Культуральная среда для производства нитчатых грибов
Изобретение относится к биотехнологии. Культуральная среда для нитчатых грибов рода Arthrobotrys содержит солодовый экстракт в количестве от 75 до 85 мас.% и дрожжевой экстракт в количестве от 15 до 25 мас.%, где указанные проценты представляют собой мас.% в пересчете на сухую массу указанной культуральной среды. Другая культуральная среда для нитчатых грибов рода Arthrobotrys содержит мелассу в количестве от 60 до 65%, сахарозу в количестве от 10 до 15%, жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве от 10 от 15% и дрожжевой экстракт в количестве от 10 до 15%. Третья культуральная среда для нитчатых грибов рода Arthrobotrys содержит солодовый экстракт в количестве от 25 до 30 мас.%, мелассу в количестве от 40 до 45 мас.% и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания в количестве от 25 до 30%, в пересчете на сухую массу среды. Способ получения нитчатых грибов рода Arthrobotrys в промышленном масштабе заключается в том, что осуществляют посев конидий вышеуказанных грибов в культуральную среду и выдерживают культуральную среду при температуре 23-30°С в течение 5-10 дней для оценки репродукции и роста грибов. Изобретение позволяет получить через 7 дней культивирования сухую массу культивируемых грибов порядка 9-10 г при концентрации около 109 КОЕ/л, 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 7 табл.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области фитосанитарных агентов.
В частности, изобретение относится к культуральной среде для нитчатых грибов (гифомицетов), более конкретно к грибам-нематофагам.
Известный уровень техники
В настоящее время все более широкое применение находят микроорганизмы и прежде всего грибы в качестве фитосанитарных агентов.
В продаже уже имеются продукты на основе грибов, предназначенные для борьбы с насекомыми, фитопатогенными грибами и другими паразитами, характерными для сельскохозяйственных культур.
Например, в патенте US 5811092 описаны агенты-нематофаги, применяемые для борьбы с нематодами, относящимися к родам Meloidogyne, Hetherodera и Ditylenchus, которые представляют собой в основном штаммы нитчатого гриба Arthrobotrys conoides Dreschsler.
Указанные нематоды вызывают серьезные поражающие растительность и обусловливающие грибами заболевания и наносят большой экономический ущерб, что приводит к потере 50-70% урожая.
Применение грибов-нематофагов в качестве альтернативы общепринятым антипаразитическим химическим средствам (таким, например, как метилбромид, трихлорнитрометан, дихлорпропен и т.д.) для внесения в почву до ее обработки или карбаматов, которые наносят непосредственно на культуры, позволяет избежать серьезных проблем, таких как необходимость стерилизации почвы, нарушение экологического баланса и потенциальная токсичность для человека и животных.
Таким образом, грибы-нематофаги особенно пригодны для применения в «органическом земледелии», однако это является относительно дорогостоящим вследствие трудностей получения их в больших количествах в промышленном масштабе.
Следовательно, существует необходимость в создании более дешевых грибов-нематофагов, которые можно применять в сельском хозяйстве.
В основу настоящего изобретения была положена задача разработать культуральную среду для нитчатых грибов и прежде всего для грибов-нематофагов, которая дает возможность получать такие микроорганизмы с высоким выходом в промышленном масштабе и в течение коротких периодов времени, что позволяет существенно снизить стоимость конечного продукта.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно изобретению такую проблему решают с помощью культуральной среды для нитчатых грибов, которая содержит по меньшей мере один источник углерода, выбранный из группы, включающей мелассу, солодовый экстракт и сахарозу, и по меньшей мере один источник органического азота, выбранный из группы, включающей дрожжевой экстракт и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания.
Предпочтительно на долю вышеуказанного по меньшей мере одного источника углерода приходится от 70 до 85 мас.% сухой массы культуральной среды, а на долю вышеуказанного по меньшей мере одного источника органического азота приходится от 15 до 30 мас.% культуральной среды.
Культуральная среда, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать также источник минерального азота, представляющий собой нитраты аммония или соли. Вышеуказанный источник минерального азота, как правило, добавляют в культуральную среду постепенно в течение периода роста грибов в количестве, составляющем не более 10 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды и, как правило, в количестве от 5 до 8 мас.%.
Предпочтительно в состав культуральной среды, предлагаемой в настоящем изобретении, входит солодовый экстракт в количестве от 75 до 85 мас.% и дрожжевой экстракт в количестве от 15 до 25 мас.% (проценты даны, как указано в конце настоящего описания, в виде мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды).
В состав другой предпочтительной культуральной среды, предлагаемой в изобретении, входит меласса в количестве от 60 до 65%, сахароза в количестве от 10 до 15%, жидкость, полученная после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве от 10 до 15% и дрожжевой экстракт в количестве от 10 до 15%. Предпочтительно в состав такой культуральной среды входит также источник минерального азота в количестве от 5 до 8%, прежде всего вторичный кислый фосфат аммония.
В состав еще одной предпочтительной культуральной среды, предлагаемой в изобретении, входят два источника углерода, т.е. солодовый экстракт в количестве от 25 до 30% и меласса в количестве от 40 до 45%, а также жидкость, полученная после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве от 25 до 30%.
Подробное описание изобретения
Далее настоящее изобретение более подробно пояснено на примерах вариантов осуществления изобретения, приведенных с целью иллюстрации, но не ограничения его объема.
Перед описанием примеров авторы считают целесообразным дать некоторые определения, касающиеся компонентов культуральной среды, предлагаемой в изобретении.
В качестве источников углерода применяют солодовый экстракт и/или мелассу, и/или сахарозу.
Солодовый экстракт получают с помощью прорастания зерен хлебных злаков (как правило, ячменя). При прорастании образуются специфические ферменты (амилазы), которые обеспечивают превращение крахмала в сахара. В состав солодового экстракта входят мальтоза, витамины и многие микроэлементы в количестве, составляющем примерно 60%.
Меласса представляет собой побочный продукт сахарной промышленности и находится в форме коричневато-черной вязкой жидкости, содержащей воду в количестве 10%, сахарозу в количестве 35%, другие сахара в количестве 20% и золу в количестве 15%.
В качестве источников органического азота применяют дрожжевой экстракт и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания.
Дрожжевой экстракт получают путем аутолиза Saccharomyces cerevisiae и он находится в форме мелкодисперсного светло-желтого порошка, легко растворимого в воде. Дрожжевой экстракт содержит пептиды, свободные аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, а также водорастворимые витамины В-группы. В дрожжевом экстракте общее содержание азота составляет 10% и содержание α-амминового азота составляет 5%.
Жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до разбухания, получают путем замачивания зерен кукурузы в течение 24-48 ч при 50°С в воде, содержащей диоксид серы. Этот реагент позволяет разрушать белковую сеть, окружающую крахмальные зерна, и дает преимущество, заключающееся в предотвращении развития нежелательных микроорганизмов в процессе замачивания. В жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до набухания, общее содержание азота составляет 7% и α-аминового азота 1,7%, в ее состав входит также сахар в количестве 5%, калий в количестве 4%, фосфор в количестве 3% и различные минералы в количестве 17%.
При создании изобретения тестировали различные культуральные среды, содержащие различные указанные выше источники углерода и азота. Эти среды можно разделить на следующие три класса:
класс 1: среды, в которых основным источником углерода является солодовый экстракт;
класс 2: среды, в которых основным источником углерода является меласса;
класс 3: среды, в которых основным источником углерода являются солодовый экстракт и меласса.
Процентное содержание источника органического азота в средах, предлагаемых в изобретении, можно снижать путем замены части такого источника органического азота на источник неорганического азота (нитраты аммония или его производные), которые постепенно добавляют в небольших количествах в процессе культивирования.
Такое добавление неорганического азота в процессе культивирования обеспечивает лучшее снабжение микроорганизма питательными веществами и в случае нитчатых грибов усиление филаментов мицелия.
Замена части источника органического азота на источник неорганического азота дает также преимущество с точки зрения снижения стоимости производства, поскольку источники органического азота (дрожжевой экстракт и жидкость, полученная после замачивания зерен кукурузы до набухания, являются наиболее дорогостоящими компонентами культуральной среды, предлагаемой в изобретении).
Культуральную среду, предлагаемую в изобретении, особенно предпочтительно применять для получения нитчатых грибов семейства Moniliales. В приведенных ниже примерах применяли, в частности, нитчатые грибы Arthrobotrys conoides Dreschsler.
Пример 1
В этом примере описана культуральная среда класса 1.
Выращивание нитчатых грибов осуществляли в колбе Эрлена вместимостью 300 мл, содержащей 150 мл культуральной среды.
Среда содержала солодовый экстракт в концентрации 20 г/л и дрожжевой экстракт в концентрации 4 г/л, и ее стерилизовали перед посевом конидий рассматриваемого гриба.
Культивирование осуществляли в течение 6 дней после посева при температуре примерно 27°С.
На третий день из культуральной среды брали образцы для определения содержания сухой массы (г/л) и количества отростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды подвергали фильтрации и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Количество отростков оценивали в 1 мл культуральной среды.
Обобщение полученных результатов дано в приведенной ниже таблице 1.
| Таблица 1 | |||
| День | рН | Сухая масса (г/л) | КОЕ/л |
| 0 | 6 | 0 | 0,00 |
| 3 | 5,26 | 1,505 | 1,92×108 |
| 4 | 5,79 | 3,345 | 1,30×109 |
| 5 | 6,56 | 5,05 | 3,07×109 |
| 6 | 6,11 | 9,895 | 4,43×109 |
Пример 2
Тест, описанный в примере 1, повторяли в миниреакторе объемом 2 л, содержащем 1,2 л культуральной среды, описанной в примере 1. Экспериментальные условия были такими же, как и в примере 1, за исключением того, что сбор образцов начинали через один день после посева конидий.
Используемый реактор представлял собой круглодонный контейнер, снабженный лопастной мешалкой, нагревающими и охлаждающими устройствами, устройствами для продувки воздухом, а также зондами для измерения значения рН, концентрации О2 и температуры.
Обобщение полученных результатов приведено ниже в таблице 2.
| Таблица 2 | |||
| День | рН | Сухая масса (г/л) | КОЕ/л |
| 0 | 6 | 0 | 0,00 |
| 1 | 5,51 | 1,175 | 2,50×106 |
| 2 | 5,5 | 1,3825 | 1,80×107 |
| 3 | 6,61 | 1,59 | 8,50×107 |
| 4 | 5,4 | 4,03 | 9,60×108 |
| 5 | 5,13 | 4,29 | 1,27×109 |
| 6 | 5,08 | 5,625 | 3,10×109 |
| 7 | 5,5 | 7,848 | 6,08×109 |
В результате по истечении семи дней культивирования получали примерно 8 г грибов на литр культуральной среды, содержащих 6,08×109 отростков.
Пример 3
В данном примере описан тест, проведенный с культуральной средой, относящейся к классу 2.
Культивирование нитчатых грибов осуществляли в колбах Эрлена вместимостью 300 мл, содержащих 150 мл культуральной среды.
Среда содержала мелассу в количестве 25 г/л, сахарозу в количестве 5 г/л, жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве 5 г/л и дрожжевой экстракт в количестве 5 г/л, и ее стерилизовали перед посевом конидий рассматриваемого гриба.
Культуру инкубировали в течение 6 дней после посева при температуре примерно 27°С.
Начиная с третьего дня, брали образцы культуральной среды для определения сухой массы (г/л) и количества отростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды подвергали фильтрации и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Количество отростков оценивали в 1 мл культуральной среды.
Обобщение полученных результатов дано в приведенной ниже таблице 3.
| Таблица 3 | |||
| День | рН | Сухая масса (г/л) | КОЕ/л |
| 0 | 5,07 | 0 | 0,0 |
| 3 | 4,87 | 1,58 | 3,2×107 |
| 4 | 4,20 | 3,82 | 1,0×108 |
| 5 | 6,46 | 6,76 | 1,0×109 |
| 6 | 6,98 | 9,995 | 3,5×109 |
Пример 4
Тест, описанный в примере 3, повторяли согласно методу, описанному в примере 2, в миниреакторе вместимостью 2 л, который содержал 1,2 л культуральной среды, описанной в примере 3. Экспериментальные условия были такими же, что и в примере 3, за исключением того, что сбор образцов начинали через один день после посева конидий.
Обобщение полученных результатов приведено ниже в таблице 4.
| Таблица 4 | |||
| День | рН | Сухая масса (г/л) | КОЕ/л |
| 0 | 5,07 | 0 | 0,00 |
| 1 | 5,04 | 2,675 | 9,90×107 |
| 2 | 5,01 | 3,9 | 3,00×108 |
| 3 | 5,44 | 5,125 | 5,00×108 |
| 4 | 6,11 | 8,295 | 8,20×108 |
| 5 | 6,69 | 2,75 | 1,07×109 |
| 6 | 7,32 | 3,485 | 2,10×109 |
| 7 | 7,65 | 10,164 | 3,77×109 |
Результаты, приведенные для периода времени после пятого дня, могут показаться аномальными, однако они обусловлены лишь избыточной концентрацией грибов в культуральной среде, что не позволяло далее отбирать гомогенные образцы.
Последний образец брали непосредственно из реактора.
В этом случае в течение семи дней получали более 10 г грибов на литр культуральной среды с содержанием отростков 3,77×109.
Пример 5
В этом примере описан тест, проведенный с использованием культуральной среды класса 3.
Культивирование нитчатого гриба осуществляли в колбе Эрлена вместимостью 300 мл, содержащей 150 мл культуральной среды.
Среда содержала мелассу в количестве 15 г/л, солодовый экстракт в количестве 10 г/л и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве 10 г/л, и ее стерилизовали перед посевом конидий рассматриваемого гриба.
Культуру инкубировали в течение 6 дней после посева при температуре примерно 27°С.
Начиная с третьего дня, брали образцы культуральной среды для определения сухой массы (г/л) и количества отростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды подвергали фильтрации и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Количество отростков оценивали в 1 мл культуральной среды.
Обобщение полученных результатов дано в приведенной ниже таблице 5.
| Таблица 5 | |||
| День | рН | Сухая масса (г/л) | КОЕ/л |
| 0 | 4,7 | 0 | 0,00 |
| 3 | 4,49 | 1,82 | 2,38×107 |
| 4 | 4,62 | 3,815 | 1,78×108 |
| 5 | 5,25 | 5,57 | 1,23×109 |
| 6 | 6,03 | 8,555 | 1,35×109 |
Пример 6
Тест, описанный в примере 5, повторяли согласно методу, описанному в примере 2, в миниреакторе вместимостью 2 л, который содержал 1,2 л культуральной среды, описанной в примере 5. Экспериментальные условия были такими же, что и в примере 5, за исключением того, что сбор образцов начинали через один день после посева конидий.
Обобщение полученных результатов приведено ниже в таблице 6.
| Таблица 6 | |||
| День | рН | Сухая масса (г/л) | КОЕ/л |
| 0 | 4,7 | 0 | 0,00 |
| 1 | 4,61 | 2,905 | 5,60×106 |
| 2 | 4,7 | 3,085 | 6,00×107 |
| 3 | 4,56 | 3,265 | 1,23×108 |
| 4 | 6,11 | 5,295 | 3,20×108 |
| 5 | 5,99 | 5,88 | 7,00×108 |
| 6 | 6,94 | 6,305 | 9,50×108 |
| 7 | 7 | 10,026 | 2,22×109 |
В течение семи дней получали более 10 г грибов на литр культуральной среды с содержанием отростков 2,22×109.
Пример 7
Культуральную среду, описанную в примере 3, модифицировали, как указано ниже, для уменьшения содержания двух источников органического азота, которые являются наиболее дорогостоящими компонентами:
25 г/л мелассы;
5 г/л сахарозы;
2,5 г/л жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до разбухания;
2,5 г/л дрожжевого экстракта.
В такой культуральной среде проводили тестирование культуры (А), с использованием указанного выше гриба с целью сравнения с результатами тестирования двух других культур (Б и В), в которых применяли такую же культуральную среду и в которые последовательно добавляли, начиная с четвертого дня, источник минерального азота.
В тесте Б. Начиная с четвертого дня (более конкретно, на четвертый, шестой и восьмой день), трижды добавляли по 0,21 г вторичного кислого фосфата аммония, так что общее количество указанного ингредиента составляло 0,63 г, а в тесте В, начиная с четвертого дня (более конкретно, на четвертый, шестой и восьмой день), трижды добавляли по 0,28 г, так что общее количество добавленного ингредиента составляло 0,84 г.
Тесты проводили в колбах Эрлена вместимостью 500 мл, содержащих 300 мл культуральной среды, которую стерилизовали перед посевом конидий.
На девятый и последний день культивирования общее содержание азота в культуральной среде (А) составляло 0,85 г/л, в то время как в средах, в которые добавляли вторичный кислый фосфат аммония (А и Б), оно составляло 1,05 г/л (А) и 1,26 г/л (Б) соответственно.
Начиная с третьего дня, из культуральных сред через каждые два дня брали образцы для определения сухой массы (г/л) и количества отростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды подвергали фильтрации и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Количество отростков оценивали в 1 мл культуральной среды.
Обобщение полученных результатов дано в приведенной ниже таблице 7.
| Таблица 7 | |||||||||
| День | А рН | А CM | A КОЕ | Б pН | Б CM | Б КОЕ | В рН | В CM | В КОЕ |
| 0 | 5,06 | 0,00 | 0,00 | 5,06 | 0,00 | 0,00 | 5,09 | 0,00 | 0,00 |
| 3 | 4,92 | 3,94 | 5,50×106 | 4,80 | 2,84 | 2,50×104 | 4,80 | 3,36 | 2,50×104 |
| 5 | 5,12 | 3,44 | 1,75×108 | 4,89 | 4,57 | 4,73×108 | 5,30 | 3,48 | 3,05×108 |
| 7 | 6,68 | 6,45 | 1,58×109 | 5,47 | 8,32 | 3,15×109 | 6,39 | 5,48 | 4,00×109 |
| 9 | 7,14 | 8,63 | 3,20×109 | 5,44 | 11,30 | 7,25×109 | 5,86 | 7,86 | 6,78×109 |
| CM = сухая масса (г/л) КОЕ = количество отростков/литр |
Как видно из приведенной выше таблицы, добавление источника минерального азота, прежде всего в небольших количествах (тест Б), позволяет существенно увеличивать количество сухой массы, которую получают, начиная с седьмого дня культивирования, и достигать более чем 100%-ного увеличения количества отростков, полученных в течение этого же периода культивирования.
1. Культуральная среда для нитчатых грибов рода Arthrobotrys, содержащая солодовый экстракт в количестве от 75 до 85 мас.% и дрожжевой экстракт в количестве от 15 до 25 мас.%, где указанные проценты представляют собой мас.% в пересчете на сухую массу указанной культуральной среды.
2. Культуральная среда для нитчатых грибов рода Arthrobotrys, содержащая мелассу в количестве от 60 до 65%, сахарозу в количестве от 10 до 15%, жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания в количестве от 10 от 15% и дрожжевой экстракт в количестве от 10 до 15%.
3. Культуральная среда по п.2, дополнительно содержащая источник минерального азота в количестве от 5 до 8%.
4. Культуральная среда по п.3, в которой источник минерального азота представляет собой вторичный кислый фосфат аммония.
5. Культуральная среда для нитчатых грибов рода Arthrobotrys, содержащая солодовый экстракт в количестве от 25 до 30 мас.%, мелассу в количестве от 40 до 45 мас.% и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания в количестве от 25 до 30%, в пересчете на сухую массу среды.
6. Способ получения нитчатых грибов рода Arthrobotrys в промышленном масштабе, заключающийся в том, что осуществляют посев конидий указанных грибов в культуральную среду согласно одному из пп.1, 2 и 5, выдерживают культуральную среду при температуре 23-30°С в течение 5-10 дней для оценки репродукции и роста грибов.
7. Способ по п.6, дополнительно включающий этап постепенного добавления минерального органического источника к указанной культуральной среде, предпочтительно начиная с четвертого дня после посева конидий, где указанный минеральный источник добавляется в количестве от 5 до 8 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды.
