Среда для дифференциальной диагностики энтеробактерий

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для ускоренной индикации и дифференциации энтеробактерий. Питательная среда содержит агар-агар, лактозу, маннит, пептон, NaCl, нейтральный красный, бромтимоловый синий и 0,2%-ный раствор оксидата торфа (криалла). Изобретение позволяет расширить арсенал питательных сред. 2 табл.

 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к дифференциальной диагностике энтеробактерий, и может быть использовано для ускоренной индикации и дифференциации энтеробактерий, выделяемых из биологического материала животных и птиц с использованием питательных сред.

Известна питательная среда Левина для выращивания сальмонелл, эшерихий, протеев, стафилококков и грибов рода Candida, содержащая пептон, агар-агар, NaCl, лактозу, двуосновной фосфат калия, индикаторы эозин желтый и метиловый синий - готовится на мясной воде.

Однако использование этой питательной среды усложнено тем, что она не подлежит хранению в готовом виде, кроме того, она позволяет дифференцировать лишь три рода представителей семейства энтеробактерий.

Наиболее близкой по сущности заявляемому решению является известная политропная полужидкая питательная среда - ПППС (Лабораторное дело, 1979, №8, стр.492. - Китченко А.В. с соавт.), предназначенная для ускоренной индикации и родовой дифференциации представителей энтеробактерий - сальмонелл, эшерихий, цитробактеров, клебсиелл, протеев, гафний. Состав среды: NaCl ч.д.а. 4,0; фосфата натрия х.ч. 0,5; сернокислого аммония ч.д.а. 1,0; сернокислого калия ч. 2,0; сернокислого магния ч.д.а. 0,5; углекислого натрия ч.д.а. 0,2; лактозы 20,0; маннита 1,0; пептона 20,0; нейтрального красного 0,04; бромтимолового синего 0,02; агар-агара 2,5-3,0; воды дистиллированной 1000,0.

Однако эта среда требует большого количества компонентов, что делает ее более дорогой и сложной в приготовлении.

Задача данного изобретения - расширение арсенала питательных сред, используемых в бактериологической диагностике.

Поставленная задача решается тем, что известная среда для дифференциальной диагностики энтеробактерий, включающая агар-агар, лактозу, маннит, пептон, NaCl, нейтральный красный, бромтимоловый синий и минерально-солевую основу (фосфат натрия, сернокислый аммоний, сернокислый калий, сернокислый магний, углекислый натрий), согласно изобретению в качестве минерально-солевой основы и биостимулятора роста содержит раствор оксидата торфа при следующем соотношении компонентов, г/л:

0,2% раствор оксидата торфа	1000,0
лактоза	20,0
маннит	1,0
пептон	20,0
NaCl	4,0
агар-агар	2,5-3,0
нейтральный красный	0,04
бромтимоловый синий	0,02

Изобретение осуществляется следующим образом.

В качестве заменителя набора солей, применяемых в составе среды, и как биостимулятор роста использован оксидат торфа, представляющий собой вытяжку из торфа, содержащую его биологические компоненты.

Приготовление среды

Экспериментальную политропную полужидкую питательную среду готовят на основе раствора оксидата торфа, заменяя тем самым минерально-солевую основу среды-прототипа, при этом содержание остальных компонентов остается неизменным.

Оксидат торфа - торфогуминовое комплексное удобрение, представляющее собой вытяжку из торфа и содержащую его биологические компоненты - заявка на патент №94011513/15 «Способ получения торфогуминового удобрения», Алексеев А.С. с соавт.; ТУ 88 БССР 135-88.

Препарат биологически активный оксидат торфа (ПБАОТ) /для ветеринарии/ представляет собой 5% жидкость от темно-коричневого до светло-коричневого цвета, имеет нейтральную реакцию, хорошо растворим в воде, имеет специфический запах, содержит в своем составе гуминовые, нафтеновые (карбоновые), фульвовые кислоты до 98%, фенолы, хиноны, полисахариды, моносахариды, комплекс аминокислот, широкий спектр макро- и микроэлементов. Является натуральным, природным, экологически чистым препаратом.

Наставление по применению ПБАОТ в ветеринарии утверждено Главным Управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации 29.07.1993 г., №19-5-2, рег. №10.07.69-93 ОВФП.

Промышленные испытания ПБАОТ на территории России проводились в 1991-1994, 1999-2003 гг. в Томской и Новосибирской областях под названием «Гумитон», «Оксидат торфа», «НФС».

Сначала готовят 0,2%-ный раствор оксидата торфа (1000,0 мл) - для этого 2 мл его растворяют в 998,0 мл дистиллированной воды.

2,5-3,0 г агар-агара предварительно заливают небольшим количеством 0,2%-ного раствора оксидата торфа (30,0-50,0 мл) и оставляют на 1-2 часа.

Остальной раствор подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 7,0-7,2.

20,0 г пептона размешивают стеклянной палочкой в небольшом количестве 0,2%-ного раствора оксидата торфа (50,0-100,0 мл).

0,04 г нейтрального красного растворяют в 3 мл дистиллированной воды, подогревая в водяной бане (до полного растворения).

0,02 г бромтимолового синего растворяют в 0,5 мл спирта.

Все подготовленные компоненты вносят в колбу с оставшимся 0,2%-ным раствором оксидата торфа, добавляют 1,0 г маннита, 20,0 г лактозы, 4,0 г NaCl и кипятят 5-7 минут (до полного растворения агар-агара), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 40°С и доводят рН среды до 7,0-7,2. Готовую среду разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среда имеет темно-коричневый цвет (плохо заваренного чая).

Чистые культуры энтеробактерий (музейные штаммы), а также выделенные культуры от больных животных и птиц (подозрительные колонии), выращенные на простых и элективных питательных средах, засевают уколом на предлагаемую среду - ЭПППС и контрольную политропную полужидкую питательную среду - ПППС (Лабораторное дело, 1979, №8, стр.492, Китченко А.В с соавт.). Посевы инкубируют при температуре +37°С, просматривают через сутки и учитывают результаты по изменению цвета питательной среды в зависимости от роста различных представителей семейства энтеробактерий.

Изобретение характеризуется следующими примерами его осуществления.

Пример 1. Готовят 0,2%-ный раствор оксидата торфа - 2,0 мл его растворяют в 998,0 мл дистиллированной воды. Далее 2,5-3,0 г агар-агара заливают небольшим количеством 0,2%-ного раствора оксидата торфа (30,0-50,0 мл) и оставляют на 1-2 часа. Остальной раствор подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 7,0-7,2. В небольшом количестве 0,2%-ного раствора оксидата торфа (50,0-100,0 мл) размешивают стеклянной палочкой 20,0 г пептона. Нейтральный красный 0,04 г растворяют в 3 мл дистиллированной воды, подогревая в водяной бане (до полного растворения). Бромтимоловый синий 0,02 г растворяют в 0,5 мл спирта.

Все подготовленные компоненты вносят в колбу с оставшимся 0,2%-ным раствором оксидата торфа, добавляют 1,0 г маннита, 20,0 г лактозы, 4,0 г NaCl и кипятят 5-7 минут (до полного растворения агар-агара), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 40°С и доводят рН среды до 7,0-7,2. Готовую среду разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среда имеет темно-коричневый цвет (плохо заваренного чая). На эту среду пробно засевают уколом культуру семейства энтеробактерий (в нашем случае - сальмонеллу).

Пример 2. Готовят 0,4%-ный раствор оксидата торфа - 4,0 мл его растворяют в 998,0 мл дистиллированной воды. Далее 2,5-3,0 г агар-агара заливают небольшим количеством 0,4%-ного раствора оксидата торфа (30,0-50,0 мл) и оставляют на 1-2 часа. Остальной раствор подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 7,0-7,2. В небольшом количестве 0,4%-ного раствора оксидата торфа (50,0-100,0 мл) размешивают стеклянной палочкой 20,0 г пептона. Нейтральный красный 0,04 г растворяют в 3 мл дистиллированной воды, подогревая в водяной бане (до полного растворения). Бромтимоловый синий 0,02 г растворяют в 0,5 мл спирта.

Все подготовленные компоненты вносят в колбу с оставшимся 0,4%-ным раствором оксидата торфа, добавляют 1,0 г маннита, 20,0 г лактозы, 4,0 г NaCl и кипятят 5-7 минут (до полного растворения агар-агара), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 40°С и доводят рН среды до 7,0-7,2. Готовую среду разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среда имеет темно-коричневый цвет (плохо заваренного чая). На эту среду пробно засевают уколом культуру семейства энтеробактерий (в нашем случае - сальмонеллу).

Пример 3. Готовят 0,6%-ный раствор оксидата торфа - 6,0 мл его растворяют в 998,0 мл дистиллированной воды. Далее 2,5-3,0 г агар-агара заливают небольшим количеством 0,6%-ного раствора оксидата торфа (30,0-50,0 мл) и оставляют на 1-2 часа. Остальной раствор подщелачивают 1%-ным раствором NaOH до рН 7,0-7,2. В небольшом количестве 0,6%-ного раствора оксидата торфа (50,0-100,0 мл) размешивают стеклянной палочкой 20,0 г пептона. Нейтральный красный 0,04 г растворяют в 3 мл дистиллированной воды, подогревая в водяной бане (до полного растворения). Бромтимоловый синий 0,02 г растворяют в 0,5 мл спирта.

Все подготовленные компоненты вносят в колбу с оставшимся 0,6%-ным раствором оксидата торфа, добавляют 1,0 г маннита, 20,0 г лактозы, 4,0 г NaCl и кипятят 5-7 минут (до полного растворения агар-агара), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 40°С и доводят рН среды до 7,0-7,2. Готовую среду разливают в пробирки по 3 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение 20 минут. Среда имеет темно-коричневый цвет (плохо заваренного чая). На эту среду пробно засевают уколом культуру семейства энтеробактерий (в нашем случае - сальмонеллу).

Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 1, 2 и 3, представлены в таблице 1:

Таблица 1
музейные штаммы энтеробакт.	ИЗМЕНЕНИЕ ЦВЕТА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ
Пример №1 - среда на 0,2%-ном растворе оксидата торфа 2,0 мл до 1000,0	Пример №2 - среда на 0,4%-ном растворе оксидата торфа 4,0 мл до 1000,0	Пример №3 - среда на 0,6%-ном растворе оксидата торфа 6,0 мл до 1000,0	Контроль (ПППС)
Salmonella	лимон-зелен.	лимон-зелен.	лимон-зелен.	лим.-зел.

Сравнивая результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 1, 2 и 3, можно констатировать, что все три экспериментальные среды показали одинаковые результаты, т.е. совпадают по изменению цвета среды с контролем, но приготовленная на основе 0,2%-ного раствора оксидата торфа (пример №1) предпочтительнее тем, что для ее приготовления требуется наименьшее количество оксидата торфа, что и обусловливает ее дальнейшее применение.

Далее проводят испытание предлагаемой политропной полужидкой питательной среды - ЭПППС, приготовленной на основе 0,2%-ного раствора оксидата торфа, для выращивания всех штаммов энтеробактерий. Для контроля используют среду - ПППС (Лабораторное дело, 1979, №8, стр.492, Китченко А.В с соавт.).

Результаты испытания предлагаемой политропной полужидкой питательной среды - ЭПППС, приготовленной на основе 0,2%-ного раствора оксидата торфа, представлены в таблице 2:

Таблица 2
музейные штаммы энтеробактерий	ИЗМЕНЕНИЕ ЦВЕТА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ
ЭПППС (предлагаемая среда)	ПППС (контроль)
Salmonella	лимонно-зеленый	лимонно-зеленый
Е.coli	малиново-красный	малиново-красный
Citrobacter	оранжево-красный	оранжево-красный
Klebsiella	не изменяется или имеет красный оттенок	не изменяется или имеет красный оттенок
Proteus	грязно-зеленый	грязно-зеленый
Hafnia	красный	красный

Сравнивая результаты испытания предлагаемой среды с контрольной, можно констатировать, что предлагаемая среда ЭПППС, приготовленная на основе 0,2%-ного раствора оксидата торфа, равноценна контрольной ПППС, что дает основание для ее использования в практике.

Таким образом, введение в среду для дифференциальной диагностики энтеробактерий минерально-солевой основы в виде раствора оксидата торфа стимулирует рост бактерий, сокращает количество компонентов, упрощает ее приготовление, удешевляет и сокращает сроки диагностических исследований.

Среда для дифференциальной диагностики энтеробактерий, включающая агар-агар, лактозу, маннит, пептон, NaCl, нейтральный красный, бромтимоловый синий и минерально-солевую основу, отличающаяся тем, что в качестве минерально-солевой основы и биостимулятора роста содержит раствор оксидата торфа при следующем соотношении компонентов, г/л:

0,2%-ный раствор оксидата торфа	1000 мл
лактоза	20,0
маннит	1,0
пептон	20,0
NaCl	4,0
агар-агар	2,5-3,5
нейтральный красный	0,04
бромтимоловый синий	0,02