5'-фосфорсодержащие производные 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина новые противовирусные агенты

Изобретение относится к 5'-фосфорсодержащим производным 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина общей структурной формулы, приведенной ниже, где R=Н, NH₂-C(O)-. Соединения по изобретению могут быть использованы для ингибирования репродукции вируса иммунодефицита человека 1-го типа в культуре клеток МТ-4. 2 табл.

 

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины, а именно к новым производным нуклеозидов, а именно к замещенным 5'-фосфорсодержащим производным 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина. Эти соединения обладают выраженным противовирусным действием, в первую очередь против вируса иммунодефицита человека, а также потенциально могут быть применены против вируса гепатита В человека.

В настоящее время в медицинской практике используется целый ряд соединений, обладающих противовирусной активностью в отношении ВИЧ. Среди них различают нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы. Среди производных нуклеозидов наиболее часто применяются 3'-азидо-3'-дезокситимидин (АЗТ, Зидовудин®), 2',3'-дидезоксицитидин (ddC, Зальцитабин®), 2',3'-дидезоксиинозин (ddI, Диданозин®), 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин (d4T, Ставудин®) и 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин (3ТС, Ламивудин®) [De Clercq, E., 2002. New development in anti-HIV chemotherapy. Biochim Biophys. Acta, 1587 258-275].

Механизм действия указанных соединений состоит в том, что после проникновения в инфицированные клетки они подвергаются трифосфорилированию и специфично блокируют синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой ВИЧ. Высокая изменчивость ВИЧ приводит к быстрому возникновению резистентных штаммов вируса [Groschel, В., Cinati, J.H., and Cinati J. Jr., 1997. Viral and cellular factors for resistance against antiretroviral agents. Intervirology, 40, 400-407; Antonelli, G, Turrziani, O., Verri, A., Narciso, P., Feri, F., D'Offizi, G., and Dianzini, F., 1996. Long-term exposure to zidovudine affects in vitro and in vivo the efficiency of thymidine kinase. AIDS Res Hum Retrovir., 12, 223-228], и, следовательно, к необходимости смены препарата. К тому же из-за низкой эффективности внутриклеточных превращений используемые препараты требуют высоких доз применения, что вызывает появление выраженных токсических эффектов.

Основным следствием токсичности 3ТС является лактоцидоз, который проявляется как при моно-, так и при комбинированной терапии [Painter G.R., Almond M.R., Мао S. and Liotta D.C., 2004, Biochemical and mechanistic basis for the activity of nucleoside analogue inhibitors of HIV reverse transcriptase. Curr. Top Med Chem, 4(10), 1035-44; De Clercq E., Emerging anti-HIV drugs. 2005, Expert Opin Emerg Drugs. 10(2), 241-73; Piliero PJ., 2004, Pharmacokinetic properties of nucleoside/nucleotide reverse transcriptase inhibitors. J Acquir Immune Defic Syndr. 37 (Suppl 1), S2-S12]. Быстрое выведение 3ТС из организма требует частого приема препарата. Кроме того, при длительном применении 3ТС быстро образуются резистентные штаммы вируса, и лечение теряет эффективность. Несмотря на все вышеперечисленные недостатки, 3ТС по-прежнему является широко применяемым анти-ВИЧ препаратом. 3ТС используется как в индивидуальном виде, так и в форме комбинаций с другими препаратами. Например, композиция 3ТС с АЗТ носит название "Combivir®".

Из родственных соединений известен Н-фосфонат АЗТ (Никавир®), одобренный в России для терапии СПИД. Он существенно менее токсичен, чем АЗТ [Никавир (фосфазид)-антиретровирусный препарат: антиВИЧ-активность, токсикология, фармакокинетика и некоторые перспективы клинического применения [Галегов Г.А., 2004, 49 (7), 5-8. Антибиотики и Химиотерапия]. Действие Никавира основано на способности высвобождать АЗТ, который после внутриклеточного превращения в АЗТ-5'-трифосфат ингибирует репликацию ВИЧ. По данным фармакокинетических исследований клинические преимущества Никавира объясняются более медленным и плавным нарастанием концентрации АЗТ в крови, чем при приеме собственно АЗТ; при этом С_макс АЗТ из Никавира <С_макс АЗТ из Зидовудина, а T_1/2 АЗТ из Никавира >Т_1/2 AЗТ из Зидовудина [Y. Skoblov et al. Intracellular metabolism and pharmacokinetics of 5'-hydrogenphosphonate of 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine, a prodrug of 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine. Antiviral Research 63 (2004), 107-113].

Данным изобретением решается задача создания низкотоксичных производных 3ТС, обладающих способностью проникать внутрь клетки и постепенно высвобождать активный нуклеозид (3ТС). Это позволяет поддерживать внутриклеточную концентрацию препарата, достаточную для проявления терапевтического эффекта в течение длительного времени и, таким образом, снизить разовую дозу препарата, а также частоту приема и, как результат, уменьшить побочные эффекты.

Задача решена созданием соединений 5'-фосфонил-2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин общей формулы

где R=Н, NH₂-С(O)-.

Новые соединения подавляют репродукцию вируса иммунодефицита человека 1-го типа в культуре перевиваемых лимфоцитов МТ-4, обеспечивают защиту клеток от цитопатогенного действия вируса и не проявляют токсичности в отношении хозяйских клеток вплоть до крайне высоких концентраций (табл.1). Из полученных экспериментальных данных видно, что исследуемые соединения, не оказывая токсического действия на клетки в эффективных концентрациях, в высокой степени подавляют репродукцию вируса иммунодефицита 1-го типа в культуре клеток МТ-4. Терапевтический индекс исследуемых соединений (IS), определяемый как отношение токсической дозы препарата к его эффективной дозе, сравним с таковым для 3ТС. Вирусологические тесты проведены в соответствии с описанными ранее протоколами.

Показано, что заявляемые фосфорсодержащие производные 3ТС в организме животных медленно высвобождают 3ТС, таким образом, представляя собой латентные формы ЗТС (Пример 4, табл.2). Исследования показывают, что для заявляемых соединений единственным продуктом метаболизма, детектируемым в крови животных, является 3ТС. Фармакокинетические параметры, приведенные в табл.2, были определены по образовавшемуся 3ТС.

Поскольку заявляемые 5'-фосфорсодержащие производные 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина являются эффективными депо-формами 3ТС, который также широко применяется против вируса гепатита В человека, следует ожидать аналогичной активности от новых соединений.

Целевые соединения получали по следующей схеме в одну или несколько стадий:

Ниже приведены конкретные примеры, раскрывающие сущность изобретения.

Пример 1.

5'-Фосфит 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина получали по следующей схеме:

Для фосфитилирования нуклеозида возможно использование РCl₃, (PhO)₂P(O)H, фосфористого ангидрида или же свободной фосфористой кислоты с активацией 1,3-дициклогексилкарбодиимидом, 2,4,6-триизопропилбензолсульфонилхлоридом или пивалоилхлоридом, а также другие методы.

5'-Фосфит 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина

К раствору 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина (500 мг, 2,18 ммоль) и фосфористой кислоты (268 мг, 3,27 ммоль) в пиридине (2 мл) прибавляли дициклогексилкарбодиимид (674 мг, 3,27 ммоль), реакционную массу перемешивали при комнатной температуре 10 часов и разбавляли водой (5 мл). После 30 минут дополнительного перемешивания отделяли осадок, раствор упаривали, остаток растворяли в воде (100 мл). Раствор наносили на колонку с DEAE-Toyopearl, элюировали в линейном градиенте NH₄HCO₃ (0→0,1 М). Целевые фракции упаривали и переупаривали с водой (3 раза по 5 мл), остаток разбавляли водой (3 мл) и наносили на колонку с LiChroprep RP-18, элюировали водой. Целевую фракцию лиофилизовали, получали 546 мг (85%). ¹Н ЯМР (D₂O): 8,08 д (1Н, J=7,8 Гц, Н-6), 6,77 д (1Н, J=642,4 Гц, Н-Р), 6,32 дд (1Н, J=4.4 и 5,0 Гц, Н-1), 6,09 д (1Н, J=7,8 Гц, Н-5), 5,43 дд (1Н, J=3,1 и 3,7 Гц, Н-4'), 4,27 м (1Н, Н-5'а), 4,14 м (1Н, Н-5'б), 3,56 м (1Н, Н-2'а), 3,24 м (1Н, Н-2'б). ³¹Р ЯМР с подавлением Р-Н взаимодействия (D₂O): 6,98 с.

Пример 2.

5'-Аминокарбонилфосфонат 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина получали по следующей схеме:

2',3'-Дидезокси-3'-тиацитидин конденсировали с этоксикарбонилфосфоновой кислотой в присутствии дициклогексилкарбодиимида. Обработка полученного 5'-этоксикарбонилфосфоната 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина раствором 25% водного аммиака приводила к образованию целевого продукта.

5'-Этоксикарбонилфосфонат 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина

К раствору бис(пиридиниевой) соли этоксикарбонилфосфоновой кислоты (203 мг, 0,65 ммоль) в пиридине (5 мл) прибавляли 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин (115 мг, 0,5 ммоль) и дициклогексилкарбодиимид (436 мг, 2 ммоль). Реакционную массу перемешивали 18 ч при комнатной температуре, а затем разбавили водой до 100 мл и отфильтровали выпавший осадок. Фильтрат нанесли на колонку с DEAE-Toyopearl; элюировали линейным градиентом NH₄HCO₃ (0→0,15 М). Целевые фракции упаривали переупаривали с водой (3 раза по 5 мл), остаток разбавляли водой (3 мл) и наносили на колонку с LiChroprep RP-18, элюировали водой.

Целевую фракцию лиофилизовали, получали 152 мг (83%) 5'-этоксикарбонилфосфоната 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина. ¹Н ЯМР (D₂O): 8.16 д (1Н, J=7,8 Гц, Н-6), 6,32 дд (1Н, J=4,4 и 4,6 Гц, H-1'), 6,12 д (1Н, J=7,8 Гц, Н-5), 5,47 м (1Н, Н-4'), 4,42-4,31 м (2Н, Н-5'), 4,10 м (2Н, CH ₂CH₃) 3,58 м (1Н, Н-2'а), 3,25 м (1Н, Н-2'б), 1,13 т (3Н, J=7,1, CH₂ CH ₃). ³¹Р ЯМР с подавлением Р-Н взаимодействия (D₂O): -5,02 с.

5'-Аминокарбонилфосфонат 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина

К полученному 5'-этоксикарбонилфосфонату 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина (140 мг, 0,38 ммоль) добавили раствор 25% водного аммиака (5 мл), раствор перемешивали 12 ч при температуре +4°С, а затем сконцентрировали в вакууме. Остаток растворили в воде и хроматографировали на DEAE-Toyopearl (НСО₃ ^-), элюировали линейным градиентом NH₄HCO₃ (0→0,2 М), целевой продукт элюировали 0,12 М NH₄HCO₃. Целевые фракции упаривали и переупаривали с водой (3 раза по 5 мл), остаток разбавляли водой (3 мл) и наносили на колонку с LiChroprep RP-18, элюировали водой. Целевую фракцию лиофилизовали, получали 121 мг (71%) 5'-аминокарбонилфосфоната 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина. ¹Н ЯМР (D₂O): 8,14 д (1Н, J=7,8 Гц, Н-6), 6,30 дд (1Н, J=4,4 и 4,6 Гц, Н-1'), 6,11 д (1Н, J=7,8 Гц, Н-5), 5,44 м (1Н, Н-4'), 4,36 м (1Н, Н-5'а), 4,23 м (1Н, Н-5'б), 3,56 м (1Н, Н-2'а), 3,24 м (1Н, Н-2'б). ³¹Р ЯМР с подавлением Р-Н взаимодействия (D₂O): -1,65 с.

Пример 3.

Исследование ингибирования репродукции ВИЧ включает культивирование первично инфицированных лимфоидных клеток линии МТ-4 в присутствии исследуемых соединений, конечные концентрации которых в культуральной среде составляют 0,001-100 мкг/мл, на протяжении одного пассажа - в течение 4 суток.

Ингибирование репродукции ВИЧ в культуре чувствительных клеток определяют по снижению накопления вирусспецифического белка р24 (по данным иммуноферментного анализа), а также по увеличению жизнеспособности клеток в присутствии препарата по сравнению с контролем, определяемому на 4-е сутки культивирования при окрашивании бромидом 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ).

Исследование цитотоксического действия препарата

К клеткам добавляют исследуемый препарат в различных концентрациях. Инкубируют клетки при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ и 98% влажности 3-5 дней. Учет результатов: определение жизнеспособности и количества клеток при помощи красителя.

Влияние исследуемых соединений на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4

К клеткам добавляли исследуемый препарат и инфицировали вирусом в дозе 0,01 ТЦИД50/клетка. Инкубировали культуры клеток при 37°С в атмосфере с 5% СO₂ и 98% влажности 4-5 дней. Учет результатов проводили окрашиванием клеток с помощью тетразолиевого красителя (метод МТТ) со спектрофотометрией и световой микроскопией: исследование цитопатического эффекта вируса (ЦПД) и вирусиндуцируемого синцитийобразования (синцитий - конгломерат нескольких клеток с общей клеточной оболочкой, образовавшейся в результате слияния их мембран).

Терапевтический индекс или индекс селективности (IS) считают как отношение 50%-ной токсической концентрации соединения к его 50%-ной эффективной дозе (результаты представлены в табл.1). На основании этих количественных показателей ингибированиу можно судить об эффективности противовирусного действия заявляемого соединения.

Пример 4.

Собаке весом 12 кг вводили 190 мг исследуемого вещества орально (в смеси с творогом). Через определенные промежутки времени отбирали пробы крови (1 мл) из бедренной вены. Пробы центрифугировали (10 минут, 2000 об/мин), супернатант отделяли. Из супернатанта отбирали аликвоты (0,25 мл), добавляли оксетан (0,25 мкг, как внутренний стандарт) и метанол (0,75 мл). Полученную смесь центрифугировали 3 минуты при 5000 об/мин. Супернатант отделяли и упаривали в токе воздуха при 40°С, к остатку добавляли воду (1 мл). Аликвоты (20 мкл) анализировали методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Gynkotec, Германия; аналитическая колонка Ultrasphere ODC "Beckman" USA. Элюент: 6% ацетонитрил в 0,1% Н₃РО₄ (pH 2,1) в присутствии 0,15% триэтиламина. Детекция при λ_max 265 нм, температура 30°С. Фармакокинетические параметры, полученные в результате анализа данных, приведены в табл.2.

Таблица 1
Противовирусная активность 3ТС и его фосфита против ВИЧ-1 ГКВ-4046
Соединение	ID50,	CD50,	IS
µМ	µМ
5'-фосфит 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина	42±9	>2200	>52
5'-аминокарбонил-фосфонат 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина	67±8	>3700	>55
3ТС	1,1±0.5	41	37

Таблица 2
Фармакокинетические параметры 3ТС после введения собаке внутрь 140 мг субстанций 3ТС и 5'-фосфита 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина в эквиваленте 190 мг 3ТС
Соединение	Т1/2 часы	AUC, мг.ч/литр	MRT, часы	CL, литр/час	Tмакс, часы	Смакс, мг/литр
5'-фосфит 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина	6,8	21,8	9,98	8,7	2,0	2,82
5'-аминокарбонил-фосфо-нат 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина	6.5	18,5	10,54	9,1	2,7	1,79
3ТС	5,9	30,7	8,62	6,2	1,5	5,17

Таким образом, показано, что заявленные соединения обладают низкой токсичностью, способны эффективно ингибировать репродукцию вируса иммунодефицита человека первого типа в культуре клеток МТ-4 и генерировать 3ТС в организме млекопитающих, обеспечивая плавное нарастание его концентрации в крови.

5'-Фосфорсодержащие производные 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидина, имеющие общую формулу
,
где R=H, NH₂-C(O)-.