Рекомбинантная плазмидная днк, содержащая гены синтеза бутанола из clostridium acetobutylicum (варианты), рекомбинантный штамм lactobacillus brevis - продуцент н-бутанола (варианты) и способ микробиологического синтеза н-бутанола
Владельцы патента RU 2375451:
Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству н-бутанола путем ферментации углеводосодержащего сырья рекомбинантными бактериями. Сконструированы рекомбинантные плазмидные ДНК: pBCS, содержащая гены биосинтеза бутанола crt, bcd, etfB, etfA и hbd из C.acetobutylicum и pTHL-BCS, содержащая помимо ранее перечисленных ген thi из C.acetobutylicum. Плазмиды способны реплицироваться как в грамотрицательных (Е.соli), так и в грамположительных (L.brevis) бактериях. Получены рекомбинантные штаммы-продуценты н-бутанола на основе бактерий Lactobacillus brevis: штамм Lactobacillus brevis ВКПМ В-10044, содержащий плазмиду pBCS; штамм Lactobacillus brevis ВКПМ В-10043, содержащий плазмиду pTHL-BCS, способные синтезировать бутанол и устойчивые к его концентрации 2,0-2,8 мас.% в жидкой среде. Разработан способ микробиологического синтеза бутанола на основе рекомбинантных бактерий L.brevis, совмещающих способность синтезировать бутанол с устойчивостью к его концентрациям в жидкой среде не менее 2,0 мас.%, позволяющий получать бутанол при использовании в качестве источника углерода в средах для культивирования как глюкозы, так и ксилозы. Изобретение позволяет повысить эффективность синтеза. 5 н.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил.
Группа заявляемых изобретений относится к биотехнологии, в частности к производству н-бутанола путем ферментации углеводосодержащего сырья микроорганизмами, и представляет собой рекомбинантные плазмидные ДНК, включающие гены синтеза бутанола из Clostridium acetobutylicum (С.acetobutylicum), рекомбинантные штаммы бактерий Lactobacillus brevis (L. brevis), содержащие эти плазмиды и сочетающие способность синтезировать н-бутанол с устойчивостью к его повышенным концентрациям, а также способ микробиологического синтеза н-бутанола.
н-Бутанол (бутанол) - четырехуглеродный спирт, широко используемый в различных отраслях промышленности. Он применяется для производства красок, нитроэмалей, пластификаторов, бутилацетата, фенолоформальдегидных смол и присадок к смазочным маслам, используется в качестве растворителя, является экстрагентом для жиров. Благодаря высокому содержанию энергии, низкой летучести, хорошей смешиваемости, высокому октановому числу бутанол рассматривают в качестве перспективного топлива в двигателях внутреннего сгорания.
В промышленности бутанол получают химическим синтезом из пропилена или ацетальдегида, а также путем ферментации углеводосодержащего сырья бактериями рода Clostridium.
Получение бутанола и ацетона с помощью анаэробных бактерий Clostridium acetobutylicum, разработанное Вайцманом в первой половине XX века [1], стало к середине века одним из крупнейших биотехнологических процессов. В настоящее время производство бутанола ферментативным путем с использованием существующих промышленных штаммов бактерий рода Clostridium экономически невыгодно. Одной из главных причин этого является невысокая производительность штаммов, обусловленная их чувствительностью к конечному продукту ферментации - бутанолу.
В источниках информации имеются сведения об устойчивых к бутанолу микроорганизмах, представляющих собой природные, либо полученные методами селекции или генной инженерии штаммы. Это бутанол-устойчивые штаммы клостридий, лактобацилл, энтеробактерий [2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11]. Во всех перечисленных случаях штаммы устойчивы к концентрации бутанола в среде, не превышающей 2,5 мас.%. Среди них нет штаммов, синтезирующих бутанол за счет гетерологичной экспрессии генов метаболического пути синтеза бутанола из других организмов. У природных штаммов Clostridium уровень синтеза бутанола не превышает 1,5 мас.%, после чего происходит ингибирование дальнейшего синтеза конечным продуктом - бутанолом. Штаммы, уровень устойчивости которых к бутанолу не превышает 1,5 мас.%, считают чувствительными к бутанолу.
Ближайшим аналогом заявляемых штаммов является штамм Lactobacillus plantarum PN 0512 [8], который не синтезирует бутанол, но устойчив к концентрации 2 мас.% бутанола в жидкой среде.
Известны способы микробиологического синтеза бутанола с использованием рекомбинантных штаммов-продуцентов бутанола, полученных на основе бактерий Escherichia coli (E.coli.).
Гены тиолазы (thiL), альдегид-алкоголь дегидрогеназы (adhe) и bcs-oпepoна (кротоназы (crt), бутирил-СоА-дегидрогеназы (bcd), субъединиц флавопротеина ETF (etfB и etfA), 3-гидроксибутирил-СоА-дегидрогеназы (hbd)) из С.acetobutylicum клонированы в E.coli с использованием экспрессионного вектора рКК223-3 под контролем конституитивного tac-промотора (Ptac) [12]. Максимальный уровень синтеза бутанола-1200 мг/л, достигают путем анаэробной 60-часовой инкубации предварительно выращенной и сконцентрированной до плотности 20 ОЕ клеточной биомассы в ферментационной среде, содержащей глюкозу. Пределы устойчивости к бутанолу в данной работе не исследованы.
В другой работе [13] гены из С.acetobutylicum, существенные для синтеза бутанола, клонированы и экспрессированы в E.coli с использованием совместимых плазмидных векторов pZE12-luc [14] и pACYC184 (New England Biolabs). Сконструированная на основе вектора pZE12-luc плазмида pJCL50 содержит гены тиолазы и алкоголь-альдегид дегидрогеназы под контролем ИПТГ-индуцибельного промотора PLlacO1 бактериальный участок инициации репликации для E. coli ColEl и ген устойчивости к ампициллину. Сконструированная на основе вектора pACYC184 плазмида pJCL60 содержит гены кротоназы, бутирил-КоА-дегидрогеназы, субъединиц флавопротеина ETF и гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы под контролем ИПТГ-индуцибельного промотора PLlacO1 бактериальный участок инициации репликации для E.coli р15А и гены устойчивости к тетрациклину и хлорамфениколу. Благодаря совместимости ColEl и р15А, плазмиды pJCL50 и pJCL60 сосуществуют в клетках Е. coli и обеспечивают синтез бутанола. Плазмида pJCL60 является ближайшим аналогом заявляемых плазмид, но она способна реплицироваться только в E.coli.
Ближайшим аналогом заявляемого способа является способ микробиологического синтеза бутанола с использованием рекомбинантного штамма Е. coli JCL198, трансформированного плазмидами pJCL50 и pJCL60 (т.е. содержащего гены тиолазы, алкоголь-альдегид дегидрогеназы, кротоназы, бутирил-КоА-дегидрогеназы, субъединиц флавопротеина ETF и гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназы из С.acetobutylicum, ответственные за синтез бутанола) и выращенного в микроаэрофильных условиях на среде, содержащей глюкозу. Уровень синтеза бутанола в этом случае не превышает 20 мг/л. Предел устойчивости штамма Е. coli JCL198 к бутанолу - 1,5% [13].
Более высокий уровень синтеза бутанола (552 мг/л) получен с использованием рекомбинантного штамма Е. coli JCL187, трансформированного плазмидами pJCL60 и pJCL17 (производная плазмиды pJCL50, в которой ген тиолазы из С.acetobutylicum замещен на ген atoQ, кодирующий тиолазу в Е. coli) и дополнительно содержащего делеции собственных генов альдегид-алкоголь дегидрогеназы (adhE), лактат дегидрогеназы (ldhA), фумарат редуктазы (frdBC), анаэробного репрессора пируват декарбоксилазы (fnr) и фосфотрансацетилазы (pta). В качестве субстрата для ферментации использован глицерин [13].
Задача заявляемой группы изобретений состоит в разработке способа микробиологического синтеза бутанола на основе рекомбинантных бактерий, совмещающих способность синтезировать бутанол с устойчивостью к его повышенным концентрациям.
Задачу решают путем:
- конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК (плазмиды) pBCS, способной реплицироваться как в грамотрицательных (E.coli), так и в грамположительных (L.brevis) бактериях и содержащей гены биосинтеза бутанола (crt, bcd, et/fB, etfA и hbd) из С.acetobutylicum, контролируемые их собственными регуляторными элементами;
- конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК (плазмиды) pTHL-BCS, способной реплицироваться как в грамотрицательных (E.coli), так и в грамположительных (L.brevis) бактериях и содержащей гены биосинтеза бутанола (thl, crt, bcd, etfB, etfA и hbd) из С.acetobutylicum, контролируемые их собственными регуляторными элементами;
- конструирования рекомбинантного штамма бактерий L.brevis ВКПМ 5563/pBCS, способного синтезировать бутанол и устойчивого к его концентрации 2,0 мас.% в жидкой среде;
- конструирования рекомбинантного штамма бактерий L.brevis ВКПМ 5563/pTHL-BCS, способного синтезировать бутанол и устойчивого к его концентрации 2,8 мас.% в жидкой среде;
- разработки способа микробиологического синтеза бутанола на основе рекомбинантных бактерий L.brevis, совмещающих способность синтезировать бутанол с устойчивостью к его концентрациям в жидкой среде не менее 2,0 мас.%.
Процесс получения заявляемых штаммов состоит из несколько этапов.
Этап 1. Конструирование рекомбинантных плазмидных ДНК pBCS и pTHL-BCS, содержащих гены из С.acetobutylicum, ответственные за синтез бутанола.
Плазмиду pBCS конструируют на основе шаттл-вектора pHYc, способного реплицироваться в широком круге грамположительных и грамотрицательных бактерий [15]. Вектор pHYc содержит ген bla, обеспечивающий устойчивость штаммов Е. coli к ампициллину; ген cmr, обеспечивающий устойчивость лактобацилл к хлорамфениколу; участки инициации репликации для грамотрицательных (ori-177) и грамположительных (ori-pAMal) бактерий.
Плазмида pBCS наряду с генами вектора pHYc содержит промотор, кодирующую область и терминатор транскрипции bcs-оперона из С.acetobutylicum. Кодирующая область bcs-оперона включает следующие гены, ответственные за синтез бутанола: кротоназы (crt), бутирил-СоА-дегидрогеназы (bcd), субъединиц флавопротеина ETF (etfB и etfA) и 3-гидроксибутирил-СоА-дегидрогеназы (hbd).
Плазмида pTHL-BCS сконструирована на основе плазмиды pBCS и содержит помимо ранее перечисленных генов ген тиолазы (thl) из С.acetobutylicum.
Этап 2. Трансформация плазмидами pBCS или pTHL-BCS штамма-реципиента.
В качестве штамма-реципиента выбран штамм ВКПМ 5563, относящийся к виду бактерий L. brevis, природные представители этого вида не синтезируют бутанол, но способны синтезировать другой спирт - этанол. В отличие от остальных лактобацилл бактерии L.brevis способны утилизировать не только глюкозу, но и ксилозу, то есть имеют более широкий спектр ферментируемых субстратов [16].
Процесс трансформации осуществляют методом электропорации [16]. В результате получают рекомбинантные штаммы L.brevis ВКПМ 5563/pBCS и L.brevis ВКПМ 5563/pTHL-BCS, способные синтезировать бутанол.
Этап 3. Адаптация штаммов L.brevis к повышенным концентрациям бутанола.
Штаммы L. brevis адаптируют к повышенным концентрациям бутанола путем ряда последовательных пересевов с постепенным увеличением концентрации бутанола в среде.
Клетки выращивают в течение 2-3 дней при 25°С на среде MRS следующего состава, мас.%:
| пептон | 1 |
| мясной экстракт | 1 |
| дрожжевой экстракт | 0,5 |
| глюкоза | 2 |
| твин 80 | 0,1 |
| К2НРO4 | 0,2 |
| ацетат Na | 0,5 |
| цитрат (NH4)2 | 0,2 |
| MgSO4×7H2O | 0,02 |
| MnSO4×H2O | 0,005 |
| вода | остальное, |
дополнительно содержащей бутанол. Начальная концентрация бутанола в среде - 0,4 мас.%. С каждым последующим пересевом концентрацию бутанола увеличивают на 0,4 мас.%.
В результате проведения работы в соответствии с перечисленными этапами получены два устойчивых к бутанолу штамма, каждый из которых содержит один из двух наборов генов биосинтеза бутанола из С.acetobutylicum:
L.brevis ВКПМ 5563/pBCS депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов как Lactobacillus brevis ВКПМ В-10044;
L.brevis ВКПМ 5563/pTHL-BCS депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов как Lactobacillus brevis ВКПМ В-10043.
Заявляемые штаммы ВКПМ В-10043 и ВКПМ В-10044 имеют общие морфологические и физиолого-биохимические признаки, но различаются генотипически.
Морфологические признаки.
Клетки прямые, палочковидные, подвижные, грамположительные, неспорообразующие. При выращивании в течение 24-72 час при температуре 25-30°С на агаризованных средах (MRS, MSS и молочной) колонии шероховатые, круглые, матовые, творожисто-белые, край неровный.
Состав среды MSS, мас.%:
| глюкоза | 6 |
| дрожжевой экстракт | 0,5 |
| ацетат NH4 | 0,3 |
| КН2РO4 | 0,1 |
| MgSO4×7H2O | 0,1 |
| K2НРO4 | 0,08 |
| цистеин - HCl | 0,05 |
| FeSO4×7H2O | 0,005 |
| пара-аминобензойная кислота | 0,001 |
| вода | остальное |
Состав молочной среды, мас.%:
| стерильное обезжиренное молоко | 10 |
| натрий лимоннокислый | 1 |
| дрожжевой экстракт | 2 |
| глюкоза | 1 |
| вода | остальное |
Физиолого-биохимические признаки
Оба штамма растут при температуре от 20 до 40°С (оптимум 30°С, рН 4.0-6.0) В качестве источника углерода утилизируют глюкозу, фруктозу, ксилозу и арабинозу. Плохо растут на мальтозе и галактозе. Не усваивают сахарозу и целлобиозу. В качестве источника азота используют минеральный азот в аммонийной форме, а также органический азот в виде пептона, аминокислот.
Принадлежность заявляемых штаммов к виду L.brevis подтверждена на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рДНК.
Штамм L.brevis ВКПМ В-10044 синтезирует бутанол и устойчив к концентрациям бутанола 2,0 мас.% в жидкой среде.
Штамм L.brevis ВКПМ В-10043 синтезирует бутанол и устойчив к концентрациям бутанола 2,8 мас.% в жидкой среде.
Генотипические признаки
Оба штамма устойчивы к хлорамфениколу и канамицину.
Штамм L.brevis ВКПМ В-10044 содержит на плазмиде pBCS гены биосинтеза бутанола (crt, bсd, etfB, etfA и hbd) из С.acetobutylicum
Штамм L.brevis ВКПМ В-10043 содержит на плазмиде pTHL-BCS гены биосинтеза бутанола (thl, crt, bcd, etfB, etfA и hbd) из С.acetobutylicum.
Способ в общем виде
Посевной материал, представляющий собой клетки рекомбинантного штамма-продуцента, подготавливают путем инкубации в течение 24-48 час при температуре 20-30°С на среде MRS, содержащей 10 мг/мл хлорамфеникола и 12,5 мг/мл канамицина. Затем выросшую культуру переносят в соотношении 1:50 (по объему) в модифицированную среду MRS, содержащую 4% глюкозы, 10 мг/мл хлорамфеникола и 12,5 мг/мл канамицина.
Процесс культивирования ведут в 50 мл флаконах в течение 24-48 час при температуре 20-30°С, в микроаэрофильных условиях, которые достигают за счет заполнения флаконов доверху средой. Количество синтезированного бутанола определяют методом газовой хроматографии в пробах, отобранных из культуральной жидкости после удаления клеток центрифугированием при 5000g. Уровень синтеза бутанола заявляемым способом достигает 300 мг/л, что в 10-15 раз превышает таковой у ближайшего аналога.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами графических изображений.
Фиг.1. Схема рекомбинантной плазмидной ДНК pBCS.
Фиг.2. Схема рекомбинантной плазмидной ДНК pTHL-BCS.
Изобретение подтверждено следующими примерами.
Пример 1. Клонирование генов бактерий С.acetobutylicum, ответственных за синтез бутанола
В синтезе бутанола бактериями С.acetobutylicum принимают участие следующие ферменты:
1. Тиолаза катализирует превращение двух молекул ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА и КоА.
2. 3-Гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназа катализирует превращение ацетоацетил-КоА в 3-гидроксибутирил-КоА с использованием NADH (NADH-никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма) в качестве кофактора.
3. Кротоназа катализирует превращение 3-гидроксибутирил-КоА в кротонил-КоА с высвобождением Н2О.
4. Бутирил-КоА дегидрогеназа с помощью состоящего из двух субъединиц белка электронного транспорта ETF катализирует превращение кротонил-КоА в бутирил-КоА.
5. Бутиральдегид дегидрогеназа осуществляет превращение бутирил-КоА в бутиральдегид и КоА, реакция является NADH-зависимой.
6. Бутанол дегидрогеназа катализирует превращение бутиральдегида в бутанол с использованием NADH в качестве кофактора.
Гены C.acetobutylicum, кодирующие кротоназу, бутирил-КоА-дегидрогеназу, субъединицы флавопротеина ETF и 3-гидроксибутирил-КоА-дегидрогеназу организованы в bcs-оперон.
Праймеры для амплификации генов тиолазы и bcs-оперона конструируют на основе анализа полного генома С.acetobutylicum ATCC 824 (Табл.1).
Таблица 1
Последовательности праймеров для амплификации генов тиолазы и bcs-оперона из С.acetobutylicum.
| Гены | Праймеры | Последовательность 5'→3' |
| bcs-оперон: crt, bcd, etfB, etfA, hbd | Bcs_for Bcs_rev |
ATCCTTCTTTTCTTCTATCATATC AGCCGAGATTAGTACGGTAATG |
| thl | Thl_for Thl_rev |
TTTGGAGTATTAAAGGATAGAC TTAGCCTCATAATCTTTCAAATG |
Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции проводят по известным методикам [17, 18,19].
Штамм С.acetobutylicum 7 (Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44, №1, с.49-55) получен из музея Московского государственного университета. Штамм хранят и поддерживают путем периодического пересева в среде MSS.
Среду MSS с внесенным посевным материалом штамма С.acetobutylicum 7 в соотношении 50:1 (по объему) пастеризуют в водяной бане в течение 20 мин при 80°С и инкубируют анаэробно при 37°С в течение 24 час. Клетки отделяют центрифугированием при 5000g. Из полученной биомассы выделяют геномную ДНК.
Гены тиолазы и bcs оперона амплифицируют с использованием специфических праймеров (табл.1), геномной ДНК С.acetobutylicum 7 и KOD - полимеразы повышенной точности (Novagen). В результате получают ПЦР-фрагменты: THL, содержащий ген тиолазы и на 99% гомологичный фрагменту полного генома С.acetobutylicum ATCC 824, расположенному между 3005706 и 3007561 п.н. и BCS, содержащий гены bcs-оперона и на 99% гомологичный фрагменту полного генома С.acetobutylicum ATCC 824, расположенному между 2831629 и 2836638 п.н. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Полученные ПЦР-фрагменты клонируют в ТОРО-вектор (Invitrogen). Правильность клонирования подтверждают секвенированием каждой из рекомбинантных вставок. В конечном итоге получают рекомбинантные плазмиды: pTOPO-THL, содержащую ген тиолазы, и рТОРО-BCS, содержащую гены bcs оперона. Активности ферментов синтеза бутанола определяют общепринятыми методами [20, 21, 22]. Уровни удельной активности нативных ферментов, ответственных за синтез бутанола у С.acetobutylicum, и соответствующих ферментов у рекомбинантных штаммов E.coli подтверждают экспрессию генов из C.acetobutylicum в E.coli (Табл.2).
Таблица 2
Удельная активность (Ед/мг белка, мин) нативных ферментов, ответственных за синтез бутанола у C.acetobutylicum, и соответствующих ферментов у рекомбинантных штаммов
| Фермент | Нативные ферменты С.acetobutylicum | Нативные ферменты E.coli | Ферменты у рекомбинантных штаммов E.coli |
| тиолаза | 15,5 | - | 15,2 |
| 3-гидроксибутирил-КоА-деги- дрогеназа |
10,2 | - | 10,7 |
| Кротоназа | 86,8 | - | 207 |
Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pBCS
С целью экспрессии генов синтеза бутанола из бактерий C.acetobutylicum в бактериях L.brevis конструируют плазмиду pBCS (содержит bcs-оперон) на основе шаттл-вектора pHYc.
Вектор pHYc и плазмиду pTOPO-BCS (пример 1) обрабатывают рестриктазами BamHI и XbaI. Фрагмент плазмиды pTOPO-BCS, содержащий bcs-оперон, лигируют с более крупным XbaI/BamHI фрагментом вектора pHYc, полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli. В результате получают рекомбинантный штамм Е. coli/pBCS, содержащий плазмиду pBCS. Первичную структуру плазмиды pBCS подтверждают секвенированием. Штамм Е. coli/pBCS не синтезирует бутанол, несмотря на активность ферментов bсs-оперона.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pBCS (SEQ ID NO 1) имеет размер 9954 пары нуклеотидов (п.н.) и содержит гены биосинтеза бутанола (crt, bcd, etfB, etfA и hbd) из С.acetobutylicum, регулируемые их собственными промотором (р) и терминатором (t); ген bla, обеспечивающий устойчивость Е. coli к ампициллину (Ар); ген cmr, обеспечивающий устойчивость L.brevis к хлорамфениколу (Cm); участки инициации репликации для грамотрицательных (ori-177) и грамположительных (ori-pAMa1) бактерий (фиг.1).
Пример 3. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pTHL-BCS
С целью экспрессии расширенного набора генов синтеза бутанола из бактерий C.acetobutylicum в бактериях L.brevis на основе шаттл-вектора pHYc конструируют плазмиду pTHL-BCS, содержащую bcs-оперон и ген тиолазы.
Плазмиду pTOPO-THL (пример 1) обрабатывают рестриктазой EcoRI. Фрагмент ДНК, содержащий ген тиолазы, обрабатывают фрагментом Кленова и лигируют с плазмидой pBCS, предварительно линеаризованной по сайту рестриктазы SmaI. Лигазной смесью трансформируют клетки E.coli. В результате получают рекомбинантный штамм Е. coli/pTHL-BCS, содержащий плазмиду pTHL-BCS и синтезирующий бутанол в количестве 10 мг/л. Первичную структуру плазмиды pTHL-BCS подтверждают секвенированием.
Рекомбинантная плазмидная ДНК pTHL-BCS (SEQ ID NO 2) имеет размер 11787 п.н. и содержит гены биосинтеза бутанола (crt, bcd, etfB, etfA и hbd) из С.acetobutylicum, регулируемые их собственными промотором (р) и терминатором (t); ген тиолазы из С acetobutylicum, регулируемый собственными промотором (р) и терминатором (t); ген bla, обеспечивающий устойчивость Е. coli к ампициллину (Ар); ген cmr, обеспечивающий устойчивость L.brevis к хлорамфениколу (Cm); участки инициации репликации для грамотрицательных (ori-177) и грамположительных (ori-pAMal)
бактерий (фиг.2).
Пример 4. Получение заявляемого штамма L.brevis ВКПМ В-10044
Штамм L.brevis ВКПМ 5563 (не синтезирующий бутанол) получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Чувствительность штамма ВКПМ 5563 к действию хлорамфеникола в концентрациях, превышающих 5 мг/л, и устойчивость к действию канамицина в концентрациях, не превышающих 15 мг/л, установлены с помощью тестирования на MRS-агаре, содержащем соответствующие антибиотики.
С целью получения рекомбинантного штамма клетки L.brevis ВКПМ 5563 трансформируют плазмидой pBCS методом электропорации. Селекцию трансформантов проводят на MRS-агаре, содержащем одновременно хлорамфеникол (10 мг/л) и канамицин (12,5 мг/л). Наличие плазмиды подтверждают методом полимеразной цепной реакции. Затем рекомбинантный штамм L.brevis ВКПМ 5563/pBCS модифицируют путем адаптации к повышенным концентрациям бутанола в среде. В результате получают заявляемый штамм L.brevis ВКПМ В-10044, способный синтезировать бутанол (примеры 6,7) и устойчивый к концентрации 2 мас.% бутанола в жидкой среде, что соответствует уровню устойчивости к бутанолу ближайшего аналога.
Пример 5. Получение заявляемого штамма L.brevis ВКПМ В-10043
Получение штамма осуществляют, как в примере 4, но вместо плазмиды pBCS используют плазмиду pTHL-BCS. В результате трансформации с последующей модификацией получают заявляемый штамм L.brevis ВКПМ В-10043, способный синтезировать бутанол (пример 8) и устойчивый к концентрации 2,8 мас.% бутанола в жидкой среде, что в 1,4 раза превышает уровень устойчивости к бутанолу ближайшего аналога.
Пример 6. Синтез бутанола с использованием штамма L.brevis ВКПМ В-10044 на среде с глюкозой
Посевной материал выращивают путем инкубации клеток штамма L.brevis ВКПМ В-10044 при температуре 25°С в течение 48 час на среде MRS, содержащей 10 мг/мл хлорамфеникола и 12,5 мг/мл канамицина.
Модифицированную среду MRS, содержащую 4% глюкозы, 10 мг/мл хлорамфеникола и 12,5 мг/мл канамицина, засевают подготовленным посевным материалом и ведут процесс ферментации в микроаэрофильных условиях, в течение 48 час при температуре 25°С. Уровень синтеза бутанола составляет 300 мг/л.
Пример 7. Синтез бутанола с использованием штамма L.brevis ВКПМ В-10044 на среде с ксилозой
Процесс ведут, как в примере 6, но с использованием модифицированной среды MRS, содержащей 4% ксилозы. Уровень синтеза бутанола составляет 100 мг/л.
Пример 8. Синтез бутанола с использованием штамма L.brevis ВКПМ В-10043 на среде с глюкозой
Процесс ведут, как в примере 6, но с использованием штамма L.brevis ВКПМ В-10043.
Уровень синтеза бутанола на среде MRS, содержащей 4% глюкозы, составляет 200 мг/л.
Таким образом, в заявляемых результатах впервые продемонстрирована возможность получения бактерий Lactobacillus brevis, синтезирующих бутанол, устойчивых к его повышенным концентрациям, а в средах для культивирования в качестве источников углерода использующих как глюкозу, так и ксилозу.
Штаммы L. brevis/pBCS и L. brevis/pTHL-BCS получены путем комбинации генно-инженерных и адаптационных методов. Для синтеза бутанола бактериями L.brevis достаточно экспрессии следующего набора генов из C.acetobutylicum: crt (кротоназы), bcd (бутирил-СоА-дегидрогеназы), etfA, etfB (субъединиц флавопротеина ETF) и hbd(3-гидроксибутирил-СоА-дегидрогеназы). Вероятно, в этом случае часть реакций биосинтеза бутанола (синтез бутиральдегида и бутанола) выполняется за счет собственных ферментов клетки-хозяина. Экспрессия гена тиолазы в штамме L. brevis/pTHL-BCS наряду с вышеперечисленными генами не приводит к повышению уровня синтеза бутанола.
Уровень синтеза бутанола у заявляемых рекомбинантных штаммов лактобацилл значительно превосходит таковой у ближайшего аналога в сходных условиях культивирования, а устойчивость их к бутанолу сопоставима с результатами, экспериментально подтвержденными на лактобациллах и других бактериях.
Способность заявляемых штаммов синтезировать бутанол путем ферментации как глюкозы, так и ксилозы, позволяет использовать в качестве субстратов для ферментации гидролизаты растительной биомассы, представляющие собой дешевое непищевое сырье.
Заявляемые рекомбинантные штаммы-продуценты бутанола относятся к виду L.brevis, природные представители которого не способны синтезировать бутанол. Введение нового вида бактерий в число продуцентов бутанола дает дополнительные возможности для разработки более эффективных путей его биосинтеза.
Источники информации
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pBCS, предназначенная для трансформации бактерий Lactobacillus brevis, имеющая размер 9954 п.н., содержащая промоторную, кодирующую и терминирующую области bcs-оперона из Clostridium acetobutylicum, включающего гены биосинтеза бутанола: crt, bcd, etfB, etfA. и hbd, а также ген устойчивости к ампициллину bla, ген устойчивости к хлорамфениколу cmr и участки инициации репликации ori-177 для грамотрицательных и ori-pAMal для грамположительных бактерий, соответствующая нуклеотидной последовательности SEQ ID NO I.
2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTHL-BCS, предназначенная для трансформации бактерий Lactobacillus brevis, имеющая размер 11787 п.н., содержащая промоторную, кодирующую и терминирующую области bcs-оперона из Clostridium acetobutylicum, включающего гены биосинтеза бутанола: crt, bcd, etfB, etfA. и hbd, промоторную, кодирующую и терминирующую области гена ml из Clostridium acetobutylicum, а также ген устойчивости к ампициллину bla, ген устойчивости к хлорамфениколу cmr и участки инициации репликации ori-177 для грамотрицательных бактерий и ori-pAMal для грамположительных бактерий, соответствующая нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 2.
3. Рекомбинантный штамм Lactobacillus brevis ВКПМ В-10044 - продуцент н-бутанола, полученный трансформацией штамма Lactobacillus brevis ВКПМ 5563 плазмидной ДНК по п.1.
4. Рекомбинантный штамм Lactobacillus brevis ВКПМ В-10043 - продуцент н-бутанола, полученный трансформацией штамма Lactobacillus brevis ВКПМ 5563 плазмидной ДНК по п.2.
5. Способ микробиологического синтеза н-бутанола, предусматривающий культивирование рекомбинантных бактерий, содержащих гены биосинтеза н-бутанола из Clostridium acetobutylicum, в микроаэрофильных условиях в питательной среде, включающей источники углерода, азота и минеральные добавки до максимального накопления целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцентов, содержащих гены биосинтеза н-бутанола из Clostridium acetobutylicum, используют рекомбинантные бактерии Lactobacillus brevis, полученные трансформацией бактерий Lactobacillus brevis плазмидной ДНК по п.1 или 2 и совмещающие способность синтезировать н-бутанол с устойчивостью к концентрации н-бутанола в жидкой среде от 2,0 мас.% и выше, а в качестве углерода в средах для культивирования используют глюкозу и/или ксилозу.
