Способ иммунотерапии костно-мозговыми предшественниками дендритных клеток, сенсибилизированных фотомодифицированными опухолевыми клетками in vivo, больных диссеминированными солидными опухолями

Изобретение относится к медицине, онкологии и может быть использовано для противоопухолевой иммунотерапии больных солидными опухолями. Для этого после сеанса фотодинамической терапии первичной опухоли или ее метастазов вводят аутологичные костно-мозговые предшественники дендритных клеток в дозе 3×10⁶ клеток/кг веса пациента в 3,5 мл официнального физиологического раствора для инъекций и 1,0 мл альбумина человека. Введение осуществляют в точки интратуморально и по периферии ФДТ-модифицированной опухоли, также по периферии пораженных паховых лимфоузлов и межпальцевые промежутки стопы или кисти по 0,5 мл. Первые 5 введений проводят ежедневно. Затем последующие пять введений проводят каждые три недели 2-3-мя курсами. Способ позволяет активировать специфический противоопухолевый иммунитет.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для вакцинотерапии диссеминированных солидных опухолей.

Известен способ противоопухолевой иммунотерапии больных солидными опухолями дендритными клетками, полученных из моноцитов периферической крови и нагруженных апоптотическими опухолевыми клетками ex vivo, который в среднем позволяет наблюдать до 15% объективных ответов (Qian К., Wang Y., Shi Н. et al. The primary clinical trial of dendritic cell vaccine pulsed with apoptosis tumor cell in patients with malignant cancers. - J. Clinical Oncology, 2007, Vol.25, No. 18S, p.13509; Dhodapkar M.V., Dhodapkar K.M., Palucka A.K. Interaction of tumor cells with dendritic cells: balancing immunity and tolerance. - Cell Death and Differentiation, 2008, Vol.15, pp.39-50). Кроме того, существует способ иммунотерапии плоскоклеточного рака у экспериментальных животных с помощью фотомодифицированых опухолевых клеток в апоптозе, тормозящий развитие опухоли у большинства вакцинированных животных (Korbelik М., Stott В., Sun J. Photodynamic therapy-generated vaccines: relevance of tumor cell death expression. - Br. J. Cancer, 2007, Vol.97, pp.1381-1387).

В последние годы стала очевидна большая роль дендритных клеток в "высокопрофессиональной" презентации низкоиммуногенных опухолеассоциированных антигенов. Показано, что дендритные клетки, а не сами опухолевые клетки ответственны за индукцию противоопухолевого иммунитета. Разработано представление об антигенспецифических дендритных клетках, которые участвуют в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки эффекторных CD8⁺ цитотоксических Т-лимфоцитов. Доказана многофункциональная направленность их действия, в частности обнаружено влияние на CD4⁺ Т-хелперы и регуляторные Т-клетки (Treg).

По современным представлениям снижение противоопухолевого иммунобиологического надзора при развитии опухоли связано с нарушением функции периферических дендритных клеток. Эти дефекты обусловлены прежде всего снижением экспрессии молекул класса I и II главного комплекса гистосовместимости, ответственного за презентацию антигенов и молекул CD80 и CD86, костимулирующих активность Т-лимфоцитов (Syme R., Bajwa R., Robertson L. at al. Comparison of CD34⁺ and monocyte-derived dendritic cells from mobilized peripheral blood from cancer patients. - Stem Cells, 2005, Vol.23, pp.74-81). Эти данные позволяют предположить, что дефекты противоопухолевого иммунитета могут быть преодолены обеспечением успешной презентации опухолеассоциированных антигенов.

Механизмы нарушения функции периферических дендритных клеток при развитии опухоли окончательно неясны. Существует предположение, что это связано с факторами, продуцируемыми опухолевыми клетками. Действительно, в эксперименте получены данные, свидетельствующие о том, что развитие опухоли у экспериментальных животных приводит к нарушению созревания дендритных клеток, снижению экспрессии молекул II класса главного комплекса гистосовместимости на их поверхности. При этом вакцинация мышей дендритными клетками, выращенными из костно-мозговых предшественников ех vivo, снижает рост опухоли, а введение зрелых дендритных клеток из селезенки не оказывает влияния на опухолевый рост. Было также показано, что супернатант опухолевых клеток снижает способность дендритных клеток контролировать цитотоксическую функцию аллогенных Т-клеток только в том случае, когда с ним инкубировали созревающие дендритные клетки, полученные из костного мозга, а не зрелые клетки из селезенки мыши с опухолью.

Эти данные были подтверждены при изучении функциональной активности дендритных клеток у больных диссеминированной карциномой молочной железы. Было показано, что зрелые дендритные клетки этих больных не способны стимулировать цитотоксичность Т-клеток, в то время как способность Т-лимфоцитов подвергаться аллогенной стимуляции не была нарушена. При этом дендритные клетки, дифференцированные в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) из костномозговых предшественников этих же больных, демонстрировали нормальный уровень функциональной активности.

Добавление супернатанта опухолевых клеток, полученных при культивировании клеточной линии рака молочной железы человека, снижало функцию дендритных клеток при их дифференцировке из CD34⁺ гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови человека под целенаправленным действием цитокинов. При этом впервые был расшифрован механизм этого подавления. Было показано, что действующим началом в опухолевом супернатанте является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), который, связываясь с Flt-1 рецептором на поверхности гемопоэтических предшественников, тормозит активность транскрипционного фактора NF-kB, что приводит к нарушению созревания дендритных клеток.

Таким образом, данные, полученные в эксперименте и у онкологических больных, демонстрируют дефектность периферических дендритных клеток, являющихся ключевым звеном в формировании противоопухолевого иммунитета. При этом было установлено, что сами костно-мозговые предшественники остаются интактными и способны при повторной стимуляции демонстрировать высокую функциональную активность.

Экспериментальные и клинические данные подтверждают противоопухолевую эффективность костно-мозговых предшественников дендритных клеток, стимулированных специфическими опухолеассоциированными антигенами, в том числе аутологичными опухолевыми клетками в апоптозе (Goldszmid R.S., Idouaga G., Bravo A.I. et al. Dendritic cells charged with apoptotic cells induce long-lived protective CD4⁺ and CD8⁺ T cell immunity against B16 melanoma. - J. Immunology, 2003, Vol.171, pp.5940-5947).

Результатов клинического исследования, аналогичного нашему методу, у больных солидными опухолями в доступной литературе не обнаружено. Это наряду с безопасностью метода позволяет считать костно-мозговые CD34⁺ предшественники дендритных клеток, сенсибилизированных фотомодифицированными опухолевыми клетками, перспективными кандидатами для активной специфической иммунотерапии пациентов с распространенными формами солидных опухолей, в том числе и резистентных к стандартному лечению (химиотерапии, иммунотерапии, лучевой терапии).

Прототипом нашего способа является противоопухолевая иммунотерапия ненагруженными костно-мозговыми предшественниками дендритных клеток (Liu Н., Hin J., Tao X. et al. Immunity of unloaded dendritic cells in lung melanoma of mice. - J. Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2007, Vol.27, No. 4, pp.381-384) и фотоиммунотерапия экспериментального колоректального рака дендритными клетками (Jalili A., Makowski М., Switaj Т. et al. Effective photoimmunotherapy of murine colon carcinoma induced by the combination of photodynamic therapy and dendritic cells. - Clinical Cancer Rec., 2004, Vol.10, pp.4498-4508).

Технический результат настоящего изобретения состоит в активации специфического противоопухолевого иммунитета на проводимую иммунотерапию. Этот результат достигается путем:

- стимуляции выхода стволовых CD34⁺ гемопоэтических клеток из костного мозга в периферическую кровь с помощью Г-КСФ ("Граноцит", 10 мкг/кг веса пациента, подкожно, в течение 5-ти дней);

- афереза стволовых гемопоэтических клеток на 4-й и 5-й день на сепараторе клеток крови "Coba Spectra". При этом получают клеточную суспензию мононуклеаров, содержащую 120×10⁶ и более клеток в 1 мл;

- дифференцировки клеточной суспензии в присутствии ГМ-КСФ в течение 5-ти дней. Разработанная методика позволяет получить 380×10⁷ и более функционально полноценных несенсибилизированных дендритных клеток с иммунофентипом CD11c⁺CDla⁺HLA DR⁺CD14^-CD19^-CD3^-CD56^-;

- внутривенного капельного введения фотосенсибилизатора;

- интерстициальной фотодинамической терапии. Длина волны излучения лазера должна соответствовать максимуму поглощения фотосенсибилизатора. Плотность мощности на торце световода 50-100 мВт/см². Доза света составляет 100-120 Дж;

введения 5-ти дневных, несенсибилизированных костно-мозговых предшественников дендритных клеток по разработанной нами схеме:

- одна доза препарата - 3×10⁶ клеток/кг веса пациента находится в 3,5 мл официнального 0,9% физиологического раствора для инъекций и 1,0 мл раствора альбумина человека;

- вводится в центр ФДТ-модифицированной опухоли, по ее периферии и эндолимфатически в 9 точек по 0,5 мл;

- 5 первых вакцинаций проводятся ежедневно, последующие пятикратные введения, от 2-х до 3-х и более курсов каждый 21-й день (число вакцинаций определяется количеством дифференцированных дендритных клеток).

Большим преимуществом нашего метода является и тот факт, что мы руководствуемся критериями "включения" и "исключения" в исследование больных солидными опухолями, а также проводим оценку токсичности и эффективности иммунотерапии костно-мозговыми дендритными клетками у этой категории больных.

Критерии включения:

1. Гистологически или цитологически верифицированный диагноз метастатической формы солидной опухоли с очагами поражения, доступными для биопсии и лазерного воздействия.

2. Мужчины и женщины старше 18 лет.

3. Наличие измеримых или оцениваемых очагов поражения, которые могут быть легко контролируемы физикальным обследованием или неинвазивными инструментальными методами.

4. Отсутствие какого-либо противоопухолевого лечения (химиотерапия, иммунотерапия, гормонотерапия, лучевая терапия) в течение последних 4-х недель или наличие явных признаков прогрессирования после их проведения.

5. Лабораторные исследования:

- клинический анализ периферической крови;

- биохимический анализ крови;

- иммунологические исследования.

6. Общее удовлетворительное состояние (индекс Карновского не менее 70%).

7. Ожидаемая продолжительность жизни не менее 3-х месяцев.

8. Подписание больным информированного согласия на участие в данном исследовании.

Критерии исключения:

1. Наличие метастатического поражения ЦНС.

2. Активный аутоиммунный процесс.

3. Больные с одной из перечисленных ниже инфекций: HIV-1, HIV-2, HBV, HCV, HTLV-1.

4. Наличие признаков системной инфекции или других тяжелых заболеваний сердечно-сосудистой, нервной, респираторной или эндокринной системы.

5. Наличие беременности или лактации.

6. Нарушение функции печени или почек (билирубин периферической крови >1,5×N, креатинин - >1,5×N).

7. Гематологические показатели:

- лейкоциты <2,5×10⁹/л

- лимфоциты <1,0×10⁹/л

- гемоглобин <90 г/л

- тромбоциты <75×10⁹/л.

8. Наличие в анамнезе опухоли другой локализации.

Оценка токсичности. Препарат должен быть безвреден для аутологичного больного. Контроль проводится в соответствии с критериями токсичности, рекомендованными ВОЗ. Мониторинг основных жизненных параметров (индекс Карновского, ЧСС, АД, температура оцениваются через 10, 30, 60 мин, каждые 2 и 24 часа). Особое внимание уделяется лихорадке, гастроинтестинальной и гематологической токсичности, а также функции печени, почек и нервной системы. В случае развития тяжелых побочных эффектов (3 или 4 степени) повторное введение аутологичных несенсибилизированных дендритных клеток этому пациенту применяться не будет. Больной будет исключен из исследования, однако, динамическое наблюдение за ним будет продолжено.

Оценка эффективности. Оценка эффективности проводится на основании частоты и степени выраженности объективных лечебных эффектов и продолжительности лечебного эффекта. Выраженность объективного лечебного эффекта определяется перед каждым введением препарата на основании рекомендаций ВОЗ (Miller A. et al., 1981). Кроме того, у больных отдельно оценивается иммунологическая активность препарата для людей. Установлено, что аутологичный препарат в сочетании с сеансом фотодинамической терапии вызывает рестриктированный иммунный ответ на опухолеассоцированные антигены у 100% первично иммунизированных больных. Это проявляется увеличением количества иммунокомпетентных клеток в два и более раз, и усилением их функциональной активности. В связи с этим до начала иммунотерапии костно-мозговыми дендритными клетками больных солидными опухолями, а также после каждого 5-кратного введения препарата и перед последующим курсом определяются иммунологические показатели (гиперчувствительность замедленного типа, количество и функциональная активность цитотоксических Т-лимфоцитов, Т-хелперов, В-клеток, естественных киллерных клеток и др.), производится гистологическое и иммуногистохимическое исследование биоптата отдаленного, не подвергнутого местному лечению, метастатического образования.

Изобретательский уровень и новизна метода заключается в том, что углубленное понимание механизмов прогрессии опухоли и взаимоотношений иммунной системы и опухоли, а также развитие биотехнологии обусловили реальные перспективы улучшения результатов лечения опухолей с помощью методов иммунотерапии. Несомненно, этот метод позволит определить место иммунотерапии несенсибилизированными костномозговыми дендритными клетками в сочетании с фотодинамической терапией в комплексном лечении больных солидными опухолями, наряду с химиотерапией, гормонотерапией, лучевой терапией и хирургическим лечением.

Положительный эффект нашего изобретения состоит в том, что мы предлагаем способ активации специфического противоопухолевого иммунитета на проводимую иммунотерапию аутологичными костно-мозговыми дендритными клетками в комплексном лечении больных распространенными формами солидных опухолей, в том числе резистентных к стандартному лечению (химиотерапии, иммунотерапии, лучевой терапии) с обязательным использованием показаний и противопоказаний к данному виду иммунотерапии.

Для лучшего понимания сущности заявленного изобретения, а также для подтверждения его соответствия условию "промышленная применимость" приводим примеры конкретной реализации способа.

Пример 1. Больная Б., 49 лет. Диагноз: Меланома кожи левой голени. Хирургическое лечение 28.03.02 г. Метастазы в мягких тканях правой голени и бедра, состояние после изолированной регионарной перфузии от 24.04.05. Метастазы в правых пахово-бедренных лимфоузлах, правой молочной железе, мягких тканях правой голени. Хирургическое лечение (ампутация правой молочной железы, удаление внутрикожных метастатических образований правой голени) от 14.05.07. Прогрессирование процесса на фоне иммунотерапии интерфероном-альфа. Метастазы в подвздошных лимфоузлах справа, паховых лимфоузлах справа, теле позвонка L3 с мягкотканым компонентом. Больная подписала информированное согласие и ей начата специфическая иммунотерапия (вакцинотерапия) на основе аутологичных костно-мозговых предшественников дендритных клеток, сенсибилизированных ФДТ-модифицированными опухолевыми клетками в апоптозе in vivo.

С 14.11.07 по 20.11.07 проводилась стимуляция костно-мозговых CD34⁺ гемопоэтических предшественников дендритных клеток с операцией афереза на 5-й и 6-й день. 3.12.07 внутривенно вводился фотосенсибилизатор и лазерное облучение метастатически пораженных паховых лимфоузлов справа. Через 12 часов после лазерного воздействия в очаг вводилась взвесь аутологичных дендритных клеток. Также дендритные клетки вводились по периферии пораженных паховых лимфоузлов слева и в 1-й межпальцевой промежуток левой стопы (эндолимфатически). Было выполнено 5 введений с интервалом 24 часа. Отмечены общие реакции, выражающиеся в повышении температуры тела до 37,8°С и ознобе через 2-3 часа после вакцинации. Местно - локальный отек тканей в месте введения вакцины. После 1-го курса вакцинотерапии отмечено купирование болевого синдрома, частичный регресс паховых лимфоузлов справа, увеличение абсолютного содержания лимфоцитов периферической крови с 1,23×10⁹/л до 3,38×10⁹/л.

С 24.12.07 по 29.12.07 проведен 2-й курс вакцинотерапии, на фоне которого температурная реакция носила менее выраженный характер и достигала субфебрильных цифр (до 37,3°С). Местная реакция также была незначительной - отек в месте введения развивался через 2 часа после вакцинации и полностью купировался через 3-4 часа. Все явления токсичности были 1-2 ст., носили кратковременный характер, купировались самостоятельно и не требовали применения фармакологических средств. Содержание лимфоцитов периферической крови в процессе лечения возросло с 1,68×10⁹/л до 3,44×10⁹/л. Объективными методами зарегистрирована стабилизация размеров конгломератов подвздошных лимфоузлов справа (по данным МРТ), однако его структура стала неоднородной за счет участков распада в центре, имеющих жидкостные характеристики. Отмечен также регресс правых паховых лимфоузлов с 27 мм до 18 мм (по данным УЗИ). Размеры деструкции в теле позвонка L3 и мягкотканого компонента в этой области - стабильных размеров.

Пример 2. Больная К., 54 года. Диагноз: Меланома кожи спины с метастазами в подмышечные лимфатические узлы слева, состояние после аксилярной лимфаденэктомии слева от 12.12.06. Метастазы в мягких тканях правого локтевого сустава, левых паховых лимфоузлах, подключичных лимфоузлах слева, мягких тканях левой верхней конечности, правого бедра, susp. тонкой кишке. Предшествующее лечение: 03.02.05 - широкое иссечение меланомы кожи спины. 12.12.06 аксилярная лимфаденэктомия справа. С марта 2007 г. по октябрь 2007 г. - терапия интерферономальфа в стандартном режиме с экскалацией дозы до 9 млн. Ед.

В связи с прогрессированием заболевания (появление опухолевых образований в области правого локтевого сустава, мягких тканях левой верхней конечности) пациентка подписала информированное согласие и включена в настоящее исследование. С 21.12.07 по 24.12.07 ей проводилась стимуляция костно-мозговых CD34⁺ гемопоэтических предшественников дендритных клеток с операцией афереза на 5-й и 6-й день. 28.12.07 внутривенно вводился фотосенсибилизатор и лазерное облучение мягкотканого очага в области правого локтевого сустава. С 29.12.07 по 2.01.08 проводился 1-й курс вакцинотерапии дендритными клетками, выращенных из аутологичных костно-мозговых предшественников и сенсибилизированных фотомодифицированными опухолевыми клетками в апоптозе in vivo. Дендритные клетки вводились в центр и по периферии ФДТ-модифицированной опухоли, в область пораженных паховых лимфоузлов слева и в 1-й межпальцевой промежуток правой кисти (эндолимфатически). Было выполнено 5 введений с интервалом 24 часа. На фоне проведения вакцинотерапии отмечались местные реакции, развивающиеся в течение 2-3 часов и общие реакции в виде повышения температуры до 38,0°С, снижающейся самостоятельно до нормальных величин через 5-6 часов после введения; спонтанные ощущения тепла и вибрации в областях, пораженных опухолевым процессом. После 1-го курса вакцинотерапии отмечено уменьшение в размерах мягкотканого образования в области правого локтевого сустава с 4,5 см до 3,5 см. С 16.01.08 по 21.01.08 проведен 2-й курс вакцинотерапии, который также сопровождался отеком в месте введения вакцинных дендритных клеток, ощущением тепла, повышением температуры тела до 38,5°С, уменьшением в размерах мягкотканого образования в области правого локтевого сустава до 2 см, полным регрессом 2-х из 7 мягкотканых образований верхней конечности слева. С 12.02.08 по 17.02.08 был проведен 3-й курс вакцинотерапии, на фоне которого наблюдались выше описанные транзиторные явления токсичности 1-2 ст., увеличение абсолютного содержания лимфоцитов периферической крови до 4,5×10⁹/л, уменьшение мягкотканого образования в области правого локтевого сустава до 1 см в диаметре, стабилизация процесса в паховых лимфоузлах слева (по данным компьютерной томографии).

Кроме того, клиническая эффективность метода подтверждалась лимфогистиоцитарной инфильтрацией отдаленных метастазов, не подверженных непосредственному лечебному воздействию (приложение 1), что, несомненно, свидетельствует о выраженной специфической активации иммунной системы пациентов с распространенным опухолевым процессом на фоне выраженной прогрессии опухолевого заболевания.

Таким образом, мы предлагаем способ иммунотерапии костно-мозговыми предшественниками дендритных клеток, сенсибилизированных фотомодифицированными опухолевыми клетками in vivo больных солидными опухолями наряду с традиционными методами: химиотерапией, лучевой терапией, хирургическим лечением.

Приложение 1.

ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Пациентка К., 54 года.

Гистологическое исследование первичной опухоли №К-69481 от 20.11.07. Экзофитная поверхностно распространяющаяся эпителиоидная и веретеноклеточная пигментная меланома кожи. Уровень инвазии по Кларку 4 балла. Толщина опухоли по Бреслоу 5 мм.

Гистологическое исследование метастатического образования на фоне специфической вакцинотерапии Б284481 от 17.01.08.

№1 (эксцизионная биопсия инфильтрата правого бедра): кусочки фиброзной ткани и жировой клетчатки с очаговыми смешанно-клеточными скоплениями, в которых наблюдаются крупные клетки со светлыми ядрами и светлой цитоплазмой (макрофаги? опухолевые клетки?), плазматические клетки, лимфоциты, небольшое количество сегментоядерных лимфоцитов, макрофаги с обломками клеток в цитоплазме, скудные скопления пигмента.

№2 (трепанбиопсия инфильтрата левой локтевой области): кусочек кожи с небольшим гиперкератозом без опухолевых изменений. В поле зрения обнаруживается небольшое количество сосудов в сосочковом слое дермы и протоков потовых желез, нервов в сетчатом слое дермы.

Иммуногистохимическое исследование метастатического образования на фоне специфической вакцинотерапии Б284481 от 17.01.08.

№1 (эксцизионная биопсия инфильтрата правого бедра): маленькие фрагменты фиброзной ткани(2,7×0,09 мм) с лимфогистиоцитарными инфильтратами. Подавляющее большинство клеточных инфильтратов - лимфоидные клетки (LCA+). Дальнейшая характеристика лимфоидного компонента невозможна из-за отсутствия в панели пан-Т и пан-В клеточных маркеров. Антитела к антигену CD8 демонстрируют наличие в инфильтрате небольшого количества цитотоксических Т-клеток. Характеристика хелперной субпопуляции невозможна из-за неспецифического окрашивания. Значительную долю в инфильтрате составляют гистиоциты (CD14+). Все использованные меланоцитарные маркеры (мелан-А, тирозиназа, НМВ45) отрицательные. Маркеры дендритных клеток CD83 и CD 1а отрицательные. CD95 - неспецифическое окрашивание. Вс1-2 экспрессируется преимущественно в лимфоидных клетках.

№2 (трепанбиопсия инфильтрата левой локтевой области): фрагменты жировой ифиброзной ткани, инфильтрированные лимфоцитами, гистиоцитами с большой примесью полиморфноядерных лейкоцитов. Основным клеточным компонентом инфильтратов являются лимфоциты (LCA+). Детально охарактеризовать лимфоидную популяцию не представляется возможным из-за отсутствия в панели пан-Т и пан-В клеточных маркеров. Характеристика хелперной субпопуляции невозможна из-за неспецифического окрашивания. Цитотоксические Т-лимфоциты присутствуют в небольшом количестве. Небольшую часть инфильтрата составляют гистиоциты (CD 14+). Все использованные меланоцитарные маркеры (мелан-А, тирозиназа, MITF, НМВ45) отрицательные. Маркеры дендритных клеток CD83 и CD 1а отрицательные. CD95 -неспецифическое окрашивание. Вс1-2 экспрессируется в лимфоидных клетках. Каспаза-3 экспрессируется преимущественно в лимфоидных клетках.

Способ противоопухолевой иммунотерапии больных солидными опухолями, включающий введение костно-мозговых предшественников дендритных клеток, отличающийся тем, что после сеанса фотодинамической терапии первичной опухоли или ее метастазов вводят аутологичные костно-мозговые предшественники дендритных клеток в дозе 3×10⁶ клеток/кг веса пациента в 3,5 мл официнального физиологического раствора для инъекций и 1,0 мл альбумина человека в точки: интратуморально и по периферии ФДТ-модифицированной опухоли, а также по периферии пораженных паховых лимфоузлов и межпальцевые промежутки стопы или кисти по 0,5 мл, причем первые 5 введений проводят ежедневно, затем последующие пять введений проводят каждые три недели 2-3-мя курсами.