 в растворе 0,5-0,6 М NaCl - 30-37, формалин 40% - 0,5-0,8, ГОА афицинальная 6,0% остальное. Вакцину вводят телятам внутримышечно двукратно с интервалом 13-16 дней в дозе 1,0 мл. Вакцина имеет высокую профилактическую активность. 4 табл.
Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к получению инактивированных вакцин против респираторно-кишечной патологии крупного рогатого скота, вызываемой вирусами адено- и вирусной диареи.
Вирусная диарея и аденовирусная инфекция крупного рогатого скота - остро протекающие, контагиозные вирусные болезни, главным образом, телят, характеризующиеся поражением органов респираторно-кишечного тракта. Болезни регистрируются во всех странах мира, в том числе и в России. Вирусы вызывают заболевания у крупного рогатого скота, поражая от 40-60 % животных и обуславливая в 20-30 % случаев вспышки респираторно-кишечных болезней. Как правило, данные вирусы вызывают заболевания в ассоциации в 80-85 % случаях, при этом смертность телят достигает 27-30 % (1).
Известна вакцина для профилактики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, включающая антигены аденовируса КРС штамм В-10, который инактивировали димером этиленимином (ДЭИ) в конечной концентрации 0,1 % и в качестве адъюванта использовали аэросил (2).
Известны также вакцины для специфической профилактики вирусной диареи, включающие антигены вируса диареи КРС штаммы Оригон, С-24 V, Нью-Йорк, которые инактивировали формалином и в качестве адъюванта была использована гидроокись алюминия (3).
Вакцины обладают высокой эффективностью, однако они имеют ряд недостатков. Так, например, вакцины применяют раздельно, что связано с огромными затратами труда ветеринарных специалистов, многократным беспокойством животных, созданием у них стрессового состояния, что неблагоприятно отражается на иммунологической реактивности животных к прививке.
В задачу наших исследований входит получить вакцину, обеспечивающую создание длительного напряженного иммунитета в организме животного против аденовирусной инфекции и вирусной диареи КРС и не обладающую реактогенными свойствами.
Поставленная задача достигается тем, что инактивированная бивалентная вакцина против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота включает в себя антигены аденовируса первого серотипа В-10 с инфекционным титром 6-7 lg ТЦД50/мл, штамма «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 17-8 lg ТЦД 50/мл, инактивированных формалином, концентрированных в 5 раз полиэтиленгликолем 6000 и депонированных на гидроокиси алюминия при следующем соотношении компонентов (об. %):
| антиген аденовируса КРС первого | |
| типа В-10 с инфекционным титром | |
| 6-7 lg ТЦД 50/мл концентрированный в 5 раз; | |
| 10 % ПЭГ- 6000 в растворе 0,5-0,6 М NaCI | 30-37 |
| антиген вируса вирусной диареи КРС штамма «Оригон» | |
| с инфекционным титром 7-8 lg. ТЦД50/мл; | |
| концентрированный в 5 раз 8-9 % ПЭГ-6000 | |
| в растворе 0,5-0,6 М NaCI | 30-37 |
| формалин 40% | 0,5-0,8 |
| гидроокись алюминия афицинальная 6,0 % | остальное. |
Пример
Для приготовления инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота берут вируссодержащий материал аденовируса первого серотипа В-10 с инфекционным титром 6-7 lg ТЦД 50/мл (Тканевых Цитопатических Доз), полученную вируссодержащую суспензию инактивируют формалином в конечной концентрации 0,2-0,3 % и концентрируют в 5 раз исходного объема полиэтиленгликолем 6000 в конечной концентрации 10,0 %. Далее берут антиген вируса вирусной диареи КРС штамм «Оригон», полученный из вируссодержащей суспензии с инфекционным титром 7-8 lg ТЦД 50/мл, инактивируют формалином 0,2-0,3 % конечной концентрации при температуре 37-38°С в течение 72 часов при рН 7,2-7,4. Полученные антигены концентрируют полиэтиленгликолем (ПЭГ 6000) в конечной концентрации 8 % и ресуспендируют в 0,5-0,6 М NaCl, затем антигены смешивают в равных объёмах 1:1 и добавляют официнальный адъювант 6 % ГОА до 2-3 % конечной концентрации в полученной вакцине.
Конкретные примеры приготовления вакцины отражены в табл.1.
Для определения безвредности вакцины использовали два вида лабораторных животных - белых мышей весом 15-18 г и кроликов весом 2,5 кг. Вакцину вводили внутримышечно однократно в дозе 0,2 и 1 мл соответственно. В течение 10-дневного наблюдения вакцинированные животные оставались живыми, на месте введения вакцины не образовывалось некроза тканей. Таким образом, вакцина предложенного состава полностью безвредна для животных, данные представлены в таблице 3.
Испытание эффективности вакцины с различными соотношениями компонентов проводили на лабораторных крысах. Вакцину в указанных в табл. 1. концентрациях вводили животным двукратно с интервалом 14 дней, внутримышечно в дозе 0,2 мл. Формировали пять опытных групп. Вакцину каждой концентрации вводили 5-ти крысам. Первой группе вводили с минимальными значениями компонентов, второй группе - оптимальное, третьей - максимальное, четвертой меньше минимального и пятой - больше максимального.
Кровь для определения уровня специфических антител брали из сердца до иммунизации (фон) и через две недели после последней вакцинации. Титр специфических антител определяли в реакции нейтрализации на культуре клеток (РН). При этом уровни специфических антител при оптимальной и максимальной концентрациях компонентов существенно не отличались, а дальнейшее увеличение концентрации компонентов не приводило к увеличению уровней специфических антител. Использование для иммунизации вакцины в дозах меньше минимальных оказалось неэффективным, так как не вызывало выработку антител в титрах, обеспечивающих защиту против этих инфекций.(табл. 1)
Уровень специфических антител в сыворотке крови иммунизированных животных представлен в табл. 2 ( минимальное, оптимальное и максимальное).
Способ профилактики аденовирусной инфекции и вирусной диареи КРС с помощью предложенной вакцины заключается в следующем.
Иммунизацию крупного рогатого скота проводили по следующей схеме.
Три группы клинически здоровых телят, не содержащих в сыворотке крови специфических антител (по 5 голов в группе, всего 15 животных). Животным первой группы вводили инактивированную бивалентную вакцину против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота внутримышечно дважды с интервалом 14 дней по 1 мл. Животным второй и третьей группы вводили в соответствии с утвержденными наставлениями по применению коммерческие моновакцины против аденовируса и вируса вирусной диареи внутримышечно по 10 мл двукратно с интервалом 14 дней. Через 14 дней после второй иммунизации от всех животных брали пробы крови из яремной вены в количестве 5-8 мл. Результаты представлены в табл. 3.
Активность вакцин по уровню антител в сыворотке крови телят к аденовирусу и вирусу ВД КРС представлены в табл. 4.
Таким образом, в крови животных иммунизированных предложенной вакциной, отмечался не только более высокий уровень специфических антител к вирусу вирусной диареи и аденовирусу крупного рогатого скота, но и удалось уменьшить дозу вакцины в десять раза, что, в свою очередь, обеспечивало защиту животных сразу против двух инфекций с меньшими трудозатратами.
Предложенную вакцину вводят животным внутримышечное двукратно с интервалом 13-16 дней в дозе 1 мл.
Высокая профилактическая активность предложенной вакцины по сравнению с известными вакцинами того же назначения была подтверждена испытаниями, проведенными в условиях животноводческих хозяйств, и обеспечивает длительный (не менее б месяцев) напряженный иммунитет, не обладает реактогенными свойствами.
Вакцина апробирована нами с положительным результатом с 2004-2007 гг. на кафедре ветеринарной вирусологии московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им К. И Скрябина и хозяйстве «ООО Аграрное» Орехово-Зуевского района.
Полученная вакцина позволит снизить экономический ущерб, причиняемый данными вирусами животноводству Российской Федерации, и найдет применение в неблагополучных хозяйствах.
Источники информации
1. Автореф. дисс. к.в.н. Курбанбекова З.Д. Эпизоотическая ситуация по респираторно-кишечным болезням молодняка крупного и мелкого рогатого скота в центральных районах Таджикистана. М.: - 2007 гг.- с. 9.
2. Дисс. к.б.н. Литвинов О.Б. Экспериментальные исследования по разработке инактивированной вакцины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. М.: - 1984 гг.- с.39.
3. Книга. Сюрин В.Н. Вирусные болезни животных. М.-ВНИТИБП.-1998 гг.- с.139.
| ТАБЛИЦА 1 Антигенная активность инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота | |||||
| показатели | Изготовление вакцины | ||||
| С минимальными значениями параметров | С оптимальными значениями параметров | С максимальными значениями | Со значениями параметров | ||
| Ниже мини-альных | Выше максимальных | ||||
| штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром | 7 lg ТЦД 50/мл | 7,75 lg ТЦД 50/мл | 8 lg ТЦД 50/мл | 6 lg ТЦД 50/МЛ | 8,5 lg ТЦД 50/мл |
| инактивацию проводят формалином концентрации 0,2 %при температуре | 0,2% | 0,25% | 0,3% | 0,1% | 0,35% |
| 37°С | 37,5°С | 38°С | 36°С | 38°С | |
| полученный антиген штамма «Оригон» концентрируют полиэтиленгликолем в растворе 0,5-0,6 М NaCl | 8% | 8,5% | 9% | 7,5% | 9,5% |
| 0,5 М | 0,55 М | 0,6 М | 0,4 М | 0,7 М | |
| адъювант ГОА в концентрации | до 2% | до 2,5% | до 3% | до 1,5% | до 3,5% |
| Стабильность вакцины при хранении | Не менее 12 месяцев | Не менее 12 месяцев | Не менее 12 месяцев | Менее 12 месяцев | Не менее 12 месяцев |
| Антигенная активность вакцины. | Титр антител 1:64-1:128 |
Титр антител 1: 1024-1:4096 |
Титр антител 1: 1024-1:4096 |
Титр антител 1:16-1:32 |
Титр антител 1:32-1:128 |
| Безвредность. | безвредная | безвредная | безвредная | безвредная | безвредная |
| Стерильность. | стерильная | стерильная | стерильная | стерильная | стерильная |
| Иммуногенность | 85-90% | 85-90% | 85-90% | 60% | 74% |
| Таблица 2 Уровень специфических антител в сыворотке крови иммунизированных крыc | ||||||
| Бивалентная вакцина против аденовирусной инфекции и вирусной диареи КРС | Титры антител при иммунизации | |||||
| 1 группа, доза 0,1 мл | 2 группа, доза 0,2 мл | 3 группа, доза 0,4 мл | ||||
| фон | 21сут после последней иммунизации | фон | 21 сут после последней иммунизации | фон | 21 сут после последней иммунизации | |
| К аденовирусу | 0 | 1:64 | 0 | 1:256 | 0 | 1:512 |
| К вирусу диареи КРС | 0 | 1:32 | 0 | 1:256 | 0 | 1:256 |
| Таблица 3 Исследование предложенной вакцины на безвредность |
|||||||||||
| Наименование вакцины | Кол-во животных | Дни наблюдения (гибель животных) | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
| Инактивированная Бивалентная вакцина против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота | Белые мыши и крысы | ||||||||||
| Минимальная концентрация | 5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Оптимальная концентрация | 5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Максимальная концентрация | 5 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| Таблица 4 Исследование антителообразования в сыворотке крови телят | ||||||
| Вид антигена | Уровень специфических антител при иммунизации | |||||
| предложенная | Протатипы (моновакцины) | |||||
| Вакцина против аденовирусной инфекции КРС | Вакцина против вирусной диареи КРС | |||||
| фон | После иммуниза ции |
фон | После иммунизации | фон | После иммунизации | |
| Аденовирус | 0 | 1:512 | 0 | 1:128 | 0 | 0 |
| Вирус вирусной диареи | 0 | 1:256 | 0 | 0 | 0 | 1:128 |
1. Инактивированная бивалентная вакцина против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, включающая антиген аденовируса первого серотипа В-10, инактивант, адъювант концентрированный ПЭГ-6000 в конечной концентрации 10%, отличающаяся тем, что вакцина дополнительно содержит антиген вируса вирусной диареи «Оригон», концентрированный 8-9% ПЭГ-6000 в растворе 0,5-0,6 М NaCl, в качестве инактиванта - афицинальный формалин, а в качестве адъюванта - афицинальная ГОА, при этом компоненты входят в состав вакцины в следующем соотношении, об.%:
| антиген аденовируса первого типа В-10 с | |
| инфекционным титром 6-7 lg ТЦД 50/мл, | |
| концентрированный 5 раз ПЭГ-6000 | |
| в растворе 0,5-0,6 М NaCl | 30-37 |
| антиген вируса вирусной диареи штамма «Оригон» | |
| с инфекционным титром 7-8 lg ТЦД 50/мл, | |
| концентрированный 5 раз ПЭГ-6000 в растворе | |
| 0,5-0,6 M NaCl | 30-37 |
| афицинальный формалин | 0,5-0,8 |
| ГОА афицинальная | остальное |
2. Способ профилактики аденовирусной инфекции и вирусной диареи КРС, включающий введение вакцины, охарактеризованной в п.1, которую вводят телятам внутримышечно двукратно с интервалом 13-16 дней в дозе 1,0 мл.
