4-((z)-4'-гидроксибутен-2'-ил)-2-r-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-c][1,2,4]триазин-7-оны

Настоящее изобретение относится к 4-((Z)-4′-гидроксибутен-2′-ил)-2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онам общей формулы (1)

обладающие противовирусным действием в отношении вируса герпеса простого типа 1 (ВПГ-1). Технический результат: получены новые производные 1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-она, обладающие полезными биологическими свойствами. 1 табл.

 

1. Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и медицины и касается Z-изомеров 4-(4'-гидроксибутен-2'-ил)-2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов, обладающих противовирусным действием в отношении вируса герпеса простого типа 1 (ВПГ-1), предназначенных для лечения и профилактики инфекционных заболеваний человека, вызванных вирусом герпеса простого типа 1. Изобретение может быть использовано в лечебных учреждениях и научно-исследовательских лабораториях.

2. Уровень техники

Актуальность проблемы противовирусной терапии в условиях выявления новых возбудителей опасных и медленных вирусных инфекций, а также быстрое появление мутантных штаммов вирусов, резистентных к применяемым лекарствам, вызывает потребность в новых эффективных и малотоксичных противовирусных препаратах. В настоящее время наиболее распространенной и перспективной группой противовирусных препаратов, эффективных в отношении вирусов герпеса, гепатитов, вируса иммунодефицита человека и других, являются ациклические нуклеозиды - ацикловир, ганцикловир, пенцикловир, его депо форма фамцикловир и проч. (Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2-х т. 14-е изд. М.: Новая волна. 2000. Т.1, 2.; Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. Под ред. Г.Л.Вышковского. М.: ООО РЛС-2004. 2004. 1503 с., E.De Clercq "Antiviral drugs: Current state of the art" J. of Clinical Virology 22 (2001) 73-89), которые являются структурными аналогами природных нуклеозидов пуринового ряда и ингибиторами ферментов синтеза вирусных нуклеиновых кислот

АЦИКЛОВИР	ГАНЦИКЛОВИР	ПЕНЦИКЛОВИР	ФАМЦИКЛОВИР

Недостатками имеющихся препаратов являются их низкая оральная биодоступность и достаточно высокая токсичность. Кроме указанных типов соединений имеются данные о противовирусном действии 6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-онов (Синтез и противовирусная активность 6-нитро-7-оксо-4,7-дигидроазоло [5,1-с][1,2,4]триазинов. В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский, О.Н.Чупахин, М.М.Зубаиров, А.Б.Капустин, Н.И.Митин и др. / Химико-фармацевтический журнал. № 9, 1990, с.41-44), являющихся структурными аналогами пуринов

Известна натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она дигидрат, которая принадлежит к ряду соединений, проявляющих противовирусное действие (О.Н.Чупахин, В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский, В.Н.Чарушин, А.Ю.Петров, О.И.Киселев. Натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрат, обладающая противовирусной активностью. Патент РФ №2294936 от 10.03.2007), которая может быть использована в медицинской практике, животноводстве, птицеводстве

Натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она дигидрат является близким структурным аналогом заявляемых соединений и потому выбрана в качестве прототипа. Указанное соединение проявляет противовирусную активность в отношении вирусов ВЭЛ (венесуэльский энцефаломиэлит лошадей), ЛДР (лихорадка долины Рифт), Синдбис, ВБА (вирус болезни Ауески), вируса гриппа птиц в отношении вируса ЗЭЛ (западный энцефаломиэлит лошадей).

Задачей изобретения является поиск новых соединений, обладающих более широким спектром противовирусного действия и низкой токсичностью.

3. Сущность изобретения

Сущность изобретения составляют 4-((Z)-4'-гидроксибутен-2'-ил)-2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-оны общей формулы (1)

обладающие противовирусным действием в отношении вируса герпеса простого типа 1 (ВПГ-1). Фрагмент R в заявляемых соединениях является либо водородом, либо метильной группой, либо метилтиогруппой.

4. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

4.1. Синтез заявляемых соединений

Синтез заявляемых соединений осуществляют в две стадии. На первой стадии исходное соединение 2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-он (2) последовательно обрабатывают водным раствором карбоната натрия и после выделения осадка нагревают с (Z)-4-бромбутен-2-илацетатом в ДМФА с образованием промежуточного соединения - 4-((Z)-4'-ацетоксибутен-2'-ил)-2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-она (3). Строение промежуточных соединений (3) подтверждено данными элементного анализа, ¹Н ЯМР, ¹³С ЯМР и ИК-спектроскопии

На второй стадии промежуточное соединение 4-((Z)-4'-ацетоксибутен-2'-ил)-2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]три-азин-7-он (3) обрабатывают в метаноле хлористым ацетилом и получают заявляемое соединение 4-((Z)-4'-гидроксибутен-2'-ил)-2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-он (1). Строение заявляемых соединений (1) подтверждено данными элементного анализа, ¹Н ЯМР, ¹³С ЯМР и ИК-спектроскопии

4.1.1. Синтез 4-((Z)-4'-Ацетоксибутен-2'-ил)-2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]три-азин-7-онов (3а-с). Суспензию 9.40 ммоль 6-фенил-2-R-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-она (2а-с) в 6 мл 17% раствора Na₂CO₃ перемешивают при комнатной температуре в течение 0.5 ч, осадок отфильтровывают, сушат и растворяют в 10 мл ДМФА. К полученному раствору добавляют 1.77 г (9.20 ммоль) (2)-4-бромбутен-2-илацетата и реакционную массу нагревают на водяной бане 2 ч. К охлажденной реакционной массе добавляют 200 мл воды, осадок отфильтровывают и кристаллизуют из изопропилового спирта.

3а (R=Н): (30%), т.пл. 83°C. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, δ м.д., ⁿJ/Гц): 2.04 (с, 3Н, ОАс); 4.82 (д.д, 2Н, Н(4'), ³J=6.5,⁴J=1.3 Гц); 5.16 (д.д, 2Н, H(1'), ³J=6.5, ⁴J=1.2 Гц); 5.85 (д.т.т, 1Н, Н(2'), ³J=11.0, ³J=6.5, ⁴J=1.3 Гц); 5.94 (д.т.т, 1Н, Н(3'), ³J=11.0, ³J=6.5, ⁴J=1.2 Гц); 7.49-7.54 (м, 3Н Нm, Нр); 8.01 (м, 2Н, Н₀); 8.45 (с, 1Н, Н-2). Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, δ м.д.): 20.63 (O-СО-СН₃), 50.88 (С(1')), 59.80 (С(4')), 126.42 (С(2')), 128.21 (Cm), 128.45 (Сo), 129.10 (С(3')), 129.66 (Ср), 132.22 (Ci), 139.15 (C(6)), 149.12 (C(7)), 150.94 (C(3a)), 153.29 (C(2)), 170.19 (O-СО-СН₃). Найдено (%) С, 59.09; Н, 4.45; N-21.65. Брутто формула: C₁₆H₁₅N₅O₃. Вычислено (%) С, 59.08; Н, 4.62; N, 21.54. ИК-спектр, ν/см^-1: 1713, 1745(С=O).

3b (R=Me): (60%), т.пл. 70°С. Спектр ЯМР ¹H (400 МГц, δ м.д., ⁿJ/Гц): 2.04 (с, 3Н, ОАс); 2.45 (с, 3Н, С(2)-Ме); 4.81 (д.д, 2Н, Н(4'), ³J=6.5, ⁴J=1.3 Гц); 5.11 (д.д, 2Н, Н(1'), ³J=6.6, ⁴J=1.3 Гц); 5.84 (д.т.т, 1Н, Н(2'), ³J=11.0, ³J=6.6, ⁴J=1.3 Гц); 5.93 (д.т.т, 1Н, Н(3'), ³J=11.0, ³J=6.5, ⁴J=1.3 Гц); 7.48-7.51 (м, 3Н, Нm, Нр); 8.00 (м, 2Н, Н₀). Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, δ м.д.): 14.30 (С2-Ме); 20.62 (O-СО-СН₃); 50.79 (С(1')), 59.81 (С(4')), 126.47 (С(2')), 128.17 (Сm), 128.40 (С₀), 129.03 (С(3')), 129.60 (Ср), 132.29 (Сi), 139.10 (С(6)), 148.60 (С(7)), 151.15 (С(3а)), 162.78 (С(2)), 170.17 (O-СО-СН₃). Найдено (%) С, 60.08; Н, 5.03; N, 20.84. С₁₇Н₁₇N₅О₃. Вычислено (%) С, 60.18; Н, 5.02; N, 20.64. ИК-спектр, ν/см^-1: 1714, 1740 (С=O).

3с (R=SMe): (67%), т.пл. 104°С. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, δ м.д., ⁿJ/Гц): 2.04 (с, 3Н, ОАс); 2.66 (с, 3Н, SMe); 4.81 (д.д, 2Н, Н(4'), ³J=6.5, ⁴J=1.3 Гц); 5.08 (д.д, 2Н, Н(1'), ³J=6.5, ⁴J=1.1 Гц); 5.81 (д.т.т, 1Н, Н(2'), ³J=11.0, ³J=6.5, ⁴J=1.1 Гц); 5.92 (д.т.т, 1Н, Н(3'), ³J=11.0, ³J=6.5, ⁴J=1.3 Гц); 7.48-7.52 (м, 3Н, Hm, Нр); 8.00 (м, 2Н, Н₀). Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, δ м.д.): 13.50 (SMe); 20.62 (O-СО-СН₃); 50.79 (C(1')); 59.81 (C(4')); 126.25 (C(2')); 128.20 (Cm); 128.40 (Co); 129.16 (C(3')); 129.72 (Cp); 132.16 (Ci); 139.60 (C(6)); 147.79 (C(7)); 151.45 (C(3a)); 165.55 (C(2)); 170.16 (O-СО-СН3). Найдено (%) С, 54.89; Н, 4.49; N, 18.88. Брутто формула: C₁₇H₁₇N₅O₃S. Вычислено (%) С, 54.89; Н, 4.58; N, 18.86. ИК-спектр, ν/см^-1: 1728, 1692 (С=О).

4.1.2. Синтез 4-((Z)-4'-гидроксибутен-2'-ил)-2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-онов (1a-c).

При температуре 5°С к 30 мл метилового спирта прибавляют 1 мл хлористого ацетила. К полученному раствору добавляют 1.5 ммоль 4-(4'-ацетоксибутен-2'-ил)-2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-она (3а-с) реакционную массу выдерживают при комнатной температуре 4 ч, нейтрализуют безводным ацетатом натрия и упаривают в вакууме водоструйного насоса на водяной бане. Из остатка методом колоночной хроматографии на силикагеле выделяют продукт (1a-c). Элюент этилацетат: гексан (4:1).

1a (R=Н): (41%), т.пл. 112°С. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, δ м.д., ⁿJ/Гц): 4.23 (д.д.д, 2Н, Н(4'), ³J=5.8, 5.4, ⁴J=1.2 Гц); 4.87 (т, 1Н, ОН, ³J=5.4 Гц); 5.11 (д.д, 2Н, Н(1'), ³J=6.5, ⁴J=1.2 Гц); 5.72 (д.т.т, 1Н, Н(2'), ³J=11.0, 6.5, ⁴J=1.4 Гц); 5.82 (д.т.т, 1Н, Н(3'), ³J=11.0, 5.8, ⁴J=1.2 Гц); 7.48-7.54 (м, 3Н, Hm, Hр); 8.01 (м, 2Н. Н₀); 8.45 (с, 1Н, Н(2)). Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, δ м.д.): 51.18 (С1'), 57.33 (С4'). 122.35 (С2'), 128.21 (Cm), 128.46 (Сo), 129.61 (Cp), 132.82 (Сi), 135.54 (С3'), 139.06 (С6), 149.12 (С7), 150.93 (С3а), 153.28 (С2). Найдено (%) С, 59.30; Н, 4.54; N, 24.71. С₁₄Н₁₃N₅О₂. Вычислено (%) С, 59.36; Н, 4.59; N, 24.73. ИК-спектр, ν/см^-1: 1700 (С=O), 3368 (ОН).

1b (R=Me): (70%), т.пл. 125°С. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, δ м.д., ⁿJ/Гц): 2.45 (с, 3Н, С2-Ме); 4.21 (д.д.д, 2Н, Н(4'), ³J=5.8, 5.3, ⁴J=1.5 Гц); 4.88 (т, 1Н, ОН, ³J=5.3 Гц); 5.07 (д.д, 2Н, H(1'), ³J=6.5, ⁴J=1.4 Гц); 5.71 (д.т.т, 1Н, Н(2'), ³J=11.1, 6.5, ⁴J=1.5 Гц); 5.82 (д.т.т, 1Н, Н(3'), ³J=11.1, 5.8, ⁴J=1.4 Гц); 7.46-7.53 (м, 3Н, Нm, Hp); 8.00 (м, 2Н, Н₀). Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, δ м.д.): 14.33 (С2-Ме), 51.13 (С(1')), 57.36 (С(4')), 122.44 (С(2')); 128.20 (Cm); 128.43 (C₀); 129.59 (Cp); 132.36 (Ci); 135.45 (С3'); 139.04 (С(6)); 148.63 (С(7)); 151.17 (С(3а)); 162.79 (С(2)). Найдено (%) С, 60.53; Н, 5.05; N, 23.51. C₁₅H₁₅N₅O₂. Вычислено (%) С, 60.61; Н, 5.05; N, 23.57. ИК-спектр, ν/см^-1: 1698 (С=O), 3329 (ОН).

1c (R=SMe): (45%), т.пл. 146°С. Спектр ЯМР ¹Н (400 МГц, δ м.д., ⁿJ/Гц): 2.66 (с, 3H, SMe); 4.21 (д.д.д, 2H, H(4'), ³J=5.8, 5.3, ⁴J=1.6 Гц); 4.86 (т, 1Н, ОН, ³J=5.3 Гц); 5.04 (д.д, 2Н, Н-1', ³J=6.5, ⁴J=1.3 Гц); 5.70 (д.т.т, 1H, H(2'), ³J=11.1, 6.5, ⁴J=1.6 Гц); 5.82 (д.т.т, 1Н, Н(3)', ³J=11.1, 5.8, ⁴J=1.4 Гц); 7.49-7.52 (м, 3Н, Нm, Нр); 8.00 (м, 2Н, Н₀). Спектр ЯМР ¹³С (100 МГц, δ м.д.): 13.51 (SMe); 51.10 (C(1')); 57.34 (C(4')); 122.24 (C(2')); 128.21 (Cm); 128.42 (Co); 129.69 (Cp); 132.24 (Сi); 135.55 (С(3')); 139.53 (С(6)); 147.81 (С(7)); 151.49 (С(3а)); 165.52 (С(2)). Найдено (%) С, 54.56; Н, 4.50; N, 21.02. C₁₅H₁₅N₅O₂S. Вычислено (%) С, 54.71; Н, 4.56; N, 21.28. ИК-спектр, ν/см^-1: 1698 (С=O), 3492 (ОН).

4.2. Противовирусное действие заявляемых соединений

Материалы и методы

Клетки. Использовали монослойные 24-часовые культуры перевиваемых линий клеток почек зеленой мартышки Vero-Е6 (ростовая питательная среда Игла (произв. Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН) с добавлением эмбриональной сыворотки телят ЭТС (7%) (произв. «ПанЭко», Москва).

Вирусы. В работе использовали эталонный штамм вируса герпеса простого типа 1 ((ВПГ-1, штамм L₂).

Цитотоксичность соединений оценивали по состоянию клеточного монослоя с определением максимально переносимой концентрации (МПК), не вызывающей изменение клеточного монослоя по сравнению с контролем после 72 ч инкубации. Количественно цитотоксичность определяли по способности мертвых клеток окрашиваться трипановым синим в соответствии с общепринятым методом (trypan blue exclusion method) [Holy A., De Clercq E., Votryba I. // Phosphonylmethyl Ethers of Nucleosides and their Acyclic Analogues/ Ed. J.C.Martin. Washington, 1989, P.50-71; Галегов Г.А., Шобухов В.М., Скоробогатый М.В., Манасова Е.В. и др. // Биоорг. химия, 2003, № 3, С.290-295; Fedorov I.I., Kazmina E.M., De Clercq E. et all // J. Med. Chem., 1997, Vol.40, № 4, P.486-494.] За величину 50% цитотоксической дозы/концентрации ЦД₅₀ принимали концентрацию соединения, при которой выживаемость клеток составляет 50% через 72 ч контакта с изучаемыми соединениями. Результаты исследования цитопатического действия приведены в таблице.

Противогерпесвирусная активность заявляемых соединений in vitro

Противовирусную активность исследовали в культуре клеток Vero, выращенной в 96-луночных панелях (Linbro, Flow labor., UK). Культуру клеток инфицировали вирусом с множественностью 0,1 или 0,01 БОЕ/кл и инкубировали под жидкой средой поддержки (среды Игла и 199, соединенные в соотношении 1:1 + 2% эмбриональной телячьей сыворотки), содержащей препарат в известной концентрации. Препарат вносили непосредственно перед инфицированием. После инкубации в течение 48 или 72 часов, по достижении 95-100% цитопатического эффекта (ЦПЭ) определяли концентрацию, ингибирующую развитие вирусиндуцированного ЦПЭ на 50% по сравнению с контролем (ИД₅₀), и концентрацию, ингибирующую развитие вирусиндуцированного ЦПЭ полностью (ИД₉₅). Результаты исследования противовирусного действия приведены в таблице.

Противовирусная активность заявляемых соединений (1)
соединение	МПК, mM	ЦД50, mM (% мертвых клеток)	ИД50, mM м.и.* 0,1 БОЕ/кл	ИД50/ИД95, mM м.иa 0,01 БОЕ/кл	ХТИ (м-и.a 0,01 БОЕ/Кл)
Ia	>0,5	>0,5(11,90)	0,5	0,05/0,5	>10
Ib	>0,5	≥0,5(37,31) 0,25(22,73)	0,25	0,03/0,5	>16
Ic	0,25	≥0,5(40,91) 0,25(36,51)	0,12	0,015/0,25	16
прототип	>0,5	>0,5(16,57)	0.5	0,25/>0,5	>2
*м.и. - множественность инфицирования

Новые соединения подавляют репликацию вируса герпеса простого типа 1 (ВПГ-1) в культуре клеток Vero, обеспечивают защиту клеток от цитопатогенного действия вируса и не проявляют токсичности в отношении хозяйских клеток вплоть до крайне высоких концентраций. Соединение-прототип обладает существенно более низким противовирусным действием в отношении ВПГ-1. Вирусологические тесты проведены в соответствии с описанными ранее протоколами.

4-((Z)-4′-гидроксибутен-2′-ил)-2-R-6-фенил-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазин-7-оны общей формулы (1)