Структурирующие молочнокислые бактерии
Изобретение относится к области пищевой промышленности и биотехнологии. Описан штамм Streptococcus thermophilus, продуцирующий молочную кислоту. Также раскрыты последовательности нуклеиновых кислот, выделенные из этого штамма, продуцирующие полисахариды, пищевая или фармацевтическая композиция и молочный продукт, содержащие такой штамм. Штамм обладает сильными структурирующими свойствами. Изобретение может быть использовано в пищевой промышленности. 13 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл.
Объектом настоящего изобретения являются штаммы молочнокислых бактерий, содержащие, по меньшей мере, одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8, а также способ получения этих штаммов. Наконец, настоящее изобретение относится к пищевым продуктам, содержащим и/или произведенным с использованием упомянутых штаммов.
В пищевой промышленности используют многие бактерии, в частности в виде ферментов, в частности, молочнокислые бактерии для улучшения вкуса и консистенции продуктов, а также для увеличения срока хранения этих продуктов. В молочной промышленности молочнокислые бактерии интенсивно используются для обеспечения скисания молока (сквашиванием), а также для структурирования продукта, в который их вводят.
Среди молочнокислых бактерий, используемых в пищевой промышленности, можно указать роды Streprococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus и Bifidobacterium.
Молочнокислые бактерии вида Streptococcus thermophilus используются экстенсивно отдельно или в сочетании с другими бактериями для производства пищевых продуктов, в частности ферментированных продуктов. В частности, они входят в состав ферментов, используемых для производства продуктов из сквашенного молока, например йогуртов. Некоторые из них играют преобладающую роль в получении необходимой консистенции ферментированного продукта. Это свойство тесно связано с производством полисахаридов. Среди штаммов Streptococcus thermophilus различают структурирующие штаммы и неструктурирующие штаммы.
Под структурирующим штаммом Streptococcus thermophilus следует понимать штамм, образующий сквашенное молоко, имеющее в описанных в примерах условиях вязкость, примерно превышающую 35 Па·с, область тиксотропии примерно ниже 2000 Па/с и порог текучести примерно ниже 14 Па. Штамм Streptococcus thermophilus можно определить как сильно структурирующий, если он образует сквашенное молоко, имеющее в условиях, описанных в примерах, вязкость примерно выше 50 Па·с, область тиксотропии примерно ниже 1000 Па/с и порог текучести примерно ниже 10 Па.
Для решения задач, стоящих перед пищевой промышленностью, возникла необходимость в создании новых структурирующих штаммов молочнокислых бактерий, в частности, Streptococcus thermophilus.
В связи с этим задачей настоящего изобретения является создание штамма молочнокислых бактерий, обладающего хорошими свойствами структурирования пищевых продуктов.
С учетом этого объектом настоящего изобретения является штамм молочнокислых бактерий, содержащий, по меньшей мере, одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8.
Настоящим изобретением предлагается также новый штамм Streptococcus thermophilus, депонированный 26 февраля 2003 г. в Национальной коллекции культур микроорганизмов под номером 1-2980.
Объектом настоящего изобретения являются также нуклеотидные последовательности SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8, а также нуклеотидные последовательности, содержащие, по меньшей мере, одну из этих нуклеотидных последовательностей.
Еще одним объектом настоящего изобретения являются плазмиды, используемые в качестве векторов для клонирования и/или экспрессии, содержащие, по меньшей мере, одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8, а также нуклеотидные последовательности, содержащие, по меньшей мере, одну из этих нуклеотидных последовательностей.
Настоящее изобретение касается также бактерий-хозяев, трансформированных описанными выше плазмидами или векторами.
Объектом настоящего изобретения является также способ получения описанных выше штаммов, заключающийся в том, что эти штаммы получают путем трансформации плазмидами или векторами, содержащими, по меньшей мере, одну из нуклеотидных последовательностей SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8, или с помощью вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, содержащую, по меньшей мере, одну из этих нуклеотидных последовательностей.
Настоящим изобретением предлагаются также бактериальные культуры, содержащие, по меньшей мере, один описанный выше штамм или содержащие, по меньшей мере, один штамм, полученный с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением.
Наконец, настоящее изобретение касается пищевой или фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один штамм в соответствии с настоящим изобретением или, по меньшей мере, один штамм, полученный с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, или бактериальную культуру в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение отличается многими преимуществами в плане структурирования сред, в которых оно используется. В частности, оно позволяет получать гели, например, на основе сквашенного молока, которые являются консистентными, клейкими, обволакивающими, обладающими текучестью и устойчивостью по отношению к перемешиванию и не образуют зерен.
Другие преимущества и отличительные признаки настоящего изобретения будут более очевидны из нижеследующего описания и примеров, приведенных в качестве иллюстрации и не носящих ограничительного характера.
Прежде всего, настоящее изобретение относится к штамму молочнокислых бактерий, содержащему, по меньшей мере, одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8.
Молочнокислые бактерии являются грамположительными прокариотами, входящими в группу Firmicutes. Они являются гетеротрофными и хемиорганотрофными; как правило, анаэробными или аэротолерантыми, их метаболизм может быть гомо ферментативным или гетероферментативным: молочнокислые бактерии, в основном, производят молочную кислоту путем брожения глюцидного субстрата. Лишенные каталазы молочнокислые бактерии образуют гетерогенную группу кокков, включая роды Aerococcus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus и Weissella или включая палочки родов Lactobacillus и Carnobacterium. Название «молочнокислые бактерии» часто распространяют на другие родственные бактерии, такие как Bifidobacterium.
Среди штаммов молочнокислых бактерий, которые могут использоваться в рамках настоящего изобретения, можно назвать роды Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus и Bifidobacterium.
Предпочтительным штаммом молочнокислых бактерий в соответствии с настоящим изобретением является Streptococcus thermophilus.
Streptococcus thermophilus является видом, присутствующим в естественном виде в молоке и широко используемым в пищевой промышленности, в частности в молочной промышленности, так как позволяет сквашивать и структурировать молоко. В данном случае речь идет о гомоферментативной термофильной бактерии.
Настоящее изобретение касается также штамма Streptococcus thermophilus, депонированного 26 февраля 2003 г. в Национальной коллекции культур микроорганизмов под номером 1-2980.
Объектом настоящего изобретения являются также нуклеотидные последовательности SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8.
Нуклеотидные последовательности SEQ ID №2 - SEQ ID №8 являются частью оперона примерно из 14350 пар оснований, участвующего в синтезе полисахаридов (оперон PS). Этот оперон входит в последовательность SEQ ID №1. Это значит, что в соответствии с настоящим изобретением последовательность SEQ ID №1 включает последовательности SEQ ID №2 - SEQ ID №8.
Первичная структура оперона, определенная в соответствии с настоящим изобретением, приведена на фиг.1. Между генами deoD (перед опероном PS) и orfl4.9 (после оперона PS) было идентифицировано 17 ORF (открытых рамок считывания), называемых eps13A, eps13B, eps13C, eps13D, eps13E, eps13F, eps13G, eps13H, eps13I, eps13J, eps13K, eps13L, eps13M, eps13N, eps13O, eps13P и IS1193. 16 первых ORF, расположенных на кодирующей нити, потенциально кодируют полипептиды, вовлеченные в синтез экзоклеточных или капсульных полисахаридов; 17-я ORF, расположенная на антипараллельной нити, потенциально кодирует функциональный транспозон, принадлежащий к семейству IS1193.
Можно присвоить наименование и определить место каждой ORF. Ниже указано наименование каждой ORF, затем предполагаемая функция выделенного белка и, наконец, позиция области, содержащей эту ORF (по отношению к последовательности SEQ ID №1, указанной в списке последовательностей):
- eps13A: регулятор транскрипции (342…1802)
- eps13B: полимеризация (регуляция длины цепи) и/или транспорт полисахаридов (1803…2534)
- eps13C: полимеризация (регуляция длины цепи) и/или транспорт полисахаридов (2543…3235)
- eps13D: полимеризация (регуляция длины цепи) и/или транспорт полисахаридов (3245…3985)
- eps13E: ундекапренилфосфатгликозилтрансфераза (4042…5409)
- eps13F: ундекапренилфосфатгликозилтрансфераза(5611…6195)
- eps13G: ундекапренилфосфатгликозилтрансфераза (6251…6634)
- eps13H: бета-1,4-галактозилтрансфераза (6643…7092)
- eps13I:. бета-1,4-галактозилтрансфераза (7092…7607)
- eps13J: рамнозилтрансфераза (7597…8493)
- eps13K: гликозилтрансфераза (8763…9797)
- eps13L: полимераза повторяющейся единицы (9827…10969)
- eps13M: полимераза повторяющейся единицы (10984…11793)
- eps13N: гликозилтрансфераза (11844…12578)
- eps13O: гликозилтрансфераза (12633…13016)
- eps13P: трансмембранный переносчик (13049…14482)
- IS1193: транспозон (дополнение (14614…15870).
Настоящее изобретение касается также нуклеотидных последовательностей, содержащих, по меньшей мере, одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8. Под нуклеотидной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, одну из вышеперечисленных последовательностей, в рамках настоящего изобретения следует понимать нуклеотидные последовательности, содержащие, по меньшей мере, одну ORF, продукт трансляции которой обладает значительной идентичностью (процентное содержание идентичных остатков превышает или равно 80% после сопоставления последовательностей при максимальном соответствии между позициями остатков), по меньшей мере, с одной из полипептидных последовательностей, выведенных из ORF, идентифицированных в последовательностях SEQ ID №1 - SEQ ID №8.
Нуклеотидные последовательности SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8 могут быть встроены в вектор с помощью генной инженерии, в частности с помощью технологий рекомбинантных ДНК, хорошо известных специалистам.
Настоящее изобретение касается также вектора для клонирования и/или экспрессии, содержащего, по меньшей мере, одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8, или определенных выше нуклеотидных последовательностей.
Предпочтительным вектором в соответствии с настоящим изобретением являются плазмиды. Речь может идти о репликативных или интегративных плазмидах.
Этими векторами и/или плазмидами можно трансформировать бактерии для включения в них этих векторов и/или плазмид. Трансформацию можно осуществлять с помощью электропорации или конъюгации, как известно специалистам в этой области техники.
Настоящее изобретение касается также бактерий-хозяев, трансформированных указанными выше плазмидами или векторами.
Предпочтительно трансформированными бактериями являются молочнокислые бактерии. В частности, речь идет о молочнокислых бактериях, которые могут быть выбраны из родов Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus и Bifido bacterium.
Предпочтительным штаммом молочнокислых бактерий в соответствии с настоящим изобретением является Streptococcus thermophilus.
Настоящее изобретение касается также способа получения штамма или трансформированных бактерий-хозяев в соответствии с настоящим изобретением, заключающегося в том, что их получают путем трансформации вектором, содержащим, по меньшей мере, одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8, или нуклеотидной последовательностью, содержащей, по меньшей мере, одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8.
Согласно способу в соответствии с настоящим изобретением предпочтительным вектором является плазмида.
Предпочтительно согласно способу в соответствии с настоящим изобретением трансформация сопровождается встраиванием в геном штамма или бактерии-хозяина, трансформированной, по меньшей мере, одним событием рекомбинации.
Настоящее изобретение касается также бактериальной культуры, содержащей, по меньшей мере, один штамм в соответствии с настоящим изобретением или содержащей, по меньшей мере, один штамм, полученный с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, или содержащей, по меньшей мере, одну бактерию, трансформированную в соответствии с настоящим изобретением.
Под бактериальной культурой понимают смесь различных штаммов, в частности фермент или закваски.
Предпочтительными смесями штаммов в соответствии с настоящим изобретением являются смеси Streptococcus thermophilus с другими Streptococcus thermophilus или смеси Streptococcus thermophilus с Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, или смеси Streptococcus thermophilus с другими Lactobacillus и/или с Bifidobacterium, или смеси Streptococcus thermophilus с Lactococcus, или смеси Streptococcus thermophilus с другими штаммами молочнокислых бактерий и/или дрожжевых грибков.
Настоящее изобретение касается также использования штамма в соответствии с настоящим изобретением или штамма, полученного с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, или бактериальной культуры в соответствии с настоящим изобретением для производства пищевого продукта или пищевого ингредиента.
В качестве предпочтительного пищевого продукта или пищевого ингредиента в соответствии с настоящим изобретением можно назвать молочный продукт, мясной продукт, зерновой продукт, напиток, мусс или порошок.
Настоящее изобретение касается также пищевой или фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один штамм в соответствии с настоящим изобретением или, по меньшей мере, один штамм, полученный с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, или бактериальную культуру в соответствии с настоящим изобретением.
Объектом настоящего изобретения является также молочный продукт, содержащий, по меньшей мере, один штамм в соответствии с настоящим изобретением или, по меньшей мере, один штамм, полученный с помощью способа в соответствии с настоящим изобретением, или бактериальную культуру в соответствии с настоящим изобретением.
В случае молочного продукта его производство осуществляют известным в этой области способом, в частности сквашиванием молочного продукта путем включения штамма в соответствии с настоящим изобретением.
В качестве молочного продукта в соответствии с настоящим изобретением можно указать сквашенное молоко, йогурт, созревшие сливки, сыр, творог, молочный напиток, ретентат молочного продукта, плавленый сыр, сливочный десерт, деревенский сыр или детское молоко.
Предпочтительно молочным продуктом в соответствии с настоящим изобретением является молоко животного и/или растительного происхождения.
В качестве молока животного происхождения можно указать коровье молоко, овечье молоко, козье молоко и буйволиное молоко.
В качестве молока растительного происхождения можно указать любое способное к сквашиванию вещество растительного происхождения, которое может быть использовано в рамках настоящего изобретения, в частности полученное из зерен сои, риса или ячменя.
На фиг.1 показана структура оперона PS штамма в соответствии с настоящим изобретением в сравнении с опероном PS других, уже известных штаммов Streptococcus thermophilus.
На фиг.2 показана факториальная схема 1-2 анализа по основным составляющим (АОС), полученная на основании органолептических данных, на сквашенных молочных продуктах, полученных с использованием различных рассматриваемых штаммов.
На фиг.3 показаны средние оценки описательных показателей СТРУКТУРА НА ЛОЖКЕ для каждого из рассматриваемых штаммов. Интерпретация результатов теста Ньюмана-Койлза: разница между штаммами, связанными одной буквой, является несущественной.
На фиг.4 показаны средние оценки описательных показателей СТРУКТУРА ВО РТУ для каждого из рассматриваемых штаммов. Интерпретация результатов теста Ньюмана-Койлза: разница между штаммами, связанными одной буквой, является несущественной.
Далее следует описание конкретных, но не ограничительных примеров.
ПРИМЕРЫ
1) Определение последовательности оперона PS Streptococcus thermophilus CNCM I-2980
Фрагмент ДНК, содержащий оперон PS штамма Streptococcus thermophilus CNCM I-2980, получили с помощью ПЦР-амплификации из геномной ДНК, выделенной из этого штамма. Амплификацию осуществляли с помощью термоциклера Mastercycler (Eppendorf) с использованием ДНК-полимеразы LA-Taq (BioWhittaker/Cambrex) и следующих праймеров: 5'-GGGTGAACGTATCTCAGTAATGGGACTGG-3' и 5'-CCTGAGTTATGCGACGATTACTTGGCTG-3'. Амплификацию проводили в следующих условиях: 14 циклов с чередованием денатурации при 98°C в течение 30 с и гибридизации-синтеза при 68°C в течение 15 мин с 15 с на цикл, затем 1 дополнительный цикл синтеза при 72°C в течение 10 мин. Полную последовательность ПЦР-продукта получали путем клонирования фрагментов.
2) Молекулярная характеристика штамма в соответствии с настоящим изобретением в сравнении с уже известными штаммами Streptococcus thermophilus
- Последовательность оперона PS
Последовательность оперона PS штамма Streptococcus thermophilus CNCM I-2980, состоящую из примерно 17100 пар оснований, синтезировали с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы очищенной геномной ДНК штамма и с использованием двух консервированных специфических праймеров генов (deoD, кодирующего пуриннуклеотидфосфорилазу, и orf14.9 неизвестной функции), обычно обрамляющих оперон PS у Streptococcus thermophilus, описанных в литературе. Последовательность, заключенная между генами deoD и orf14.9, соответствующая последовательности SEQ ID №l, приведена вместе со списком последовательностей.
- Генетическая организация оперона PS
На фиг.1 схематично показана генетическая структура оперона PS штамма CNCM I-2980, установленная с помощью анализа нуклеотидной последовательности, а также структура оперона PS 7 других штаммов Streptococcus thermophilus. Для приведенных структур, идентифицированных наименованием штамма и номером доступа в GENBANK (в скобках), стрелки обозначают место, размер и направление генов от инициаторного кодона инициации до терминирующего кодона. Значения цветов и/или рисунков объяснены на фиг.1.
- Сравнение с литературой
Структурный анализ оперона PS штамма CNCM I-2980 показывает, что его организация аналогична организации уже известных оперонов PS (см. фиг.1): первая ORF, потенциально вовлеченная в регуляцию транскрипции оперона PS, с последующими 3 ORF, вероятно участвующими в регуляции полимеризации повторяющихся единиц PS и/или в их переносе, с последующими 11 ORF, кодирующими гликозилтрансферазы и полимеразу, обеспечивающие сборку повторяющейся единицы, и с последующей 1 ORF, потенциально вовлеченной в перенос повторяющихся единиц через плазмидную мембрану.
Окружающая генетическая среда оперона PS штамма CNCM I-2980 также сходна с окружающей генетической средой других известных оперонов CNCM 1-2980: перед ORF deoD, кодирующая пуриннуклеотидфосфорилазу, и после в противоположном направлении ORF ISI193 и orf14.9, кодирующие соответственно транспозон (принадлежащий к семейству транспозонов IS1193, являющихся подвижными генетическими элементами) и белок неизвестной функции.
Однако сравнение последовательности между белками, потенциально кодируемыми ORF оперона штамма CNCM I-2980, и белками, доступными в опубликованных базах данных (GENBANK), показывает, что генетическое содержание оперона PS штамма CNCM 1-2980 является новым в своей дистальной части.
- Проксимальная часть оперона PS штаммов Streptococcus thermophilus и в целом известных на сегодняшний день стрептококков содержит 4 ORF, называемых epsA (или cpsA, или сарА, или wzg), epsB (или cpsB, или сарВ, или wze), epsC (или cpsC, или сраС, или wzd) и epsD (или cpsD, или capD, или wze), выведенные полипептидные продукты которых для каждой из 4 ORF имеют значительное сходство последовательности между штаммами. На этом уровне полипептидные продукты, выведенные из ORF eps13A, eps13B, eps13C и eps13D оперона PS штамма CNCM I-2980, не отличаются от полипептидных продуктов, выведенных из других оперонов PS (содержание одинаковых аминокислот превышает или равно 94%).
- Сразу же после ORF epsD в большинстве известных оперонов PS у Streptococcus thermophilus присутствует ORF epsE (или cpsE, или сарЕ, или wchA). В этом случае сходство последовательности между гомологическими полипептидными продуктами, полученными из различных известных последовательностей, является значительным; продукт трансляции ORF eps13E штамма CNCM I-2980 имеет значительное сходство с его гомологами, полученными из других штаммов.
- Организация 4 следующих ORF (eps13F, eps13G, eps13H и eps13J) оперона PS штамма CNCM I-2980, хотя и была ранее описана, но встречается реже среди различных известных структур оперонов PS Streptococcus thermophilus. Эта организация была обнаружена, хотя и в неполном виде, в штаммах IP6757 (номер доступа GENBANK AJ289861), «тип VII» (номер доступа GENBANK AF454498) и «тип III» (номер доступа GENBANK AY057915).
- В дистальной части оперона 7 ORF eps13J, eps13L, eps13M, eps13N, eps13C) и eps13P являются новыми и специфическими к оперону PS штамма CNCM I-2980. Хотя и являющееся слабым, их сходство последовательности на белковом уровне или в некоторых случаях наличие специфических белковых рисунков позволяет наделить продукты этих ORF предполагаемой функцией: потенциальная гликозилтрансферазная или полимеразная активность для продукта ORF eps13J-eps13C), трансмембранная транспортная активность PS для продукта ORF eps13P.
3) Сравнительный реологический тест штамма Streptococcus thermophilus CNCM I-2980
Используемые штаммы Streptococcus thermophilus CNCM I-2423, CNCM I-2429, CNCM I-2432, CNCM I-2978 и CNCM I-2979 являются штаммами из коллекции фирмы «Rhodia Food». Их используют в большей степени для промышленного производства сквашенных молочных продуктов или йогуртов в силу их структурирующих свойств. Они являются типичными представителями штаммов, описанных в уровне техники. В дальнейшем они рассматриваются в сравнении со штаммом CNCM 1-2980 и считаются типичньми представителями структурирующих штаммов, используемых в настоящее время в агропромышленном комплексе.
Штаммы Streptococcus thermophilus RD736 и RD676 являются штаммами, выпускаемыми компанией «Rhodia Food», известными своей слабой структурирующей способностью. Полисахариды, которые они могут производить, и их оперон PS неизвестны. В дальнейшем они рассматриваются в сравнении со штаммом CNCM 1-2980 в качестве типичных представителей неструктурирующих штаммов.
Сквашенное молоко получают, добавляя 3% (мас./об.) сухого обезжиренного молока в 100 мл обезжиренного молока UHT 1/2 (Le Petit Vendeén®). Раствор пастеризуют при 90°C в течение 10 мин, при этом температуру измеряют в середине массы молока. Полученный таким образом ферментационный субстрат инокулируют тестируемым штаммом из расчета 106 CFU/мл (колониеобразующие единицы/мл), затем инкубируют при 43°C в водяной бане до получения рН 4,6. Регистрацию рН осуществляют непрерывно. Полученный таким образом сквашенный молочный продукт помещают в вентилируемый шкаф при 6°C до их анализа.
Проводят два типа реологических измерений: определение вязкости и текучести. Измерение вязкости проводят при 8°C на сквашенном молоке после 1, 7, 14 и 28 дней хранения при 6°C с использованием вискозиметра Brookfield® типа RVF (Brookfield Engineering Laboratories, Inc.), установленного на штативе Heilpath (Brookfield Engineering Laboratories, Inc.). Вискозиметр оснащен иглой типа С, и скорость колебания, сообщаемая игле, составляет 10 об/мин. Измерения текучести проводят при 8°C на сквашенном молоке после 14 дней хранения при 6°C после его предварительного перемешивания с использованием реометра AR 1000-N (ТА Instrument), оборудованного коаксиальными цилиндрами (радиус 1=15 мм, радиус 2=13,83 мм, высота 32 мм, промежуточное пространство 2 мм). Для сегмента подъема усилие, прилагаемое при непрерывном сканировании, меняется от 0 до 60 Па в течение 1 минуты в линейном режиме. Для сегмента опускания усилие, прилагаемое при непрерывном сканировании, меняется от 60 до 0 Па в течение 1 минуты в линейном режиме. При этом учитываются значения области тиксотропии и порога текучести; последний вычисляют по модели Кассона.
Вязкость сквашенного молока, полученного с использованием штамма Streptococcus thermophilus CNCM I-2980, была измерена после 1,7, 14 и 28 дней хранения при 6°C (таблица 1). Значение вязкости, измеренной после одного дня хранения, равна 53,3 Па·с. Это значение незначительно меняется во времени, что свидетельствует о стабильности сквашенного молока, полученного с использованием штамма Streptococcus thermophilus CNCM 1-2980. Для сравнения (таблица 1) значения вязкости, измеренной для сквашенного молока, полученного с использованием штаммов RD736 и RD676, известными своей низкой структурирующей способностью, находятся в пределах от 26 до 30 Па·с. Другие тестируемые штаммы придают сквашенному молоку более низкую вязкость, чем штамм CNCM 1-2980. Можно различать первую группу штаммов, придающих вязкость порядка 40 Па·с (CNCM I-2979, CNCM I-2423 и CNCM I-2432), и вторую группу, в которую входит CNCM 1-2980, обеспечивающих вязкость порядка 50 Па·с.
| Таблица 1 Вязкость и рН сквашенного молока, полученного с использованием разных штаммов, после разных сроков хранения при 6°C |
||||
| Штаммы | Вязкость, Па·с/рН | |||
| 1 день хранения | 7 дней хранения | 14 дней хранения | 28 дней хранения | |
| CNCM I-2980 |
53,3/4,50 | 53,0/4,44 | 53,0/4,42 | 53,5/4,40 |
| CNCM I-2429 |
51,2/4,55 | 51,9/4,45 | 51,0/4,44 | 51,2/4,44 |
| CNCM I-2978 |
50,4/4,56 | 51,8/4,52 | 49,6/4,49 | 51,0/4,45 |
| CNCM I-2432 |
42,4/4,60 | 42,2/4,56 | 43,0/4,55 | 43,0/4,45 |
| CNCM I-2423 |
42,0/4,60 | 41,9/4.40 | 42,0/4,37 | 43,0/4,30 |
| CNCM I-2979 |
37,8/4,54 | 40,7/4,45 | 42,2/4,42 | 42,2/4,33 |
| RD676 | 29,6/4,60 | 30,0/4,57 | 30,0/4,57 | 30,0/4,52 |
| RD736 | 26,0/4,45 | 26,0/4,34 | 28,0/4,34 | 27,0/4,26 |
Измерения текучести позволили определить два существенных реологических фактора (порог текучести и области тиксотропии) для реологического описания сквашенного молока (таблица 2). Для сквашенного молока, полученного со штаммом CNCM 1-2980, средние значения составляют от 5,89 Па и 488 Па/с соответственно для порога текучести и для области тиксотропии. Эти значения существенно отличаются от значений, полученных для сквашенного молока, приготовленного с использованием штаммов, считающихся неструктурирующими (RD676 и RD736). Например, для сквашенного молока, полученного со штаммом RD676, эти средние значения составляют соответственно 17,01 Па и 17083 Па/с. В случае штаммов, считающихся структурирующими, значения порога текучести и области тиксотропии являются гораздо более близкими к значениям, полученным при использовании штамма CNCM 1-2980, и вместе с тем значительно их превышают, что доказывает более высокую структурирующую способность штамма CNCM 1-2980.
| Таблица 2 Значения порога текучести и области тиксотропии (средние значения при трех повторах), измеренные с помощью прибора AR1000-N сквашенного молока, полученного с использованием разных штаммов, после 14 дней хранения при 6°C |
||
| Штаммы | Порог текучести (Па) | Область тиксотропии (Па/с) |
| CNCM I-2980 | 5,89 | 488 |
| CNCM I-2429 | 13,32 | 1215 (2 значения) |
| CNCM I-2978 | 10,51 | 728 |
| CNCM I-2432 | 12,27 | 1245 |
| CNCM I-2423 | 8,86 | 1344 |
| CNCM I-2979 | 13,56 | 1786 |
| RD676 | 17,01 | 17083 |
| RD736 | 15,91 | 33100 |
4) Органолептическая характеристика штамма Streptococcus thermophilus CNCM 1-2980 в сравнении с контрольными штаммами
Оценка сквашенного молока была осуществлена органолептическим анализом после 14 дней хранения при 6°C. Количественный описательный анализ сквашенного молока при оптимальной температуре дегустации 12°C был произведен комиссией из 9 экспертов по неструктурированной линейной шкале от 0 до 6 пунктов. Анализ органолептического профиля был продублирован с интервалом в несколько дней. Предварительно отобранные и обученные эксперты проводили оценку по четырем описательным показателям структуры на ложке: ломкость, устойчивость к перемешиванию, стекание, зернистость и по 4 описательным показателям структуры во рту: таяние, клейкость, густота, обволакивание. Органолептические отличия были оценены путем двухфакторного вариационного анализа (называемого ANOVA) с фиксированной моделью с последующим сравнительным тестом по среднему значению Ньюмана-Койлза с порогом альфа 5% на каждом из описательных показателей. Для визуализации пространства продукта был применен анализ по основным составляющим (АОС) с органолептическими описательньми показателями с переменными значениями и штаммами по индивидам. Иерархическая возрастающая классификация (ИВК) позволила выделить группы штаммов на основе АОС. Программными обеспечениями, использованными для этих статистических анализов, являются Fizz® (Biosystems), Statgraphics® и Uniwin plus®.
Данные по сквашенному молоку, полученному с использованием штамма Streptococcus thermophilus CNCM 1-2980, сравнивались с результатами по сквашенному молоку, полученному с использованием других контрольных штаммов. Средние значения, полученные для разных штаммов по определенным показателям структуры, приведены в таблице 3, а существенные отличия, выявленные в результате ANOVA и сравнительного теста по средним значениям, представлены в таблице 4 и на фиг.3 и 4.
| Таблица 3 Средние оценки, присвоенные комиссией органолептического анализа для сквашенного молока, полученного с использованием разных рассматриваемых штаммов, по описательным показателям структуры |
||||||||
| Штаммы | Показатели на ложке | Показатели во рту | ||||||
| Ломкость | Устойчивость к перемешиванию | Зернистость | Стекание | Таяние | Клейкость | Густота | Обволакивание | |
| CNCM I-2980 |
0,89 | 4,97 | 0,04 | 5,09 | 1,32 | 4,27 | 5,06 | 4,41 |
| CNCM I-2249 |
4,12 | 3,49 | 1,53 | 1,24 | 3,36 | 1,46 | 3,54 | 2.94 |
| CNCM I-2978 |
3,39 | 4,35 | 0,42 | 2,83 | 2,96 | 1,97 | 3,86 | 3,41 |
| CNCM I-2432 |
3,28 | 3,14 | 1,60 | 1,32 | 3,11 | 1,43 | 3,01 | 2,91 |
| CNCM I-2423 |
1,64 | 4,02 | 0,16 | 3,44 | 2,25 | 2,48 | 3,61 | 3,30 |
| CNCM I-2979 |
3,98 | 2,79 | 2,36 | 0,74 | 3,71 | 0,72 | 2,39 | 2,22 |
| RD676 | 4,98 | 1,46 | 5,14 | 0,17 | 4,96 | 0,04 | 0,91 | 1,03 |
| RD736 | 4,35 | 1,45 | 3,43 | 0,04 | 5,18 | 0,31 | 0,77 | 0,67 |
| Таблица 4 Сравнение средних оценок по каждому из описательных показателей структуры на ложке и структуры во рту с помощью теста Ньюмана-Койлза с 5%. Интерпретация результатов: разница между штаммами, связанными одной и той же буквой, является несущественной |
||||||||
| Штаммы | Показатели на ложке | Показатели во рту | ||||||
| Ломкость | Устойчивость к перемешиванию | Зернистость | Стекание | Таяние | Клейкость | Густота | Обволакивание | |
| CNCM I-2980 |
Е | А | Е | А | D | А | А | А |
| CNCM I-2249 |
В | С | D | D | В | С | В | ВС |
| CNCM I-2978 |
С | В | Е | С | В | ВС | В | В |
| CNCM I-2432 |
с | CD | D | D | В | с | С | ВС |
| CNCM I-2423 |
D | В | Е | В | С | в | в | в |
| CNCM I-2979 |
В | D | С | Е | В | D | D | с |
| RD676 | А | Е | А | F | А | D | Е | D |
| RD736 | В | Е | В | F | А | D | Е | D |
На фиг.3 и 4 показаны гистограммы результатов, представленных в таблице 4. По всем описательным показателям считающиеся неструктурирующими штаммы RD676 и RD736 существенно отличаются от других штаммов. Среди структурирующих штаммов штамм CNCM I-2980 существенно и резко отличается по всем показателям, кроме зернистости, по которой он не дифференцируется от штаммов CNCM I-2978 и CNCM I-2423.
АОС позволяет определить место штаммов в зависимости от их расстояния по отношению к органолептическим показателям.
На схеме 1-2 АОС на фиг.2 представлено 97,3% пространства продукта. Составляющая 1 противопоставляет две группы органолептических переменных. Первая группа, включающая в себя переменные: устойчивость к перемешиванию, густота во рту, обволакивание во рту, стекание на ложке и клейкость на ложке, характеризует составляющую 1 справа. Вторая группа, включающая в себя переменные: таяние во рту, ломкость на ложке и зернистость на ложке, характеризует составляющую 1 слева. Первая группа антикоррелируется со второй группой. Эти переменные позволяют анализировать место штаммов на этой схеме. Кроме того, анализ по ИВК позволяет классифицировать по разным группам штаммы, обведенные пунктирной линией на факториальной схеме 1-2.
Факториальная схема противопоставляет несколько групп штаммов, определяющих разные свойства структурирования. Из этих анализов следует, что штаммы RD676 и RD736 придают сквашенному молоку ломкую и зернистую структуру на ложке и тающую во рту. При этом они не придают густой, клейкой и обволакивающей структуры во рту и стойкой к перемешиванию или стекающей структуры на ложке по сравнению с другими группами штаммов. Следовательно, в результате их использования получают неструктурированное сквашенное молоко. В отличие от них штаммы CNCM I-2429, CNCM I-2432 и CNCM I-2979 вырабатывают среднеструктурированное сквашенное молоко, штаммы CNCM I-2423 и CNCM I-2978 вырабатывают структурированное сквашенное молоко и штамм CNCM I-2980 вырабатывает высокоструктурированное сквашенное молоко. Этот анализ показывает, что штамм CNCM I-2980 придает сквашенному молоку особые свойства структурирования по сравнению со всеми контрольными штаммами.
5) Сравнительный тест на устойчивость штамма Streptococcus thermophilus CNCM I-2980 по отношению к фагам
Чувствительность штамма к бактериофагу определяют методом зон лизиса. 100 мкл культуры тестируемого штамма и 100 мкл соответствующего разведения сыворотки, содержащей рассматриваемый бактериофаг, использовали для посева на охлажденной агаровой среде (агар 0,6% мас./об.) М17-глюкозы с добавлением 10 мМ CaCl2. Смесь выливали на поверхность отвержденной агаровой среды (агар 1,5% мас./об.) М17-глюкозы с добавлением 10 мМ СаСl2. После инкубации при 42°C в течение 16 часов оценку чувствительности штамма к бактериофагу проводили по наличию зон лизиса. Отсутствие зон лизиса свидетельствует об устойчивости этого штамма по отношению к исследуемым фагам. Спектр чувствительности штамма к бактериофагам (называемый также лизотипом) представляет собой совокупность значений чувствительности и устойчивости по отношению к исследуемым бактериофагам.
В таблице 5 представлены бактериофаги, использованные для этого исследования, и их исходные штаммы/штаммы размножения. Речь идет о штаммах и бактериофагах из коллекции «Rhodia Food». Бактериофаги были выбраны по их способности к заражению контрольных структурирующих штаммов.
| Таблица 5 Фаги |
|
| Наименование фага | Исходный штамм |
| 2972 | CNCM I-2423 |
| 4082 | RD729 |
| 4074 | CNCM I-2429 |
| 4154 | CNCM I-2429 |
| 1272 | CNCM I-2978 |
| 4128 | RD852 |
| 1255 | CNCM I-2432 |
| 1765 | RD728 |
| 4121 | RD862 |
Для оценки промышленной применимости штамма CNCM I-2980 в связи с проблемами, связанными с бактериофагами, была произведена оценка лизотипа штамма CNCM I-2980 и его сравнение с контрольными структурирующими штаммами. В таблице 6 показана чувствительность штаммов к различным фагам (лизотип), определенная методом зон лизиса. Оказалось, что шесть исследуемых штаммов имеют разные лизотипы. В частности, штамм CNCM I-2980 имеет лизотип, отличающийся от лизотипов других исследуемых структурирующих штаммов. Действительно, штамм CNCM I-2980 не был заражен тестируемыми фагами.
| Таблица 6 Лизотип тестируемых штаммов |
||||||
| Фаги | Штаммы | |||||
| CNCM I-2980 | CNCM I-2423 | CNCM I-2978 | CNCM I-2432 | CNCM I-2429 | CNCM I-2979 | |
| 2972 | - | + | - | - | - | - |
| 4082 | - | + | - | - | - | - |
| 1272 | - | - | + | - | - | - |
| 4128 | - | - | + | - | - | - |
| 1255 | - | - | - | + | - | - |
| 1765 | - | - | - | + | - | - |
| 4074 | - | - | - | - | + | - |
| 4154 | - | - | - | - | + | - |
| 4121 | - | - | - | - | - | + |
| +: чувствительность к тестируемому фагу; | ||||||
| -: устойчивость к тестируемому фагу. |
1. Штамм Streptococcus thermophilus, продуцирующий молочную кислоту, депонированный 26 февраля 2003 г.в Национальной коллекции культур микроорганизмов под номером 1-2980.
2. Нуклеотидная последовательность SEQ ID №1, выделенная из штамма по п.1, включающая PS оперон, для продуцирования полисахаридов.
3. Нуклеотидная последовательность SEQ ID №2, выделенная из штамма по п.1, которая вызывает продуцирование полисахаридов.
4. Нуклеотидная последовательность SEQ ID №3, выделенная из штамма по п.1, которая вызывает продуцирование полисахаридов.
5. Нуклеотидная последовательность SEQ ID №4, выделенная из штамма по п.1, которая вызывает продуцирование полисахаридов.
6. Нуклеотидная последовательность SEQ ID №5, выделенная из штамма по п.1, которая вызывает продуцирование полисахаридов.
7. Нуклеотидная последовательность SEQ ID №6, выделенная из штамма по п.1, которая вызывает продуцирование полисахаридов.
8. Нуклеотидная последовательность SEQ ID №7, выделенная из штамма по п.1, которая вызывает продуцирование полисахаридов.
9. Нуклеотидная последовательность SEQ ID №8, выделенная из штамма по п.1, которая вызывает продуцирование полисахаридов.
10. Нуклеиновая кислота, выделенная из штамма по п.1, которая вызывает продуцирование полисахаридов, содержащая, по меньшей мере, одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей SEQ ID №1, SEQ ID №2, SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8, или нуклеиновая кислота, которая содержит, по меньшей мере, одну ORF, продукт трансляции которой обладает процентным содержанием идентичных остатков более или равным 80% с, по меньшей мере, одной из полипептидных последовательностей, выведенных из ORF, идентифицированных в последовательностях SEQ ID №1 - SEQ ID №8.
11. Применение штамма по п.1 для производства пищевого продукта, или пищевого ингредиента, или фармацевтической композиции.
12. Применение по п.11, отличающееся тем, что пищевым продуктом или пищевым ингредиентом является молочный продукт, мясной продукт, зерновой продукт, напиток, мусс или порошок.
13. Пищевая или фармацевтическая композиция, содержащая, по меньшей мере, один штамм по п.1.
14. Молочный продукт, содержащий, по меньшей мере, один штамм по п.1.
15. Молочный продукт по п.14, отличающийся тем, что речь идет о сквашенном молоке, йогурте, созревших сливках, сыре, твороге, молочном напитке, ультраконцентрате молочного продукта, плавленом сыре, сливочном десерте, деревенском сыре или молоке для питания младенцев.
16. Молочный продукт по п.14 или 15, отличающийся тем, что содержит молоко животного и/или растительного происхождения.
