Штамм bifidobacterium pseudocatenulatum ov-2, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств
Владельцы патента RU 2373278:
Федеральное Государственное учреждение науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)
Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-2 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находящегося на грудном вскармливании, депонирован и хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора под №211. Штамм высокотехнологичен, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией бифидобактерий, образует органические кислоты, обладает антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно патогенной микрофлоры, устойчив к широкому спектру антибиотиков, нетоксичен. Это позволяет использовать штамм В. pseudocatenulatum OV-2 в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, что обеспечивает пробиотический эффект и нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и урогенитального трактов, кожных и слизистых покровов, а также расширяет арсенал средств коррекции микрофлоры человеческого организма. 4 табл.
Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и множества других причин [1, 4].
Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры - как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения.
Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью видами - Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп, но с возрастом их доля в составе микробиоценоза постепенно снижается. Вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3, 6].
Анализ ДНК, начатый в 70-е годы, позволил идентифицировать новые виды бифидобактерий (В. catenulatum, В. pseudocatenulatum, В. dentium, В. animalis, В. angulatum.) и расширить представления о видовом составе бифидофлоры человека и закономерностях ее становления [2, 5, 8].
Это дает основание считать, что при конструировании и назначении средств коррекции микрофлоры необходимо учитывать биоразнообразие видового состава бифидофлоры. Включение новых производственных штаммов бифидобактерий расширит номенклатуру и повысит эффективность разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микроэкологических нарушений в различных биотопах и позволит проводить данные мероприятия более рационально.
Задачей настоящего изобретения является получение штамма В. pseudocatenulatum OV-2, обладающего антагонистической активностью, устойчивостью к средствам антибактериальной терапии, высокой кинетикой накопления биомассы на питательных средах при промышленном выращивании.
Штамм В. pseudocatenulatum OV-2 выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора под №211.
Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах (капсулы, таблетки, суспензии, суппозитории, аэрозоли), биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. pseudocatenulatum OV-2 может быть применен в производстве гигиенических и косметических средств, например кремов, гелей, косметических масок.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма В. pseudocatenulatum OV-2, который может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности в составе бактерийных препаратов, биологически активных добавок, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств. Штамм В. pseudocatenulatum OV-2 в ходе технологического процесса на производственных средах в короткие сроки накапливает биомассу с высоким содержанием бифидобактерий, обладает антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам и органическим кислотам, нетоксичен, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры. Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации видов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного здорового человека.
Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.
Морфологические свойства
Клетки штамма В. pseudocatenulatum OV-2 представляют собой Грам + полиморфные, бесспоровые неподвижные палочки с утолщением на одном конце, расположенные одиночно, попарно или в виде китайских иероглифов. В полужидких питательных средах клетки растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза, образуя колонии в виде «комет» с плотным ядром около 2 мм в диаметре и длинным вуалевидным хвостом длиной 1,5-2,0 см.
Физиолого-биохимические свойства
Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания составляет 37-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L + молочной кислоты без образования газа, закисляет среду до рН 3,9-4,1. Ферментирует лактозу, арабинозу, эскулин, вариабельно - галактозу. Не ферментирует мальтозу, фруктозу, мелецитозу, сахарозу, салицин, трегалозу, маннитол, рамнозу, маннозу, раффинозу, целлобиозу, сорбитол, на уреазу, нитраты и индол реакция отрицательна.
Генотипирование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу. Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 272010 и EU 272016.
Культуральные свойства
Штамм активно накапливает биомассу на производственных средах различного состава до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерий и органических кислот (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.
| Таблица 1 | ||
| Показатели содержания бифидобактерий и органических кислот при культивировании штамма В. pseudocatenulatum OV-2 на разных средах выращивания | ||
| Питательная среда | КОЕ/мл | °T |
| Среда для культивирования бифидобактерий (БС) | 5,0×109 | 178 |
| МРС | 5,6×l09 | 205 |
| Гидролизатно-молочная среда | 6,0×l09 | 210 |
| Печеночная среда | 5,8×109 | 210 |
| Молоко восстановленное обезжиренное | 2,0×108 | 38 |
Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. pseudocatenulatum OV-2 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 10 КОЕ/мл и органические кислоты - ценные продукты метаболизма, с которыми, преимущественно, связан уровень антагонистической активности штамма. Молоко не сквашивает; при культивировании в молоке значение кислотности составляет не более 36-38°Т.
Данные изучения динамики накопления микробной массы и органических кислот в процессе культивирования представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | ||||
| Динамика культивирования штамма В. pseudocatenulatum OV-2 | ||||
| Время выращивания после посева, (час) | Культивирование на обезжиренном восстановленном молоке | Культивирование на БС | ||
| °T | КОЕ/мл | °T | КОЕ/мл | |
| 0 | 18 | 5,0×106 | 44 | 2,1×106 |
| 2 | 18 | 6,0×106 | 48 | 3,0×106 |
| 4 | 20 | 7,5×106 | 52 | 2,0×107 |
| 6 | 20 | 1,1×l07 | 60 | 1,1×108 |
| 8 | 20 | 1,2×107 | 60 | 1,5×108 |
| 10 | 24 | 1,1×107 | 96 | 1,5×108 |
| 14 | 26 | 5,0×l07 | 102 | 1,6×108 |
| 16 | 28 | 5,0×107 | 100 | 5,0×108 |
| 18 | 30 | 1,0×108 | 150 | 1,0×109 |
| 20 | 32 | 1,0×108 | 172 | 1,0×109 |
| 22 | 37 | 1,2×108 | 174 | 1,2×109 |
| 24 | 38 | 2,0×108 | 178 | 5,0×109 |
| 30 | 38 | 2,0×108 | 178 | 5,0×109 |
Как видно из таблицы 2, в процессе культивирования происходит динамичное накопление микробной массы и органических кислот. Максимальные величины этих показателей отмечались к 24 часам культивирования.
Таким образом, штамм В. pseudocatenulatum OV-2 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах накапливает биомассу бифидобактерий и органические кислоты в короткие сроки и с высокими показателями.
Антагонистическая активность штамма изучалась методом отсроченного антагонизма с тест-культурами условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (таблица 3).
| Таблица 3 | ||
| Антагонистическая активность штамма В. pseudocatenulatum OV-2 | ||
| № | Штамм тестируемого микроорганизма | Зона задержки роста в присутствии штамма В. pseudocatenulatum OV-2, мм |
| 1. | Staphylococcus aureus ATCC 6538-P | 23±3 |
| 2. | Shigella flexneri 337 | 28±5 |
| 3. | Shigella sonnei 177 | 25±5 |
| 4. | Proteus vulgaris 1274 | 27±0 |
| 5. | Escherichia coli 157 | 18±5 |
Результаты, представленные в таблице 3, показали, что при нанесении тест-культур на суточную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-2 на агаризованной среде (метод перпендикулярных штрихов), их рост подавляется. Размер зон задержки роста свидетельствует о том, что штамм В. pseudocatenulatum OV-2 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых культур.
Чувствительность к антибиотикам штамма В. pseudocatenulatum OV-2 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2.1890-04 [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.
| Таблица 4 | ||||||
| Антибиотикочувствительность штамма В.pseudocatenulatum OV-2 | ||||||
| № | Наименование антибиотика | Интерпретация зон, мм | Содержание препарата в диске, мкг | Диаметр зоны ингибирования роста, мм |
||
| Устойчив | Промежуточно устойчив | Чувствителен | ||||
| 1 | Бензилпенициллин | ≤19 | 20-27 | ≥28 | 10 | 38±2 |
| 2 | Оксациллин | ≤10 | 11-13 | ≥14 | 10 | 23±1 |
| 3 | Ампициллин | ≤10 | 11-14 | ≥16 | 10 | 35±2 |
| 4 | Карбенициллин | ≤14 | 15-18 | ≥19 | 25 | 35±0 |
| 5 | Азлоциллин | ≤13 | 14-16 | ≥16 | 75 | 40±3 |
| 6 | Цефалотин | ≤14 | 15-18 | ≥19 | 30 | 40±2 |
| 7 | Цефалексин | ≤14 | 15-18 | ≥19 | 30 | 32±2 |
| 8 | Цефазолин | ≤14 | 15-18 | ≥19 | 30 | 32±2 |
| 9 | Цефтазидим | ≤14 | 15-17 | ≥18 | 30 | 30±0 |
| 10 | Цефотаксим | ≤14 | 15-20 | ≥21 | 30 | 35±2 |
| 11 | Имипенем | ≤13 | 14-15 | ≥16 | 10 | 35±2 |
| 12 | Стрептомицин | ≤16 | 17-19 | ≥20 | 30 | 8±0 |
| 13 | Неомицин | ≤12 | 13-16 | ≥17 | 30 | 10±0 |
| 14 | Канамицин | ≤14 | 15-18 | ≥19 | 30 | 0±0 |
| 15 | Гентамицин | ≤12 | 13-14 | ≥15 | 10 | 10±0 |
| 16 | Амикацин | ≤14 | 15-16 | ≥17 | 30 | 0±0 |
| 17 | Тетрациклин | ≤16 | 17-21 | ≥22 | 30 | 30±2 |
| 18 | Доксициклин | ≤15 | 16-19 | ≥20 | 10 | 30±2 |
| 19 | Эритромицин | ≤17 | 18-21 | ≥22 | 15 | 32±2 |
| 20 | Азитромицин | ≤13 | 14-17 | ≥18 | 15 | 28±2 |
| 21 | Кларитромицин | ≤13 | 14-17 | ≥18 | 15 | 35±3 |
| 22 | Рокситромицин | ≤13 | 15-18 | ≥19 | 30 | 35±2 |
| 23 | Линкомицин | ≤19 | 20-23 | ≥24 | 15 | 35±2 |
| 24 | Клиндамицин | ≤14 | 15-20 | ≥21 | 2 | 40±2 |
| 25 | Ванкомицин | ≤14 | 15-16 | ≥17 | 30 | 25±0 |
| 26 | Хлорамфеникол (левомицитин) | ≤15 | 16-18 | ≥19 | 30 | 35±2 |
| 27 | Рифампицин | ≤12 | 13-15 | ≥16 | 5 | 35±0 |
| 28 | Полимиксин | ≤11 | 12-14 | ≥15 | 300 ед | 0±0 |
| 29 | Налидиксовая кислота | ≤12 | 13-17 | ≥18 | 30 | 8±0 |
| 30 | Ципрофлоксацин | ≤15 | 16-20 | ≥21 | 5 | 22±2 |
| 31 | Пефлоксацин | ≤14 | 15-21 | ≥22 | 10 | 15±0 |
| 32 | Ломефлоксацин | ≤18 | 19-21 | ≥22 | 10 | 18±0 |
Как видно из таблицы 4, штамм В. pseudocatenulatum OV-2 устойчив к полимиксину, амикацину, канамицину, промежуточно устойчив к стрептомицину, неомицину, налидиксовой кислоте, гентамицину, пефлоксацину, ломефлоксацину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, штамм чувствителен.
Безвредность
В опыте изучения острой токсичности штамма В. pseudocatenulatum OV-2 показана его полная безвредность: при введении белым мышам per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5х107 КОЕ на животное гибели мышей не отмечено.
Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. pseudocatenulatum OV-2 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах активно накапливает биомассу бифидобактерий не ниже 109 КОЕ/мл и органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков. Безвреден при введении лабораторным животным.
Представленные данные изучения штамма В. pseudocatenulatum OV-2 позволяют сделать заключение об его перспективности при использовании как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, а также средств гигиенического и косметического назначения.
Пример 1. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 для получения биологически активной добавки к пище в жидкой форме.
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-2 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока - 0,5 л, пептон - 2 г, лактоза - 10 г, хлористый натрий - 5 г, цистеин - 0,2 г, агар-агар - 1 г, дистиллированная вода - 0,5 литра; рН среды - 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часа при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 109 КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают.
Пример 2. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта.
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-2 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38 С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 109 КОЕ/мл бифидобактерий.
Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 106-7 КОЕ/мл или КОЕ/г.
Пример 3. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 для получения бактерийного препарата.
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. pseudocatenulatum OV-2 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 107-8 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 106-8 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 109 КОЕ/мл бифидобактерий.
К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при - 40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 108 КОЕ/г живых клеток бифидобактерий.
Пример 4. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище.
Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 109 КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси, из расчета получившейся массы, добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы №0 по 0,4 г. В 1 г БАД к пище содержится не менее 10 КОЕ жизнеспособных бифидобактерий.
Пример 5. Использование штамма В. pseudocatenulatum OV-2 для получения гигиенических и косметических средств.
Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. pseudocatenulatum OV-2 с содержанием бифидобактерий не менее 109 КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.
Литература
1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. / Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.
2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. /Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы - Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, №1-2, с.31.
3. Гончарова Г.И., Вильшанская Ф.Л., ж. Микробиол., 1968, №7, с.55.
4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. / Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295.
5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова А.М. / Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. - Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, №5, с.9-12.
6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. /Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника. - Сб. научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 1986, с.64-69.
7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890-04, 2004, 52 с.
8. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. /Бифидобактерии: традиционный взгляд и современные генетические исследования: Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2, №5, с.76-79.
Штамм Bifidobacterium pseudocatenulatum OV-2, коллекционный номер № 211, хранится в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
