Штамм bifidobacterium breve ov-12, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств
Владельцы патента RU 2373274:
Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Штамм Bifidobacterium breve OV-12 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находящегося на грудном вскармливании, депонирован и хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №217. Штамм высокотехнологичен, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией бифидобактерий, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, устойчив к широкому спектру антибиотиков, нетоксичен. Это позволяет использовать штамм В. breve OV-12 в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, обеспечивающих пробиотический эффект и нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и урогенитального трактов, кожных и слизистых покровов, а также обеспечивает расширение арсенала аналогичных средств. 4 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и множества других причин [1, 4].
Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры - как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения.
Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью видами - Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп, но с возрастом их доля в составе микробиоценоза постепенно снижается. Вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3,6].
Применение современных подходов генотипирования бифидобактерии подтвердило присутствие В. breve в составе микрофлоры грудных детей [2, 5, 6, 8].
Включение новых производственных штаммов бифидобактерии расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микроэкологических нарушений в различных биотопах и позволит проводить данные мероприятия более рационально.
Целью настоящего изобретения является штамм Bifidobacterium breve OV-12, который выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора под №217.
Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах, в том числе биологически активных добавок, капсул, таблеток, суспензий, суппозиториев; ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. breve OV-12 может быть применен в производстве гигиенических средств, например кремов, гелей, косметических масок.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, которые в качестве действующего начала пробиотической направленности содержат штамм В. breve OV-12, в ходе технологического процесса на производственных средах в короткие сроки накапливающего биомассу с высоким содержанием бифидобактерий, обладающего антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам, органическим кислотам, а также внешним воздействиям, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры.
Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации штаммов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного здорового человека.
Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.
Морфологические свойства
Клетки штамма В. breve OV-12 представляют собой Грам+ полиморфные, бесспоровые неподвижные крупные палочки с бифуркацией на одном конце, расположенные попарно крестообразно в виде хромосомы, буквы Х, Т, «рожек улитки».
В полужидких питательных средах клетки растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза; отдельно выросшие колонии имеют вид «комет» в форме елочек длиной до 1 см. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.
Физиолого-биохимические свойства
Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания - 37,5-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L+молочной кислоты без образования газа, закисляя среду до рН 3,9-4,1. Ферментирует мальтозу, фруктозу, галактозу, лактозу, мелецитозу, сахарозу, маннозу, вариабельно сбраживает раффинозу, ксилозу, арабинозу. Не ферментирует салицин, трегалозу, рамнозу, маннозу, эскулин, целлобиозу, сорбитол. На уреазу, нитраты и индол реакция отрицательна.
Генотипирование штамма В. breve OV-12 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу.
Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 272015 и EU 272021.
Культуральные свойства
Штамм активно накапливает биомассу на производственных средах различного состава до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерий и органических кислот (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.
| Таблица 1 | ||
| Накопление биомассы и органических кислот при культивировании штамма В. breve OV-12 на различных питательных средах. | ||
| Питательная среда | КОЕ/мл | °T |
| Среда для культивирования бифидобактерий (БС) | 5,0×109 | 178 |
| МРС | 5,6×109 | 205 |
| Гидролизатно-молочная среда | 6,0 ×109 | 210 |
| Печеночная среда | 5,8×109 | 210 |
| Молоко восстановленное обезжиренное | 2,0×108 | 135 |
Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. breve OV-12 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 109 КОЕ/мл и органические кислоты - ценные продукты метаболизма, с которыми, преимущественно, связан уровень антагонистической активности штамма. Молоко сквашивает к 24 часам до 90°Т с образованием плотного сгустка. Максимальная кислотность в молоке - 150°Т.
Данные изучения динамики накопления микробной массы и органических кислот (продуктов метаболизма) в процессе культивирования представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||||
| Динамика культивирования штамма В.breve OV-12 в молоке и среде для выделения и культивирования бифидобактерий в стационарных условиях | ||||
| Время выращивания после посева, (ч) | Выращивание на молоке | Выращивание на БС среде | ||
| °T | КОЕ/мл | °T | КОЕ/мл | |
| 0 | 18 | 1,2×107 | 34 | 2,lxl06 |
| 24 | 90 | 2,0×108 | 140 | 3,5х109 |
| 48 | 135 | 2,2×108 | 260 | 4,0х109 |
Как видно из таблицы 2, в процессе культивирования происходит динамичное накопление микробной массы и органических кислот. Максимальные величины этих показателей отмечались к 24 часам культивирования.
Таким образом, из приведенных данных видно, что штамм В. breve OV-12 отличается высокой технологичностью, активно наращивает биомассу бифидобактерий на производственных и лабораторных средах с высокими показателями значения КОЕ/мл.
Антагонистическая активность штамма изучалась на плотных питательных средах методом отсроченного антагонизма с тест-культурами условно-патогенных микроорганизмов.
Результаты, представленные в таблице 3, показали, что В. breve OV-12 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых штаммов.
| Таблица 3 | ||
| Антагонистическая активность штамма В. breve OV-12 | ||
| № | Штамм тестируемого микроорганизма | Зона задержки роста в присутствии штамма В. breve OV-12, мм |
| 1 | Staphylococcus aureus ATCC 6538-P | 20±3 |
| 2 | Shigella flexneri 337 | 28±3 |
| 3 | Shigella sonnei 177 | 26±5 |
| 4 | Proteus vulgaris 1274 | 28±2 |
| 5 | Escherichia coli 157 | 26±3 |
Чувствительность к антибиотикам штамма В. breve OV-12 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2.1890-04 [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.
| Таблица 4 | ||||||
| Антибиотикочувствительность штамма В. breve OV-12 | ||||||
| № | Название антибиотика | Интерпретация зон | Содержание препарата в диске, мкг | Диаметр зоны ингибирования роста в мм | ||
| Устойчив | Промежуточно устойчив | Чувствителен | ||||
| 1 | Бензилпенициллин | ≤19 | 20-27 | ≥28 | 10 | 37±1 |
| 2 | Оксациллин | ≤10 | 11-13 | ≥14 | 10 | 35±0 |
| 3 | Ампициллин | ≤10 | 11-14 | ≥16 | 10 | 40±2 |
| 4 | Карбенициллин | ≤14 | 15-18 | ≥19 | 25 | 42±2 |
| 5 | Азлоциллин | ≤13 | 14-16 | ≥16 | 75 | 40±2 |
| 6 | Цефалотин | ≤14 | 15-18 | ≥19 | 30 | 40±2 |
| 7 | Цефалексин | ≤14 | 15-18 | ≥19 | 30 | 32±2 |
| 8 | Цефазолин | ≤14 | 15-18 | ≥19 | 30 | 30±2 |
| 9 | Цефтазидим | ≤14 | 15-17 | ≥18 | 30 | 33±2 |
| 10 | Цефотаксим | ≤14 | 15-20 | ≥21 | 30 | 35±2 |
| 11 | Имипенем | ≤13 | 14-15 | ≥16 | 10 | 40±0 |
| 12 | Стрептомицин | ≤16 | 17-19 | ≥20 | 30 | 15±2 |
| 13 | Неомицин | ≤12 | 13-16 | ≥17 | 30 | 0±0 |
| 14 | Канамицин | ≤14 | 15-18 | ≥19 | 30 | 0±0 |
| 15 | Гентамицин | ≤12 | 13-14 | ≥15 | 10 | 12±2 |
| 16 | Амикацин | ≤14 | 15-16 | ≥17 | 30 | 0±0 |
| 17 | Тетрациклин | ≤16 | 17-21 | ≥22 | 30 | 27±2 |
| 18 | Доксициклин | ≤15 | 16-19 | ≥20 | 10 | 34±0 |
| 19 | Эритромицин | ≤17 | 18-21 | ≥22 | 15 | 30±0 |
| 20 | Азитромицин | ≤13 | 14-17 | ≥18 | 15 | 20±2 |
| 21 | Кларитромицин | ≤13 | 14-17 | ≥18 | 15 | 25±3 |
| 22 | Рокситромицин | ≤13 | 15-18 | ≥19 | 30 | 37±2 |
| 23 | Линкомицин | ≤19 | 20-23 | ≥24 | 15 | 35±1 |
| 24 | Клиндамицин | ≤14 | 15-20 | ≥21 | 2 | 32±2 |
| 25 | Ванкомицин | ≤14 | 15-16 | ≥17 | 30 | 38±3 |
| 26 | Хлорамфеникол (левомицитин) | ≤15 | 16-18 | ≥19 | 30 | 21±2 |
| 27 | Рифампицин | ≤12 | 13-15 | ≥16 | 5 | 35±2 |
| 28 | Полимиксин | ≤11 | 12-14 | ≥15 | 300 ЕД | 0±0 |
| 29 | Налидиксовая кислота | ≤12 | 13-17 | ≥18 | 30 | 0±0 |
| 30 | Ципрофлоксацин | ≤15 | 16-20 | ≥21 | 5 | 12±2 |
| 31 | Пефлоксацин | ≤14 | 15-21 | ≥22 | 10 | 0±0 |
| 32 | Ломефлоксацин | ≤18 | 19-21 | ≥22 | 10 | 25±2 |
Как видно из таблицы 4, штамм устойчив к полимиксину, налидиксовой кислоте, амикацину, неомицину, канамицину, пефлоксацину, гентамицину, ципрофлоксацину, стрептомицину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, штамм чувствителен.
Безвредность
В опыте изучения острой токсичности штамма В.breve OV-12 показана его полная безвредность: при введении белым мышам дозы per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5×107 КОЕ на животное, гибели мышей не отмечено.
Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. breve OV-12 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах активно накапливает биомассу бифидобактерий не ниже 109 КОЕ/мл и органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков. Безвреден при введении лабораторным животным.
Представленные данные изучения штамма В. breve OV-12 позволяют сделать заключение о перспективности его использования как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, а также средств гигиенического и косметического назначения.
Пример 1. Использование штамма В. breve OV-12 для получения биологически активной добавки к пище в жидкой форме
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока - 0,5 л, пептон - 2 г, лактоза - 10 г, хлористый натрий - 5 г, цистеин - 0,2 г, агар-агар - 1 г, дистиллированная вода - 0,5 литра; рН среды - 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часа при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 109 КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают.
Пример 2. Использование штамма В. breve OV-12 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38 С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 109 КОЕ/мл бифидобактерий.
Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 106-7 КОЕ/мл или КОЕ/г.
Пример 3. Использование штамма В. breve OV-12 для получения бактерийного препарата
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 КОЕ/мл бифидобактерий.
К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при -40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 10 КОЕ/г живых клеток бифидобактерий.
Пример 4. Использование штамма В. breve OV-12 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище
Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 109 КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси из расчета получившейся массы добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы №0 по 0,4 г. В1 г БАД к пище содержится не менее 108 KОЕ жизнеспособных бифидобактерий.
Пример 5. Использование штамма В. breve OV-12 для получения гигиенических и косметических средств
Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. breve OV-12 с содержанием бифидобактерий не менее 109 КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.
Пример 6. Использование штамма В. breve OV-12 для получения кисломолочного продукта
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде
до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в стерильное обезжиренное молоко в количестве 5% к его объему и культивируют при 37-38°С до сквашивания (в течение 16-18 часов). Готовый продукт охлаждают и разливают по 0,2 л в пластиковые стаканчики и укупоривают крышками из металлической фольги. Продукт содержит не менее 108 КОЕ/мл бифидобактерий.
Литература
1. Бондаренко В.М., Мапулевич Т.В. / Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.
2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. /Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы - Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, №1-2, с.31.
3. Гончарова Г.И., Вилыпанская Ф.Л., Ж. микробиол., 1968, №7, с.55.
4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. / Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295.
5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. / Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. - Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, №5, с.9-12.
6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. / Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника, - Сб. научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 1986, с.64-69.
7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2. 1890-04, 2004., 52 с.
8. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. / Бифидобактерий: традиционный взгляд и современные генетические исследования: Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2, №5, с.76-79.
Штамм Bifidobacterium breve OV-12, коллекционный номер №217, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
