Способы лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний с помощью соединений 2,4-пиримидиндиамина

Изобретение относится к 2,4-пиримидиндиаминам, таким как N4-(4-Хлор-3-метоксифенил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин, N4-(3-хлор-4-метоксикарбонилметиленоксифенил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил] -2,4-пиримидиндиамин, N4-[3-хлор-4-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин, N4-[3-хлор-4-(2-гидроксиэтиленокси)фенил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин, и другим соединениям, указанным в п.1 формулы настоящего изобретения в качестве ингибиторов Syk-киназы, а также к фармацевтическим композициям на их основе и их применению. Соединения могут найти применение для лечения таких аутоимуных заболеваний, как системная красная волчанка, ревматоидный артрит и др. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 16 ил. 11 табл.

 

1. Перекрестные ссылки на «родственные» заявки

Согласно § 119(e) части 35 Свода Законов США (United States Code - U.S.C.) настоящая заявка является превалирующей по отношению к следующим заявкам: регистрационный номер 60/399 673, дата подачи 29 июля 2002 года; регистрационный номер 60/443 949, дата подачи 31 января 2003 года и регистрационный номер 60/452 339, дата подачи 6 марта 2003 года.

2. Область изобретения

Настоящее изобретение относится в целом к соединениям 2,4-пиримидинаминов, фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, промежуточным соединениям и синтетическим способам производства указанных соединений и способам применения этих соединений и композиций в различных областях, например при лечении или профилактике аутоиммунных заболеваний и/или симптомов, связанных с этими заболеваниями.

3. Предпосылки к созданию изобретения

Перекрестное связывание Fc-рецепторов, таких, например, как рецептор с высоким сродством к IgE (FcεRI) и/или рецептор с высоким сродством к IgG (FcγRI), активирует сигнальный каскад в мастоцитах, базофилах и других иммунных клетках, в результате чего происходит выделение химических медиаторов, ответственных за различные неблагоприятные события. Например, такое перекрестное связывание приводит к выделению преформированных медиаторов реакций анафилактической гиперчувствительности I типа (немедленная реакция), таких как гистамин, из зон накопления в гранулах посредством дегрануляции. Оно также приводит к синтезу и выделению других медиаторов, включая лейкотриены, простагландины и факторы активации тромбоцитов (PAF), которые играют важную роль в воспалительных реакциях. Дополнительные медиаторы, которые синтезируются и выделяются в результате перекрестного связывания Fc-рецепторов, включают в себя цитокины и оксид азота.

Сигнальный каскад или каскады, активированные в результате перекрестного связывания Fc-рецепторов, как, например, FcεRI и/или FcγRI, включает в себя набор клеточных протеинов. Одними из наиболее важных распространителей межклеточных сигналов являются тирозинкиназы. Важной тирозинкиназой, участвующей в установлении сигнальных путей трансдукции, связанных с перекрестным связыванием рецепторов FcεRI и/или FcγRI, а также других каскадов передачи сигналов, является Syk-киназа (см. обзор в Valent et al., 2002, Intl. J. Hematol. 75(4):257-362).

Поскольку медиаторы, выделенные в результате перекрестного связывания рецепторов FcεRI и FcγRI, являются ответственными за проявление многочисленных неблагоприятных явлений или играют в этом важную роль, крайне желательно иметь в наличии соединения, способные ингибировать сигнальный каскад или каскады, ответственные за их выделение. Более того, ввиду критической роли Syk-киназы в сигнальном каскаде (каскадах) этих и других рецепторов наличие соединений, способных ингибировать Syk-киназу, также очень желательно.

4. Краткое описание изобретения

Одним из аспектов настоящего изобретения является предложение новых соединений 2,4-пиримидинаминов, которые, как будет подробно описано ниже, проявляют биологическую активность в ряде направлений. Эти соединения в целом состоят из 2,4-пиримидинаминного «ядра», которое имеет следующую структуру и систему нумерации:

Указанные соединения согласно настоящему изобретению замещаются в месте присоединения азота (N2) к атому C2 с целью образования вторичного амина и могут быть далее замещены в одном или нескольких положениях: в месте присоединения азота (N4) к атому C4, C5 и/или C6. При замещении в узле N4 заместитель образует вторичный амин. Заместитель в узле N2, а также возможные заместители в других положениях могут сильно отличаться по природе и физико-химическим свойствам. Например, заместитель (заместители) может представлять собой разветвленный, неразветвленный или циклический алкил, разветвленный, неразветвленный или циклический гетероалкил или комбинацию этих групп. Эти группы замещения могут в дальнейшем быть замещены, как подробно описано ниже.

Заместители N2 и/или N4 могут присоединяться непосредственно к соответствующим атомам азота или могут быть отделены от соответствующих атомов азота посредством линкеров, которые могут быть одинаковыми или различными. Природа линкеров может широко варьироваться и может включать в себя практически любую комбинацию атомов или групп, подходящую для разделения одной части молекулы от другой. Например, линкером может являться мост из ациклического углеводорода (например, насыщенный или ненасыщенный алкен-, как, например, метан-, этан-, этен-, пропан-, 1-пропен-, бутан-, 1-бутен-, 2-бутен, 1,3-бутадиен- и им подобные), мост из моноциклического или полициклического углеводорода (например, 1,2-бензол-, 2,3-нафталин- и им подобные), простой ациклический гетероатомный мост или гетероалкилдиильный мост (например,-О -, -S-, -S-O-, -NH-, -PH-, -C(O)-, -C(O)NH-, -S(O)-, -S(O)₂-, -S(O)NH-, -S(O)₂NH-, -O-CH₂-, -CH₂-O-CH₂-, -O-CH=CH-CH₂- и им подобные), моноциклический или полициклический гетероарильный мост (например, 3,4-фуран-, пиридин-, тиофен-, пиперидин-, пиперазин-, пиразидин-, пирролидин- и им подобные) или комбинации перечисленных мостов.

Заместители в положениях N2, N4, C5 и/или C6, а также потенциальные линкеры могут в дальнейшем быть замещены одной или несколькими идентичными или различными группами замещения. Природа этих групп замещения может меняться в широких пределах. Неограниченный ряд примеров подходящих групп замещения включает в себя разветвленные, неразветвленные и циклические алкилы, моно- и полициклические арилы, разветвленные, неразветвленные и циклические гетероалкилы, моно- и полициклические гетероарилы, галогенидуглеводороды, разветвленные, неразветвленные и циклические галогенидалкилы, гидроксилы, оксогруппы, триоксогруппы, разветвленные, неразветвленные и циклические алкоксигруппы, разветвленные, неразветвленные и циклические галогенидалкоксигруппы, трифторметоксигруппы, моно- и полициклические арилоксигруппы, моно- и полициклические гетероарилоксигруппы, эфиры, спирты, сульфиды, тиоэфиры, сульфанилы (тиолы), имины, азогруппы, азиды, амины (первичные, вторичные и третичные), нитрилы (любые изомеры), цианаты (любые изомеры), тиоцианаты (любые изомеры), нитрозогруппы, нитрогруппы, диазы, сульфоксиды, сульфонилы, сульфоновые кислоты, сульфамиды, сульфоноамиды, эфиры сульфаминовой кислоты, альдегиды, кетоны, карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды, амидины, формадины, аминокислоты, ацетилены, карбаматы, лактоны, лактамы, глюкозиды, глюконуриды, сульфоны, кетали, ацетали, тиокетали, оксимы, оксаминовые кислоты, эфиры оксаминовых кислот и т.д., а также комбинации указанных групп. Группы замещения, имеющие функциональную реакционноспособность, могут быть защищенными или незащищенными, что хорошо известно из предшествующих работ.

В одном из иллюстрационных примеров соединения 2,4-пиримидинаминов согласно настоящему изобретению представляют собой соединения с нижеприведенной структурной формулой (I):

включая их соли, гидраты, сольваты и N-оксиды, в которой структурные звенья L¹ и L², каждое в отдельности независимо друг от друга, выбраны из групп, содержащих прямую связь и линкер;

R² выбран из группы, содержащей (C1-C6) алкил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; (C3-C8) циклоалкил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; циклогексил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; циклогетероалкил с 3-8 членами, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; (C5-C15) арил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; фенил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸ и гетероарил с 5-15 членами, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸;

R⁴ выбран из группы, содержащей водород, (C1-C6) алкил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; (C3-C8) циклоалкил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; циклогексил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; циклогетероалкил с 3-8 членами, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; (C5-C15) арил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; фенил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; и гетероарил с 5-15 членами, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸;

R⁵ выбран из группы, содержащей R⁶, (C1-C6) алкил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; (C1-C4) алканил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸; (C2-C4) алкенил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸ и (C2-C4) алкинил, который может быть замещен одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸;

Каждая из групп R⁶ независимо выбрана из группы, содержащей водород, электроотрицательную группу, -OR^d, -SR^d, (C1-C3) галогенидалкилоксигруппу, (C1-C3) пергалогенидоалкилоксигруппу, -NR^cR^c, галоген, (C1-C3) галогенидалкил, (C1-C3) пергалоидоалкил, -CF₃, -CH₂CF₃, -CF₂CF₃, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO₂, -N₃, -S(O)R^d, -S(O)₂R^d, -S(O)₂OR^d, -S(O)NR^cR^c; -S(O)₂NR^cR^c, -OS(O)R^d, -OS(O)₂R^d, -OS(O)₂OR^d, -OS(O)NR^cR^c, -OS(O)₂NR^cR^c, -C(O)R^d, -C(O)OR^d, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NR^cR^c, -OC(O)R^d, -SC(O)R^d, -OC(O)OR^d, -SC(O)OR^d, -OC(O)NR^cR^c, -SC(O)NR^cR^c, -OC(NH)NR^cR^c, -SC(NH)NR^cR^c, -[NHC(O)]_nR^d, -[NHC(O)]_nOR^d, -[NHC(O)]_nNR^cR^c и -[NHC(NH)]_nNR^cR^c, (C5-C10) арил с возможным замещением одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸, фенил с возможным замещением одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸, (C6-C16) арилалкил с возможным замещением одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸, 5-10-членный гетероарил с возможным замещением одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸ и 6-16-членный гетероарилалкил с возможным замещением одной или несколькими идентичными или различными группами R⁸;

R⁸ выбран из группы, содержащей R^a, R^b, в которой группа R^a может быть замещена одной или несколькими идентичными или различными группами R^a или R^b, группа -OR^a может быть замещена одной или несколькими идентичными или различными группами R^a или R^b, -B(OR^a)₂, -B(NR^cR^c)₂, -(CH₂)_m-R^b, -(CHR^a)_m-R^b, -O-(CH₂)_m-R^b, -S-(CH₂)_m-R^b, -O-CHR^aR^b, -O-CR^a(R^b)₂, -O-(CHR^a)_m-R^b,

-O-(CH₂)_m-CH[(CH₂)_mR^b]R^b, -S-(CHR^a)_m-R^b, -C(O)NH-(CH₂)_m-R^b,

-C(O)NH-(CHR^a)_m-R^b, -O-(CH₂)_m-C(O)NH-(CH₂)_m-R^b,

-S-(CH₂)_m-C(O)NH-(CH₂)_m-R^b, -O-(CHR^a)_m-C(O)NH-(CHR^a)_m-R^b,

-S-(CHR^a)_m-C(O)NH-(CHR^a)_m-R^b, -NH-(CH₂)_m-R^b, -NH-(CHR^a)_m-R^b,

-NH[(CH₂)_mR^b], -N[(CH₂)_mR^b]₂, -NH-C(O)-NH-(CH₂)_m-R^b,

-NH-C(O)-(CH₂)_m-CHR^bR^b и -NH-(CH₂)_m-C(O)-NH-(CH₂)_m-R^b;

каждая из групп R^a независимо выбрана из группы, содержащей водород, (C1-C6) алкил, (C3-C8) циклоалкил, циклогексил, (C4-C11) циклоалкилалкил, (C5-C10) арил, фенил, (C6-C16) арилалкил, бензил, 2-6-членный гетероалкил, 3-8-членный циклогетероалкил, морфолинил, пиперазинил, гомопиперазинил, пиперидинил, 4-11-членный циклогетероалкилалкил, 5-10-членный гетероарил и 6-16-членный гетероарилалкил;

каждая из групп R^b представляет собой подходящую группу, которая выбрана из группы, содержащей =O, -OR^d, (C1-C3) галогенидалкилоксигруппу, -OCF₃, =S, -SR^d, =NR^d, =NOR^d, -NR^cR^c, галоген, -CF₃, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO₂, =N₂, -N₃, -S(O)R^d, -S(O)₂R^d, -S(O)₂OR^d, -S(O)NR^cR^c, -S(O)₂NR^cR^c, -OS(O)R^d, -OS(O)₂R^d, -OS(O)₂OR^d, -OS(O)₂NR^cR^c, -C(O)R^d, -C(O)OR^d, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NR^cR^c, -C(NR^a)NR^cR^c, -C(NOH)R^a, -C(NOH)NR^cR^c, -OC(O)R^d, -OC(O)OR^d, -OC(O)NR^cR^c, -OC(NH)NR^cR^c, -OC(NR^a)NR^cR^c, -[NHC(O)]_nR^d, -[NR^aC(O)]_nR^d, -[NHC(O)]_nOR^d, -[NR^aC(O)]_nOR^d, -[NHC(O)]_nNR^cR^c, -[NR^aC(O)]_nNR^cR^c, -[NHC(NH)]_nNR^cR^c и -[NR^aC(NR^a)]_nNR^cR^c;

каждая из групп R^c отдельно пре дставляет собой защитную группу или R^a, или, наоборот, каждая из групп R^c берется совместно с атомом азота, к которому она присоединена, с целью формирования 5-8-членного циклогетероалкила или гетероарила, которые могут включать в себя один или несколько идентичных или различных дополнительных гетероатомов и которые могут замещаться одной или несколькими идентичными или различными группами R^a или подходящими группами R^b;

каждая R^d группа отдельно представляет собой защитную группу или R^a;

каждый параметр m отдельно представляет собой целое число от 1 до 3; и

каждый параметр n отдельно представляет собой целое число от 0 до 3.

Другой аспект настоящего изобретения заключается в предложении пролекарств соединений 2,4-пиримидинаминов. Подобные пролекарства могут быть активными в виде их пролекарств или же неактивными до момента превращения в активную лекарственную форму при определенных физиологических или иных условиях применения. В пролекартвах согласно настоящему изобретению одна или несколько функциональных групп соединений 2,4-пиримидинаминов включены в прокомпоненты (promoieties), которые отщепляются от молекулы при условиях применения обычно путем гидролиза, ферментативного расщепления или другого механизма расщепления с образованием функциональных групп. Например, первичные или вторичные аминогруппы могут быть включены в амидный прокомпонент, который расщепляется при условиях применения с образованием первичной или вторичной аминогруппы. Таким образом, пролекарства согласно настоящему изобретению включают в себя особые виды защитных групп, которые называются «прогруппы» (“progroups”) и маскируют одну или несколько функциональных групп соединений 2,4-пиримидинаминов, которые расщепляются при условиях применения с образованием активных лекарственных соединений 2,4-пиримидинаминов. Функциональные группы, входящие в состав соединений 2,4-пиримидинаминов, которые могут быть замаскированы с помощью прогрупп с целью включения в прокомпонент, включают в себя, не ограничиваясь ими, амины (первичные и вторичные), гидроксилы, сульфанилы (тиолы), карбоксилы, карбонилы, фенолы, катехолы, диолы, алкины, фосфаты и пр. В настоящее время известно огромное количество прогрупп, подходящих для маскировки указанных функциональных групп с целью образования прокомпонентов, способных расщепляться при условиях применения. Все эти прогруппы, сами по себе или в комбинациях, могут быть включены в пролекарства согласно настоящему изобретению. Конкретные примеры прокомпонентов, образующих первичные или вторичные аминогруппы, которые могут быть включены в пролекарства согласно настоящему изобретению, включают в себя, не ограничиваясь ими, следующие группы: амиды, карбаматы, имины, мочевины, фосфенилы, фосфорилы и сульфенилы. Конкретные примеры прокомпонентов, образующих сульфанильные группы, которые могут быть включены в пролекарства согласно настоящему изобретению, включают в себя, не ограничиваясь ими, следующие группы: тиоэфиры, например, S-метилпроизводные (монотио-, дитио-, окситио-, аминотиоацетали, силиловые тиоэфиры, сложные тиоэфиры, тиокарбонаты, тиокарбаматы, асимметричные дисульфиды и т.д. Конкретные примеры прокомпонентов, образующих в результате расщепления гидроксильные группы, которые могут быть включены в пролекарства согласно настоящему изобретению, включают в себя, не ограничиваясь ими, следующие группы: сульфонаты, сложные эфиры и карбонаты. Конкретные примеры прокомпонентов, образующих карбоксильные группы, которые могут быть включены в пролекарства согласно настоящему изобретению, включают в себя, не ограничиваясь ими, следующие группы: сложные эфиры (включая сложные силиловые эфиры, эфиры оксаминовой кислоты и тиоэфиры), амиды и гидразиды.

В одном из иллюстративных примеров пролекарства согласно настоящему изобретению представляют собой соединения со структурной формулой (I), в которой защитная группа R^c и R^d является прогруппой.

Замещение атомов водорода, присоединенных к N2 и N4 в 2,4-пиримидинаминах, имеющих структурную формулу (I), заместителями оказывает неблагоприятное воздействие на активность соединений. Однако и это будет оценено специалистами - эти атомы азота могут быть включены в прокомпоненты, которые при условиях применения расщепляются и образуют 2,4-пиримидинамины согласно структурной формуле (I). Таким образом, как показано в другом иллюстративном примере, пролекарства согласно настоящему изобретению представляют собой соединения со следующей структурной формулой (II):

включая их соли, гидраты, сольваты и N-оксиды, в которых

R², R⁴, R⁵, R⁶, L¹ и L² - группы, указанные ранее при описании формулы (I); и

каждая из групп R^2b и R^4b в отдельности и независимо одна от другой является прогруппой.

Следующий аспект настоящего изобретения заключается в предложении композиций, содержащих одно или несколько соединений и/или пролекарств согласно настоящему изобретению, а также соответствующий носитель, наполнитель или разжижитель. Точная природа носителя, наполнителя или разжижителя будет зависеть от желаемого использования данной композиции - от веществ, применяемых в ветеринарной практике, до веществ, применяемых для лечения человека.

Еще один аспект настоящего изобретения заключается в предложении промежуточных соединений, используемых при синтезе соединений 2,4-пиримидинамина и пролекарств согласно настоящему изобретению. В одном из примеров промежуточные соединения представлены 4-пиримидинаминами со структурной формулой (III):

включая их соли, гидраты, сольваты и N-оксиды, в которых R⁴, R⁵, R⁶ и L² представляют собой группы, описанные ранее при определении структурной формулы (I); LG представляет собой замещаемую группу, например -S(O)₂Me, -SMe или галогеновые группы (т.е. F, Cl, Br, I); и R^4c представляет собой водород или прогруппу.

В другом примере промежуточные соединения представлены 2-пиримидинаминами согласно структурной формуле (IV):

включая их соли, гидраты, сольваты и N-оксиды, в которых R², R⁵, R⁶ и L¹ представляют собой группы, описанные ранее при определении структурной формулы (I); LG представляет собой замещаемую группу, например -S(O)₂Me, -SMe или галогеновые группы (т.е. F, Cl, Br, I); и R^2c представляет собой водород или прогруппу.

В еще одном примере промежуточные соединения представлены 4-амино- или 4-гидрокси-2-пиримидинаминами в соответствии со структурной формулой (V):

включая их соли, гидраты, сольваты и N-оксиды, в которых R², R⁵, R⁶ и L¹ представляют собой группы, описанные ранее при определении структурной формулы (I); R⁷ представляет собой амино- или гидроксильную группу и R^2c представляет собой водород или прогруппу.

В последующем примере промежуточные соединения представлены N4-замещенными цитозинами в соответствии со структурной формулой (VI):

включая их соли, гидраты, сольваты и N-оксиды, в которых R⁴, R⁵, R⁶ и L² представляют собой группы, описанные ранее при определении структурной формулы (I); и R^4c представляет собой водород или прогруппу.

Еще один аспект настоящего изобретения заключается в предложении способов синтеза соединений 2,4-пиридинаминов и пролекарств согласно настоящему изобретению. В одном из примеров указанный способ предполагает реакцию 4-пиримидинаминов со структурной формулой (III) с амином, имеющим формулу HR^2cN-L¹-R², где L¹, R² и R^2c представляют собой группы, указанные ранее при описании структурной формулы (IV), с целью образования 2,4-пиримидинамина, имеющего структурную формулу (I), или пролекарства в соответствии со структурной формулой (II).

В другом примере указанный способ предполагает реакцию 2-пиримидинаминов со структурной формулой (IV) с амином, имеющим формулу R⁴-L²-NHR^4c, в которой L⁴, R⁴ и R^4c представляют собой группы, указанные ранее при описании структурной формулы (III), с целью образования 2,4-пиримидинаминов, имеющего структурную формулу (I), или пролекарства в соответствии со структурной формулой (II).

В еще одном примере указанный способ предполагает реакцию 4-амино-2-пиримидинаминов со структурной формулой (V) (в которой R⁷ является аминогруппой) с амином, имеющим формулу R⁴-L²-NHR^4c, в которой L⁴, R⁴ и R^4c представляют собой группы, указанные ранее при описании структурной формулы (III), с целью образования 2,4-пиримидинамина, имеющего структурную формулу (I), или пролекарства в соответствии со структурной формулой (II). В альтернативном варианте, 4-амино-2-пиримидинамин может реагировать с соединением, имеющим формулу R⁴-L²-LG, в которой R⁴ и L² представляют собой группы, указанные ранее при описании структурной формулы (I), и LG представляет собой замещаемую группу.

В еще одном примере указанный способ предполагает реакцию галогенирования 4-гидрокси-2-пиримидинамина со структурной формулой (V) (R⁷ является гидроксильной группой) с целью образования 2-пиримидинамина со структурной формулой (IV), с последующей реакцией указанного пиримидинамина с соответствующим амином, как указано выше.

В еще одном примере указанный способ предполагает реакцию галогенирования N4-замещенного цитозина со структурной формулой (VI) с целью образования 4-пиримидинамина со структурной формулой (III) с последующей реакцией указанного пиримидинамина с соответствующим амином, как указано выше.

Соединения 2,4-пиримидинаминов согласно настоящему изобретению являются мощными ингибиторами дегрануляции иммунных клеток, таких как мастоциты, базофилы, нейтрофилы и/или эозинофилы. Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения заключается в предложении способов регуляции и, в частности, ингибирования дегрануляции таких клеток. Предлагаемый способ в целом заключается в приведении дегранулируемой клетки в контакт с соединением 2,4-пиримидинаминов или пролекарства согласно настоящему изобретению либо соответствующей соли, гидрата, сольвата, N-оксида указанных соединений и/или их комбинации в количестве, достаточном для эффективной регуляции или ингибирования дегрануляции клетки. Указанный способ может применяться in vitro или in vivo как тактика лечения или профилактики заболеваний, характеризуемых клеточной дегрануляцией, обусловленных ею или связанных с ней.

Не претендуя на связь с какой-либо теорией, объясняющей принцип действия, имеющиеся в наличии биохимические данные подтверждают, что соединения 2,4-пиримидинаминов оказывают ингибирующий эффект на дегрануляцию, по крайней мере частично, за счет блокирования и ингибирования каскада передачи сигналов (каскадов), инициированного в результате перекрестного связывания Fc-рецепторов с высокой степенью сродства к IgE (“FcεRI”) рецепторам и/или IgG (“FcγRI”) рецепторам. На самом деле соединения 2,4-пиримидинамина являются мощными ингибиторами дегрануляции, опосредованной и FcεRI-, и FcγRI- рецепторами. Как следствие этого соединения 2,4-пиримидина могут использоваться для ингибирования сигнальных каскадов указанных Fc-рецепторов в клетках любых типов, экспрессирующих такие FcεRI- и/или FcγRI-рецепторы, включая, но не ограничиваясь ими, следующие клетки: макрофаги, мастоциты, базофилы, нейтрофилы и/или эозинофилы.

Указанные способы также позволяют регулировать и, в частности, ингибировать процессы, протекающие в прямом направлении, которые являются результатом активации таких сигнальных каскадов Fc-рецепторов. Такие прямые процессы включают в себя, не ограничиваясь ими, следующие; FcεRI- и/или FcγRI- опосредованную дегрануляцию, производство цитокина и/или производство и/или выделение медиаторов липидов, таких как лейкотриены и простагландины. Указанный способ в целом заключается в приведении клетки из категории описанных выше, экспрессирующей Fc-рецептор, в контакт с соединением 2,4-пиримидинаминов или пролекарством согласно настоящему изобретению, либо соответствующей солью, гидратом, сольватом, N-оксида указанных соединений и/или их комбинаций, в количестве, достаточном для эффективной регуляции или ингибирования сигнального каскада Fc-рецепторов и/или прямого процесса, затронутого активацией этого сигнального каскада. Указанный способ может применяться in vitro или in vivo в качестве тактики лечения или профилактики заболеваний, характеризуемых, обусловленных или связанных с сигнальным каскадом Fc-рецепторов, как, например, заболеваний, обусловленных выделением химических медиаторов гранул в процессе дергануляции, выделением и/или синтезом цитокинов, и/или выделением и/или синтезом медиаторов липидов, таких как, например, лейкотриенов и простагландинов.

Еще один аспект настоящего изобретения заключается в предложении способов лечения и/или профилактики заболеваний, характеризуемых, обусловленных или связанных с выделением химических медиаторов в результате активирования сигнальных каскадов Fc-рецепторов, таких, например, как сигнальные каскады FcεRI- и/или FcγRI-рецепторов. Эти способы могут применяться как на животных, так и на людях. Указанные способы в целом заключаются во введении животным или человеку соединения 2,4-пиримидинаминов или пролекарства согласно настоящему изобретению либо соответствующей соли, гидрата, сольвата, N-оксида указанных соединений и/или их комбинации в количестве, достаточном для эффективного лечения или предотвращения заболевания. Как обсуждалось выше, активация сигнального каскада FcεRI- или FcγRI-рецепторов в определенных иммунных клетках приводит к выделению и/или синтезу различных химических веществ, которые являются фармакологическими медиаторами широкого диапазона заболеваний. Любые из этих заболеваний могут лечиться или быть предотвращены в соответствии со способами согласно настоящему изобретению.

Например, в мастоцитах и базофилах активация сигнального каскада FcεRI- или FcγRI-рецепторов приводит к немедленному (т.e. в течение 1-3 мин с момента акцивации рецепторов) выделению преформированных медиаторов атопических реакций и/или реакций гиперчувствительности I типа (например, гистамина, протеаз, как, например, триптазы, и т.д.) посредством процесса дегрануляции. Такие атопические реакции и/или реакции гиперчувствительности I типа включают в себя, не ограничиваясь ими анафилактические реакции на окружающую среду и другим аллергенам (например, пыльцу, яд насекомых и/или животных, пищу, лекарства, контрастную краску и т.д.), анафилактоидная реакция, сенная лихорадка, аллергический конъюнктивит, аллергический ринит, аллергическая астма, атопический дерматит, экзема, крапивница, нарушение функции слизистой оболочки, тканей, а также ряд желудочно-кишечных расстройств.

Вслед за немедленным выделением преформированных медиаторов посредством дегрануляции происходит выделение и/или синтез ряда других химических медиаторов, включая, среди прочих, фактор активации тромбоцитов (PAF), простагландины и лейкотриены (например, LTC4), а также синтез de novo и выделение цитокинов, как, например, TNFα, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 и т.д. Первый их этих двух процессов происходит примерно через 3-30 мин после активации рецепторов; последующий - примерно через 30 мин - 7 ч после активации рецепторов. Эти медиаторы “поздней стадии” считаются частично ответственными за хронические симптомы перечисленных выше атопической реакции и реакции гиперчувствительности I типа и вдобавок являются химическими медиатороами воспалений и воспалительных заболеваний (т.е. остеоартрит, воспалительная болезнь кишечника, язвенный колит, болезнь Крона, идиопатическая воспалительная болезнь кишечника, синдром повышенной раздражимости желудка, спастический колит и т.д.), слабое рубцевание (т.е. склеродерма, выраженный фиброз, образование келоидов, послеоперационные рубцы, фиброз легких, спазм сосудов, мигрень, реперфузионная травма и пост-инфаркт миокарда) и синдром Шегрена. Все эти заболевания могут лечиться или быть предотвращены в соответствии со способами согласно настоящему изобретению.

Дополнительные болезни, которые можно лечить или предотвратить с помощью способов согласно настоящему изобретению, включают в себя болезни, связанные с патологией базофильных клеток и/или мастоцитов. Примеры таких заболеваний включают в себя, не ограничиваясь ими, болезни кожи, как, например, склеродерма, болезни сердца, как, например, инфаркт миокарда, болезни легких, как, например, изменения или преобразования мышц легких или хроническое обструктивное заболевание легких (СOPD), и болезни кишечника, как, например, синдром воспаления кишечника (спастический колит).

Соединения 2,4-пиримидинаминов согласно настоящему изобретению также являются мощными ингибиторами тирозинкиназы и, в частности, Syk-киназы. Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения заключается в предложении способов регуляции и, в частности, ингибирования активности Syk-киназы. Способ в целом заключается в приведении Syk-киназы или клетки, содержащей Syk-киназу, в контакт с соединением 2,4-пиримидинаминов или пролекарства согласно настоящему изобретению либо с соответствующей солью, гидратом, сольватом, N-оксидом указанных соединений и/или их композицией в количестве, достаточном для эффективной регуляции или ингибирования активности Syk-киназы. В одном из примеров Syk-киназа представлена в качестве изолированной или рекомбинантной Syk-киназы. В другом примере Syk-киназа представлена в качестве эндогенной или рекомбинантной Syk-киназы, экспрессированной клеткой, как, например, в случае мастоцита или базофила. Способ может применяться in vitro или in vivo в качестве тактики лечения или профилактики заболеваний, характеризуемых, обусловленных или связанных с активностью Syk-киназы.

Не ограничиваясь какой-либо одной теорией, объясняющей принцип действия, считается, что соединения 2,4-пиримидинаминов согласно настоящему изобретению оказывают ингибирующий эффект на дегрануляцию клеток и/или выделение других химических медиаторов преимущественно за счет ингибирования Syk-киназы, которая активируется посредством гомодимера гамма-цепи рецептора FcεRI (см., например, фиг.2). Этот гомодимер гамма-цепи является общим для других Fc-рецепторов, включая FcγRI, FcγRIII и FcαRI. Для всех этих рецепторов процесс внутриклеточной передачи сигналов опосредован общим гомодимером гамма-цепи. Связывание и агрегация этих рецепторов приводит к рекрутингу и активации тирозинкиназ, как, например, Syk-киназы. В результате этих общих сигнальных действий указанные соединения 2,4-пиримидинаминов могут использоваться для регуляции и, в частности, ингибирования сигнальных каскадов Fc-рецепторов с гомодимерами гамма-цепи, как, например, FcεRI, FcγRI, FcγRIII и FcαRI, а также реакций клеток, полученных посредством этих рецепторов.

Известно, что Syk-киназа играет критическую роль в других сигнальных каскадах. Например, Syk-киназа является эффектором сигналов рецепторов В-клеток (ВCR) (Turner et al., 2000, Immunology Today 21:148-154) и является существенным компонентом сигнального пути бэта(1), бэта(2) и бэта(3)-интегрина в нейтрофилах (Mocsai et al., 2002, Immunity 16:547-558). Поскольку указанные соединения 2,4-пиримидинаминов являются мощными ингибиторами Syk-киназы, их можно использовать для регуляции, в частности ингибирования, любых сигнальных каскадов, в которых Syk-киназа играет роль, например, в сигнальных каскадах Fc-рецепторов, BCR и интегрина, а также реакций клеток, полученных посредством этих рецепторов. Регуляция или ингибирование конкретной реакции клетки частично зависят от конкретного типа клетки и сигнального каскада рецепторов и хорошо известны в литературе. Некоторые из примеров реакций клеток, которые можно регулировать или ингибировать посредством соединений 2,4-пиримидинаминов, включают в себя респираторный всплеск, клеточную адгезию, дегрануляцию клеток, распространение клеток, миграцию клеток, фагоцитоз (например, в макрофагах), поток ионов кальция (например, в мастоцитах, базофилах, нейтрофилах, эозинофилах и B-клетках), агрегацию тромбоцитов и созревание клеток (например, в B-клетках).

Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения заключается в предложении способов регуляции, в частности ингибирования, каскадов передачи сигналов, в которых участвует Syk-киназа. Способ в целом заключается в приведении Syk-зависимого рецептора или клетки, экспрессирующей Syk-зависимый рецептор, в контакт с соединением 2,4-пиримидинаминов или пролекарства согласно настоящему изобретению либо соответствующей соли, гидрата, сольвата, N-оксида указанных соединений и/или их комбинации в количестве, достаточном для эффективной регуляции или ингибирования каскада передачи сигналов. Указанные способы могут также использоваться для регуляции и, в частности, ингибирования прямых процессов или реакций клеток, полученных в результате активации конкретного Syk-зависимого каскада передачи сигналов. Способы можно использовать для регуляции любых каскадов передачи сигналов, в которых роль Syk-киназы неизвестна или же установлена позже. Способы могут использоваться in vitro или in vivo в качестве тактики лечения и профилактики заболеваний, характеризуемых, обусловленных или связанных с активацией Syk-зависимого каскада передачи сигналов. Некоторые примеры таких заболеваний включают болезни, описанные ранее.

Данные, полученные в результате клеточного анализа, в совокупности с данными, полученными на животных, также подтверждают, что соединения 2,4-пиримидинаминов в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы для лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний и/или симптомов этих заболеваний. Соответствующие способы в целом включают в себя введение пациенту, страдающему аутоиммунным заболеванием или находящемуся под угрозой развития аутоиммунного заболевания, 2,4-пиримидиндиамина или пролекарства согласно настоящему изобретению или же приемлемой соли, N-оксида, гидрата, сольвата или их комбинации в количестве, эффективном для лечения или профилактики аутоиммунного заболевания и/или связанных с ним симптомов. Аутоиммунные заболевания, поддающиеся лечению или профилактике с помощью соединений 2,4-пиримидинаминов, включают в себя заболевания, зачастую ассоциируемые с реакциями нон-анафилактической гиперчувствительности (II, III и/или IV типа), и/или заболевания, опосредованные, по крайней мере частично, активацией сигнального каскада FcγR в моноцитах. Такого рода аутоиммунные заболевания включают в себя, не ограничиваясь ими, заболевания, часто характеризуемые как аутоиммунные расстройства отдельного органа или единого типа клеток, а также заболевания, часто характеризуемые как включающие в себя системные аутоиммунные расстройства. Некоторые примеры заболеваний, часто характеризуемых как аутоиммунные расстройства отдельного органа или единого типа клеток, включают в себя тиреоидит Хасимото, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный атрофический гастрит пернициозной анемии, аутоиммунный энцефаломиелит, аутоиммунный орхит, синдром Гудпасчера, аутоиммунную тромбоцитопению, симпатическую офтальмию, астенический бульбарный паралич, базедову болезнь, билиарный первичный цирроз печени, хронический агрессивный гепатит, язвенный колит и мембранную гломерулопатию. Некоторые примеры заболеваний, часто характеризуемых как включающие в себя системные аутоиммунные расстройства, включают в себя системную красную волчанку, ревматоидный артрит, синдром Шегрена, синдром Рейтера, полимиозит-дерматомиозит, системный склероз, нодозный полиартериит, рассеянный склероз и буллезный пемфигоид.

5. Краткое описание фигур

На фиг.1 приведена наглядная иллюстрация продуцирования IgE под действием аллергенов и последующее выделение преформированных и прочих химических медиаторов мастоцитов;

На фиг.2 приведена наглядная иллюстрация каскада передачи сигналов рецепторов FcεR1, что приводит к дегрануляции мастоцитов и/или базофилов;

На фиг.3 приведена наглядная иллюстрация предполагаемых участков действия соединений, которые выборочно ингибируют дегрануляцию в обратном направлении, опосредованную FcεRI-рецепторами, и соединений, которые ингибируют дегрануляцию, опосредованную FcεRI-рецепторами и вызванную иономицинами;

На фиг.4 приведена графическая иллюстрация эффектов определенных соединений 2,4-пиримидинаминов, DMSO (контроль) и иономицинов на поток Ca²⁺ в культивируемых мастоцитах человека (CHMC);

На фиг.5 приведена графическая иллюстрация быстроты ингибирующего воздействия соединений R921218 и R926495;

На фиг.6 приведена графическая иллюстрация эффекта вымывания на ингибирующее воздействие соединений R921218 и R921302;

На фиг.7 приведены данные, показывающие, что переменная концентрация соединений R921218 (A) и R921219 (B) ингибирует фосфорилирование различных протеинов в прямом направлении от Syk-киназы в каскаде передачи сигналов рецепторов IgE в активированных клетках костномозговых мастоцитов (BMMC клетках);

На фиг.8 приведены данные, демонстрирующие ингибирование фосфорилирования эндогенного субстрата (LAT) и пептидного субстрата в зависимости от дозы Syk-киназы при возрастающих концентрациях соединений R921218 (X), R921219 (Y) и R921304 (Z);

На фиг.9 приведены данные, демонстрирующие конкурентный в отношении ATФ характер ингибирования Syk-киназы соединением R921219;

На фиг.10 приведены данные, показывающие, что переменная концентрация соединений R921219 (A) и R218218 (B) ингибирует фосфорилирование протеинов в прямом направлении от Syk-киназы, но не LYN-киназы, в каскаде передачи сигналов FcεRI-рецепторов в активированных CHMC клетках; на фигуре также показано ингибирование фосфорилирования протеинов в прямом направлении от LYN-киназы, но не Syk-киназы, в присутствии известного ингибитора LYN-киназы (PP2);

На фиг.11A-D приведены данные, демонстрирующие ингибирование фосфорилирования протеинов в прямом направлении от Syk-киназы в каскаде передачи сигналов FcεRI-рецепторов в клетках BMMC;

Фиг.12 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность соединения R921302 при лечении артрита, индуцированного антителом против колагена (CAIA), при испытании на мышах;

Фиг.13 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность соединения R921302 при лечении CAIA у мышей по сравнению с другими агентами и контрольными агентами;

Фиг.14 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность соединения R921302 при лечении индуцированного коллагеном артрита (CIA), при испытании на крысах;

Фиг.15 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность соединения R921302 при ингибировании экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE) у мышей, являющегося клинической моделью рассеяного склероза; и

Фиг.16 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность соединения R921302 при испытании на мышах линии SJL, которым в первый день иммунизации ввели 150 мкг препарата PLP 139-151 и 200 мкг препарата MTB (CFA).

6. Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

6.1 Определения

Следующие термины, используемые в настоящем тексте, имеют приведенные ниже значения:

“Алкил”, самостоятельно или как часть другого соединения, относится к насыщенному или ненасыщенному моновалентному углеводородному радикалу с разветвленной, неразветвленной или циклической структурой и установленным числом атомов углерода (например, C1-C6 означает количество атомов углерода от одного до шести), полученному путем отделения одного атома водорода от одиночного атома углерода исходного алкана, алкена или алкина. Типичные алкильные группы включают в себя, не ограничиваясь ими, метил; этилы, как, например, этанил, этенил, этинил; пропилы, как, например, пропан-1-ил, пропан-2-ил, циклопропан-1-ил, проп-1-ен-1-ил, проп-1-ен-2-ил, проп-2-ен-1-ил, циклопроп-1-ен-1-ил; циклопроп-2-ен-1-ил, проп-1-ин-1-ил, проп-2-ин-1-ил и т.д.; бутилы, такие как бутан-1-ил, бутан-2-ил, 2-метил-пропан-1-ил, 2-метил-пропан-2-ил, циклобутан-1-ил, бут-1-ен-1-ил, бут-1-ен-2-ил, 2-метил-проп-1-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, бут-2-ен-2-ил, бута-1,3-диен-1-ил, бута-1,3-диен-2-ил, циклобут-1-ен-1-ил, циклобут-1-ен-3-ил, циклобута-1,3-диен-1-ил, бут-1-ен-1-ил, бут-1-ин-3-ил, бут-3-ин-1-ил и т.д.; и им подобные. Если предполагаются заданные уровни насыщения, используется термин “алканил”, “алкенил” и/или “алкинил”, как указано ниже. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения алкильные группы представляют собой алкил (C1-C6).

“Алканил”, самостоятельно или как часть другого соединения, относится к насыщенному алкилу с разветвленной, неразветвленной или циклической структурой, полученному путем отделения одного атома водорода от одиночного атома углерода исходного алкана. Типичные алкильные группы включают в себя, как минимум, метанил; этанил; пропанилы, такие как пропан-1-ил, пропан-2-ил (изопропил), циклопропан-1-ил и т.д.; бутанилы, такие как бутан-1-ил, бутан-2-ил (втор-бутил), 2-метил-пропан-1-ил (изобутил), 2-метил-пропан-2-ил (трет-бутил), циклобутан-1-ил и т.д.; и им подобные. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения алкильные группы представляют собой алканил (C1-C6).

“Алкенил”, самостоятельно или как часть другого соединения, относится к ненасыщенному алкилу с разветвленной, неразветвленной или циклической структурой, имеющему по меньшей мере одну двойную углерод-углеродную связь, полученную путем отделения одного атома водорода от одиночного атома углерода исходного алкена. Группа может иметь цис- или трансконфигурацию в окрестности двойной связи (двойных связей). Типичные алкильные группы включают в себя, не ограничиваясь ими, этенил; пропенилы, как, например, проп-1-ен-1-ил, проп-1-ен-2-ил, проп-2-ен-1-ил, проп-2-ен-2-ил, циклопроп-1-ен-1-ил; циклопроп-2-ен-1-ил; бутенилы, как, например, бут-1-ен-1-ил, бут-1-ен-2-ил, 2-метил-проп-1-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, бут-2-ен-2-ил, бута-1,3-диен-1-ил, бута-1,3-диен-2-ил, циклобут-1-ен-1-ил, циклобут-1-ен-3-ил, циклобута-1,3-диен-1-ил и т.д.; и им подобные. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения алкильные группы представляют собой алкенил (C2-C6).

“Алкинил”, самостоятельно или как часть другого соединения, относится к ненасыщенному алкилу с разветвленной, неразветвленной или циклической структурой, имеющему по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь, полученную путем отделения одного атома водорода от одиночного атома углерода исходного алкина. Типичные алкильные группы включают в себя, не ограничиваясь ими, этинил; пропинилы, как, например, проп-1-ин-1-ил, проп-2-ин-1-ил и т.д.; бутинилы, как, например, бут-1-ин-1-ил, бут-1-ин-3-ил, бут-3-ин-1-ил и т.д.; и им подобные. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения алкинильная группа представляет собой алкинил (C2-C6).

“Алкилдиил”, самостоятельно или как часть другого соединения, относится к насыщенной или ненасыщенной двухвалентной углеводородной группе с разветвленной, неразветвленной или циклической структурой и установленным числом атомов углерода (т.е. C1-C6 означает количество атомов углерода от одного до шести), полученной путем отделения одного атома водорода от каждого из двух обособленных атомов углерода исходного алкана, алкена или алкина или путем отделения двух атомов водорода от одиночного атома углерода исходного алкана, алкена или алкина. Два центра моновалентных радикалов или каждая валентность центра двухвалентного радикала могут формировать связи с одним и тем же или с разными атомами. Типичные алкилдиильные группы включают в себя, как минимум, метандиил; этилдиилы, такие как этан-1,1-диил, этан-1,2-диил, этен-1,1-диил, этен-1,2-диил; пропилдиилы, такие как пропан-1,1-диил, пропан-1,2-диил, пропан-2,2-диил, пропан-1,3-диил, циклопропан-1,1-диил, циклопропан-1,2-диил, проп-1-ен-1,1-диил, проп-1-ен-1,2-диил, проп-2-ен-1,2-диил, проп-1-ен-1,3-диил, циклопроп-1-ен-1,2-диил, циклопроп-2-ен-1,2-диил, циклопроп-2-ен-1,1-диил, проп-1-ин-1,3-диил и т.д.; бутилдиилы, такие как бутан-1,1-диил, бутан-1,2-диил, бутан-1,3-диил, бутан-1,4-диил, бутан-2,2-диил, 2-метил-пропан-1,1-диил, 2-метил-пропан-1,2-диил, циклобутан-1,1-диил; циклобутан-1,2-диил, циклобутан-1,3-диил, бут-1-ен-1,1-диил, бут-1-ен-1,2-диил, бут-1-ен-1,3-диил, бут-1-ен-1,4-диил, 2-метил-проп-1-ен-1,1-диил, 2-метанилиден-пропан-1,1-диил, бута-1,3-диен-1,1-диил, бута-1,3-диен-1,2-диил, бута-1,3-диен-1,3-диил, бута-1,3-диен-1,4-диил, циклобут-1-ен-1,2-диил, циклобут-1-ен-1,3-диил, циклобут-2-ен-1,2-диил, циклобута-1,3-диен-1,2-диил, циклобута-1,3-диен-1,3-диил, бут-1-ен-1,3-диил, бут-1-ен-1,4-диил, бута-1,3-диин-1,4-диил и т.д.; и им подобные. Если предполагаются заданные уровни насыщения, используется термин “алканилдиил”, “алкенилдиил” и/или “алкинилдиил”. Если предполагается, что участвуют две валентности одно и того же атома углерода, используется термин «алкилиден». В предпочтительных вариантах осуществления изобретения алкилдиильная группа представляет собой алкилдиил (C1-C6). Также предпочтительны насыщенные нецикличные алканилдиильные группы, в которых центры радикалов находятся в крайних атомах углерода, например, метандиил (метан-); этан-1,2-диил (этан-); пропан-1,3-диил (пропан-); бутан-1,4-диил (бутан-); и им подобные (также именуемые алкиленами, определение которым дано ниже).

“Алкилен”, самостоятельно или как часть другого соединения, относится к неразветвленной насыщенной или ненасыщенной алкилдиильной группе с двумя крайними центрами моновалентных радикалов, полученными путем отделения одного атома водорода от каждого их двух крайних атомов углерода неразветвленного исходного алкана, алкена или алкина. Обозначение двойной или тройной связи, если она существует, в отдельной алкиленгруппе указано в квадратных скобках. Типичные алкиленгруппы включают в себя, не ограничиваясь ими, метан-; этиленгруппы, как, например, этан-, этен-, этин-; пропиленгруппы, как, например, пропан-, проп[1]ен-, пропа[1,2]диен-, проп[1]ин- и т.д.; бутиленгруппы, как, например, бутан-, бут[1]ен-, бут[2]ен-, бута[1,3]диен-, бут[1]ин-, бут[2]ин-, бута[1,3]диин- и т.д.; и им подобные. Если предполагаются заданные уровни насыщения, используется термин “алкан-,” “алкен-” и/или “алкин-”. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения группа алкилен представляет собой алкилен- (C1-C6) или (C1-C3). Также предпочтительны неразветвленные насыщенные алкангруппы, например метан-, этан-, пропан-, бутан- и им подобные.

«Гетероалкил», «Гетероалканил», «Гетероалкенил», «Гетероалкинил», «Гетероалкилдиил» и «Гетероалкилен», как таковые или как часть других соединений, относятся к группам алкилов, алканилов, алкенилов, алкинилов, алкилдиилов или алкиленов соответственно, в которых один или более атомов углерода независимо друг от друга заменены идентичными или различными гетероатомами или гетероатомными группами. Типичные гетероатомы и/или гетероатомные группы, которые могут заменить атомы углерода, включают в себя, не ограничиваясь ими, -O-, -S-, -S-O-, -NR'-, -PH-, -S(O)-, -S(O)₂-, -S(O) NR'-, -S(O)₂NR'- и им подобные, включая их комбинации, в которых каждый R' радикал отдельно является атомом водорода или алкильной группой (C1-C6).

«Циклоалкил» и «Гетероциклоалкил», самостоятельно или как часть другого соединения, относятся к циклическим версиям «алкил»- и «гетероалкил»-групп соответственно. В случае гетероалкильной группы гетероатом может занимать положение, в котором он примыкает к остальной части молекулы. Типичные группы циклоалкилов включают в себя, не ограничиваясь ими, циклопропил; циклобутилы, как, например, циклобутанил или циклобутенил; циклопентилы, как, например, циклопентанил и циклопентенил; циклогексилы, как, например, циклогексанил и циклогексенил; и им подобные. Типичные группы гетероциклоалкилов включают в себя, не ограничиваясь ими, тетрагидрофуранил (например, тетрагидрофуран-2-ил, тетрагидрофуран-3-ил и т.д.), пиперидинил (например, пиперидин-1-ил, пиперидин-2-ил и т.д.), морфолинил (например, морфолин-3-ил, морфолин-4-ил и т.д.), пиперазинил (например, пиперазин-1-ил, пиперазин-2-ил и т.д.) и им подобные.

«Ациклический гетероатомный мост» относится к двухвалентному мосту, в котором атомы основной цели представляют собой исключительно гетероатомы и /или гетероатомные группы. Типичные нецикличные гетероатомные мостики включают в себя, не ограничиваясь ими, -O-, -S-, -S-O-, -NR'-, -PH-, -S(O)-, -S(O)₂-, -S(O) NR'-, -S(O)₂NR'- и им подобные, включая их комбинации, в которых каждый R'-радикал отдельно является атомом водорода или алкильной группой (C1-C6).

«Исходная ароматическая кольцевая система» относится к ненасыщенной циклической или полициклической кольцевой системе, имеющей сопряженную π-электронную систему. В определение «исходной ароматической кольцевой системы» конкретно включены конденсированные кольцевые системы, в которых одно или несколько колец являются ароматическими и одно или несколько колец являются насыщенными или ненасыщенными, такими, например, как флуорен, индан, инден, фенален, тетрагидронафталин и т.д. Типичные исходные ароматические кольцевые системы включают в себя, не ограничиваясь ими, ацеантрилен, аценафтилен, ацефенантрилен, антрацен, азулен, бензол, хризен, коронен, флуорантен, флуорен, гексацен, гексафен, гексален, индацен, s-индацен, индан, инден, нафталин, октацен, октафен, октален, овален, пента-2,4-диен, пентацен, пентален, пентафен, фенален, фенантрен, пицен, плеиаден, пирен, пирантрен, рубицен, тетрагидронафталин, трифенилен и им подобные, а также различные гидроизомеры указанных соединений.

« Арил», самостоятельно или как часть другого соединения, относится к моновалентной ароматической углеводородной группе с установленным количеством атомов углерода (например, C5-C15 означает количество атомов углерода от 5 до 15), полученных путем отделения одного атома водорода от обособленного атома углерода исходной ароматической системы колец. Типичные арильные группы включают в себя, не ограничиваясь ими, группы, полученные из ацеантрилена, аценафтилена, ацефенантрилена, антрацена, азулена, бензола, хризена, коронена, флуорантена, флуорена, гексацена, гексафена, гексалена, а-индацена, с-индацена, индана, индена, нафталина, октацена, октафена, окталена, овалена, пента-2,4-диена, пентацена, пенталена, пентафена, перилена, феналена, фенантрена, пицена, плеиадена, пирена, пирантрена, рубицена, трифенилена, тринафталина и им подобных, а также различные гидроизомеры указанных соединений. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения арильная группа представляет собой арил (C5-C15) с наиболее предпочтительной (C5-C10) структурой. Наиболее предпочтительными арилами являются циклопентадиенил, фенил и нафтил.

«Ариларил», самостоятельно или как часть другого соединения, относится к моновалентной углеводородной группе, полученной путем отделения одного атома водорода от обособленного атома углерода кольцевой системы, в которой две или более идентичных или неидентичных исходных ароматических систем колец объединены непосредственно друг с другом с помощью одинарной связи, в которой количество упомянутых прямых кольцевых соединений на единицу меньше, чем количество задействованных исходных ароматических систем колец. Типичные ариларильные группы включают в себя, не ограничиваясь ими, бифенил, трифенил, фенил-нафтил, бинафтил, бифенил-нафтил и им подобные. Если ариларильная группа имеет заданное число атомов углерода, то это число относится к атомам углерода, составляющим каждое исходное ароматическое кольцо. Например, ариларил (C5-C15) представляет собой ариларильную группу, в которой каждое ароматическое кольцо состоит из 5-15 атомов углерода, например бифенил, трифенил, бинафтил, фенилнафтил и т.д. Желательно, чтобы каждая исходная ароматическая кольцевая система ариларильной группы была независимой ароматической системой (C5-C15), а лучше - ароматической системой (C5-C10). Также желательными являются ариларильные группы, в которых все исходные ароматические кольцевые системы являются идентичными, например бифенил, трифенил, бинафтил, тринафтил и т.д.

«Биарил», самостоятельно или как часть другого соединения, относится к ариларильной группе, имеющей две идентичные исходные ароматические системы колец, которые соединены непосредственно друг с другом с помощью одинарной связи. Типичные биарильные группы включают в себя, не ограничиваясь ими, бифенил, бинафтил, биантрацил и им подобные. Желательно, чтобы ароматические системы колец представляли собой ароматические кольца (C5-C15), а лучше - ароматические кольца (C5-C10). Особенно желательно, чтобы биарильная группа представляла собой бифенил.

«Арилалкил», самостоятельно или как часть другого соединения, относится к ациклической алкильной группе, в которой один из атомов водорода, связанный с атомом углерода, обычно - концевым или sp ³ атомом углерода, замещен арильной группой. Типичные арилалкильные группы включают в себя, не ограничиваясь ими, бензил, 2-фенилэтан-1-ил, 2-фенилэтен-1-ил, нафтилметил, 2-нафтилэтан-1-ил, 2-нафтилэтен-1-ил, нафтобензил, 2-нафтофенилэтан-1-ил и им подобные. В случае алкильных соединений используются следующие термины: арилалканил, арилалкенил и/или арилалкинил. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения арилалкильная группа представляет собой арилалкил (C6-C21), например, алканильный, алкенильный или алкинильный фрагмент арилалкильной группы представляет собой (C1-C6) структуру, а арильный фрагмент - (C5-C15) структуру. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления изобретения арилалкильная группа имеет структуру (C6-C13), например, алканильный, алкенильный или алкинильный фрагмент арилалкильной группы имеет структуру (C1-C3), а арильный фрагмент - (C5-C10).

«Исходная гетероароматическая кольцевая система» относится к исходной ароматической кольцевой системе, в которой один или несколько атомов углерода независимо друг от друга замещены такими же или отличающимися гетероатомами или гетероатомными группами. Типичные гетероатомы или гетероатомные группы, замещающие атомы углерода, включают в себя, не ограничиваясь ими, N, NH, P, O, S, S(O), S(O)₂, Si и т.д. В определение «исходных гетероароматических кольцевых систем» конкретно включены конденсированные кольцевые системы, в которых одно или более колец являются ароматическими и одно или более колец являются насыщенными или ненасыщенными, такими, например, как бензодиоксан, бензофуран, хроман, хромен, индол, индолин, ксантен и т.д. В определение «исходные гетероароматические кольцевые системы» также включены известные кольца, содержащие общие группы замещения, как, например, бензопирон и 1-метил-1,2,3,4-тетразол. Из определения «исходных гетероароматических кольцевых систем» конкретно исключены бензольные кольца, конденсированные с образованием циклических полиалкиленгликолей, таких как циклический полиэтиленгликоль. Типичные исходные гетероароматические кольцевые системы включают в себя, не ограничиваясь ими, акридин, бензимидазол, бензисоксазол, бензодиоксан, бензодиоксол, бензофуран, бензопирон, бензотиадиазол, бензотиазол, бензотриазол, бензоксаксин, бензоксазол, бензоксазолин, карбазол, β-карболин, хроман, хромен, циннолин, фуран, имидазол, индазол, индол, индолин, индолизин, изобензофуран, изохромен, изоиндол, изоиндолин, изоквинолин, изотиазол, изоксазол, нафтиридин, оксадиазол, оксазол, перимидин, фенантридин, фенантролин, феназин, фталазин, птеридин, пурин, пиран, пиразин, пиразол, пиридазин, пиридин, пиримидин, пиррол, пирролизин, хиназолин, хинолин, хинолизин, хиноксалин, тетразол, тиадиазол, тиазол, тиофен, триазол, ксантен и им подобные.

«Гетероарил», самостоятельно или как часть другого соединения, относится к моновалентной гетероароматической группе с установленным количеством кольцевых атомов (например, «5-14-членный» означает количество кольцевых атомов от 5 до 14), полученных в результате отделения одного атома водорода от обособленного атома исходной гетероароматической системы колец. Типичные гетероарильные группы включают в себя, не ограничиваясь ими, группы, полученные на основе акридина, бензимидазола, бензизоксазола, бензодиоксана, бензодиаксола, бензофурана, бензопирона, бензотиадиазола, бензотиазола, бензотриазола, бензоксазина, бензоксазола, бензоксазолина, карбазола, β-карболина, хромана, хромена, циннолина, фурана, имидазола, индазола, индола, индолина, индолизина, изобензофурана, изохромена, изоиндола, изоиндолина, изохинолина, изотиазола, изоксазола, нафтиридина, оксадиазола, оксазола, перимидина, фенантридина, фенантролина, фенанзина, фталазина, птеридина, пурина, пирана, пиразина, пиразола, пиридазина, пиридина, пиримидина, пиррола, пирролизина, хиназолина, хинолина, хинолизина, хинексалина, тетразола, тиадиазола, тиазола, тиофена, триазола, ксантена и им подобного, а также различных гидроизомеров указанных соединений. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения гетероарильная группа представляет собой 5-14-членный гетероарил, в то время как наиболее предпочтительным является 5-10-членный гетероарил.

«Гетероарил-гетероарил», самостоятельно или как часть другого соединения, относится к моновалентной гетероароматической группе, полученной в результате отделения одного атома водорода от обособленного атома кольцевой системы, в которой две или более идентичные или неидентичные исходные гетероароматические системы непосредственно связаны друг с другом одинарной связью, в которой количество таких прямых кольцевых соединений на единицу меньше количества задействованных исходных гетероароматических кольцевых систем. Типичные гетероарил-гетероарильные группы включают в себя, не ограничиваясь ими, бипиридил, трипиридил, пиридилпиринил, бипиринил и т.д. При заданном числе атомов, указанные числа относятся к количеству атомов, составляющих каждую из исходных гетероароматических кольцевых систем. Например, 5-15-членный гетероарил-гетероарил представляет собой гетероарил-гетероарильную группу, в которой каждая из исходных гетероароматических кольцевых систем состоит из 5-15 атомов, например бипиридил, трипиридил и т.д. Желательно, чтобы каждая исходная гетероароматическая кольцевая система представляла собой независимую 5-15-членную гетероароматическую систему, а лучше - 5-10-членную гетероароматическую систему. Также предпочтительны гетероарил-гетероарильные группы, в которых все исходные гетероароматические кольцевые системы являются идентичными.

«Бигетероарил», самостоятельно или как часть другого соединения, относится к гетероарил-гетероарильной группе, включающей в себя две идентичные исходные гетероароматические кольцевые системы, соединенные непосредственно друг с другом одинарной связью. Типичные бигетероарильные группы включают в себя, не ограничиваясь ими, бипиридил, бипиринил, бихинолинил и им подобные. Предпочтительно, чтобы гетероароматические кольцевые системы представляли собой 5-15-членные гетероароматические кольца, а лучше - 5-10-членные гетероароматические кольца.

«Гетероарилалкил», самостоятельно или как часть другого соединения, относится к ациклической алкильной группе, в которой один из атомов водорода, связанный с атомом углерода, обычно - концевым или sp ³ атомом углерода, замещен гетероарильной группой. В случае алкильных соединений используются обозначения «гетероарилалканил», «гетероарилалкенил» и/или «гетероарилалкинил». В предпочтительных вариантах осуществления изобретения гетероарилалкильная группа представляет собой 6-21-членный гетероарилалкил, например, алканильный, алкенильный или алкинильный фрагмент гетероарилалкила представляет собой алкил со структурой (C1-C6), а гетероарильный компонент - 5-15-членный гетероарил. В наиболее предпочтительных вариантах осуществления изобретения гетероарилалкил представляет собой 6-13-членный гетероарилалкил, например, алканильный, алкенильный или алкинильный фрагмент гетероарилалкила представляет собой алкил со структурой (C1-C3), а гетероарильный компонент - 5-10-членный гетероарил.

«Галоген» или «Гало», самостоятельно или как часть другого соединения, в общем случае относятся к фтор-, хлор-, бром- и иодгруппам.

«Галогеналкил», самостоятельно или как часть другого соединения, относится к алкильной группе, в которой один или более атомов водорода замещаются галогеном. Таким образом, термин «галогеналкил» подразумевает моногалогеналкилы, дигалогеналкилы, тригалогеналкилы и т.д., включая пергалогеналкилы. Например, выражение «(C1-C2) галогеналкил» включает в себя фторметил, дифторометил, трифторметил, 1-фторэтил, 1,1-дифторэтил, 1,2-дифторэтил, 1,1,1-трифторэтил, перфторэтил и т.д.

Вышерассмотренные группы могут включать префиксы и /или суффиксы, которые широко используются при создании дополнительных хорошо известных замещающих групп. Например, «алкилокси» или «алкокси» относится к группе формулы -OR”, «алкиламин» относится к группе формулы -NHR” и «диалкиламин» относится к группе формулы -NR”R”, где каждый R” представляет собой независимый алкил. В качестве другого примера «галогеналкокси» или «галогеналкилокси» относится к группе формулы -OR''', где R''' представляет собой галогеналкил.

«Защитная группа» относится к группе атомов, которые будучи присоединенными к реактивной функциональной группе в молекуле маскируют, снижают или предотвращают реактивность функциональной группы. Обычно защитная группа может быть по желанию выборочно исключена в процессе синтеза. Примеры защитных групп можно найти в кн. Грина и Ватса «Защитные группы в органической химии», 3-е издание, 1999 г., изд-во Дж. Уайли энд Санс, Нью-Йорк (Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, 3^rd Ed., 1999, John Wiley & Sons, NY), а также в кн. Харрисона и др. «Краткий обзор способов синтетической органики», т. 1-8, 1971-1996, изд-во Дж. Уайли энд Санс, Нью-Йорк (Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8, 1971-1996, John Wiley & Sons, NY). Типичные аминосодержащие защитные группы включают в себя, не ограничиваясь ими, формил, ацетил, трифторацетил, бензил, бензилоксикарбонил (“CBZ”), трет-бутоксикарбонил («ВОС»), триметилсилил («ТМС»), 2-триметилсилил-этанесульфонаил («ТEС), тритил и замещенные тритиловые группы, аллилоксикарбонил, 9-фторенилметилоксикарбонил («FMOC»), нитровератрилоксикарбонил («NVOC») и им подобные. Представительные гидроксильные защитные группы включают в себя, не ограничиваясь теми из них, где гидорксильная группа является ацилированной или алкилированной, как, например, бензиловый или тритиловый эфиры, а также алкиловые эфиры, тетрагидропираниловые эфиры, триалкилсилиловые эфиры (например, группы TMС или TИППС) и аллиловые эфиры.

«Пролекарство» относится к производному активного соединения 2,4-пиримидиндиамина (лекарства), которое требует преобразования при условиях применения, например внутри тела, с целью выделения активного 2,4-пиримидиндиамина. Пролекарства часто, но необязательно, фармакологически неактивны, пока их не превращают в активные лекарства. Пролекарства обычно получают путем маскирования функциональной группы, входящей в состав лекарства 2,4-пиримидиндиамина с целью активирования прогруппы (определение дано ниже) для формирования прокомпонента, который затем подвергается преобразованию, например расщеплению, при заданных условиях применения с целью выделения функциональной группы и, следовательно, активного лекарства 2,4-пиримидиндиамина. Расщепление прокомпонента может происходить самопроизвольно, как, например, в результате реакции гидролиза, под воздействием катализатора или другого агента, как, например, фермента, света, кислоты или основания, а также в результате изменения или воздействия какого-либо физического параметра или окружающей среды, например температуры. Агент может быть эндогенным (внутренним), с точки зрения условий применения, как, например, фермент, присутствующий в клетках, для которых пролекарство предназначено, или кислотные условия в желудке, или он может вводиться экзогенно (наружно).

Широкое разнообразие прогрупп и прокомпонентов, пригодных для маскирования функциональных групп в активных компонентах, содержащих соединия 2,4-пиримидиндиамины, для получения пролекарств, хорошо известны в практике. Например, гидроксильная функциональная группа может быть маскирована как сульфонат, сложный эфир или прокомпонент углекислой соли, который может быть гидролизован in vivo для получения гидроксильной группы. Аминосодержащая функциональная группа может быть маскирована как амид, карбамат, имин, мочевина, фосфенил, фосфорил или прокомпонент сульфенила, который может быть гидролизован in vivo для получения аминосодержащей группы. Карбоксильная группа может быть маскирована как сложный эфир (включающий силиловые эфиры и тиоэфиры), прокомпонент амида или гидразида, который может быть гидролизован in vivo для получения карбоксильной группы. Прочие характерные примеры подходящих прогрупп и соответствующих им прокомпонентов являются очевидными для экспертов в данной области.

«Прогруппа» относится к типу защитной группы, которая при использовании с целью маскирования функциональной группы в активном лекарстве, содержащем 2,4-пиримидиндиамин, для формирования прокомпонента превращает лекарство в пролекарство. Прогруппы обычно присоединяются к функциональной группе лекарства посредством связей, которые могут расщепляться при заданных условиях применения. Таким образом, прогруппа является той частью прокомпонента, которая расщепляется для высвобождения функциональной группы при заданных условиях применения. В качестве конкретного примера можно привести амидосодержащий прокомпонент, имеющий формулу -NH-C(O)CH₃, который содержит прогруппу -C(O)CH₃.

«Fc-рецептор» относится к члену семейства молекул клеточной поверхности, который связывает Fc часть иммуноглобулина (содержащую специфическую константную область). Каждый Fc-рецептор связывает иммуноглобулин определенного типа. Например, Fcα-рецептор (“FcαR”) связывает IgA, FcεR-рецептор связывает IgE, а FcγR-рецептор связывает IgG.

Семейство FcαR включает в себя полимерный рецептор Ig, участвующий в эпителиальном переносе IgA/IgM, миклоидный специфический RcαRI-рецептор (также именуемый CD89), Fcα/μR-рецептор и по меньшей мере два альтернативных IgA-рецептора (в качестве последнего обзора см. Монтейро и ван де Винкель, 2003 г. Ежегодное обозрение иммунологии, современные электронные публикации (Monteiro & van de Winkel, 2003, Annu. Rev. Immunol, advanced e-publication)). Рецептор FcαRI проявляется на нейтрофилах, эозинофилах, моноцитах/макрофагах, дендритных клетках и купферовых клетках. FcαRI включает в себя одну альфа-цепочку и FcR-гамма-гомодимер, который несет мотив активации (ITAM) в цитоплазматическом домене и фосфорилирует Syk-киназу.

Семейство FcεR включает в себя два типа рецепторов: названные FcεRI и FcεRII (также известные как CD23). FcεRI представляет собой рецептор с высоким сродством (связывает IgE со сродством порядка 10¹⁰M^-1), который обнаруживается на мастоците, базофильных и эозинофильных клетках, и прикрепляет мономерный IgE к поверхности клетки. FcεRI имеет одну альфа-цепочку, одну бета-цепочку и гомодимер гамма-цепочки, рассмотренный выше. FcεRII представляет собой рецептор с низким сродством, экспресированный на мононуклеарных фагоцитах, в лимфоцитах, эозинофилах и тромбоцитах. FcεRII составляет одиночную полипептидную цепочку и не содержит гомодимер гамма-цепочки.

Семейство FcγR включает в себя три типа: названные FcγRI (также известный как CD64), FcγRII (также известный как CD32) и FcγRIII (также известный как CD16). FcγRI представляет собой рецептор с высоким сродством (связывает IgG1 со сродством порядка 10⁸M^-1), который обнаруживается на мастоците, базофильных, мононуклеарных, нейтрофильных, эозинофильных, дендритных и фагоцитных клетках, что прикрепляет монометрический IgG к поверхности клетки. FcγRI включает в себя одну альфа-цепочку и димер гамма-цепочки, который входит в FcαRI и в FcεRI.

FcγRII представляет собой рецептор с низким сродством, экспрессируемый на нейтрофилах, моноцитах, эозинофилах, тромбоцитах и B-лимфоцитах. FcγRII включает в себя одну альфа-цепочку и не содержит гомодимер гамма-цепочки, рассмотренный выше.

The FcγRIII представляет собой рецептор с низким сродством (связывает IgG1 со сродством порядка 5x10⁵M^-1), экспессируемый на NK, эозинофиловых, макрофаговых, нейтрофильных клетках и мастоцитах. Он образует одну альфа-цепочку и гамма-гомодимер, который входит в FcαRI, FcεRI и в FcγRI.

Эксперты в данной области согласятся, что предложенная структура субъединицы и связывающие свойства этих разнообразных Fc-рецепторов, а также типы клеток, экспрессируемые ими, охарактеризованы не полностью. Вышеприведенная дискуссия главным образом отражает текущее состояние вопроса относительно этих рецепторов (см, например, Иммунобиология: Иммунная система в здоровом состоянии и при болезнях, 5-е издание, Джейнвэй и др., 2001 г., рис.9.30 на стр. 371 (Immunobiology: The Immun System in Health & Disease, 5^th Edition, Janeway et al., Eds, 2001, ISBN 0-8153-3642-x, Figure 9.30 at pp. 371)) и не ставит целью ограничиться множеством сигнальных каскадов рецепторов, которые могут регулироваться конпонентами, описанными в данной заявке.

«Дегрануляция посредством Fc-рецептора» или «Дегрануляция, обусловленная Fc-рецептором,» относится к дегрануляции, которая осуществляется посредством каскада передачи сигнала Fc-рецептора, инициированного перекрестным связыванием Fc-рецептора.

«Дегрануляция, обусловленная IgE,» или «Дегрануляция посредством FcεRI» относится к дегрануляции, которая осуществляется посредством каскада передачи сигнала IgE-рецептора, инициированного перекрестным связыванием IgE, связанного с помощью FcεR1. Перекрестное связывание может быть вызвано аллергенспецифическим IgE или многовалентным связывающим агентом, таким как анти-IgE-антитело. На фиг.2 показано, что в мастоцитах и/или базофильных клетках сигнальный каскад FcεRI, ведущий к дегрануляции, может быть разбит на две стадии: обратную и прямую. Обратная стадия включает в себя все процессы, которые происходят до мобилизации ионов кальция (показаны как “Ca²⁺” на фиг.2; см. также фиг.3). Прямая стадия включает в себя мобилизацию ионов кальция и все ее последующие прямые процессы. Соединения, которые ингибируют дегрануляцию посредством FcεRI, могут действовать в любой точке вдоль каскада передачи сигналов, посредником которого является FcεRI. Соединения, которые избирательно ингибируют дегрануляции посредством FcεRI в обратном направлении, действуют так, чтобы ингибировать этой части сигнального каскада FcεRI в обратном направлении от точки, в которой возбуждается мобилизация ионов кальция. В клеточных пробах cоединения, которые избирательно ингибируют дегрануляции посредством FcεRI в обратном направлении, препятствуют дегрануляции клеток, таких как мастоциты или базофильные клетки, которые активируются или стимулируются аллергеном, характерным для IgE, или связывающим агентом (таким как анти-IgE-антитело), но заметно не ингибируют дегрануляцию клеток, которая активируется или стимулируется дегранулирующими агентами, обходящими сигнальный путь FcεRI, такими, например, как кальциевый ионофор иономицин и A23187.

«Дегрануляция, обусловленная IgG,» или «Дегрануляция посредством FcγRI» относится к дегрануляции, которая осуществляется посредством каскада передачи сигналов, инициированного перекрестным связыванием IgG, связанного с помощью FcγRI. Перекрестное связывание может быть вызвано аллергенспецифическим IgG или многовалентным связывающим агентом, таким как анти-IgG-антитело или частичное антитело. Как и сигнальный каскад FcεRI, сигнальный каскад FcγRI в мастоцитах и блазофильных клетках также ведет к дегрануляции, которая может быть разбита на те же две стадии: обратную и прямую. Подобно дегрануляции посредством FcεRI, соединения, которые избирательно ингибируют дегрануляцию посредством FcγRI в обратном направлении, действуют в обратном направлении от точки, в которой возбуждается мобилизация ионов кальция. В клеточных пробах cоединения, которые избирательно ингибируют дегрануляцию посредством FcγRI в обратном направлении, ингибируют дегрануляцию клеток, таких как мастоциты или базофильные клетки, которые активируются или стимулируются аллергенспецифическими IgG или связывающим агентом (таким как анти-IgG-антитело или его часть), но заметно не ингибируют дегрануляцию клеток, которые активируются или стимулируются дегранулирующими агентами, обходящими сигнальный путь FcγRI, такими, например, как кальциевые ионофоры иомицина и A23187.

«Дегрануляция, обусловленная ионофором,» или «Дегрануляция посредством ионофора» относится к дегрануляции клетки, такой как мастоцит или базофильная клетка, которая появляется при воздействии на такой ионофор кальция, как, например, иономицин или A23187.

«Syk-киназа» относится к хорошо известной тирозинкиназе протеина селезенки нерецептора 72 кДа (цитоплазматического), экспрессируемой в B-клетке и других гематопоэтических клетках. Syk-киназа состоит из двух последовательных консенсусных доменов Src-гомологии 2 (SH2), которые связываются с фосфорилированными мотивами иммунорецепторов, основанных на тирозине, линкерных доменов и каталитических доменов (обзор структуры и функции Syk-киназы приведены в Sada et al., 2001, J. Biochem. (Tokyo) 130:177-186); а также Turner et al., 2000, Immunology Today 21:148-154). Syk-киназа интенсивно изучалась как эффектор сигналов рецептора В-клетки (BCR) (см. выше Turner et al., 2000). Syk-киназа является также критической для фосфорилирования тирозина сложных протеинов, которые регулиируют важные пути, ведущие от иммунорецепторов, таких как каскады мобилизации Ca²⁺ и активированной митогеном протеинкиназы (MAPK) (см., например, фиг.2) и дегрануляция. Syk-киназа также играет критическую роль в сигнализировании интегрина в нейтрофилах (см., например, Мочаи и др., 2002 г., Иммунитет, т. 16, стр. 547-558 (Mocsai et al. 2002, Immunity 16:547-558)).

Как принято в настоящей работе, под Syk-киназой подразумевают киназу любых видов животных, влючая, но не ограничиваясь ими, человека, обезьян, коров, свиней, грызунов и т.д., принадлежащую семейству Syk. В эту группу конкретно включены изоформы, варианты сплайсинга, аллельные варианты, мутанты как естественного, так и искуственного происхождения. Аминокислотные последовательности таких Syk-киназ хорошо известны и имеются в GENBANK (банк генетического материала). Характерные примеры mRNA-кодирования различных изоформ человеческой Syk-киназы можно найти в GENBANK под № gi|21361552|ref|NM__003177.2|, gi|496899|emb|Z29630.1|HSSYKPTK[496899] и gi|15030258|gb|BC011399.1|BC011399[15030258], которые включены в настоящую работу в качестве ссылки.

Опытные практики оценят то, что тирозинкиназы, принадлежащие к другим семействам, могут иметь активные участки или связывающие карманы с трехмерной структурой, подобной структуре Syk. В результате этого структурного подобия считается, что такие киназы, иминуемые в данной заявке «Syk-имитаторами», могут служить катализаторами фосфорилирования подложек, которые фосфорилируются с помощью Syk-киназы. Таким образом, становится понятно, что такие Syk-имитаторы, каскады передачи сигналов, на которые оказывают влияние такие Syk, и биологические реакции от воздействия таких Syk-имитаторов и сигнальных каскадов, зависящих от Syk-имитаторов, можно регулировать и даже ингибировать с помощью соединений 2,4-пиримидиндиамина, описанных в данной заявке.

«Сигнальный каскад, зависящий от Syk», относится к каскаду передачи сигналов, на который оказывает влияние Syk-киназа. Некоторые примеры таких сигнальных каскадов, зависящих от Syk, включают в себя FcαRI, FcεRI, FcγRI, FcγRIII, BCR и сигнальные каскады интегрина.

Термин «аутоиммунное заболевание» относится к заболеваниям, зачастую ассоциируемым с неанафилактическими реакциями гиперчувствительности (реакциями гиперчувствительности II, III и/или IV типа), которые в основном являются результатом собственной гуморальной и/или опосредованной клетками иммунной реакции пациента на одно или более иммуногенное вещество эндогенной и/или экзогенной природы. Такие аутоиммунные болезни отличаются от заболеваний, связанных с анафилактическими реакциями гиперчувствительности (I типа или опосредованных IgE).

6.2 Соединения 2,4-пиримидиндиаминов

Структуры, представляющие суть изобретения, являются в основом соединениями 2,4-пиримидиндиаминов, которые соответствуют структурной формуле (I):

включая их соли, гидраты, сольваты и N-оксиды, в которой

L¹ и L², каждый независимо друг от друга, выбраны из группы, состоящей из одной прямой связи и одного линкера;

R² выбран из группы, состоящей из (C1-C6) алкила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸ группами, (C3-C8) циклоалкила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами, циклогексила, который может быть замещен одной или более одинаковыми или различными R⁸-группами, 3-8-членного циклогетероалкила, который может быть замещен одной или более одинаковыми или различными R⁸-группами, (C5-C15) арила, который может быть замещен одной или более одинаковыми или различными R⁸-группами, фенила, который может быть замещен одной или более одинаковыми или различными R⁸ группами, и 5-15-членного гетероарила, который может быть замещен одной или более одинаковыми или различными R⁸-группами;

R⁴ выбран из группы, состоящей из водорода, (C1-C6) алкила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами, (C3-C8) циклоалкила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами, циклогексила, которые могут быть замещены одной или более идентичными или различными R⁸-группами, 3-8-членного циклогетероалкила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами, (C5-C15) арила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами, фенила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами, и 5-15-членного гетероарила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами;

R⁵ выбран из группы, состоящей из R⁶, (C1-C6) алкила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами, (C1-C4) алканила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами, (C2-C4) алкенила, который может быть замещен одной или более идентичными или разными R⁸-группами, и (C2-C4) алкинила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами;

каждый R⁶ независимо выбран из группы, состоящей из водорода, электроотрицательной группы, -OR^d, -SR^d, (C1-C3) галогеналкилокси, (C1-C3) пергалогеналкилокси, -NR^cR^c, галогена, (C1-C3) галогеналкила, (C1-C3) пергалогеналкила, -CF₃, -CH₂CF₃, -CF₂CF₃, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO₂, -N₃, -S(O)R^d, -S(O)₂R^d, -S(O)₂OR^d, -S(O)NR^cR^c, -S(O)₂NR^cR^c, -OS(O)R^d, -OS(O)₂R^d, -OS(O)₂OR^d, -OS(O)NR^cR^c, -OS(O)₂NR^cR^c, -C(O)R^d, -C(O)OR^d, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NR^cR^c, -OC(O)R^d, -SC(O)R^d, -OC(O)OR^d, -SC(O)OR^d, -OC(O)NR^cR^c, -SC(O)NR^cR^c, -OC(NH)NR^cR^c, -SC(NH)NR^cR^c, -[NHC(O)]_nR^d, -[NHC(O)]_nOR^d, -[NHC(O)]_nNR^cR^c и -[NHC(NH)]_nNR^cR^c, (C5-C10) арила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами, фенила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами, (C6-C16) арилалкила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами, 5-10-членного гетероарила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами, и 6-16-членного гетероарилалкила, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R⁸-группами;

R⁸ выбран из группы, состоящей из R^a, R^b, R^a, замещенных одним или более идентичными или различными R^a или R^b, -OR^a, замещенного одним или более идентичными или различными R^a или R^b, -B(OR^a)₂, -B(NR^cR^c)₂, -(CH₂)_m-R^b, -(CHR^a)_m-R^b, -O-(CH₂)_m-R^b, -S-(CH₂)_m-R^b, -O-CHR^aR^b, -O-CR^a(R^b)₂, -O-(CHR^a)_m-R^b, -O-(CH₂)_m-CH[(CH₂)_mR^b]R^b, -S-(CHR^a)_m-R^b, -C(O)NH-(CH₂)_m-R^b, -C(O)NH-(CHR^a)_m-R^b, -O-(CH₂)_m-C(O)NH-(CH₂)_m-R^b, -S-(CH₂)_m-C(O)NH-(CH₂)_m-R^b, -O-(CHR^a)_m-C(O)NH-(CHR^a)_m-R^b, -S-(CHR^a)_m-C(O)NH-(CHR^a)_m-R^b, -NH-(CH₂)_m-R^b, -NH-(CHR^a)_m-R^b, -NH[(CH₂)_mR^b], -N[(CH₂)_mR^b]₂, -NH-C(O)-NH-(CH₂)_m-R^b, -NH-C(O)-(CH₂)_m-CHR^bR^b и -NH-(CH₂)_m-C(O)-NH-(CH₂)_m-R^b;

каждый R^a независимо выбран из группы, состоящей из водорода, (C1-C6) алкила, (C3-C8) циклоалкила, циклогексила, (C4-C11) циклоалкилалкила, (C5-C10) арила, фенила, (C6-C16) арилалкила, бензила, 2-6-членного гетероалкила, 3-8-членного циклогетероалкила, морфолинила, пипеазинила, гомопиперазинила, пиперидинила, 4-11-членного циклогетероалкилалкила, 5-10-членного гетероарила и 6-16-членного гетероарилалкила;

каждый R^b представляет собой подходящую группу, независимо выбранную из группы, состоящей из =O, -OR^d, (C1-C3) галогеналкилокси, -ОCF₃, =S, -SR^d, =NR^d, =NOR^d, -NR^cR^c, галогена, -CF₃, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO₂, =N₂, -N₃, -S(O)R^d, -S(O)₂R^d, -S(O)₂OR^d, -S(O)NR^cR^c, -S(O)₂NR^cR^c, -OS(O)R^d, -OS(O)₂R^d, -OS(O)₂OR^d, -OS(O)₂NR^cR^c, -C(O)R^d, -C(O)OR^d, -C(O)NR^cR^c, -C(NH)NR^cR^c, -C(NR^a)NR^cR^c, -C(NOH)R^a, -C(NOH)NR^cR^c, -OC(O)R^d, -OC(O)OR^d, -OC(O)NR^cR^c, -OC(NH)NR^cR^c, -OC(NR^a)NR^cR^c, -[NHC(O)]_nR^d, -[NR^aC(O)]_nR^d, -[NHC(O)]_nOR^d, -[NR^aC(O)]_nOR^d, -[NHC(O)]_nNR^cR^c, -[NR^aC(O)]_nNR^cR^c, -[NHC(NH)]_nNR^cR^c и -[NR^aC(NR^a)]_nNR^cR^c;

каждый R^c независимо представляет собой R^a или, альтернативно, каждый R^c берется вместе с атомом азота, с которым он связан, для образования 5-8-членного циклогетероалкила или гетероарила, который может включать в себя один или более таких же или других дополнительных гетероатомов и который может быть замещен одной или более идентичными или различными R^a или подходящими R^b-группами;

каждый R^d независимо представляет собой R^a;

каждый m независимо представляет собой целое число от 1 до 3; и

каждый n независимо представляет собой целое число 0 до 3.

В соединениях согласно структурной формуле (I) L¹ и L², независимо друг от друга, представляют собой одну прямую связь и одного линкера. Таким образом, как будет понятно квалифицированным практикам, заместители R² и/или R⁴ могут быть связаны как непосредственно со своими соответствующими атомами азота, так и, альтернативно, дистанционированы от своих соответствующих атомов азота с помощью линкера. Тождественность линкера некритична, и типичные подходящие линкеры включают в себя (но не ограничиваются перечисленным) (C1-C6) алкилдиилы, (C1-C6) алканы и (C1-C6) гетероалкилдиилы, каждый из которых может быть замещен одной или более одинаковыми или разными R⁸ группами, где R⁸ соответствует, как было предварительно определено, структурной формуле (I). В конкретных вариантах осуществления изобретения L¹ и L², каждый независимо друг от друга, выбраны из группы, состоящей из одной прямой связи, (C1-C3) алкилдиила, который может быть замещен одним или более идентичными или различными R^a, подходящих R^b или R⁹ групп и 1-3-членного гетероалкилдиила, который может быть замещен одним или более идентичными или различными R^a, подходящих R^b или R⁹ групп, где R⁹ выбран из группы, состоящей из (C1-C3) алкила, -OR^a, -C(O)OR^a, (C5-C10) арила, который может быть замещен одним или более идентичными или различными галогенами, фенила, который может быть замещен одним или более идентичными или различными галогенами, 5-10-членного гетероарила, который может быть замещен одним или более идентичными или различными галогенами, и 6-членного гетероарила, который может быть замещен одним или более идентичными или различными галогенами; и R^a и R^b соответствуют, как было предварительно определено, структурной формуле (I). Специфические R⁹-группы, которые могут быть использованы для замены L¹ и L², включают в себя -OR^a, -C(O)OR^a, фенил, галогенфенил и 4-галогенфенил, где R^a соответствует, как было предварительно определено, структурной формуле (I).

В другом конкретном варианте осуществления изобретения L¹ и L², каждый независимо друг от друга, выбраны из группы, состоящей из метан-, этан- и пропан-, каждый из которых может быть однозамещен группой R⁹, в которой R⁹ соответствует вышеприведенному предварительному определению.

Во всех вышеприведенных вариантах осуществления изобретения конкретные R^a-группы, которые можно включить в R⁹-группы, выбраны из группы, состоящей из водорода, (C1-C6) алкила, фенила и бензила.

Еще в одном конкретном варианте осуществления изобретения каждый из L¹ и L² представляет собой одну прямую связь, такую что соединения 2,4-пиримидиамина согласно настоящему изобретению соответствуют структурной формуле (Ia):

включая их соли, гидраты, сольваты и N-оксиды, в которой

R², R⁴, R⁵ и R⁶ соответствуют, как было предварительно определено, структурной формуле (I). Дополнительные специфические воплощения соединений 2,4-пиримидиамина согласно настоящему изобретению изложены ниже.

В первой реализации элементов структурных формул (I) и (Ia) R², R⁴, R⁵, R⁶, L¹ и L² представляют собой группы, описанные ранее при определении структурных формул (I) и (Ia), с оговоркой, что R² не является 3,4,5-триметоксифенилом, 3,4,5-три (C1-C6) алкоксифенилом или

где R²¹, R²² и R²³ соответствуют определению для R¹, R² и R³ согласно патенту США № 6 235 746, раскрытие которого включено в настоящее описание в виде ссылки. В конкретной реализации этого первого осуществления изобретения R²¹ представляет собой водород, галогенгруппу, неразветвленный или разветвленный (C1-C6) алкил, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R²⁵-группами, гидроксил, (C1-C6) алкоксигруппу, который может быть замещен одним или более идентичными или различными фенилом или R²⁵-группами, тиол (-SH), (C1-C6) алкилтио, который может быть замещен одним или более идентичными или различными фенилом или R²⁵-группами, амин- (-NH₂), -NHR²⁶ или -NR²⁶R²⁶; каждый из R²² и R²³ является, независимо друг от друга, неразветвленным или разветвленным (C1-C6) алкилом, который может быть замещен одной или более идентичными или различными R²⁵-группами; R²⁵ выбран из группы, состоящей из галоген-, гидроксила, (C1-C6) алкоксигруппы, тиола, (C1-C6) алкилтио, (C1-C6) алкиламин- и (C1-C6) диалкиламин-; и каждый R²⁶ независимо является (C1-C6) алкилом, который может быть замещен одним или более идентичными или различными фенилом или R²⁵-группами или -C(O)R²⁷, где R²⁷ представляет собой (C1-C6) алкил, который может быть замещен одним или более идентичными или различными фенилом или R²⁵-группами.

В другом конкретном примере реализации первого варианта осуществления изобретения R²¹ представляет собой метокси, который может быть замещен одной или более идентичными или различными галогенгруппами и/или каждый из R²² и R²³, независимо друг от друга, представляют собой метил или этил, который может быть замещен одной или более идентичными или различными галогенгруппами.

Во втором варианте осуществления изобретения соединения со структурными формулами (I) и (Ia) R², R⁴, R⁵ и L² представляют собой группы, описанные ранее при определении структурных формул (I) и (Ia), L¹ представляет собой одну прямую связь, а R⁶ представляет собой водород при условии, что R² не является 3,4,5-триметоксифенилом, 3,4,5-три (C1-C6) алкоксифенилом или

где R²¹, R²² и R²³, как определено выше, связаны с первой реализацией изобретения.

В третьей реализации изобретения из структурных формул (I) и (Ia) соединений 2,4-пиримидиамина исключается одно или более из следующих соединений:

N2,N4-бис(4-этоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R070790);

N2,N4-бис(2-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R081166);

N2,N4-бис(4-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R088814);

N2,N4-бис(2-хлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R088815);

N2,N4-бисфенил-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R091880);

N2,N4-бис(3-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R092788);

N2,N4-бис(3-хлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R067962);

N2,N4-бис(2,5-диметилфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R067963);

N2,N4-бис(3,4-диметилфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R067964);

N2,N4-бис(4-хлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R0707153);

N2,N4-бис(2,4-диметилфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R070791);

N2,N4-бис(3-бромофенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R008958);

N2,N4-бис(фенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин;

N2,N4-бис(морфолино)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин;

N2,N4-бис[(3-хлор-4-метоксифенил)]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин.

В четвертой реализации изобретения из композиции структурных формул (I) и (Ia) исключаются соединения в соответствии со следующей структурной формулой (Ib):

в которой R²⁴ -(C1-C6) алкил, а R²¹, R²² и R²³, как определено выше, связаны с первой реализацией изобретения.

В пятой реализации изобретения из композиции структурных формул (I) и (Ia) исключаются соединения, описанные в примерах 1-141 патента США № 6 235 746, раскрытие которого включено сюда в виде ссылки.

В шестой реализации изобретения из композиции структурных формул (I) и (Ia) исключаются соединения, которые определяются формулой (1) или формулой 1(a) этого патента США № 6 235 746 (см., например, описание со строки 48 столбца 1 до строки 49 столбца 7 и строк 9-36 столбца 8, которое включено сюда в виде ссылки).

В седьмой реализации изобретения из композиции структурных формул (I) и (Ia) исключаются соединения, в которых R⁵ - циан- или -C(O)NHR, где R - водород или (C1-C6) алкил, когда R² замещен фенилом; R4 - замещенный или незамещенный (C1-C6) алкил, (C₃-C₈) циклоалкил, 3-8-членный циклогетералкил или 5-15-членный гетероарил и R⁶ - водород.

В восьмой реализации изобретения из композиции структурных формул (I) и (Ia) исключаются соединения, которые определяются формулами (I) и (X) WO 02/04429 или любого соединения, изложенного в WO 02/04429, раскрытие которого включено сюда в виде ссылки.

В девятой реализации компонетов структурных формул (I) и (Ia), когда R⁵ - циано или -C(O)NHR, где R - водород или (C1-C6) алкил и R⁶ - водород, тогда R² отличается от замещенной фенильной группы.

В десятой реализации из структурных формул (I) и (Ia) исключены те соединения, в которых R² и R⁴, каждый независимо друг от друга, представляют собой замещенное или незамещенное кольцо пиррола или индола, которое присоединено к остальной части молекулы посредством ее кольцевого атома азота.

В одиннадцатой реализации из композиции структурных формул (I) и (Ia) исключаются соединения, которые определяются формулами (I) и (IV), приведенными в патенте США № 4 983 608 или любым соединением, описанным в патенте США № 4 983 608, которые включены в ссылки настоящей заявки.

Экспертам в данной области будет понятно, что в составе формул (I) и (Ia) R² и R⁴ могут быть одинаковыми или различными и при этом степень различия может меняться в широких пределах. Когда R² и/или R⁴ представляют собой кольца, которые могут быть замещены, такие как по желанию замещенные циклоалкилы, циклогетероалкилы, арилы и гетероарилы, кольцо может быть присоединено к остальной части молекулы с помощью любого доступного атома углерода или гетероатома. Дополнительные заместители могут быть присоединены к любым доступным атомам углерода и/или гетероатомам.

В двенадцатом примере реализации композиции структурных формул (I) и (Ia) R² и/или R⁴ представляет собой фенил или (C5-C15) арил, которые могут быть замещены, при условии что: (1) если R⁶ - водород, тогда R² - не является 3,4,5-триметоксифенилом или 3,4,5-три (C1-C6) алкоксифенилом; (2) если R² - 3,4,5-тризамещенный фенил, тогда заместители при 3- и 4-положениях не являются одновременно метокси- или (C1-C6) алкоксигруппами; или (3) если R⁶ - водород и R⁴ - (C1-C6) алкил, (C₃-C₈) циклоалкил, 3-8-членный циклогетероалкил или 5-15-членный гетероарил, тогда R⁵ не является цианом. В противном случае R² подлежит оговорке, приведенной в связи с первым или вторым примерами реализации. По желанию замещенная группа арила или фенила может быть присоединена к остальной части молекулы посредством любого доступного атома углерода. Конкретные примеры фенилов, которые могут быть замещены, включают в себя фенилы, которые могут быть одно-, два- или тризамещенными одинаковыми или разными R⁸-группами, где R⁸ соответствует его ранее установленному значению для структурной формулы (I) и вышеприведенным оговоркам. Если фенил является однозамещенным, заместитель R⁸ может находиться в орто-, мета- или в пара-положении. При нахождении в орто-, мета- или в пара-положении R⁸ предпочтительно выбирается из группы, состоящей из (C1-C10) алкила, (C1-C10) разветвленного алкила, -OR^a, который можно заместить одной или более идентичными или различными R^b группами, -O-C(O)OR^a, -O-(CH₂)_m-C(O)OR^a, -C(O)OR^a, -O-(CH₂)_m-NR^cR^c, -O-C(O)NR^cR^c, -O-(CH₂)_m-C(O)NR^cR^c, -O-C(NH)NR^cR^c, -O-(CH₂)_m-C(NH)NR^cR^c и -NH-(CH₂)_m-NR^cR^c, где m, R^a и R^c соответствуют обозначениям, установленным ранее для структурной формулы (I). В реализации этих компонентов -NR^cR^c представляет собой 5-6-членный гетероарил, который может включать в себя один или более идентичных или различных дополнительных гетероатомов. Конкретные примеры таких 5-6-членных гетероарилов включают в себя, не ограничиваясь ими, оксадиазолил, триазолил, тиазолил, оксазолил, тетразолил и изоксазолил.

В другом примере реализации этих компонентов -NR^cR^c представляет собой 5-6-членное насыщенное кольцо циклогетероалкила, которое дополнительно включает один или несколько идентичных или различных гетероатомов. Конкретные примеры таких циклогетероалкилов включают в себя, не ограничиваясь ими, пирролидинил, пиразолидинил, имидазолидинил, пиперидинил, пиперазинил и морфолинил.

В еще одном примере реализации этих компонентов, каждый R^a независимо представляет собой (C1-C6) алкил и/или каждый -NR^cR^c представляет собой -NHR^a, где R^a - является (C1-C6) алкилом. В одном конкретном примере реализации R⁸ представляет собой -O-CH₂-C(O)NHCH₃ группу. В другом конкретном примере реализации R⁸ представляет собой -OH группу.

Если фенил является дву- или тризамещенным, заместители R⁸ могут находиться в любой комбинации положений. Например, заместители R⁸ могут располагаться в положениях 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4-, 3,5-, 2,3,4-, 2,3,5-, 2,3,6-, 2,4,5-, 2,4,6-, 2,5,6- или 3,4,5-. В одном из примеров реализации соединения, включающем двузамещенный фенил, заместители располагаются иначе, чем в положениях 3,4. В другом примере реализации они располагаются в положениях 3,4. В одном из примеров реализации соединения, включающем тризамещенный фенил, заместители располагаются иначе, чем 3,4,5 или, в альтернативном случае, ни один из двух заместителей не располагается в положениях 3,4. В другом примере реализации заместители располагаются в положениях 3,4,5.

Конкретные примеры заместителей R⁸ в таких дву- и тризамещенных фенилах включают различные заместители R⁸, описанные выше в связи с орто-, мета- и пара- замещенными фенилами.

В другом примере конкретной реализации заместители R^8-, пригодные для замещения таких дву- и тризамещенных фенилов, включают (C1-C6) алкил, (C1-C6) алкоксигруппу, метоксигруппу, галo-, хлор-, (C1-C6) пергалогеналкил, -CF₃, (C1-C6) пергалогеналкоксигруппу и -OCF₃. В предпочтительном случае такие заместители R⁸ размещаются в положениях 3,4 или 3,5. Конкретные примеры предпочтительных колец двузамещенного фенила включают 3-хлор-4-метоксифенил, 3-метокси-4-хлорофенил, 3-хлор-4-трифторметоксифенил, 3-трифторметокси-4-хлорфенил, 3,4-дихлорфенил, 3,4-диметоксифенил и 3,5-диметоксифенил при условии, что: (1) если R⁴ представляет собой один из вышеуказанных фенилов и каждый из R⁵ и R⁶ представляет собой водород, то R² не является 3,4,5-три (C1-C6)алкоксифенилом или 3,4,5-триметоксифенилом; (2) если R² представляет собой 3,4-диметоксифенил, а каждый из R⁵ и R⁶ представляет собой водород, то R⁴ не является 3-(C1-C6)алкоксифенилом, 3-метоксифенилом, 3,4-ди-(C1-C6) алкоксифенилом или 3,4-диметоксифенилом; (3) если R⁴ представляет собой 3-хлор-4-метоксифенил и R⁵ представляет собой галоидо- или фторгруппу, и дополнительно (по выбору) R⁶ представляет собой водород, то R² не является 3-хлор-4-(C1-C6)алкоксифенилом или 3-хлор-4-метоксифенилом; (4) если R⁴ представляет собой 3,4-дихлорфенил, R⁵ представляет собой водород, (C1-C6) алкил, метил, галоген- или хлор- и дополнительно R⁶ представляет собой водород, то R² не является фенилом, однозамещенным в пара--позиции (C1-C6) алкоксигруппой, которая может являться замещенной одной или более идентичными или различными группами R^b, -OH или -NR^cR^c, где R^b и R^c соответствуют их ранее установленным обозначениям для структурной формулы (I); и/или (5) R², и/или R⁴ не является 3,4,5-три (C1-C6)алкоксифенилом или 3,4,5-триметоксифенилом, в особенности, если каждый из R⁵ и R⁶ представляет собой водород.

В другом примере реализации предлагаемых соединений, включающих тризамещенный фенил, последний имеет формулу:

в которой R³¹ представляет собой метил или (C1-C6) алкил; R³² представляет собой водород, метил или (C1-C6) алкил и R³³ представляет собой галогенгруппу.

В тринадцатом примере реализации предлагаемых соединений со структурными формулами (I) и (Ia) R² и/или R⁴ представляют собой гетероарил, который может быть замещен. Типичные группы гетероарила, соответствующие этому тринадцатому примеру реализации, содержат от 5 до 15, а более типичные - от 5 до 11 кольцевых атомов и включают один, два, три или четыре одинаковых или разных герероатомов или групп гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из N, NH, O, S, S(O) и S(O)₂. Гетероарил, который можно заместить, может быть присоединен к своему соответствующему атому азота C2 или C4 или к линкеру L¹ или L² посредством любого доступного атома углерода или гетероатома, но обычно он присоединяется посредством атома углерода. Дополнительные заместители могут быть теми же самыми или другими и могут быть присоединены к любому доступному атому углерода или гетероатома. В одном из примеров реализации этих структур R⁵ не является бром-, нитро- или трифторметилом, а также циано- или

-C(O)NHR группой, где R - водород или (C1-C6) алкил. В другом примере реализации этих структур, если каждый из R² и R⁴ представляет собой замещенный или незамещенный пиррол или индол, то кольцо присоединяется к остальной части молекулы посредством кольцевого атома углерода. Еще в одном примере реализации предлагаемых структур, включающих по желанию замещенную группу гетероарила, гетероарил не является незамещенным или замещенным одинаковыми или разными группами R⁸ в количестве от одной до четырех, где R⁸ соответствует ранее определенному его значению в структурной формуле (I). Конкретные примеры таких гетероарилов, которые можно заместить, включают в себя, не ограничиваясь ими, следующие группы гетероарилов:

в которых

p - целое число от одного до трех;

каждый символ - - - независимо представляет собой одинарную или двойную связь;

R³⁵ - водород или R⁸, где R⁸ соответствует его значению, которое было предварительно определено для структурной формулы (I);

X выбран из группы, состоящей из CH, N и N-O;

каждый Y независимо выбран из группы, состоящей из O, S и NH;

каждый Y¹ независимо выбран из группы, состоящей из O, S, SO, SO₂, SONR³⁶, NH и NR³⁷;

каждый Y² независимо выбран из группы, состоящей из CH, CH₂, O, S, N, NH и NR³⁷;

R³⁶ - водород или алкил;

R³⁷ выбран из группы, состоящей из водорода и прогруппы, предпочтительно из водорода или прогруппы, выбранных из группы, состоящей из арила, арилалкила, гетероарила, R^a, R^b-CR^aR^b-O-C(O)R⁸, -CR^aR^b-O-PO(OR⁸)₂, -CH₂-O-PO(OR⁸)₂, -CH₂-PO(OR⁸)₂, -C(O)-CR^aR^b-N(CH₃)₂, -CR^aR^b-O-C(O)-CR^aR^b-N(CH₃)₂, -C(O)R⁸, -C(O)CF₃ и -C(O)-NR⁸-C(O)R⁸;

A выбран из группы, состоящей из O, NH и NR³⁸;

R³⁸ выбран из группы, состоящей из алкила и арила;

R⁹, R¹⁰, R¹¹ и R¹², каждый независимо друг от друга, выбран из группы, состоящей из алкила, алкокси, галогена, галогеналкокси, аминоалкила и гидроалкила или, в альтернативном случае, R⁹ и R¹⁰ и/или R¹¹ и R¹² взяты вместе из кеталя;

каждый Z выбран из группы, состоящей из гидроксила, алкоксигруппы, арилоксигруппы, сложного эфира, карбамата и сульфонила;

Q выбран из группы, состоящей из -OH, OR⁸, -NR^cR^c, -NHR³⁹-C(O)R⁸, -NHR³⁹-C(O)OR⁸, -NR³⁹-CHR⁴⁰-R^b, -NR³⁹-(CH₂)_m-R^b и -NR³⁹-C(O)-CHR⁴⁰-NR^cR^c;

R³⁹ и R⁴⁰, каждый независимо друг от друга, выбраны из группы, состоящей из водорода, алкила, арила, алкиларилa; арилалкила и NHR⁸; и

R^a, R^b и R^c соответствуют их обозначениям, предварительно определяемым для структурной формулы (I). Предпочтительные заместители R^b для Q выбраны из -C(O)OR⁸, -O-C(O)R⁸, -O-P(O)(OR⁸)₂ и -P(O)(OR⁸)₂.

В одном из примеров реализации вышепредставленных гетероарилов, а также других 5-15-членных гетероарилов, соответствующих этой реализации изобретения, каждый R⁸ является независимо выбранным из группы, состоящей из R^d, -NR^cR^c, -(CH₂)_m-NR^cR^c, -C(O)NR^cR^c, -(CH₂)_m-C(O)NR^cR^c, -C(O)OR^d, -(CH₂)_m-C(O)OR^d и -(CH₂)_m-OR^d, где m, R^c и R^d соответствуют их обозначениям, предварительно определяемым для структурной формулы (I).

В конкретном примере реализации R^d и/или R^c выбираются из группы, состоящей из R^a и (C3-C8) циклоалкила, который может быть замещен одной или более такими же или другими группами гидроксила, аминo- или карбоксила.

В другом примере реализации вышепредставленных гетероарилов каждый R³⁵ представляет собой атом водорода, углеродную цепь (C1-C6), которая включает в себя метил, этил, изопропил, циклоалкильную группу, которая включает в себя циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, или группу , где x=1-8, -CH₂CONHMe, -CH₂CH₂NHMe,

-CH₂CH₂CONHMe, -CH₂CH₂CH₂NHMe или -CH₂CH₂CH₂OCH₃.

В еще одном примере реализации вышепредставленных гетероарилов связность ароматического кольца находится в положении 5 или 6. Важно понимать, что любой из R² или R⁴ может использовать группы гетероарила, указанные в настоящей заявке.

В четырнадцатом примере реализации композиции структурных формул (I) и (Ia), каждый R² и R⁴, независимо друг от друга, представляет собой фенил, арил или гетероарил, которые могут быть замещены, при условии что: (1) если L¹ представляет собой прямую связь и R⁶ (и возможно R⁵) представляет собой водород, то R² не является 3,4,5-триметоксифенилом или 3,4,5-три (C1-C6) алкоксифенилом; (2) если и L¹ и L² представляют собой прямые связи, R⁶ представляет собой водород и R⁵ - галогенгруппу, то и R² и R⁴ не являются одновременно 3,4,5-триметоксифенилом или 3,4,5-три (C1-C6) алкоксифенилом; (3) если R⁴ представляет собой 3-метоксифенил или 3-(C1-C6) алкоксифенил и R² - 3,4,5-тризамещенный фенил, то заместители, размещенные в положениях 3 и 4, не являются одновременно метокси- или (C1-C6) алкоксигруппой; (4) если R² представляет собой замещенный фенил и R⁶ представляет собой водород, то R⁵ не является циано- или -C(O)NHR группой, где R представляет собой водород или (C1-C6) алкил; и/или (5) если R² и R⁴ представляют собой, каждый независимо друг от друга, замещенный или незамещенный пиррол или индол, то последние присоединяются к остальной части молекулы посредством кольцевого атома углерода. В альтернативном варианте, на R² распространяются замечания, изложенные в связи с первым или вторым примерами реализации настоящего изобретения.

В данном четырнадцатом примере реализации настоящего изобретения заместители R² и R⁴ могут быть одинаковыми или различными. Конкретные фенил, арил и/или гетероарилы, которые могут быть замещены, включают те из них, которые проиллюстрированы выше в двенадцатом и тринадцатом примерах реализации.

В пятнадцатом примере реализации композиции структурных формул (I) и (Ia), включающих вышеописанные примеры реализации с первого по четырнадцатый, R⁶ представляет собой водород и R⁵ представляет собой электроотрицательную группу. Как будет понятно экспертам в данной области, электроотрицательные группы - это атомы или группы атомов с относительно сильной способностью притягивать к себе электроны. Конкретные примеры электроотрицательных групп в соответствии с рассмотренным четырнадцатым примером реализации включают в себя, не ограничиваясь ими, -CN, -NC, -NO₂, галоген-, бром-, хлор-, фторгруппы, (C1-C3) галогеналкил, (C1-C3) пергалогеналкил, (C1-C3) фторалкил, (C1-C3) перфторалкил, -CF₃, (C1-C3) галогеналкоксигруппу, (C1-C3) пергалогеналкоксигруппу, (C1-C3) фторалкоксигруппу, (C1-C3) перфторалкоксигруппу, -OCF₃, -C(O)R^a, -C(O)OR^a, -C(O)CF₃ и -C(O)OCF₃ группы. В данном конкретном случае электроотрицательная группа - это электроотрицательная группа, содержащая галоген, как, например, -OCF₃, -CF₃, бром-, хлор- или фторгруппы. В другом конкретном случае R⁵ представляет собой фторгруппу при условии, что в соответствии с третьим примером реализации состав не может быть произвольным.

В шестнадцатом примере реализации соединения со структурными формулами (I) и (Ia) соответствуют соединениям, имеющим структурную формулу (Ib):

и их солям, гидратам, сольватам и N-окcидам, где R¹¹, R¹², R¹³ и R¹⁴, все независимо друг от друга, выбраны из группы, состоящей из водорода, гидроксигруппы, (C1-C6) алкоксигруппы и -NR^cR^c; и R⁵, R⁶ и R^c соответствуют прежнему определению для структурной формулы (I) при условии, что, если каждый из R¹³, R⁵ и R⁶ - водород, то R¹¹ и R¹² не являются одновременно метоксигруппой, (C1-C6) алкоксигруппой или (C1-C6) галогеналкоксигруппой.

В семнадцатом примере реализации соединения со структурными формулами (I) и (Ia) представляют собой соединения, соответствующие структурной формуле (Ic):

и их солям, гидратам, сольватам и N-окидам, где

R⁴ выбран из группы, состоящей из 5-10-членного гетероарила и 3-гидроксифенила;

R⁵ - F или -CF₃; и

R⁸ - -O(CH₂)_m-R^b, где m и R^b соответствуют прежнему определению для структурной формулы (I). В конкретной реализации R⁸ - -O-CH₂-C(O)NH-CH₃ и/или R⁴ - гетероарил, соответствующий тринадцатому примеру реализации настоящего изобретения.

В восемнадцатом примере реализации соединения со структурными формулами (I) и (Ia) включают в себя любые соединения, выбранные из Табл.1, которые подавляют каскад передачи сигнала рецептора Fc, активность Syk-киназы, каскад передачи сигнала рецептора, зависящего от Syk-киназы, или дегрануляцию клеток, измеренную in vitro, при условии, что соединения с указанными структурными формулами не являются соединениями, исключенными выше при описании третьего и/или других примеров реализации. В данном конкретном случае такие соединения имеют IC₅₀ порядка 20 мкм или меньше по результатам измерений дегрануляции клеток в процессе анализа in vitro, как, например, анализ дегрануляции, описанный в разделе «Примеры».

В девятнадцатом примере реализации соединения со структурными формулами (I) и (Ia) включают в себя любые соединения, выбранные из Табл.1, которые подавляют каскад рецепторов FcγR1 или FcεR1 с IC₅₀ порядка 20 мкм или меньше по результатам анализа in vitro, как, например, анализ дегрануляции, описанный в разделе «Примеры», при необязательном условии, что соединения с указанными структурными формулами не являются соединениями, исключенными выше при описании третьего и/или других примеров реализации.

В двадцатом примере реализации соединения со структурной формулой (Ia) включают в себя соединения, в которых R² выбран из групп, состоящих из

R⁴, R⁸, R^a, R^b, R^c, R^d соответствуют описанным выше, R⁵ представляет атом фтора, R⁶ - атом водорода и каждый из R²¹ независимо является атомом галогена либо алкилом, который по усмотрению может быть замещен одной или более аналогичными или отличными галоидогруппами. Группы R²² и R²³, каждая независимо друг от друга, представляют собой атом водорода, метил или этил, которые, по усмотрению, могут быть замещены одной или более аналогичными или отличными галоидогруппами, каждое значение m независимо представляет собой целое число от 1 до 3 и каждое значение n независимо представляет собой целое число от 0 до 3.

В двадцать первом примере реализации соединения со структурной формулой (Ia) включают в себя соединения, в которых R⁴ представляет собой группу , в которой R⁹ и R¹⁰ соответствуют описанным выше и дополнительно каждая в отдельности включают в себя атом водорода, группа R² представляет собой фенильную группу, замещенную одной или более аналогичными группами R⁸, или , где R³⁵ соответствует вышеописанной. В одном конкретном случае, когда R² представляет собой фенильную группу, одна или более R⁸ выбраны из галогена и алкоксигруппы. В одном из примеров фенильная группа является дву- или тризамещенной одной или несколькими идентичными группами R⁸.

В двадцать втором примере реализации соединения со структурной формулой (Ia) включают соединения, в которых R⁴ представляет собой группу и R² представляет фенильную группу, замещенную одной или несколькими идентичными группами R⁸. В одном конкретном случае одна или более R⁸ выбраны из галогена и алкоксигруппы. В одном из примеров фенильная группа является дву- или тризамещенной одной или несколькими идентичными группами R⁸.

В двадцать третьем примере реализации соединения со структурной формулой (Ia) включают в себя соединения, в которых R⁴ представляет собой фенильную группу, замещенную одной или несколькими идентичными группами R⁸, где R² представляет собой , в которой R³⁵ соответствует вышеописанной группе. В конкретных примерах фенильная группа R⁴ является дву- или тризамещенной идентичными или различными атомами галогенов. В другом примере R⁴ является монозамещенной группой с атомом галогена. В одном из примеров R³⁵ является гидроксиалкильной группой. В определенных случаях, гидроксиалкильная группа может быть дополнительно превращена в эфирную группу, карбамат, и т.д.

В двадцать четвертом примере реализации соединения со структурной формулой (Ia) включают в себя соединения, в которых R⁴ представляет собой , в которой группа R³⁵ соответствует описанной выше и R² представляет фенильную группу, замещенную одной или несколькими идентичными группами R⁸. В одном из примеров R³⁵ является атомом водорода или алкильной группой. В другом примере фенильная группа R² является дву- или тризамещенной одной или несколькими идентичными группами R⁸ и, в частности, атомами галогенов.

В двадцать пятом примере реализации соединения со структурной формулой (Ia) включают в себя соединения, в которых R⁴ представляет собой , в которой группа R³⁵ соответствует описанной выше и R² представляет собой , в которой R⁹ и R¹⁰ соответствуют описанным выше и дополнительно каждая в отдельности включают атом водорода. В одном из примеров R³⁵ является атомом водорода или алкильной группой, например метилом, и R⁹ и R¹⁰ представляют алкильные группы, например группы метила.

В двадцать шестом примере реализации соединения со структурной формулой (Ia) включают в себя соединения, в которых R⁴ представляет двузамещенную фенильную группу, замещенную идентичными или отличными R⁸ группами, и R² представляет собой , в которой группа R³⁵ соответствует описанной выше. В конкретных случаях фенильная группа замещена атомом галогена и алкоксигруппой, например, метоксигруппой. В определенных примерах, R³⁵ представляет атом водорода, алкильную группу, например метилгруппу, или гидроксиалкильную группу. В конкретных случаях, гидроксиалкильная группа может быть преобразована в эфирную группу, карбамат и т.д.

В двадцать седьмом примере реализации соединения со структурной формулой (Ia) включают в себя соединения, в которых R⁴ представляет собой , в которых R⁸ и R^с соответствуют описанным выше, и R² представляет фенильную группу, замещенную одной или более идентичными R⁸ группами. В одном конкретном случае R^с является атомом водорода или алкильной группой. В другом случае фенильная группа R² является дву- или тризамещенной одной или несколькими идентичными группами R⁸ и, в частности, атомами галогенов или .

В двадцать восьмом примере реализации соединения со структурной формулой (Ia) включают в себя соединения, в которых R⁴ представляет собой , в которой Y¹, Y² и каждая из групп R³⁵ независимо друг от друга соответствуют описанным выше, и R² представляет собой , в которой R³⁵ соответствует описанной выше. В одном случае двадцать восьмого примера реализации относительно R⁴ Y¹ представляет собой кислород, Y² представляет собой NH и одна или более групп R³⁵ или часть R⁴ являются алкильной группой и, в частности, группой метила. В конкретных случаях двадцать восьмого примера реализации две группы R³⁵, входящие в состав R⁴, образуют гемдиалкилкомпонент и, в частности, гемдиметил компонент, расположенный по соседству с NH группой, представленной в виде . В конкретных случаях двадцать восьмого примера реализации, касающихся группы R², R³⁵ представляет собой атом водорода или алкильную группу, в частности группу метила.

В двадцать девятом примере реализации соединения со структурной формулой (Ia) включают в себя соединения, в которых R⁴ представляет собой , в которой R⁹ и R¹⁰ соответствуют вышеописанным или представляют замещенную фенильную группу. В одном случае фенильная группа является дву- или тризамещенной одной или несколькими идентичными группами R⁸. В частности, фенильная группа может быть дву- или тризамещенной одной или несколькими атомами галогенов, которые могут быть идентичными или различными. R² в двадцать девятом примере реализации представляет собой , в которой R³⁵ соответствует вышеописанной. В одном из случаев двадцать девятого примера реализации R³⁵ группы R² не является метилом. В другом случае двадцать девятого примера реализации R² является .

В тридцатом примере реализации применимом к примерам реализации с первого по двадцать девятый, R⁵ представляет атом галогена, например фтора, и R⁶ представляет атом водорода.

Также конкретно описаны комбинации вышеприведенных примеров конкретных реализаций настоящего изобретения с первого по тридцатый.

Специалисты в данной области оценят то, что описанные в данной заявке соединения 2,4-пиримидиндиамина могут включать в себя функциональные группы, которые могут быть маскированы прогруппами для создания пролекарств. Такие пролекарства обычно, но не обязательно, фармакологически неактивны до тех пор, пока не переходят в свою активную лекарственную форму. Действительно, многие из соединений активного 2,4-пиримидиндиамина, описанные в Табл. 1, включают в себя просоединения, которые являются гидролизуемыми или иначе расщепляемыми при условиях применения. Например, группы сложного эфира обычно подвергаются кислотно-катализированному гидролизу для получения исходной карбоновой кислоты, если они находятся в условиях кислотной среды желудка, или подвергаются гидролизу, катализированному основанием, если они находятся в условиях основной среды кишечника или крови. Таким образом, при назначении для орального применения 2,4-пиримидиндиамины, которые включают сложные эфиры, могут считаться пролекарствами соответствующей карбоновой кислоты независимо от того, имеет ли сложный эфир фармакологически активную форму. Исходя из данных Табл.1 многочисленные 2,4-пиримидиндиамины рассматриваемого изобретения, содержащие сложный эфир, активны в форме их сложного эфира, в форме «пролекарства».

В пролекарствах рассматриваемого изобретения любой имеющийся функциональный компонент можно маскировать с помощью прогруппы для получения пролекарства. Функциональные группы в соединениях 2,4-пиримидиндиамина, которые с помощью прогрупп могут быть маскированы для включения в прокомпонент, включают в себя, не ограничиваясь ими, амины (первичный и вторичный), гидроксилы, сульфанилы (тиолы), карбоксилы и т.д. В практике известны бесчисленные прогруппы, пригодные для маскирования таких функциональных групп для получения прокомпонентов, которые расщепляются при предпочтительных условиях применения. Все эти прогруппы, отдельно или в комбинациях, могут быть включены в пролекарства согласно настоящему изобретению.

В одном из иллюстративных примеров реализации пролекарства согласно настоящему изобретению представляют собой соединения, соответствующие структурной формуле (I), в которой R^c и R^d могут представлять собой прогруппу в дополнение к ранее описанным альтернативным вариантам.

Замещение атомов водорода, присоединенных к N2 и N4 в 2,4-пиримидиндиаминах со структурной формулой (I), заместителями оказывает обратное влияние на активность компонентов. Однако, как оценят специалисты в этой области, эти атомы азота могут быть включены в просоединения, которые при условиях применения расщепляются с образованием 2,4-пиримидиндиаминов в соответствии со структурной формулой (I). Таким образом, в другом примере реализации пролекарства согласно настоящему изобретению являются соединениями, соответствующими структурной формуле (II):

включающей соли, гидраты, сольваты и N-оксиды, в которой

R², R⁴, R⁵, R⁶, L¹ и L² соответствуют прежнему определению структурной формулы (I); и

R^2b и R^4b, каждый независимо друг от друга, являются прогруппой. Конкретные примеры прогрупп в соответствии с этим примером реализации изобретения включают в себя, не ограничиваясь ими, (C1-C6) алкил, -C(O)CH₃, -C(O)NHR³⁶ и -S(O)₂R³⁶, где R³⁶ - (C1-C6) алкил, (C5-C15) арил и (C3-C8) циклоалкил.

В пролекарствах со структурной формулой (II) заместители могут выбираться в соответствии с указанными ранее при рассмотрении различных примеров реализации с первого по двадцатый для структурных формул (I) и (Ia) или комбинаций таких примеров.

Понятно, что многие из соединений и пролекарств согласно настоящему изобретению, как и различных образцов соединений, конкретно описанных и/или проиллюстрированных здесь, могут демонстрировать явления таутомерии, конформационной изомерии, геометрической изомерии и/или оптической изомерии. Например, соединения и пролекарства согласно настоящему изобретению могут включать в себя один или более хиральных центров и/или двойных связей и, как следствие, могут существовать как стереоизомеры, как, например, изомеры с двойными связями (то есть геометрические изомеры), энантиомеры и диастереоизомеры и их смеси, такие как рацемические смеси. В качестве другого примера можно рассматривать соединения и пролекарства согласно настоящему изобретению, которые могут существовать в нескольких таутомерических формах, включая енольную форму, кетольную форму и их смесь. В качестве различных названий, формулы и структуры соединений в спецификации и заявках могут представлять только одну из возможных таутомерических форм, форм конформационной изомерии, оптической изомерии или геометрической изомерии. Следует понимать, что изобретение включает любые таутомерические формы, любые формы конформационной изомерии, оптической изомерии и/или геометрической изомерии соединений и пролекарств, имеющих одно или более преимуществ, описанных здесь, а также смеси этих разнообразных различных изомерных форм. В случаях ограниченной ротации вокруг структуры ядра 2,4-пиримидиндиамина становится возможным образование атропных изомеров, которые также конкретно включены в соединения согласно настоящему изобретению.

Кроме того, специалисты в данной области должны понимать, что при включении в списки альтернативных заместителей членов, которые ввиду валентности или по другим причинам нельзя использовать для замещения конкретной группы, следует использовать только те члены списка, которые пригодны для замены конкретной группы. Например, очевидно, что пока все перечисленные альтернативные заместители для R^b могут быть использованы для замены алкильной группы, некоторые из альтернативных заместителей, такие как =O, не могут быть использованы для замены фенильной группы. Необходимо учесть, что имеются в виду только возможные комбинации пар групп-заместителей.

Соединения и/или пролекарства согласно настоящему изобретению могут быть идентифицированы в соответствии с их химической структурой или химическим названием. Если химическая структура и химическое название противоречат друг другу, определяющей при идентификации конкретного соединения является химическая структура.

В зависимости от природы различных заместителей соединения и пролекарства 2,4-пиримидиндиамина, составляющие изобретение, могут иметь форму солей. Такие соли включают в себя соли, пригодные для фармацевтического применения («фармацевтически приемлемые соли»), соли, пригодные для ветеринарного применения, и т.д. Такие соли могут быть получены из кислот или оснований, что хорошо известно на практике.

В одном из примеров реализации соль является фармацевтически приемлемой. Обычно фармацевтически приемлемые соли - это те соли, которые сохраняют существенную часть одной или более желательных фармацевтических функций исходного компонента и которые пригодны для назначения людям. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя соли с кислотной добавкой, образованные с помощью неорганических кислот или органических кислот. Неорганические соли, пригодные для формирования фармацевтически приемлемых солей с кислотной добавкой, включают в себя, не ограничиваясь ими, к примеру, следующие: гидрогалидные кислоты (например, соляная кислота, бромистоводородная кислота, иодистоводородная кислота и т.д.), серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и им подобные. Органические кислоты, пригодные для формирования фармацевтически приемлемых солей с кислотной добавкой, включают, к примеру, но не ограничиваются следующими: уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту, пропионовую кислоту, гексановую кислоту, циклопентанпропионовую кислоту, гликолевую кислоту, щавелевую кислоту, пировиноградную кислоту, молочную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, яблочную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, пальмитиновую (гексадекановую) кислоту, бензойную кислоту, 3-(4-гидроксибензоил) бензойную кислоту, коричную (В-фенилакриловую) кислоту, мандельную кислоту, алкилсульфоновые кислоты (например, метансульфокислота, этансульфокислота, 1,2-этан-дисульфокислота, 2-гидроксиэтансульфокислота и т.д.), арилсульфокислоту (например, бензолсульфоновую кислоту, 4-хлоробензолсульфоновую кислоту, 2-нафталиндисульфоновую кислоту, 4-толуолсульфокислоту, циклоалкилсульфоновые кислоты (например, камфорсульфокислота), 4-метилбицикло[2.2.2]-окт-2-ене-1-карбоксильную кислоту, глюкогептонную кислоту, 3-фенилпропионовую кислоту, триметилуксусную кислоту, третичную бутилуксусную кислоту, лаурилсерную серную кислоту, глюконовую кислоту, глутаминовую кислоту, гидроксинафтойную кислоту, салициловую кислоту, стеариновую (октадекановую) кислоту, муконовую кислоту и им подобные.

Фармацевтически приемлемые соли также включают в себя соли, образованные путем замещения протона кислоты, присутствующего в исходном соединении, ионом металла (например, ионом щелочного, щелочно-земельного металла или алюминия), ионом аммония или путем согласования с органическим основанием (например, этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, N-метилглюкамин, морфолин, пиперидин, диметиламин, диэтиламин и т.д.).

Соединения 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению, также как и их соли, могут находиться в форме гидратов, сольватов и N-оксидов, хорошо известных на практике.

6.3. Способы синтеза

Соединения и пролекарства согласно изобретению можно синтезировать различными способами с использованием коммерчески доступных исходных материалов и/или исходных материалов, полученных обычными синтетическими способами. Различные способы, которые могут быть использованы для синтеза компонентов 2,4-пиримидиндиамина и пролекарств согласно настоящему изобретению, описаны в патенте США № 5 958 935, ссылка на который приведена в настоящей заявке. Конкретные примеры, описывающие синтез многочисленных компонентов и пролекарств согласно настоящему изобретению, также как и их промежуточных соединений, представлены в разделе «Примеры». Все соединения, имеющие структурные формулы (I), (Ia) и (II), могут быть получены посредством несложной модификации этих способов.

Разнообразие возможных путей синтеза, которые можно использовать для синтензирования соединений 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению, описано ниже в схемах (I)-(XI). В схемах (I)-(XI) соединения с одинаковыми номерами имеют подобные структуры. Эти способы можно традиционно использовать для синтезирования пролекарств, соответствующих структурной формуле (II).

В одном из примеров реализации соединения могут быть синтезированы из замещенных или незамещенных урацилов или тиоурацилов, как показано ниже на схеме (I):

Схема (I)

На схеме (I) R², R⁴, R⁵, R⁶, L¹ и L² соответствуют прежнему определению структурной формулы (I), X представляет собой галоген (например, F, Cl, Br или I), а Y и Y', каждый независимо друг от друга, выбраны из группы, содержащей O и S. Исходя из схемы (I) урацил или тиоурацил 2 дигалогенизирован в 2- и 4-положениях с помощью стандартного галогенизирующего вещества POX₃ (или другого стандартного галогенизирующего вещества) в стандартных условиях для получения 2,4-бисгалпиримидина 4. В зависимости от заместителя R⁵ в пиримидине 4 галид в положении C4 является более реактивным по отношению к электронно-донорным веществам, чем галид в положении C2. Это различие в реактивности может быть использовано для синтезирования 2,4-пиримидиндиаминов, соответствующих структурной формуле (I), посредством реакции 2,4-бисгалогенпиримидина 4 с одним эквивалентом амина 10, производящего 4N-замещенный-2-галоген-4-пиримидинамин 8, за которым следует амин 6 для получения 2,4-пиримидиндиамина, соответствующего структурной формуле (I). 2N,4N-бис (замещенные)-2,4-пиримидиндиамины 12 и 14 могут быть получены при реакции 2,4-бисгалогенпиримидина 4 с избытком компонентов 6 или 10 соответственно.

В большинстве случаев, как показано на схеме, галид C4 более реактивен по отношению к электронно-донорным веществам. Однако, как должно быть понятно специалистам, свойства заместителя R⁵ могут изменить эту реактивность. Например, если R⁵ представляет собой трифторметил, то в результате реакции образуется смесь 50:50 4N-замещенного-4-пиримидинамина 8 и соответствующего 2N-замещенного-2-пиримидинамина. Независимо от того, что собой представляет заместитель R⁵, региоселективность реакции можно регулировать с помощью подбора растворителя и других условий синтеза (таких как температура), что хорошо известно из практики.

Реакции, иллюстрированные на схеме (I), могут протекать быстрее в случае микроволнового нагрева реакционной смеси. В этом случае можно использовать следующие условия: нагрев до 175°C в этаноле в течение 5-20 мин в реакторе Смита (производства компании Personal Chemistry) в герметичной трубке (при давлении 20 бар).

Исходные материалы урацил или тиоурацил 2 можно приобрести на коммерческой основе или получить, используя стандартную методику, применяемую в органической химии. В качестве примера коммерческих урацилов и тиоурацилов, которые можно использовать как исходные материалы для реакций по схеме (I), можно использовать урацил, поставляемый компанией Aldrich (№ по каталогу 13,078-8; CAS Registry 66-22-8); 2-тиоурацил (Aldrich, №11,558-4; CAS Registry 141-90-2); 2,4-дитиоурацил (Aldrich, №15,846-1; CAS Registry 2001-93-6); 5-ацетоурацил (Chem. Sources Int'l 2000, Registry CAS 6214-65-9); 5-азидоурацил; 5-аминоурацил (Aldrich №85,528-6; Registry CAS 932-52-5); 5-бромурацил (Aldrich №85,247-3; Registry CAS 51-20-7); 5-(транс-2-бромвинил)-урацил (Aldrich №45,744-2; Registry CAS 69304-49-0); 5-(транс-2-хлорвинил)-урацил (Registry CAS 81751-48-2); 5-(транс-2-карбоксивинил)-урацил; урацил-5-карбоновая кислота (гидрат 2,4-дигидроксипиримидин-5-карбоновой кислоты; Aldrich №27,770-3; Registry CAS 23945-44-0); 5-хлорурацил (Aldrich №22,458-8; Registry CAS 1820-81-1); 5-цианоурацил (Chem. Sources Int'l 2000; Registry CAS 4425-56-3); 5-этилурацил (Aldrich №23,044-8; Registry CAS 4212-49-1); 5-этенилурацил (Registry CAS 37107-81-6); 5-фторурацсил (Aldrich №85,847-1; Registry CAS 51-21-8); 5-иодурацил (Aldrich №85,785-8; Registry CAS 696-07-1); 5-метилурацил (тимин; Aldrich №13,199-7; Registry CAS 65-71-4); 5-нитроурацил (Aldrich №85,276-7; Registry CAS 611-08-5); урацил-5-сульфаминовая кислота (Chem. Sources Int'l 2000; Registry CAS 5435-16-5); 5-трифторметилурацил (Aldrich №22,327-1; Registry CAS 54-20-6); 5-(2,2,2-трифторэтил)-урацил (Registry CAS 155143-31-6); 5-(пентафторэтил)-урацил (CAS Registry 60007-38-3); 6-аминоурацил (Aldrich №A5060-6; Registry CAS 873-83-6) урацил-6-карбоновая кислота (оротовая кислота; Aldrich №0-840-2; Registry CAS 50887-69-9); 6-метилурацил (Aldrich №D11,520-7; Registry CAS 626-48-2); урацил-5-амино-6-карбоновая кислота (5-аминооротовая кислота; Aldrich №19,121-3; Registry CAS #7164-43-4); 6-амино-5-нитрозоурацил (6-амино-2,4-дигидрокси-5-нитрозопиримидин; Aldrich №27,689-8; Registry CAS 5442-24-0); урацил-5-фтор-6-карбоновая кислота (5-фтороротовая кислота; Aldrich №42,513-3; Registry CAS 00000-00-0); и урацил-5-нитро-6-карбоновая кислота (5-нитрооротовая кислота; Aldrich №18,528-0; Registry CAS 600779-49-9). Дополнительные 5-, 6- и 5,6-замещенные урацилы и/или тиоурацилы можно приобрести в компаниях General Intermediates of Canada, Inc. (Эдмонтон, шт. Альберта, Канада) (http://www.generalintermediates.com) и/или Interchim (Франция) (http://www.interchim.com), производящих химические реактивы, или могут быть получены, используя стандартную методику. Ниже представлено большое количество ссылок на учебники, в которых изложены подходящие синтетические способы.

Амины 6 и 10 можно приобрести в коммерческих источниках или, альтернативно, можно синтезировать, используя стандартную технику. Например, необходимые амины можно синтезировать из нитропрекурсоров, используя стандартные химические способы. Примеры конкретных реакций приведены в разделе «Примеры». См. также Vogel, 1989, Practical Organic Chemistry, Addison Wesley Longman, Ltd. and John Wiley & Sons, Inc.

Из практики известно, что в некоторых случаях амины 6 и 10 и/или заместители R⁵ и/или R⁶ на урациле или тиоурациле 2 могут включать функциональные группы, требующие защиты при синтезировании. Конкретные особенности любой используемой защитной группы (групп) будет зависеть от особенностей функциональной группы, которую необходимо защитить, и это будет учтено специалистами в данной области. Руководство по отбору подходящих защитных групп, а также синтетических стратегий для их присоединения и удаления, можно найти, например, в работе: Грин и Ватс, Защитные группы в органическом синтезе, 3-е издание, изд-во: Джон Уайли энд Санс, Нью-Йорк, 1999 г. (Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3d Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999)) и в ссылках, упоминаемых далее в тексте (далее - «Грин и Ватс»).

Конкретный пример реализации реакции по Схеме (I), в которой в качестве исходного материала используется 5-фторурацил (Aldrich, №32,937-1), представлена ниже на Схеме (Ia):

Схема (Ia)

На схеме (Ia) R², R⁴, L¹ и L² соответствуют их предыдущему определению для схемы (I). Согласно схеме (Ia) 5-фторурацил 3 галогенизирован с помощью POCl₃ для получения 2,4-дихлор-5-фторпиридимина 5, который затем реагирует с избыточным амином 6 или 10 для получения N2,N4-бис замещенного 5-фтор-2,4-пиримидиндиамина 11 или 13 сооответственно. Альтернативно, асиммметричный 2N,4N-двузамещенный-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин 9 может быть получен в результате реакции 2,4-дихлоро-5-фторпиридимина 5 с одним эквивалентом амина 10 (с образованием 2-хлор-N4-замещенного-5-фтор-4-пиримидинамина 7), а затем - с одним или более эквивалентами амина 6.

В другом примере реализации соединения 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы из замещенных или незамещенных цитозинов, представленных ниже на схемах (IIa) и (IIb):

Схема (IIa)

Схема (IIb)

На схемах (IIa) и (IIb) R², R⁴, R⁵, R⁶, L¹, L² и X соответствуют прежнему их определению для схемы (I), а PG представляет защитную группу. Исходя из схемы (IIa) экзоциклический амин C4 цитозина 20 сначала защищается подходящей защитной группой PG с образованием N4-защищенного цитозина 22. Для конкретного руководства относительно защитных групп, используемых в данном контексте, см. Vorbruggen and Ruh-Pohlenz, 2001, Handbook of Nucleoside Synthesis, John Wiley & Sons, NY, pp. 1-631). Защищенный цитозин 22 галогенизирует в положении C2 в стандартных условиях с помощью стандартного реагента галогенизации с образованием 2-хлор-4N-защищенного-4-пиримидинамина 24. Реакция с амином 6, сопровождаемая снятием защиты с экзоциклического амина C4 и реакцией с амином 10, приводит к образованию 2,4-пиримидиндиамина, соответствующего структурной формуле (I).

В альтернативном случае, исходя из схемы (IIb) цитозин 20 может вступать в реакцию с амином 10 или защищенным амином 21 с получением N4-замещенного цитозина 23 или 27 соответственно. Эти замещенные цитозины затем могут быть, как описано выше, галогенизированы, выведены из защиты (в случае N4-замещенного цитозина 27) и могут вступить в реакцию с амином 6 для получения 2,4-пиримидинамина, соответствующего структурной формуле (I).

Коммерчески доступные цитозины, которые могут быть использованы как исходные материалы в схемах (IIa) и (IIb), включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, цитозин (Aldrich №14,201-8; Registry CAS 71-30-7); N⁴-ацетилцитозин (Aldrich №37,791-0; Registry CAS 14631-20-0); 5-фторцитозин (Aldrich №27,159-4; Registry CAS 2022-85-7); и 5-(трифторметил)-цитозин. Другие подходящие цитозины, применимые как исходные материалы в схемах (IIa), можно приобрести в компаниях General Intermediates of Canada, Inc., (Эдмонтон, шт. Альберта, Канада) (http://www.generalintermediates.com) и/или Interchim (Франция) (http://www.interchim.com), или получить с помощью стандартной методики. Ниже дается большое количество ссылок на руководства по синтетическим способам их получения.

Еще в одном примере реализации соединения 2,4-пиримидиндиамина рассматриваемого изобретения могут быть синтезированы из замещенных или незамещенных 2-амино-4-пиримидинолов, как ниже показано на схеме (III):

Схема (III)

На схеме (III) R², R⁴, R⁵, R⁶, L¹, L² и X соответствуют их описанию на схеме (I), а Z - замещаемая группа, ниже подробнее рассматриваемая в связи со схемой IV. Исходя из схемы (III) 2-амино-4-пиримидинол 30 вступает в реакцию с амином 6 (или по выбору - с защищенным амином 21) для получения N2-замещенного-4-пиримидинола 32, который затем подвергается галогенизации, как описано выше, для получения N2-замещенного-4-галоген-2-пиримидинамина 34. Дополнительное снятие защиты (например, если защищенный амин 21 был использован на первом этапе), сопровождаемое реакцией с амином 10, приводит к образованию 2,4-пиримидинамина, соответствующего структурной формуле (I). В альтернативном случае, пиримидинол 30 может вступить в реакцию с ацилирующим веществом 31.

Подходящие и коммерчески доступные 2-амино-4-пиримидинолы 30, которые можно использовать как исходные материалы в схеме (III), включают в себя, не ограничиваясь ими, 2-амино-6-хлор-4-пиримидинол гидрат (Aldrich, №A4702-8; Registry CAS 00000-00-0) и 2-амино-6-гидрокси-4-пиримидинол (Aldrich, №A5040-1; Registry CAS 56-09-7). Другие 2-амино-4-пиримидинолы 30, применимые как исходные материалы в схеме (III), можно приобрести в компаниях General Intermediates of Canada, Inc., (Эдмонтон, шт. Альберта, Канада) (http://www.generalintermediates.com) и/или Interchim (Франция) (http://www.interchim.com) или получить с помощью стандартной методики. Ниже дается большое количество ссылок на руководства по синтетическим способам их получения.

В альтернативном случае, соединения 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы из замещенных или незамещенных 4-амино-2-пиримидинолов, как ниже показано на схеме (IV):

Схема (IV)

На схеме (IV) R², R⁴, R⁵, R⁶, L¹ и L² соответствуют их обозначениям на схеме (I), а Z представляет замещаемую группу. Исходя из схемы (IV) C2-гидроксил 4-амино-2-пиримидинол 40 более реактивен по отношению к нуклеофилам, чем C4-амин, настолько, что реакция с амином 6 приводит к образованию N2-замещенного-2,4-пиримидиндиамина 42. Последующая реакция с компонентом 44, который включает в себя хорошую замещаемую группу Z или амин 10, приводит к образованию 2,4-пиримидинамина, соответствующего структурной формуле (I). Компонент 44 может включать в себя практически любую замещаемую группу, которая может быть заменена C4-амином N2-замещенного-2,4-пиримидиндиамина 42. Подходящие замещаемые группы Z включают в себя, не ограничиваясь ими, галогены, метансульфонилоксигруппу (мезилокси; «OM»), трифторметанесульфонелоксигруппу («OTf») и п-толуолсульфонилоксигруппу (тозилокси; «OT»), бензолсульфонилоксигруппу («безилат») и метанитробензолсульфонилоксигруппу («нозилат»). Другие подходящие замещаемые группы хорошо известны специалистам в данной области.

Замещенный 4-амино-2-пиримидирол, используемый в качестве исходного материала, может быть получен на коммерческой основе или синтезирован с использованием стандартной методики. Ниже дается большое количество ссылок на руководства по синтетическим способам их получения.

В еще одном примере реализации соединения 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению могут быть получены из 2-хлор -4-аминопиримидина или 2-амино-4-хлорпиримидинов, как ниже показано на схеме (V):

Схема (V)

На схеме (V) R², R⁴, R⁵, R⁶, L¹, L² и X соответствуют ранее описанным на схеме (I), а Z соответствует его обозначению на схеме (IV). Исходя из схемы (V) 2-амино-4-хлорпиримидин 50 вступает в реакцию с амином 10 с образованием 4N-замещенного-2-пиримидиндиамина 52, который, следуя реакции с компонентом 31 или амином 6, образует 2,4-пиримидинамин, соответствующий структурной формуле (I). В альтернативном случае, 2-хлор-4-аминопиримидин 54 может вступать в реакцию с компонентом 44, а затем - с амином для получения соединения, соответствующего структурной формуле (I).

Примеры коммерчески доступных исходных материалов для использования в схеме (V) включают в себя, но не ограничиваются разновидностями пиримидинов 50 и 54, включая 2-амино-4,6-дихлорпиримидин (Aldrich №A4860-1; Registry CAS 56-05-3); 2-амино-4-хлор-6-метоксипиримидин (Aldrich №51,864-6; Registry CAS 5734-64-5); 2-амино-4-хлор-6-метилпиримидин (Aldrich №12,288-2; Registry CAS 5600-21-5) и 2-амино-4-хлор-6-метилтиопиримидин (Aldrich №A4600-5; Registry CAS 1005-38-5). Дополнительный исходный материал на основе пиримидина можно приобрести в компаниях General Intermediates of Canada, Inc., (Эдмонтон, шт. Альберта, Канада) (http://www.generalintermediates.com) и/или Interchim (Франция) (http://www.interchim.com), или получить, используя стандартную методику. Ниже дается большое количество ссылок на руководства по синтетическим способам их получения.

В альтернативном случае, 4-хлор-2-пиримидинамины 50 можно получить, как показано ниже на схеме (Va):

Схема (Va)

На схеме (Va) R⁵ и R⁶ соответствуют своим обозначениям в структурной формуле (I). На схеме (Va) дикарбонил 53 вступает в реакцию с гуанидином для получения 2-пиримидинамина 51. Реакция с надкислотами типа м-хлорпербензойной кислоты, трифторперуксусной кислоты или комплекса перекиси водорода с мочевиной приводит к образованию N-оксида 55, который затем галогенизируется, с получением 4-хлор-2-пиримидинамина 50. Соответствующие 4-галоген-2-пиримидинамины можно получить с помощью подходящих галогенирующих веществ.

В еще одном примере реализации изобретения соединения 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению могут быть получены из замещенных или незамещенных уридинов, как показано ниже на схеме (VI):

Схема (VI)

На схеме (VI) R², R⁴, R⁵, R⁶, L¹, L² и X соответствуют своим обозначениям на схеме (I), а верхний индекс PG представляет собой защитную группу, рассмотренную в связи со схемой (IIb). Согласно схеме (VI) уридин 60 имеет такой реактивный центр C4, что реакция с амином 10 или защищенным амином 21 приводит к образованию N4-замещенного цитидина 62 или 64 соответственно. Снятие защиты с N4-замещенных 62 или 64 с помощью кислотного катализатора (когда «PG» представляет собой кислотно-неустойчивую защитную группу) дает N4-замещенный цитозин 28, который затем может быть галогенизирован в С2-положении и может вступить в реакцию с амином 6 для получения 2,4-пиримидинадиамина, соответствующего структурной формуле (I).

Аналогичным образом в качестве исходного материала также можно использовать цитидины, как показано ниже на схеме (VII):

Схема (VII)

На схеме (VII) R², R⁴, R⁵, R⁶, L¹, L² и X соответствуют своим обозначениям на схеме (I), а верхний индекс PG представляет защитную группу, как указывалось выше. Исходя из схемы (VII) подобно иридину 60 цитидин 70 имеет такой реактивный центр C4, что реакция с амином 10 или защищенным амином 21 приводит к образованию N4-замещенного цитидина 62 или 64 соответственно. Эти цитидины 62 и 64 затем обрабатываются, как изложено выше для схемы (VI), чтобы получить 2,4-пиримидиндиамин, соответствующий структурной формуле (I).

Несмотря на то, что схемы (VI) и (VII) приведены в качестве примера с рибозилнуклеозидами, опытному специалисту в этой области ясно, что можно использовать соответствующие 2'-дезоксириб- и 2',3'-дидезоксирибонуклеозиды, а также нуклеозиды, включающие в себя сахара или аналоги сахаров, отличающиеся от рибозы.

Многочисленные уридины и цитидины, пригодные для использования в качестве исходного материала в схемах (VI) и (VII), известны специалистам и включают в себя, например, 5-трифторметил-2'-дезоксицитидин (Chem. Sources, №ABCR F07669; Registry CAS 66,384-66-5); 5-бромуридин (Chem. Sources Int'l 2000, Registry CAS 957-75-5); 5-йодо-2'-дезоксиуридин (Aldrich, №1-775-6; Registry CAS 54-42-2); 5-фторуридин (Aldrich, №32,937-1; Registry CAS 316-46-1); 5-йодуридин (Aldrich, №85,259-7; Registry CAS 1024-99-3); 5-(трифторметил)уридин (Chem. Sources Int'l 2000; Registry CAS 70-00-8); 5-трифторметил-2'-дезоксиуридин (Chem. Sources Int'l 2000; Registry CAS 70-00-8). Дополнительные уридины и цитидины, которые могут быть использованы в качестве исходного материала в Схемах (VI) и (VII), можно приобрести в компаниях General Intermediates of Canada, Inc., (Эдмонтон, шт. Альберта, Канада) (http://www.generalintermediates.com) и/или Interchim (Франция) (http://www.interchim.com) или получить, используя стандартную методику. Ниже дается большое количество ссылок на руководства по способам их искусственного получения.

Соединения 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению также могут быть синтезированы из замещенных пиримидинов, таких как хлорозамещенные пиримидины, как показано ниже на схемах (VIII) и (IX):

Схема (VIII)

Схема (IX)

На схемах (VIII) и (IX) R², R⁴, L¹, L² и R^a соответствуют своим обозначениям в структурной формуле (I), а «Ar» представляет собой группу арилов. Исходя из схемы (VIII), реакция 2,4,6-трихлорпиримидина 80 (Aldrich №T5,620-0; CAS №3764-01-0) с амином 6 приводит к образованию трех соединений: замещенного пиримидина моно-, ди- и триаминов 81, 82 и 83, которые могут быть разделены и изолированы с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) или другой обычной методики. Моно- и диамины 81 и 82 могут в дальнейшем вступать в реакцию с аминами 6 и/или 10 с образованием N2,N4,N6-тризамещенных-2,4,6-пиримидинтриаминов 84 и 85 соответственно.

N2,N4-бис-замещенные-2,4-пиримидиндиамины можно получить способом, аналогичным показанному на схеме (VIII), используя в качестве исходных материалов 2,4-дихлор-5-метилпиримидин или 2,4-дихлорпиримидин. В этом случае однозамещенный пиримидинамин, соответствующий соединению 81, не образуется. Вместо этого протекает реакция непосредственного образования N2,N4-бис-замещенный-2,4-пиримидиндиамина.

Исходя из схемы (IX), 2,4,5,6-тетрахлорпиримидин 90 (Aldrich №24,671-9; CAS №1780-40-1) взаимодействует с избыточным амином 6 с получением смеси трех компонентов: 91, 92, и 93, которые могут быть разделены и изолированы с помощью ВЭЖХ или стандартной методики. Как показано, N2,N4-бис-замещенный -5,6,-дихлор-2,4-пиримидиндиамин 92 затем при наличии галида C6 может реагировать, например, с нуклеофильным веществом 94 с получением соединения 95. В альтернативном случае соединение 92 может быть превращено в N2,N4-бис-замещенный -5-хлор-6-арил-2,4-пиримидиндиамин 97 с помощью реакции Сузуки (Suzuki). 2,4-пиримидиндиамин 95 можно превратить в 2,4-пиримидиндиамин 99 с помощью реакции с Bn₃SnH.

Специалистам в данной области понятно, что 2,4-пиримидиндиамины согласно настоящему изобретению, синтезированные с помощью способов, описанных выше, или с помощью других хорошо известных способов, также могут быть использованы как исходные материалы и/или промежуточные продукты для синтезирования дополнительных компонентов 2,4-пиримидиндиамина согласно изобретению. Конкретный пример показан ниже на схеме (X):

Схема (X)

На схеме (X) R⁴, R⁵, R⁶, L² и R^a соответствуют своим обозначениям в структурной формуле (I). Каждый R^a′ независимо представляет собой R^a и может быть таким же или отличаться от представленного R^a. Исходя из схемы (X), карбоновая кислота или сложный эфир 100 могут быть преобразованы в амид 104 с помощью реакции с амином 102. В амине 102 R^a′ может быть таким же или может отличаться от R^a кислоты или эфира 100. Аналогичным образом, эфир углекислой соли 106 может быть преобразован в карбамат 108.

Второй конкретный пример показан ниже на схеме (XI):

Схема (XI)

На схеме (XI) R⁴, R⁵, R⁶, L² и R^c соответствуют своим обозначениям в структурной формуле (I). Исходя из схемы (XI), амид 110 или 116 может быть преобразован в амин 114 или 118 соответственно благодаря сокращению содержания бора с помощью комплекса метилсульфида бора 112. Другие подходящие реакции для синтезирования соединений 2,4-пиримидиндиамина из исходного материала 2,4-пиримидиндиамина понятны специалистам в этой области.

Несмотря на то, что многие из синтетических схем, рассмотренных выше, не отражают использование защитных групп, ясно, что в некоторых случаях заместители R², R⁴, R⁵, R⁶, L¹ и/или L² могут включать в себя функциональные группы, требующие защиты. Точные свойства используемой защитной группы будут зависеть, среди прочего, от свойств функциональной группы, которую необходимо защищать, и от условий используемой реакции в конкретной синтетической схеме, что очевидно для специалистов в данной области. Руководство по выбору защитных групп и механизмов для присоединения и удаления, удобных для конкретного применения, можно найти, например, в Greene & Wuts.

Пролекарства, соответствующие структурной формуле (II), можно получить с помощью обычной модификации вышеописанных способов. В противном случае такие пролекарства можно получить с помощью реакции надлежащим образом защищенного 2,4-пиримидиндиамина, соответствующего структурной формуле (I), с подходящей прогруппой. Условия для осуществления таких реакций и для снятия защиты с продукта реакции для получения пролекарства, соответствующего формуле (II), хорошо известны.

В литературе известно большое количество обучающих способов, в основном применимых для синтеза как пиримидинов, так и исходных материалов, описанных на схемах (I)-(IX). За конкретным руководством читатель может обратиться к следующим источникам: Brown, D. J., "The Pyrimidines", в The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volume 16 (Weissberger, A., Ed.), 1962, Interscience Publishers, (A Division of John Wiley & Sons), New York (“Brown I”); Brown, D. J., "The Pyrimidines", in The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volume 16, Supplement I (Weissberger, A. and Taylor, E. C., Ed.), 1970, Wiley-Interscience, (A Division of John Wiley & Sons), New York (Brown II”); Brown, D. J., "The Pyrimidines", in The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volume 16, Supplement II (Weissberger, A. and Taylor, E. C., Ed.), 1985, An Interscience Publication (John Wiley & Sons), New York (“Brown III”); Brown, D. J., "The Pyrimidines" in The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volume 52 (Weissberger, A. and Taylor, E. C., Ed.), 1994, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 1-1509 (Brown IV”); Kenner, G. W. and Todd, A., in Heterocyclic Compounds, Volume 6, (Elderfield, R. C., Ed.), 1957, John Wiley, New York, Chapter 7 (Pyrimidines); Paquette, L. A., Principles of Modern Heterocyclic Chemistry, 1968, W. A. Benjamin, Inc., New York, pp. 1-401 (синтез урацила - стр. 313, 315; синтез пиримидина - стр. 313-316; синтез пиримидинамина - стр. 315); Joule, J. A., Mills, K. and Smith, G. F., Heterocyclic Chemistry, 3^rd Edition, 1995, Chapman and Hall, London, UK, pp. 1 - 516; Vorbruggen, H. and Ruh-Pohlenz, C., Handbook of Nucleoside Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2001, pp. 1-631 (защита пиримидинов ацелированием - стр. 90-91; силилирование пиримидинов - стр. 91-93); Joule, J. A., Mills, K. and Smith, G. F., Heterocyclic Chemistry, 4^th Edition, 2000, Blackwell Science, Ltd, Oxford, UK, pp. 1 - 589; and Comprehensive Organic Synthesis, Volumes 1-9 (Trost, B. M. and Fleming, I., Ed.), 1991, Pergamon Press, Oxford, UK.

6.4. Ингибирование сигнальных каскадов Fc-рецептора

Активные соединения 2,4-пиримидиндиамиина согласно настоящему изобретению подавляют сигнальные каскады рецептора Fc, что приводит, помимо прочего, к дегрануляции клеток. В качестве конкретного примера может служить подавление этими соединениями каскадов сигналов FcεRI и/или FcγRI, в результате чего происходит дегрануляция иммунных клеток, таких как нейтрофильные, эозинофильные клетки, мастоциты и/или базофильные клетки. И мастоциты, и базофильные клетки играют центральную роль в расстройствах, вызванных аллергенами, включая, например, аллергические риниты и астму. Исходя из фиг.1, под воздействием аллергенов, которыми, в числе прочего, могут быть пыльца или паразиты, аллергенспецифические антитела IgE синтезируются В-клетками, которые активируются с помощью IL-4 (или IL-13) и других мессенджеров, для того чтобы перейти к синтезу конкретного антитела класса IgE . Эти аллергенспецифические антитела IgE связываются с FcεRI, имеющим высокое сродство. После связывания антигена, связанные с FcεRI антитела IgE сшиваются, и активируется путь передачи сигнала рецептора IgE, который приводит к дегрануляции клеток и последующему выделению и/или синтезу множества химических медиаторов, включая гистамин, протеазы (например, триптаза и химаза), липидные посредники, такие как лейкотриены (например, LTC4), факторы активации тромбоцитов (PAF) и простагландины (например, PGD2), а также серии цитокинов, включая TNF-α, IL-4, IL-13, IL-5, IL-6, IL-8, GMCSF, VEGF и TGF-β. Выделение и/или синтез этих посредников из мастоцитов и/или базофильных клеток является причиной ранних или поздних ответов, вызванных аллергенами, и непосредственно связано с процессами, протекающими в прямом направлении, которые ведут к продолжительному воспалительному состоянию.

Молекулярные процессы в пути передачи сигнала рецептора FcεRI, которые вызывают выделение преформированных медиаторов посредством дегрануляции и выделения и/или синтеза других химических медиаторов, хорошо известны и проиллюстрированы на фиг.2. Исходя из фиг.2, FcεRI представляет собой гетеротетрамерный рецептор, составленный из IgE-связывающих альфа-субъединиц, бэта-субъединиц и двух гамма-субъединиц (гамма-гомодимер). Перекрестное связывание FcεRI-связанного IgE с помощью многовалентных связывающих веществ (включая, например, IgE-специфические аллергены, или анти-IgE-антитела, или фрагменты) вызывает быструю ассоциацию и активацию Src-зависимой Lyn-киназы. Lyn фосфорилирует мотивы активации иммунорецептора, вызванные тирозином (“ITAM”), на межклеточных бэта- и гамма-субъединицах, что приводит к рекрутингу дополнительной Lyn-киназы к бэта-субблоку и Syk-киназы - к гамма-гомодимеру. Эти связанные с рецептором киназы, которые активируются посредством внутри- и межмолекулярного фосфорилирования, фосфорилируют другие компоненты пути, такие как Btk-киназа, LAT и C-гамма (PLC-гамма) фосфолипазы. Активированная PLC-гамма инициирует путь, который ведет к активации C-киназы протеина и мобилизации Ca²⁺, что необходимо для дегрануляции. Перекрестное связывание FcεRI также активирует три основных класса киназ протеина, активированного митогеном (MAP), то есть ERK1/2, JNK1/2 и p38. Активация этих путей важна при транскрипционном регулировании провоспалительных медиаторов, таких как TNF-α и IL-6, а также лейкотриена CA (LTC4) медиатора липида.

Хоть это и не показано на рисунке, считается, что сигнальный каскад рецептора FcγRI имеет несколько общих элементов с сигнальным каскадом рецептора FcεRI. Существенно то, что подобно FcεRI рецептор FcγRI включает гамма-гомодимер, который фосфорилирован и рекрутирует Syk-киназу, как и в случае FcεRI, и активация сигнального каскада рецептора FcγRI ведет, кроме прочего, к дегрануляции. Другие рецепторы Fc, которые участвуют в гамма-гомодимере и могут регулироваться активными соединениями 2,4-пиримидиндиамина, включают, помимо прочего, FcαRI и FcγRIII.

Способность соединений 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению ингибировать сигнальные каскады рецептора Fc можно легко определить или подтвердить в результате in vitro анализа. Пробы, удобные для подтверждения ингибирования дегрануляции, опосредованной FcεRI, описаны в разделе «Примеры». В одной типичной пробе клетки, способные претерпевать дегрануляцию, опосредованную FcεRI, как, например, мастоциты или блазофилы, сначала выращивают в присутствии IL-4, фактора стволовых клеток (SCF), IL-6 и IgE для увеличения экспрессии FcεRI, подверженного воздействию тестового соединения 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению и стимулированного с помощью анти-IgE-антител (или, в альтернативном случае, IgE-зависимого аллергена). Вслед за инкубацией количество химического медиатора или другого химического реагента, выделенного и/или синтезированного в результате активации сигнального каскада FcεRI, может быть определено с использованием стандартной методики и может быть приравнено к количеству медиатора или реагента, выделенного из контрольных клеток (то есть клеток, которые стимулируются, но не подвергаются воздействию испытуемого соединения). Концентрация испытуемого соединения, которая приводит к 50%-ному сокращению количества медиатора или реагента, измеренного относительно контрольных клеток, равна IC₅₀ испытываемого соединения. Происхождение мастоцитов или базофильных клеток, используемых в пробе, будет зависеть, в частности, от предпочтительного применения соединений, что очевидно для специалистов в данной области. Например, если соединения будут использоваться для лечения или профилактики конкретного заболевания, свойственного человеку, удобным источником мастоцитов или базофильных клеток является человек или другое животное, которое принято считать приемлемой или известной клинической моделью для конкретной болезни. Таким образом, в зависимости от конкретного применения мастоциты или базофильные клетки могут быть получены из различных животных источников, от низших млекопитающих, таких как мыши и крысы, до собак, овец и других млекопитающих, обычно используемых при клинических испытаниях, и высших млекопитающих, таких как мартышки, шимпанзе, человекообразные обезьяны и даже человек. Конкретные примеры клеток, удобных для получения проб in vitro, включают в себя, в том числе, базофильные клетки грызунов или человека, линии базофильных клеток лейкемии крыс, основные мастоциты мышей (такие, как костномозговые мастоциты мышей (“BMMC”)) и основные культивированные из пуповинной крови мастоциты человека (“CHMC”) или другие ткани, например ткани легких. Способы изоляции и культивирования клеток этих типов хорошо известны или представлены в разделе «Примеры» (см., например, Demo et al., 1999, Cytometry 36(4):340-348 и одну из нескольких заявок, находящихся одновременно на рассмотрении патентного ведомства, регистрационный номер 10/053,355, дата подачи - 8 ноября 2001 г., изложение которой включено в ссылки к настоящей работе). Конечно, иммунные клетки других типов, которые дегранулируют после активации сигнального каскада FcεRI, также могут быть использованы, включая, например, эозинофилы.

Специалисты в данной области согласятся, что квантифицированный медиатор или реагент не является обязательным. Единственное требование состоит в том, чтобы медиатор или реагент был выделен и/или синтезирован в результате инициации или активации сигнального каскада рецептора Fc. Например, исходя из фиг.1, активация сигнального каскада FcεRI в мастоцитах и/или базофильных клетках приводит к многочисленным явлениям, протекающим в прямом направлении. Например, в результате активации сигнального каскада FcεRI мгновенно (то есть в течение 1-3 мин после активации рецептора) с помощью дегрануляции выделяются разнообразные преформированные химические медиаторы и реагенты. Таким образом, в одном из примеров реализации изобретения квантифицированный медиатор или реагент может быть характерным для гранул (то есть обычно присутствовать в гранулах, а не в цитоплазме клетки). Примеры гранулоспецифических медиаторов или реагентов, которые могут быть количественно оценены для определения и/или подтверждения активности соединения 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению, включают в себя, в том числе, гранулоспецифические ферменты, такие как гексозаминидаза и триптаза, и гранулоспецифические компоненты, такие как гистамин и серотонин. Пробы для количественной оценки таких факторов хорошо известны и во многих случаях коммерчески доступны. Например, выделение триптазы и/или гексозаминидазы может быть количественно оценено путем выращивания клеток с расщепляемыми субстратами, которые флуоресцируют после расщепления, с определением количества полученной флуоресценции общепринятыми способами. Такие расщепляемые флуорогенные субстраты коммерчески доступны. Например, флуорогенные субстраты Z-Gly-Pro-Arg-AMC (где Z=бензилоксикарбонил и AMC=7-амино-4-метилкумарин, производятся компанией BIOMOL Research Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA 19462, Catalog No. P-142) и Z-Ala-Lys-Arg-AMC (производится Enzyme Systems Products, a Division of ICN Biomedicals, Inc., Livermore, CA 94550, Catalog No. AMC-246) можно использовать для оценки количества выделенной триптазы. Флуорогеный субстрат 4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид (компания-поставщик: Sigma, St. Louis, MO, Catalog №69585) может быть использован для определения количества выделенной гексозаминидазы. Выделение гистамина можно количественно оценить, используя коммерчески доступный твердофазный иммуноферментный анализ ELISA, как, например, ELISA-анализ Immunotech гистамина №IM2015 (Beckman-Coulter, Inc.). Конкретные способы количественной оценки выделения триптазы, гексозаминидазы и гистамина представлены в разделе «Примеры». Каждая из этих проб может быть использована для определения или подтверждения активности соединений 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению.

Исходя из фиг.1, дегрануляция представляет собой только одну из нескольких реакций, инициируемых сигнальным каскадом FcεRI. Кроме того, активация этого сигнального пути ведет к de novo синтезу и выделению цитокинов и хемокинов, таких как IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α, IL-13 и MIP1-α, и выделению липидных медиаторов, таких как лейкотриены (например, LTC4), факторов активации тромбоцитов (ФАТ) и простагландинов. Следовательно, соединения 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению также могут быть оценены в отношении их активности с помощью оценки количества одного или нескольких из этих выделенных медиаторов и/или синтезированы с помощью активированных клеток.

В отличие от вышерассмотренных гранулоспецифических компонентов, эти медиаторы «поздней фазы» не выделяются сразу же после активации сигнального каскада FcεRI. Таким образом, при оценке количества этих медиаторов поздней стадии следует принять меры, гарантирующие, что культура активированной клетки выращена в течение времени, достаточного для осуществления синтеза (если необходимо) и выделения оцениваемого медиатора. Обычно ФАТ и липидные медиаторы, такие как лейкотриен C4, выделяются через 3-30 мин после активации FcεRI. Цитокины и другие медиаторы поздней фазы выделяются примерно через 4-8 час после активации FcεRI. Времена выращивания, соответствующие конкретным медиаторам, известны специалистам в данной области. Конкретное руководство и пробы представлены в разделе «Примеры».

Количество конкретного выделенного медиатора поздней фазы можно определить, используя любые стандартные способы. В одном из примеров реализации настоящего изобретения это количество (количества) можно оценить, используя анализ ELISA. Комплект проб ELISA, удобный для количественной оценки выделенного TNFα, IL-4, IL-5, IL-6 и/или IL-13, можно приобрести, например, в компании Biosource International, Inc., Camarillo, CA 93012 (см., например, номера по каталогу № KHC3011, KHC0042, KHC0052, KHC0061 и KHC0132). Комплект проб ELISA, удобный для количественной оценки выделенного из клеток лейкотриена C4 (LTC4), можно приобрести в компании Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI 48108 (см., например, номер по каталогу № 520211).

Как правило, соединения активных 2,4-пиримидиндиаминов согласно настоящему изобретению будут иметь концентрацию IC₅₀ по отношению к дегрануляции, опосредованной рецептором FcεRI, и/или уровень выделения или синтеза медиатора примерно 20 мкм или меньше в соответствии с результатами измерения in vitro, такой как одна из in vitro проб, рассмотренных выше или в разделе «Примеры». Конечно, специалистам в данной области понятно, что соединения, которые проявляют низкие величины IC₅₀, например, порядка 10 мкм, 1 мкм, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ или даже ниже, оказываются особенно полезными.

Специалисты в данной области также согласятся с тем фактом, что различные медиаторы, рассмотренные выше, могут вызывать разные отрицательные воздействия или разные уровни одного и того же отрицательного воздействия. Например, липидный медиатор LTC4 представляет собой сильное сосудосуживающее средство: его сильнодействие в плане сужения кровеносных сосудов примерно в 1000 раз превышает сильнодействие гистамина. В качестве другого примера, в дополнение к опосредующим атопическим реакциям или реакциям гиперчувствительности типа I, можно привести цитокины, которые также способны вызвать трансформацию ткани и пролиферацию клеток. Таким образом, несмотря на возможность использования соединений, которые ингибируют выделение и/или синтез одного из ранее рассмотренных химических медиаторов, специалисты в данной области согласятся, что соединения, которые ингибируют выделение и/или синтез большинства или даже всех из рассмотренных выше медиаторов, несомненно найдут более широкое применение ввиду их способности улучшать или полностью подавлять большинство или даже все неблагоприятные воздействия, вызванные отдельными медиаторами. Например, соединения, которые ингибируют выделение медиаторов всех трех типов - гранулоспецифических медиаторов, липидов и циклотинов эффективны при лечении или профилактике реакции гиперчувствительности немедленного типа I, а также связанных с ними хронических симптомов.

Соединения согласно настоящему изобретению, способные ингибировать выделение медиатора более чем одного типа (например, гранулоспецифического медиатора или медиатора поздней фазы), могут быть идентифицированы с помощью определения IC₅₀ относительно образцового медиатора каждого класса с использованием различных in vitro проб, рассмотренных выше (или других эквивалентных in vitro проб). Соединения согласно настоящему изобретению, которые могут подавлять медиаторы более чем одного типа, будут, как правило, проявлять значения IC₅₀ менее 20 мкм для медиаторов каждого испытанного типа. Например, соединение со значением IC₅₀ 1 мкм относительно выделения гистамина (IC₅₀ ^{гистамин}) и со значением IC₅₀ 1 нМ относительно синтеза лейкотриена LTC4 и/или выделения (IC₅₀ ^LTC4) характеризуется как немедленным выделением медиаторов (присущим гранулам), так и выделением медиаторов поздней фазы. В качестве другого конкретного примера можно привести соединение со значениями IC₅₀ ^{триптаза} 10 мкм, IC₅₀ ^LTC4 - 1 мкм и IC₅₀ ^IL-4 - 1 мкм, которое ингибирует мгновенное выделение медиаторов (характерное для гранул), а также выделение липидного и цитокинового медиаторов. Несмотря на то, что в вышеприведенных конкретных примерах используются IC₅₀ одного медиатора - представителя каждого класса, специалисты в данной области согласятся, что значения IC₅₀ большинства или даже всех медиаторов, составляющих один или несколько классов, могут также быть получены. Для специалистов в данной области будет очевидным количество (количества) и разновидность (разновидности) медиаторов, для которых данные о IC₅₀ должны быть установлены в случае конкретного соединения и применения.

Подобные пробы могут быть использованы для проверки ингибирования каскадов передачи сигналов, инициированных другими сигнальными рецепторами Fc, такими как FcαRI, FcγRI и/или FcγRIII с обычной модификацией. Например, способность соединений ингибировать передачу сигнала FcγRI можно проверить с помощью проб, аналогичных рассмотренным выше, за исключением того, что сигнальный каскад FcγRI активируется, например, благодаря выращиванию клеток с IgG и аллергенспецифическими IgG или антителом вместо IgE и аллергенспецифического IgE или антитела. Специалистам в данной области известны подходящие типы клеток, активирующие реагенты и реагенты для количественной оценки, необходимой для проверки ингибирования других рецепторов Fc, как, например, рецепторы Fc, входящие в состав гамма-гомодимера.

Но наиболее полезный класс соединений включает в себя соединения 2,4-пиримидиндиаминов, которые ингибируют выделение медиаторов гранул немедленного типа и медиаторов поздней фазы с примерно эквивалентными значениями IC₅₀. «Примерно эквивалентные» означает, что значения IC₅₀ для медиатора каждого типа отличаются друг от друга не более чем в 10 раз. Другой особенно полезный класс соединений включает в себя соединения 2,4-пиримидиндиаминов, которые ингибируют выделение медиаторов гранул немедленного типа и медиаторов цитокина с примерно эквивалентными значениями IC₅₀. В конкретных примерах реализации настоящего изобретения такие соединения ингибируют выделение нижеследующих медиаторов с примерно эквивалентными значениями IC₅₀: гистамина, триптазы, гексозаминидазы, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNFα и LTC4. Такие соединения особенно эффективны, помимо прочего, для улучшения или полного исключения как ранних, так и поздних ответов, связанных с атопическими реакциями или реакциями гиперчувствительности немедленного типа I.

В идеале способность ингибировать выделение медиаторов всех желательных типов будет присуща одному соединению. Однако можно сформулировать смеси соединений, обеспечивающих такой же результат. Например, первое соединение, которое ингибирует выделение гранулоспецифических медиаторов, может быть использовано в комбинации со вторым соединением, которое ингибирует выделение и/или синтез медиаторов цитокина.

В дополнение к путям дегрануляции FcεRI или FcγRI, рассмотренным выше, дегрануляция мастоцитов и/или блазофильных клеток может быть вызвана другими реагентами. Например, иономицин, представляющий собой ионофор кальция, который минует механизм передачи ранних сигналов FcεRI или FcγRI клетки, непосредственно вызывает поток кальция, который иициирует дегрануляцию. Как следует из фиг.2, активированный PLCγ инициирует пути, ведущие, помимо прочего, к мобилизации ионов кальция и последующей дегрануляции. Как показано на этом рисунке, такая мобилизация Ca²⁺ вызывается на более поздней стадии пути передачи сигнала FcεRI. Как было отмечено выше и показано на фиг.3, иономицин непосредственно вызывает мобилизацию Ca²⁺ и поток Ca²⁺, что приводит к дегрануляции. Другие ионофоры, которые вызывают дегрануляцию таким способом, включают в себя A23187. Способность ионофоров, таких как иономицин, вызывать дегрануляцию, чтобы обходить ранние стадии сигнальных каскадов FcεRI и/или FcγRI, позволяет использовать их как экран счетчика для выявления активных соединений согласно настоящему изобретению, которые особенно влияют на их активность в дегрануляции и ингибировании с помощью блокирования или подавления ранних сигнальных каскадов FcεRI или FcγRI, как было рассмотрено выше. Соединения, которые конкретно ингибируют такую раннюю дегрануляцию, опосредованную FcεRI или FcγRI-рецепторами, ингибируют не только дегрануляцию и последующее быстрое выделение гистамина, триптазы и других компонентов, содержащих гранулы, но также и пути активации провоспаления, вызывающие выделение TNFα, IL-4, IL-13 и липидных медиаторов, таких как LTC4. Таким образом, соединения, которые конкретно ингибируют такую раннюю дегрануляцию, опосредованную FcεRI или FcγRI-рецепторами, блокируют или ингибируют не только острые атопические реакции или реакции гиперчувствительности типа I, но также и поздние ответы, вовлекающие многочисленные медиаторы воспаления.

Соединения согласно настоящему изобретению, которые в наибольшей мере подавляют раннюю дегрануляцию, опосредованную FcεRI и/или FcγRI-рецепторами, представляют собой соединения, ингибирующие дегрануляцию, опосредованную FcεRI и/или FcγRI-рецепторами (имеющие, например, значения IC₅₀ менее 20 мкм относительно выделения гранулоспецифического медиатора или компонента по результатам измерения in vitro в пробе с клетками, которые стимулируются связывающим реагентом IgE или IgG), но незначительно ингибируют дегрануляцию, обусловленную ионофором. В одном из примеров реализации настоящего изобретения соединения рассматриваются как незначительно ингибирующие дегрануляцию, обусловленную ионофором, если определенная in vitro величина IC₅₀ дегрануляции, вызванной ионофором, не превышает 20 мкм. Конечно, активные соединения, которые проявляют даже более высокие значения IC₅₀ обусловленной ионофором дегрануляции или совсем не подавляют обусловленную ионофором дегрануляцию, особенно эффективны. В другом примере реализации настоящего изобретения соединения считаются незначительно ингибирующими дегрануляцию, обусловленную ионофором, если они демонстрируют более чем 10-кратное отличие величины значений IC₅₀ дегрануляции, опосредованной FcεRI и/или FcγRI и обусловленной ионофором дегрануляции, измеренной in vitro в пробе. Пробы, удобные для определения величины IC₅₀ обусловленной ионофором дегрануляции, включают в себя любую из ранее рассмотренных проб дегрануляции при условии, что клетки стимулируются или активируются ионофором кальция, таким как иономицин или А23187 (A.G. Scientific, San Diego, CA), вызывающим дегрануляцию, вместо анти-IgE-антител или аллергенспецифического IgE. Конкретные пробы для оценки способности определенного соединения 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению ингибировать обусловленную ионофором дегрануляцию, представлены в разделе «Примеры».

Специалистам в данной области будет понятно, что соединения, которые проявляют высокую степень избирательности к дегрануляции, опосредованной FcεRI, находят конкретное применение, поскольку такие соединения селективно воздействуют на каскад FcεRI и не оказывают влияния на другие механизмы дегрануляции. Подобным образом соединения, которые проявляют высокую степень селективности по отношению к дегрануляции, опосредованной FcγRI-рецепторами, находят конкретное применение, поскольку такие соединения селективно воздействуют на каскад FcγRI и не оказывают влияние на другие механизмы дегрануляции. Соединения, которые проявляют высокую степень селективности, в целом в 10 и более раз более селективны по отношению к опосредованной FcεRI- или FcγRI-рецепторами, чем к дегрануляции, обусловленной ионофором, как, например, дегрануляция, обусловленная иономицином.

Биохимические и другие данные подтверждают, что соединения 2,4-пиримидиндиамина, описанные в настоящей работе, являются эффективными ингибиторами активности Syk-киназы. Например, в экспериментах с изолированной Syk-киназой из двадцати четырех протестированных соединений 2,4-пиримидиндиамина все за исключением двух ингибировали фосфорилирование пептидного субстрата, катализируемое Syk-киназой, в субмикромолярном диапазоне значений IC₅₀. Остальные соединения ингибировали фосфорилирование в микромолярном диапазоне. Кроме того, все из шестнадцати прoтестированных in vitro проб с мастоцитами ингибировали фосфорилирование субстратов Syk-киназы (например, PLC-гамма1, LAT) и протеины в прямом направлении Syk-киназы (например, JNK, p38, Erk1/2 и PKB после их тестирования), но не протеины в обратном направлении потока Syk-киназы в каскаде (например, Lyn). Фосфорилирование Lyn-субстратов не ингибировалось с помощью протестированных соединений 2,4-пиримидиндиамина. Однако для следующих соединений наблюдалась высокая корреляция между их способностью ингибировать активность Syk-киназы в биохимических пробах (величина IC₅₀ находилась в диапазоне от 3 до 1850 нМ) и способностью ингибировать FcεRI-опосредованную дегрануляцию в мастоцитах (величина IC₅₀ находилась в диапазоне от 30 до 1650 нМ): R950373, R950368, R921302, R945371, R945370, R945369, R945365, R921304, R945144, R945140, R945071, R940358, R940353, R940352, R940351, R940350, R940347, R921303, R940338, R940323, R940290, R940277, R940276, R940275, R940269, R940255, R935393, R935372, R935366, R935310, R935309, R935307, R935304, R935302, R935293, R935237, R935198, R935196, R935194, R935193, R935191, R935190, R935138, R927050, R926968, R926956, R926931, R926891, R926839, R926834, R926816, R926813, R926791, R926782, R926780, R926757, R926753, R926745, R926715, R926508, R926505, R926502, R926501, R926500, R921218, R921147, R920410, R909268, R921219, R908712, R908702.

Соответственно, активность соединений 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению также может быть подтверждена с помощью биохимических или клеточных проб активности Syk-киназы. Исходя из фиг.2, в сигнальном каскаде FcεRI в мастоцитах и/или базофильных клетках Syk-киназа фосфорилирует LAT и PLC-гамма1, что приводит, помимо прочего, к дегрануляции. Любая из этих активностей может быть использована для подтверждения активности соединений 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению. В одном из примеров реализации настоящего изобретения эта активность подтверждается путем соединения изолированной Syk-киназы или ее активного фрагмента с соединением 2,4-пиримидиндиамина в присутствии субстрата Syk-киназы (например, синтетический пептид или протеин, если известно, что он должен быть фосфорилирован с помощью Syk в сигнальном каскаде) в результате оценки фосфорилирования субстрата Syk-киназой. В альтернативном случае проба может быть получена с помощью клеток, которые экспрессируют Syk-киназу. Клетки могут экспрессировать Syk-киназу эндогенно или они могут быть сконструированы так, чтобы экспрессировать рекомбинантную Syk-киназу. Клетки также могут дополнительно экспрессировать субстрат Syk-киназы. Клетки, пригодные для получения таких контрольных проб, также как и способы создания пригодных клеток, очевидны для специалистов в данной области. Конкретные примеры биохимических или клеточных проб, удобных для подтверждения активности соединений 2,4-пиримидиндиамина, представлены в разделе «Примеры».

В целом ингибиторы Syk-киназы будут иметь значения IC₅₀ по отношению к активности Syk-киназы, как, например, способность Syk-киназы фосфорилировать синтетическую или эндогенную подложку in vitro или в клеточной пробе порядка 20 мкM или менее. Специалисты в данной области согласятся с тем, что соединения с меньшими величинами IC₅₀, например порядка 10 мкM, 1мкM, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ или даже меньше, особенно эффективны.

6.5 Применение и композиции

Как было отмечено ранее, активные соединения согласно настоящему изобретению ингибируют сигнальные каскады рецептора Fc и, в частности, рецепторы Fc, включая гамма-гомодимер, такие как сигнальные каскады FcεRI и/или FcγRI, которые ведут, помимо прочего, к выделению и/или синтезу химических медиаторов из клеток посредством дегрануляции либо других процессов. Также уже обсуждалось, что активные соединения тоже являются эффективными ингибиторами Syk-киназы. Поэтому активные соединения согласно настоящему изобретению могут использоваться в различных in vitro, in vivo и ex vivo условиях для регуляции или ингибирования Syk-киназы, сигнальных каскадов, в которых Syk-киназа играет роль сигнальных каскадов рецепторов Fc, и биологических реакций, вызванных такими сигнальными каскадами. Например, в одном из примеров реализации настоящего изобретения соединения могут быть использованы для подавления Syk-киназы in vitro или in vivo фактически в клетке любого типа, экспрессирующей Syk-киназу. Они также могут использоваться для регуляции каскадов передачи сигнала, в которых Syk-киназа играет роль. Такие Syk-зависимые каскады передачи сигнала включают в себя в том числе каскады передачи сигналов FcεRI, FcγRI, FcγRIII, BCR и интегрина. Соединения также можно использовать in vitro или in vivo для регуляции и, в частности, подавления клеточных или биологических реакций, вызванных такими Syk-зависимыми каскадами передачи сигналов. Такие клеточные или биологические реакции включают в себя в том числе респираторные всплески, клеточную адгезию, клеточную дегрануляцию, распластывание клетки, миграцию клетки, агрегацию клетки, фагоцитоз, синтез и выделение цитокина, созревание клетки и поток ионов Ca²⁺. Существенно то, что указанные соединения можно использовать для ингибирования Syk-киназы in vivo в качестве терапевтического подхода к лечению или профилактике заболеваний, полностью или частично опосредованных активностью Syk-киназы. Некоторые примеры заболеваний, опосредованных Syk-киназой, которые можно лечить или предупреждать с помощью таких соединений, более подробно рассмотрены ниже.

В другом примере реализации настоящего изобретения активные соединения можно использовать для регуляции или ингибирования сигнальных каскадов рецептора Fc и/или FcεRI- и/или FcγRI-опосредованной дегрануляции в качестве терапевтического подхода к лечению или профилактике заболеваний, характеризуемых, вызываемых и/или связанных с выделением или синтезом химических медиаторов таких сигнальных каскадов или дегрануляции рецепторов Fc. Такое лечение может быть назначено животным в ветеринарных условиях или людям. В качестве примера болезней, которые характеризуются, вызваны им или связаны с ним таким выделением, синтезом или дегрануляцией медиатора и, следовательно, поддающихся лечению или профилактике с помощью активных соединений, включают в себя, не ограничиваясь ими, наследственную предрасположенность к аллергическим заболеваниям, анафилактическую гиперчувствительность или аллергические реакции, аллергии (например, аллергический конъюнктивит, аллергический ринит, аллергическая астма, атопический дерматит и пищевая аллергия), слабо выраженное рубцевание (например, склеродерма, повышенный фиброз, образование келоидов, постоперационные рубцы, фиброз легких, спазм сосудов, мигрень, реперфузионная травма и постинфарктный период), болезни, связанные с разрушением тканей (например, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), кардиобронхит и постинфарктный период), болезни, связанные с воспалением тканей (например, синдром раздраженной толстой кишки, спастическая толстая кишка и воспалительная болезнь кишечника, воспаление и рубцевание.

В дополнение к многочисленным упомянутым выше болезням полученные в результате клеточного анализа и испытаний на животных данные подтверждают, что соединения 2,4-пиримидинаминов, описанные в настоящем изобретении, также являются полезными при лечении и профилактике аутоиммунных заболеваний, а также различных симптомов, связанных с такими заболеваниями. Типы аутоиммунных заболеваний, лечение или профилактика которых возможны с помощью соединений 2,4-пиримидинаминов, в общей сложности включают в себя нарушения, связанные с повреждением тканей, которые возникают в результате гуморальной и/или опосредованной клеткой реакции на иммуногены или антигены эндогенной и/или экзогенной природы. Такие болезни зачастую характеризуют как заболевания, связанные с неанафилактическими реакциями гиперчувствительности (например, II, III и/или IV типа).

В соответствии с обсуждением, приведенным выше, реакции гиперчувствительности I типа в основном возникают в результате выделения фармакологически активных веществ, например гистамина, мастоцитами и/или базофилами в результате контакта со специфическим экзогенным антигеном. Как отмечено выше, такие реакции I типа играют роль в большом количестве заболеваний, которые включают в себя аллергическую астму, аллергический ринит и т.д.

Реакции гиперчувствительности II типа (также известные как цитотоксические, цитолитические, обусловленные комплементом или стимулируемые клеткой реакции гиперчувствительности) возникают при реакции иммуноглобулинов с антигенными компонентами клеток или тканей либо с антигеном или гаптеном, которые неразрывно связаны с клетками или тканями. Болезни, которые, как правило, связаны с реакциями гиперчувствительности II типа, включают в себя, не ограничиваясь ими, аутоиммунную гемолитическую анемию, врожденную анемию новорожденных и синдром Гудпасчера.

Реакции гиперчувствительности III типа (также известные как реакции гиперчувствительности, обусловленные токсичными, растворимыми либо иммунными комплексами) возникают в результате отложения в сосудах или тканях растворимых циркулирующих комплексов антиген-иммуноглобулин, которое сопровождается острыми воспалительными реакциями в местах отложения иммунных комплексов. Неограниченные примеры прототипов заболеваний, являющихся результатом реакций III типа, включают в себя реакцию Артюса, ревматоидный артрит, сывороточную болезнь, системную красную волчанку, определенные виды гломерулонефрита, рассеяный склероз и буллезный пемфигоид.

Реакции гиперчувствительности IV типа (часто именуемые как клеточные, клеточно-опосредованные, замедленные либо туберкулиновые реакции гиперчувствительности) вызваны сенсибилизированными Т-лимфоцитами, которые образуются в результате контакта со специфическим антигеном. Неограниченные примеры заболеваний, при которых вовлечены реакции IV типа, включают в себя контактный дерматит и отторжение аллотрансплантата.

Аутоиммунные заболевания, связанные с любыми из вышеперечисленных неанафилактических реакций гиперчувствительности, можно лечить или предупреждать с помощью соединений 2,4-пиримидинаминов согласно настоящему изобретению. В частности, указанные способы могут использоваться для лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний, часто характеризуемых как аутоиммунные расстройства единого органа или единого типа клеток, которые включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, тиреоидит Хасимото, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный атрофический гастрит при пернициозной анемии, аутоиммунный энцефаломиелит, аутоиммунный орхит, синдром Гудпасчера, аутоиммунную тромбоцитопению, метастатическую офтальмию, бульбоспинальный паралич, базедову болезнь, билиарный первичный цирроз печени, хронический агрессивный гепатит, язвенный колит и мембранную гломерулопатию, а также аутоиммунные заболевания, часто характеризуемые наличием системных аутоиммунных расстройств, которые включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, системную красную волчанку, ревматоидный артрит, синдром Шегрена, синдром Рейтера, полимиозит-дерматомиозит, системный склероз, нодозный полиартериит, рассеянный склероз и буллезный пемфигоид.

Специалисты в данной области согласятся, что многие из вышеперечисленных аутоиммунных заболеваний связаны с серьезными симптомами, ослабление проявления которых представляет значительный прогресс в лечении даже в случаях, когда не удается улучшить состояние основного заболевания. Многие из этих симптомов, а также стадии основного заболевания являются результатом активации сигнального каскада FcγR в моноцитах. Поскольку соединения 2,4-пиримидинаминов согласно настоящему изобретению являются потенциальными ингибиторами таких сигнальных каскадов FcγR в моноцитах и других клетках, описанные способы могут быть использованы при лечении и/или профилактике множества нежелательных симптомов, связанных с вышеперечисленными аутоиммунного заболевания.

В качестве примера, ревматоидный артрит (RA) обычно вызывает отеки, боль, потерю подвижности и повышенную чувствительность поврежденных суставов всего тела. Для RA характерно наличие хронически воспаленной синовиальной оболочки, густо населенной лимфоцитами. Мембрана синовиальной оболочки, которая обычно имеет толщину в один клеточный слой, становится насыщенной клетками и принимает форму, подобную лимфоидным тканям, включая в себя дендритные клетки, Т-, В- и NK-клетки, макрофаги и кластеры плазмацитов. Этот процесс в сочетании с изобилием иммунопатологоческих механизмов, которые включают в себя формирование антиген-иммуноглобулиновых комплексов, в конечном итоге приводит к нарушению целостности сустава, что ведет к деформации, окончательной потере функционирования и/или эрозии кости сустава или в непосредственной близости от сустава. Описанные способы могут быть использованы для лечения или облегчения состояния любого конкретного, нескольких или всех симптомов RA. Таким образом, в рамках контекста RA рассмотрены способы лечения (описанные в более общих чертах ниже), способствующие ослаблению проявления или улучшению состояния симптомов, зачастую ассоциируемых с RA, в независимости от сопутствующего успеха в лечении основного заболевания (RA) и/или снижения количества циркулирующего ревматоидного фактора (RF).

В качестве другого конкретного примера можно привести системную красную волчанку (SLE), которая зачастую связана с такими симптомами, как жар, боль в суставах (артралгия), артрит и серозит (плеврит или перикардит). В рамках контекста SLE рассмотрены способы лечения, способствующие ослаблению проявления или улучшению состояния симптомов, зачастую ассоциируемых с SLE, в независимости от сопутствующего успеха в лечении основной болезни (SLE).

В качестве еще одного конкретного примера можно привести рассеянный склероз (РС), ущерб от которого включает в себя нарушение остроты зрения пациента; развитие двойного зрения; нарушение функции подвижности, что влияет на способность ходить и действовать руками; недержание желудка и мочевого пузыря; спастичность; а также ограниченную чувствительность (на прикосновение, боль и температуру). В рамках контекста РС рассмотрены способы лечения, способствующие улучшению состояния или замедлению в развитии какого-либо конкретного или нескольких поражающих факторов, зачастую ассоциируемых с РС, в независимости от сопутствующего успеха в лечении основной болезни (РС).

При использовании для лечения или профилактики таких заболеваний активные соединения могут быть назначены отдельно в виде смесей одного или нескольких активных соединений или в виде смеси или комбинации с другими веществами, эффективными при лечении таких расстройств или заболеваний. Эти активные соединения также назначают в смеси или комбинации с веществами, которые применяются для лечения других расстройств или заболеваний, такими как стероиды, мембранные стабилизаторы, ингибиторы 5LO, ингибиторы синтеза и рецептора лейкотриена, ингибиторы переключения изотипа IgE или синтеза IgE, включения изотипа IgG или синтеза IgG, β-агонисты, ингибиторы триптазы, аспирин, ингибиторы COX, метотрексат, анти-TNF лекарства, ритуксан, ингибиторы PD4, ингибиторы p38, ингибиторы PDE4, антигистамины и др. Эти активные соединения можно назначать per se (самостоятельно) в виде пролекарств или как лекарственные препараты, образующие активное соединение или пролекарство.

Лекарственные препараты, содержащие активные соединения согласно настоящему изобретению (или их пролекарства), можно изготавливать с помощью обычного смешивания, растворения, гранулирования, дражеобразующего отмучивания, эмульгирования, капсулирования, процессов захватывания или лиофилизации. Эти композиции могут быть получены обычным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, разжижителей, наполнителей или вспомогательных веществ, которые облегчают переработку активных соединений в лекарства, которые можно использовать в фармацевтических целях.

Активное соединение или пролекарство можно получить в виде фармацевтических композиций per se или в виде гидрата, сольвата, N-оксида или фармацевтически приемлемой соли, как описано выше. Обычно такие соли более растворимы в водных растворах, чем соответствующие свободные кислоты и основания, в то время как можно сформировать соли, менее растворимые, чем соответствующие свободные кислоты и основания.

Лекарственные препараты согласно настоящему изобретению могут принимать форму, удобную фактически для любого вида применения, включая, например, наружное, глазное, внутреннее, трансбуккальное, системное, носовое, инъекционное, трансдермальное, прямокишечное, влагалищное и т.д., или форму, удобную для назначения в виде ингаляции или вдувания.

Для наружного применения активное соединение (соединения) или пролекарство (пролекарства) может быть приготовлено в виде растворов, гелей, мазей, кремов, суспензий и т.д., что хорошо известно в литературе.

Системные введения таких соединений включает те их них, которые предназначены для использования в виде инъекций, например подкожных, внутривенных, внутримышечных, интратекальных или внутрибрюшинных инъекций, а также те, которые предназначены для трансдермального введения, введения через слизистую оболочку, внутреннего или легочного назначения.

Эффективные инъекционные формы лекарственных средств включают в себя стерильные суспензии, растворы или эмульсии активного соединения (соединений) в водных или масляных растворителях. Композиции также могут содержать формирующие вещества, такие как суспендирующий агент, стабилизирующий агент и/или диспергатор. Получение лекарственных форм для инъекций можно представить в форме отдельных доз, например в ампулах или в контейнерах с мультидозами, и могут содержать добавленные консерванты.

В альтернативном варианте инъекционное лекарство можно назначать в виде порошка, в который для восстановления первоначальной консистенции перед употреблением добавляется удобный растворитель, включающий, в том числе, стерильную, не содержащуую пироген воду, буфер, раствор декстрозы и т.д. С этой целью активное соединение (соединения) можно высушить с помощью любой известной технологии, такой как лиофилизация, а перед употреблением вернуть в прежнюю форму.

Для применения через слизистую оболочку в лекарственном средстве используют смачивающие реагенты, соответствующие существующему биологическому барьеру. Такие вещества известны в литературе.

Для внутреннего применения фармацевтические композиции могут принимать форму, например, лепешек (пастилок), таблеток или капсул, полученных обычными способами с использованием фармацевтически приемлемых наполнителей, таких как связующие вещества (например, предварительно желатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазочные вещества (например, стеарат магния, тальк или кварц); дезинтегрирующие вещества (например, картофельный крахмал или гликолят крахмала натрия) или увлажняющие вещества (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки могут быть покрыты с помощью хорошо известных способов такими веществами, как, например, сахара, пленки или кишечно-растворимые покрытия. Соединения, которые особенно удобны для внутреннего применения, включают в себя соединения R940350, R935372, R935193, R927050 и R935391.

Жидкие лекарственные средства для внутреннего применения могут иметь форму, например, эликсиров, растворов, сиропов или суспензий или могут поставляться как сухой продукт, который перед употреблением растворяется в воде или в другом удобном растворителе. Такие жидкие лекарственные средства могут быть получены обычными способами с применением фармацевтически приемлемых добавок, таких как суспендирующие агенты (например, сироп сорбита, производные целлюлозы или гидрогенизированные пищевые жиры); эмульгирующие агенты (например, лецитин или акация); безводные растворители (например, миндальное масло, масляные сложные эфиры, этиловый спирт, кремофор^TM или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). При необходимости лекарственные средства также могут содержать буферные соли, консерванты, ароматизирующие, красящие и подслащивающие вещества.

Как хорошо известно, лекарственные средства для внутреннего применения могут быть для удобства приготовлены для получения контролируемого высвобождения активного соединения или пролекарства.

Для трансбуккального применения, композициям можно придавать форму таблеток или пастилок, полученных традиционным способом.

Для ректального или вагинального применения активное соединение (соединения) может быть получено в виде растворов (для удерживающих клизм), суппозиториев (свечей) или мазей, содержащих суппозиторную основу, такую как масло какао или другие глицериды.

Для интраназального введения или применения с помощью ингаляции или вдувания активное соединение (соединения) или пролекарство (пролекарства) могут удобно поставляться в виде аэрозолей для распыления из баллончиков под избыточным давлением или распылителя с использованием удобной сжатой жидкости, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, фторуглеродов, двуокиси углерода или другого пригодного газа. В случае использования аэрозолей под давлением дозировка может определяться с помощью клапана для выдачи мерного количества лекарства. Капсулы и баллончики, используемые в ингаляторе или в аппарате для вдувания (например, капсулы и баллончики, состоящие из желатина), могут быть получены так, чтобы содержать порошковую смесь лекарственного соединения и удобной порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.

Конкретный пример лекарственного средства в виде водной суспензии, удобной для интраназального введения, с использованием коммерчески доступных аэрозольных интраназальных устройств включает в себя следующие ингридиенты: активное соединение или пролекарство (0,5-20 мг/мл); бензальконийхлорид (0,1-0,2 мг/мл); эфир полиоксиэтиленовой жирной кислоты 80 (TWEEN® 80; 0,5-5 мг/мл); карбоксиметилцеллюлозу натрия или микрокристаллическую целлюллозу (1-15 мг/мл); фенилэтанол (1-4 мг/мл) и декстрозу (20-50 мг/мл). pH окончательной суспензии можно отрегулировать в диапазоне примерно от pH5 до pH7 обычно при pH 5,5.

Другой конкретный пример водной суспензии, удобной для приема соединений посредством ингаляции, и, в частности, для такого приема cоединения R921218 содержит 1-20 мг/мл соединения или пролекарства, 0,1-1% (объемных) эфира полиоксиэтиленовой жирной кислоты 80 (TWEEN®80), 50 ммоль - соль лимонной кислоты и/или 0,9% хлорида натрия.

Для глазного применения активное соединение (соединения) или пролекарство (пролекарства) может быть получено в виде раствора, эмульсии, суспензии и т.д., пригодных для глазного применения. В литературе известны многие растворители, удобные для применения с соединениями, используемыми в качестве глазного средства. Некоторые конкретные примеры описаны в патентах США №№6 261 547; 6 197 934; 6 056 950; 5 800 807; 5 776 445; 5 698 219; 5 521 222; 5 403 841; 5 077 033; 4 882 150 и 4 738 851.

Для пролонгированной доставки активное соединение (соединения) или пролекарство (пролекарства) может быть получено в виде препарата замедленного всасывания, принимаемого путем имплантационной или внутримышечной инъекции. Активный ингредиент может быть получен с использованием пригодных полимерных или гидрофобных материалов (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионнообменных смол, или труднорастворимых производных, например труднорастворимой соли. В альтернативном варианте могут быть использованы производимые трансдермальные системы доставки, такие как адгезивный диск или наклейка, которые медленно выделяют активное соединение (соединения) для подкожного поглощения. С этой целью могут использоваться стимуляторы проникновения для улучшения подкожного поглощения активного соединения (соединений). Удобные трансдермальные участки описаны, например, в патентах США № 5 407 713; 5 352 456; 5 332 213; 5 336 168; 5 290 561; 5 254 346; 5 164 189; 5 163 899; 5 088 977; 5 087 240; 5 008 110 и 4 921 475.

В альтернативном варианте могут использоваться другие системы доставки лекарственного средства. Липосомы и эмульсии являются хорошо известными примерами растворителей-переносчиков, которые можно использовать для доставки активного соединения (соединений) или пролекарства (пролекарств). Также могут быть использованы определенные органические растворители, такие как диметилсульфоксид (DMSO), хоть обычно это приводит к более высокой токсичности.

Лекарственные препараты при необходимости можно представить в виде упаковки или раздаточного устройства, которое может содержать одну или несколько дозированных форм с активным соединением (соединениями). В этой упаковке может находиться, например, металлическая или пластиковая фольга в качестве блистерной упаковки. Упаковка или раздаточное устройство может содержать инструкцию к примнению данного лекарства.

6.6 Эффективные дозировки

Активное соединение (соединения) или пролекарство (пролекарства) согласно настоящему изобретению или их смеси в основном будут использоваться в количествах, эффективных для достижения намеченных результатов, например в количестве, достаточном для лечения или профилактики конкретного заболевания. Соединение (соединения) могут назначаться терапевтически для достижения терапевтического результата или профилактически для достижения профилактического результата. Под терапевтическим результатом подразумевается устранение или уменьшение основного расстройства, по поводу которого ведется лечение, и/или устранение или ослабление одного или нескольких симптомов, связанных с основным расстройством в такой степени, чтобы пациент почуствовал улучшение самочувствия или состояния, даже если он продолжает страдать этим расстройством. Например, назначение активного соединения пациенту, страдающему от аллергии, обеспечивает терапевтический результат не только тогда, когда основная аллергическая реакция устранена или ослаблена, но и тогда, когда пациент испытывает ослабление остроты или продолжительности симптомов аллергии в результате воздействия аллергена. В качестве другого примера, терапевтический результат в случае астмы включает в себя улучшение дыхания после астматического приступа или уменьшение частоты или остроты астматических эпизодов. Терапевтический результат также включает в себя приостановку или замедление развития болезни независимо от того, произошло ли улучшение.

Для профилактического назначения соединение может быть прописано пациенту с риском развития одной из ранее описанных заболеваний. Например, если неизвестно, склонен ли пациент к аллергической реакции на конкретное лекарство, соединение может быть назначено до назначения лекарства, чтобы избежать или уменьшить аллергическую реакцию на это лекарство. В альтернативном случае профилактическое назначение можно применять, чтобы избежать появления у пациента симптомов, связанных с основным расстройством. Например, соединение может быть назначено страдающему аллергией до ожидаемого воздействия аллергеном. Соединения также могут быть профилактически назначены здоровым людям, которые неоднократно подвергаются воздействию агентов, связанных с одним из вышеописанных заболеваний, чтобы избежать появления расстройства. Например, соединение может быть назначено здоровому человеку, который неоднократно подвергается воздействию аллергена, известного своей способностью вызывать аллергии, как, например, латекс, с намерением предотвратить развитие аллергии у этого человека. В альтернативном случае соединение может быть назначено пациенту, страдающему от астмы, до начала деятельности, которая вызывает астматические приступы, чтобы уменьшить их остроту или вовсе избежать проявления астматических эпизодов.

Количество назначаемого соединения зависит от множества факторов, включая, например, конкретные показатели, способ применения, является ли лечение профилактическим или терапевтическим, остроту протекания болезни, а также возраст и вес пациента, биоаккумулирование конкретного активного соединения и т.д. Точность определения эффективной дозы с легкостью определяется специалистом.

Эффективные дозы первоначально можно оценить с помощью проб in vitro. Например, начальная доза для животных может быть сформулирована таким образом, чтобы концентрация циркулирующего в крови или сыворотке активного соединения была такой же или превышала бы величину IC₅₀ для конкретного соединения в соответствии с результатами измерения в пробе in vitro, как, например, in vitro CHMC или BMMC, а также в других пробах in vitro, описанных в разделе «Примеры». Точность расчета дозировки для достижения таких циркулирующих в крови или сыворотке концентраций с учетом биоаккумулирования конкретного соединения легко определяется опытным врачом. За дополнительной информацией читатель может обратиться к публикации: Fingl & Woodbury, “General Principles,” In: Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Раздел 1, стр. 1-46, последнее издание, Pagamonon Press, а также к ссылкам, приведенным в указанной книге.

Начальные дозы также можно оценить по данным анализа in vivo, используя, например, экспериментальные модели на животных. Экспериментальные модели на животных, используемые для тестирования действия соединений для лечения или профилактики различных вышеописанных заболеваний, хорошо известны в литературе. Полезные экспериментальные модели на животных для исследования гиперчувствительности или аллергических реакций описаны в публикациях: Foster, 1995, Allergy 50 (21 Suppl): 6-9, discussion 34-38 и Tumas et al., 2001, J. Allergy Clin. Immunol. 107(6):1025-1033. Полезные экспериментальные модели на животных для исследования аллергического ринита описаны в следующих источниках: Szelenyi et al., 2000, Arzneimittelforschung 50(11):1037-42); Kawaguchi et al., 1994, Clin. Exp. Allergy 24(3):238-244) и Sugimoto et al., 2000, Immunopharmacology 48(1):1-7. Полезные экспериментальные модели на животных для исследования аллергического конъюнктивита описаны в следующих источниках: Carreras et al., 1993, Br. J. Ophthalmol. 77(8):509-514; Saiga et al., 1992, Ophthalmic Res. 24(1):45-50; и Kunert et al., 2001, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42(11):2483-2489. Полезные экспериментальные модели на животных для исследования системного мастоцитоза описаны у O'Keefe et al., 1987, J. Vet. Intern. Med. 1(2):75-80 и Bean-Knudsen et al., 1989, Vet. Pathol. 26(1):90-92. Полезные экспериментальные модели на животных для исследования гипер-IgE-синдрома описаны у Claman et al., 1990, Clin. Immunol. Immunopathol. 56(1):46-53. Полезные экспериментальные модели на животных для исследования B-клеточной лимфомы описаны у Hough et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13853-13858 и Hakim et al., 1996, J. Immunol. 157(12):5503-5511. Полезные экспериментальные модели на животных для исследования атопических расстройств, таких как атопический дерматит, атопическая экзема и атопическая астма, описаны у Chan et al., 2001, J. Invest. Dermatol. 117(4):977-983 и Suto et al., 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 120(Suppl 1):70-75. Специалисты с обычным уровнем квалификации могут легко использовать эту информацию для определения дозировки, подходящей для назначения человеку. Дополнительные полезные экспериментальные модели на животных описаны в разделе «Примеры».

Размеры дозы обычно могут быть в диапазоне примерно от 0,0001 или 0,001 или 0,01 мг/кг/день до 100 мг/кг/день, но они могут быть больше или меньше в зависимости, помимо прочих факторов, и от активности соединения, его биоаккумуляции, способа назначения и различных факторов, описанных выше. Размер дозы и интервалы приема могут быть скорректированы индивидуально, с тем чтобы обеспечить уровни соединения (соединений) в плазме, достаточные для поддержания терапевтического или профилактического эффекта. Например, соединения могут быть назначены для приема один раз в неделю, несколько раз в неделю (например, через день), один раз в день или несколько раз в день в зависимости, помимо прочего, и от способа применения, конкретных показаний лечения и решения лечащего врача. В случаях местного введения или селективного приема, как, например, наружное применение, эффективная местная концентрация активного соединения (соединений) может не быть связана с концентрацией в плазме. Специалисты в данной области смогут оптимизировать эффективные местные дозы, не прибегая к экспериментальной проверке.

Предпочтительно, чтобы соединение (соединения) оказывало терапевтический или профилактический эффект не вызывая существенной токсичности. Токсичность соединения (соединений) можно определить, используя стандартные фармацевтические процедуры. Соотношение между токсическим и терапевтическим (или профилактическим) эффектами дозы представляет собой терапевтический показатель лекарственного средства. Предпочтение следует отдавать соединению (соединениям) с высокими терапевтическими показателями.

В дополнение к описанию изобретения ниже предлагаются следующие примеры, иллюстрирующие его действие, но не ограничивающие его применение.

7. ПРИМЕРЫ

7.1. Синтез исходных материалов и промежуточных соединений, полезных для синтезирования соединений 2,4-пиримидиндиамина в соответствии со схемами (I)-(V)

Большое число исходных материалов и N4-однозамещенных-2-пиримидинаминов и N2-однозамещенных-4-пиримидиндиаминов [продукты реакции ароматического нуклеофильного замещения (РАНЗ)], полезных для синтезирования соединений 2,4-пиримидиндиамина согласно настоящему изобретению в соответствии со схемами (I)-(V) было получено, как описано ниже (см. графическую часть описания). Условия, подходящие для синтезирования продуктов моно-SNAR, демонстрируются с помощью 2-хлор-N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-4-пиримидинамина (R926087).

7.5 Соединения 2,4-пиримидиндиаминов, представленные в изобретении, выступают ингибиторами дегрануляции, опосредованной рецепторами FcεRI.

Способность соединений 2,4-пиримидиндиаминов согласно настоящему изобретению ингибировать IgE-индуцированную дегрануляцию была продемонстрирована на примере различных клеточных анализов на культивированных мастоцитах человека (CHMC) и/или клетках, полученных из костного мозга мыши (BMMC). Ингибирование дегрануляции измеряли как при низкой, так и при высокой плотности клеточной популяции с помощью количественного анализа выделения гранулоспецифических факторов: триптазы, гистамина и гексозаминидазы. Ингибирование выделения и/или синтеза медиаторов липидов оценивали измерением выделения лейкотриена LTC4, а ингибирование выделения и/или синтеза цитокинов наблюдали с помощью количественного анализа TNF-α, IL-6 и IL-13; количественный анализ триптазы и гексозаминидазы проводили с применением флуорогенных субстратов в соответствии с описанием, приведенным в конкретных примерах. Количественный анализ гистамина, TNFα, IL-6, IL-13 и LTC4 проводили с использованием следующих коммерческих комплектов для обнаружения специфических антител или антигенов с помощью иммобилизованного на антигене или антителе фермента (ELISA):гистамин (компания-поставщик: «Immunotech», каталоговый № 2015, Beckman Coulter), TNFα (компания-поставщик: Biosource, каталоговый № KHC3011), IL-6 (компания-поставщик: Biosource, каталоговый № KMC0061), IL-13 (компания-поставщик: Biosource, каталоговый № KHC0132) и LTC4 (компания-поставщик: Cayman Chemical, каталоговый № 520211). Протоколы проведения различных анализов приводятся ниже.

7.5.1 Культивация мастоцитов и базофилов человека

Мастоциты и базофилы человека культивировали из CD34-негативных клеток-предшественников в соответствии с приведенным ниже описанием (см. также способы, изложенные в одновременно поданной заявке на патент США, серийный № 10/053,355, дата подачи 8 ноября 2001 г., описание которых включено в текст настоящего документа способом ссылки на первоисточник).

7.5.1.1 Подготовка полной питательной среды STEMPRO-34

Для подготовки полной питательной среды (CM) STEMPRO-34, 250 мл STEMPRO-34^TM бессывороточной среды (SFM) (компания-компания-поставщик: GibcoBRL, каталоговый № 10640) помещали в колбу для фильтрования. В эту же колбу добавляли 13 мл питательной добавки (NS) "STEMPRO-34 Nutrient Supplement" (компания-компания-поставщик: GibcoBRL, каталоговый № 10641) (процесс приготовления более подробно описан ниже). Сосуд из-под питательной добавки споласкивали примерно 10 мл бессывороточной среды (SFM) и добавляли в колбу для фильтрования. После добавления 5 мл L-глютамина (200 ммоль; компания-компания-поставщик: Mediatech, каталоговый № MT 25-005-CI) и 5 мл 100X пенициллина/стрептомицина (“пен-стреп”; компания-компания-поставщик: HyClone, каталоговый № SV30010), объем доводили до 500 мл за счет добавления бессывороточной среды (SFM) и фильтровали раствор.

Наибольшее количество переменных в приготовлении полной питательной среды (CM) содержит способ, с помощью которого размораживают и смешивают питательную добавку (NS) перед введением в бессывороточную среду (SFM). Размораживание питательной добавки (NS) необходимо производить на водяной бане при температуре 37° C с круговым перемешиванием без завихрения или встряхивания до полного растворения. При перемешивании необходимо следить, не осталось ли нерастворившихся липидов. Если таковые имеются и раствор неоднороден, необходимо вновь поместить добавку в водяную баню и продолжать процесс перемешивания до получения однородного раствора. Иногда этот компонент растворяется сразу, иногда - после одного-двух циклов перемешивания, а иногда и вовсе не растворяется. Если по прошествии одного-двух часов питательная добавка не переходит в форму однородного раствора, ее следует забраковать и разморозить новую. Не следует использовать питательную добавку (NS), которая имеет неоднородный вид после размораживания.

7.5.1.2 Увеличение популяции клеток CD34+

Начальную и достаточно малочисленную популяцию CD34-позитивных (или CD34+) клеток (1-5 x l0⁶ клеток) увеличивали до относительно высокой численности CD34-негативных клеток-предшественников (около 2-4 x l0⁹ клеток) с применением питательной среды и методологии, описанных ниже. Клетки CD34+ (от одного донора) были поставлены компанией "Allcells" (г.Беркли, шт. Калифорния). Ввиду определенной степени варьирования с точки зрения качества и количества клеток, обычно поставляемых этой компанией, полученные клеточные культуры помещали в коническую пробирку емкостью 15 мл и доводили до объема 10 мл в полной питательной среде перед использованием.

В день 0 был произведен подсчет жизнеспособных (рефрактильных) клеток, которые затем помещали в центрифугу и вращали при скорости 1200 об/мин с целью пеллетизации. После этого клетки повторно переводили в суспензию с плотностью 275 000 клеток/мл в полной питательной среде (CM), содержащей 200 нг/мл рекомбинантного фактора стволовых клеток человека (SCF) (компания-компания-поставщик: Peprotech, каталоговый № 300-07) и 20 нг/мл человеческого flt-3 лиганда (компания-компания-поставщик: Peprotech, каталоговый № 300-19) (“CM/SCF/flt-3 medium”). Примерно на четвертый или пятый день плотность культуры проверяли путем подсчета клеток и разбавляли культуру до плотности 275 000 клеток/мл свежей питательной средой "CM/SCF/flt-3 medium". Примерно на седьмой день культуру переносили в стерильную трубку и проводили подсчет клеток. Клетки обрабатывали на центрифуге при 1200 об/мин и повторно превращали в суспензию с плотностью 275 000 клеток/мл в свежей питательной среде "CM/SCF/flt-3 medium".

Этот цикл повторяли, начиная с дня № 0, в общей сложности от 3 до 5 раз на протяжении периода увеличения численности популяции.

При необходимости повторного перевода в состояние суспензии большого количества культур, содержащихся в нескольких колбах, содержимое всех колб объединяли в одном сосуде перед проведением подсчета клеток. Таким образом обеспечивали точность подсчета клеток, а также единый подход ко всей популяции. Перед объединением содержимого колбу проверяли под микроскопом на наличие загрязнений с целью предотвращения возможного загрязнения всей популяции.

Между 17-м и 24-м днем возможно ухудшение состояния культуры (т.e. гибнет от 5 до 10% от общего количества клеток) и рост популяции замедляется. В этот период наблюдение за клетками ведется ежедневно, поскольку всего лишь за сутки культура может полностью погибнуть. После начала ухудшения ее состояния клетки подсчитывают, обрабатывают на центрифуге при 850 об/мин на протяжении 15 мин и повторно превращают в суспензию с плотностью 350 000 клеток/мл в полной питательной среде CM/SCF/flt-3 medium с тем, чтобы получить еще одно или два деления культуры. За клетками ведут ежедневное наблюдение с тем, чтобы не допустить гибели культуры.

Когда процент гибели клеток культуры клеток-предшественников превышает 15% и в культуре отмечается присутствие некоторого количества продуктов разложения, CD34-негативные клетки-предшественники готовы к дифференциации.

7.5.1.3 Дифференциация CD34-негативных клеток-предшественников в мастоциты слизистых

Вторая фаза выполняется для преобразования выращенных CD34-негативных клеток-предшественников в дифференцированные мастоциты слизистых. Эти слизистые культивированные мастоциты человека получают из клеток CD34+, изолированных из пуповинной крови и обработанных для получения обширной популяции CD34-отрицательных клеток-предшественников, как описывается выше. Для получения CD43-отрицательных клеток-предшественников цикл повторного перевода в состояние суспензии культуры был идентичен вышеприведенному за исключением того, что культуру высевали с плотностью 425 000 клеток/мл и на четвертый или пятый день добавляли около 15% дополнительной питательной среды без подсчета клеток. Кроме того, цитокинный состав среды изменяли таким образом, что она содержала фактор стволовых клеток (200 нг/мл) и человеческий рекомбинант IL-6 (200 нг/мл; компания-компания-поставщик: Peprotech, каталоговый № 200-06), восстановленный до 100 мкм/мл в стерильной уксусной кислоте (10 ммоль) (“среда CM/SCF/IL-6”).

Фазы I и II по продолжительности занимают около 5 недель. Гибель клеток и наличие продуктов разложения в культуре видны на протяжении с первой по третью неделю; кроме того, со второй по пятую неделю существует период, в течение которого некоторая часть культуры уже находится не в суспензии, а прикрепляется к поверхности сосуда, в котором выращивается культура.

Как и во время I фазы, при необходимости повторного суспендирования культуры, на седьмой день каждого цикла содержимое всех колб объединяли в одном сосуде перед подсчетом клеток для обеспечения единообразия всей популяции. Каждую колбу предварительно проверяли под микроскопом с целью выявления загрязнений и недопущения загрязнения всей популяции.

При объединении содержимого колб примерно 75% от объема колбы переливали в общий сосуд, оставляя при этом в колбе около 10 мл. Затем по колбе с оставшейся жидкостью резко постукивали в поперечном направлении с тем, чтобы высвободить прикрепившиеся к поверхности клетки. Повторное постукивание производили под прямым углом к первому с тем, чтобы окончательно сдвинуть с места клетки.

Перед переливом оставшейся жидкости в сосуд для подсчета колбу наклоняли под углом 45 градусов на несколько минут. Перед высеванием в объеме 35-50 мл на колбу (при плотности 425 000 клеток/мл) клетки обрабатывали на центрифуге при 950 об/мин на протяжении 15 мин.

7.5.1.4 Дифференциация CD34-отрицательных клеток-предшественников в мастоциты соединительной ткани

Увеличенную популяцию CD34-отрицательных клеток-предшественников подготовили по вышеизложенной методике и обработали для формирования триптазо/химазоположительного фенотипа (соединительной ткани). При этом пользовались способами, аналогичными изложенным выше для мастоцитов слизистых оболочек, за исключением добавления IL-4 вместо IL-6 в питательную среду культуры. Полученные клетки типичны для мастоцитов соединительной ткани.

7.5.1.5 Дифференциация CD34-отрицательных клеток-предшественников в базофилы

Размноженную популяцию CD34-отрицательных клеток-предшественников готовили по методике, описанной выше в разделе 7.5.1.3, и использовали для формирования увеличенной популяции базофилов. CD34-отрицательные клетки обработали по способу, аналогичному изложенному выше для мастоцитов слизистых оболочек, за исключением добавления IL-3 (20-50 нг/мл) вместо IL-6 в питательную среду культуры.

7.5.2 Активация CHMC (культивированные мастоциты человека) с помощью IgE при низкой плотности клеток:анализ триптазы и LTC4

В два 96-луночных круглодонных планшета (модель Costar 3799) следует добавить 65 мкл растворов приготовленных соединений либо контрольных проб, приготовленных в MT [137 ммоль NaCl, 2,7 ммоль KCl, 1,8 ммоль CaCl_2, 1,0 ммоль MgCl₂, 5,6 ммоль глюкозы, 20 ммоль N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты (pH 7,4), 0,1% альбумина бычьей сыворотки, (Sigma A4503)] с содержанием 2% MeOH и 1% DMSO. Затем следует процесс пеллетизации клеток CHMC на центрифуге (980 об/мин, 10 мин) и повторного перевода в суспензию в предварительно подогретой среде MT. Далее, следует влить 65 мкл клеток в каждый 96-луночный круглодонный планшет. В зависимости от активности дегрануляции каждого из индивидуальных доноров CHMC поместите 1 000-1 500 клеток в каждую лунку. Перемешайте четыре раза с последующей инкубацией на протяжении 1 часа при температуре 37ºC. За час, необходимый для инкубации, приготовьте раствор 6X анти-IgE [анти-человеческий иммуноглобулин кролика IgE (1 мг/мл, компания-поставщик: Bethyl Laboratories, каталоговый № A80-109A), разбавленный в пропорции 1:167 в буферном растворе MT]. Стимулируйте клетки добавлением 25 мкл раствора 6X анти-IgE к соответствующим планшетам. К контрольным пробиркам, не подлежащим стимуляции, добавьте 25 мкл MT. После добавления антииммуноглобулина Е перемешайте дважды. Инкубируйте при 37ºC на протяжении 30 минут. Во время 30-минутной инкубации разведите раствор 20 ммоль бульона с субстратом триптазы [(Z-Ala-Lys-Arg-AMC^.2TFA; Enzyme Systems Products, №AMC-246)] 1:2000 в буферном растворе для количественного анализа триптазы [0,1 M N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты (pH 7,5), 10 % м/об. глицерола, 10 мкмоль гепарина (Sigma H-4898) 0,01% NaN₃]. Обработайте планшеты на центрифуге при 1 000 об/мин на протяжении 10 мин для пеллетизации клеток. Перенесите 25 мкл супернатанта в 96-луночный чернодонный планшет и добавьте 100 мкл свежеразведенного раствора субстрата триптазы в каждую лунку. Инкубируйте 30 минут при комнатной температуре. С помощью спектрофотометра для прочтения планшетов определите оптическую плотность планшетов при 355нм/460нм.

Количественный анализ лейкотриена C4 (LTC4) также проводится с помощью комплектов ELISA на должным образом разбавленных образцах супернатанта (определяется эмпирическим путем для популяции клеток каждого из доноров с тем, чтобы измерения проб оказывались в пределах стандартной кривой) в соответствии с инструкциями производителя.

7.5.3 Активация CHMC с помощью IgE при высокой плотности клеток: анализы на дегрануляцию (триптаза, гистамин), лейкотриен (LTC4) и цитокин (TNFальфа, IL-13)

Культивированные мастоциты человека (CHMC) сенсибилизируют на протяжении 5 дней с помощью IL-4 (20 нг/мл), фактора стволовых клеток (200 нг/мл), IL-6 (200 нг/мл) и IgE человека CP 1035K (компания-компания-поставщик: Cortx Biochem, 100-500 нг/мл в зависимости от поколения) в кондиционированной среде. После сенсибилизации клетки подсчитывают, обрабатывают на центрифуге (1000 об/мин, 5-10 минут) и повторно превращают в суспензию с плотностью 1-2 x10⁶ клеток/мл в буферном растворе MT. Добавьте 100 мкл суспензии клеток в каждую лунку и 100 мкл растворов приготовленных композиций. Окончательная концентрация среды - 0,5% DMSO. Инкубируйте при 37ºC (5% CO₂) на протяжении 1 часа. После часа обработки реагентами стимулируйте клетки 6X анти-IgE. Перемешайте пробирки с клетками и оставьте планшеты для инкубации при 37ºC (5% CO₂) на один час. После инкубации на протяжении часа обработайте клетки на центрифуге (10 минут, 1000 об/мин) и отберите 200 мкл супернатанта из каждой пробирки, при этом действуйте осторожно, чтобы не задеть осадок. Поместите планшету с супернатантом на лед. При выполнении пункта, требующего 7 часов (см. ниже), определите активность триптазы супернатанта, разведенного 1:500, повторно суспендируйте клетки в 240 мкл кондеционированной среды, содержащей 0,5% DMSO и соответствующую концентрацию соединения. Инкубируйте клетки CHMC на протяжении 7 часов при 37°C (5% CO₂). После инкубации центрифугируйте клетки 1 000 об/мин, 10 минут), отберите 225 мкл из каждой пробирки и храните при температуре -80ºC до готовности к проведению ELISA-анализов. ELISA проводится на надлежащим образом разведенных пробах (определяется эмпирическим путем для популяции клеток каждого из доноров с тем, чтобы измерения проб оказывались в пределах стандартной кривой) в соответствии с инструкциями производителя.

7.5.4 Активация BMMC (клетки костного мозга мыши) с помощью IgE при высокой плотности клеток: анализы на дегрануляцию (гексосиминидаза, гистамин), лейкотриен (LTC4) и цитокин (TNFальфа, IL-6)

7.5.4.1 Приготовление среды, кондиционированной с помощью WEHI

Среду, кондиционированную с помощью WEHI, получали путем выращивания мышиных миеломоноцитарных клеток WEHI-3B (Коллекция американских типовых культур, г. Роквилль, шт. Мериленд) в модифицированной по способу Искова среде Eagles (компания-компания-поставщик: Mediatech, г. Гернандон, шт. Вирджиния) с добавлением 10% бычьей эмбриональной сыворотки, инактивированной тепловой обработкой (производства фирмы JRH Biosciences, г. Канзас-сити, шт. Миссури), 50 мкмоль 2-меркаптоэтанола (компания-компания-поставщик: Sigma, г. Сент-Льюис, шт. Миссури) и 100 IU/мл пенициллин-стрептомицина (компания-компания-поставщик: Mediatech) в инкубаторе при 37ºC с увлажненной газовой смесью 5% CO₂/95% воздуха. Первоначальную суспензию клеток высевали примерно с плотностью 200 000 клеток/мл, а затем делили 1:4 каждые 3-4 дня на протяжении двух недель. Бесклеточные супернатанты собирали, аликвотировали и хранили при температуре -80ºC до возникновения потребности в них.

7.5.4.2 Приготовление среды BMMC

Среда BMMC состоит из 20% среды, кондиционированной с помощью WEHI, 10% бычьей эмбриональной сыворотки, инактивированной тепловой обработкой (компания-поставщик: JHR Biosciences), 25 ммоль N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты, pH 7,4 (компания-поставщик: Sigma), 2 ммоль L-глютамина (компания-поставщик: Mediatech), 0,1 ммоль заменимых аминокислот (компания-компания-поставщик: Mediatech), 1 ммоль пирувата натрия (компания-компания-поставщик:Mediatech), 50 мкмоль 2-меркаптоэтанола (компания-компания-поставщик:Sigma) и 100 IU/мл пенициллин-стрептомицина (компания-компания-поставщик:Mediatech) в среде RPMI 1640 (компания-компания-поставщик: Mediatech). Для приготовления среды BMMC все компоненты объединяют в стерильном сосуде для фильтрации IL и пропускают через фильтр 0,2 мкм перед использованием.

7.5.4.3 Протокол

Мастоциты, полученные из клеток костного мозга (BMMC), сенсибилизируют на протяжении около половины суток мышиным фактором стволовых клеток (20 нг/мл) и моноклональным анти-ДНК-белковым комплексом (10 нг/мл, Clone SPE-7, компания-компания-поставщик: Sigma, каталоговый № D-8406) в среде BMMC при плотности клеток 666 × 10³ клеток/мл. После сенсибилизации клетки подсчитывают, обрабатывают на центрифуге (1 000 об/мин, 5-10 минут) и повторно превращают в суспензию с плотностью 1-3 × 10⁶ клеток/мл в буферном растворе MT-буфера. Добавьте 100 мкл суспензии клеток к каждой лунке и 100 мкл растворов соединения. Окончательная концентрация наполнителя - 0,5% DMSO. Инкубируйте при 37ºC (5% CO₂) на протяжении 1 часа. После 1 часа обработки составом стимулируйте клетки стимулом 6X (60 нг/мл ДНК-белковый комплекс-альбумин бычьей сыворотки). Перемешайте лунки с клетками и инкубируйте планшеты при температуре 37ºC (5% CO₂) на протяжении одного часа. После одного часа инкубации центрифугируйте клетки (10 минут, 1 000 об/мин), отберите 200 мкл супернатанта из каждой пробирки; при этом действуйте осторожно, чтобы не задеть осадок, и переместите в чистую пробирку 96-луночного планшета. Поместите планшет с супернатантом на лед. Во время 4-5 часой (см. ниже) процедуры выполните анализ гексосимидазы. Повторно приготовьте суспензию клеток в 240 мкл питательной среды, кондиционерной WEI и содержащей 0,5% DMSO и соответствующую концентрацию соединения. Инкубируйте клетки BMMC на протяжении 4-5 часов при температуре 37°C (5% CO₂). После инкубации обработайте клетки на центрифуге (1 000 об/мин, 10 минут), отберите 225 мкл из каждой пробирки и поместите на хранение при температуре - 80ºC до готовности к проведению ELISA. ELISA проводится на надлежащим образом разведенных пробах (определяется эмпирическим путем для популяции клеток каждого из доноров с тем, чтобы измерения проб оказывались в пределах стандартной кривой) в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ гексозаминидазы: Влейте в каждую лунку черного 96-луночного планшета для анализа 50 мкл субстрата гексозаминидазы (4-метилумбеллиферил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид; 2 ммоль). Добавьте 50 мкл супернатанта клеток BMMC (см. выше) к субстрату гексозаминидазы, выдержите при 37ºC на протяжении 30 минут и анализируйте планшет через 5, 10, 15, и 30 минут на спектрофотометре.

7.5.5 Активация базофилов с помощью IgE или аллергена домового клеща: анализ выделения гистамина

Анализ активации базофилов проводили с использованием цельной периферической крови человека, полученной от доноров, страдающих аллергией на домовых клещей; большую часть красных кровяных телец крови удаляли осаждением декстраном. Периферическую кровь человека смешивали в пропорции 1:1 с 3% декстраном T500 и проводили осаждение эритроцитов на протяжении 20-25 мин. Верхнюю фракцию разбавляли тремя объемами физиологического раствора, забуференного фосфатом Дульбекко, после чего клетки обрабатывали на центрифуге на протяжении 10 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Супернатант удаляли аспиратором и промывали клетки равным объемом MT-буфера. Наконец, клетки повторно переводили в состояние суспензии в MT-буфере, содержащем 0,5% DMSO в первоначальном объеме крови. 80 мкл клеток смешивали с 20 мкл соединения в присутствии 0,5% DMSO в трех экземплярах в глубокодонном 96-луночном планшете для культивации культур тканей. Ряд дозировок концентратов 8 соединений подвергли тестированию, в результате которого получили 10-точечную кривую реакции на дозировку, включая максимальную (стимулированную) и минимальную (нестимулированную) реакцию. Инкубацию клеток проводили после добавления соединений на протяжении 1 часа при температуре 37ºC с 5% CO₂, после чего добавляли 20 мкл 6x стимулятора [1 мкг/мл анти-IgE (компания-компания-поставщик: Bethyl Laboratories) 667 au/мл домового клеща (компания-компания-поставщик: Antigen Laboratories)]. Клетки стимулировали на протяжении 30 минут при 37ºC, 5% CO₂, планшет обрабатывали на центрифуге 10 мин при 1 500 об/мин при комнатной температуре и собрали 80 мкл супернатанта для анализа на содержание гистамина, для которого воспользовались комплектом ELISA для гистамина (компания-компания-поставщик: Immunotech). ELISA проводили в соответствии с инструкциией компании-поставщика.

7.5.6 Результаты

Результаты анализа популяций CHMC низкой плотности (Раздел 7.5.2), популяций CHMC высокой плотности (Раздел 7.5.4) и анализа базофилов (Раздел 7.5.5) приведены в Таблице 1, результаты анализа популяций CHMC высокой плотности (Раздел 7.5.3) приведены в Таблице 2. Все величины в таблицах 1 и 2 выражены в IC₅₀ (в мкмоль). Показатель “9999” соответствует IC₅₀> 10 мкмоль при отсутствии измеримой активности при концентрации 10 мкмоль. Большая часть проанализированных соединений имела значения IC₅₀ менее 10 мкмоль и у многих величина IC₅₀ наблюдались в субмикромолярном диапазоне.

7.6 Соединения 2,4-пиримидиндиаминов ингибируют дегрануляцию, опосредованную FcγRI-рецепторами

Способность соединений 2,4-пиримидиндиамина, описанных в настоящем изобретении, подавлять FcγRI-опосредованную дегрануляцию была продемонстрирована на примере композиций R921218, R921302, R921303, R940347, R920410, R927050, R940350, R935372, R920323, R926971 и R940352 при анализах, аналогичных описанным в разделе 7.5, за исключением того, что клетки не были предварительно обработаны иммуноглобулином IgЕ и были активированы фрагментом Fab кроличьего античеловеческого иммуноглобулина IgG (компания-компания-поставщик: Bethyl Laboratories, каталоговый № A80-105).

Все проанализированные соединения имели значения IC₅₀, находящиеся в субмикромолярном диапазоне.

7.7 Избирательное ингибирование соединениями 2,4-пиримидиндиамина, представленными в изобретении, обратного каскада реакций с участием IgE-рецептора

Для подтверждения того, что многие соединения 2,4-пиримидиндиаминов, представленные в изобретении, проявляют свою ингибиторную способность за счет блокирования или ингибирования каскада передачи начальных сигналов IgE-рецепторов, некоторые из соединений проверяли способом клеточного анализа на дегрануляцию, индуцированную иономицином, как изложено ниже.

7.7.1 Активация CHMC низкой плотности иономицином, анализ триптазы

Анализ дегрануляции мастоцитов, индуцированной иономицином, проводили аналогично анализу активации CHMC низкой плотности IgE (Раздел 7.5.2, выше) за исключением того, что за время инкубации на протяжении 1 часа готовили раствор 6X иономицина [5 ммоль иономицина (Signma I-0634) в MeOH (базовый раствор), разбавленный в пропорции 1:416,7 в MT-буфере (окончательная концентрация 2 мкмоль)] и стимулировали клетки добавлением 25 мкл раствора 6X иономицина в соответствующие планшеты.

7.7.2 Активация базофилов иономицином: анализ выделения гистамина

Анализы на предмет вызванной иономицином дегрануляции базофилов проводили аналогично способу, описанному для анализа активации базофилов иммуноглобулином IgE или аллергеном домового клеща (Раздел 7.5.5, выше), за исключением того, что после инкубации с соединением клетки стимулировали 20 мкл раствора иономицина с концентрацией 2 мкмоль.

7.7.3 Результаты

Результаты анализов на дегрануляцию, индуцированную иономицином, представленные в виде показателей IC₅₀ (в мкмоль), приведены в Таблице 1. Подавляющее большинство проанализированных активных соединений (т.е. ингибирующих дегрануляцию, индуцированную иммуноглобулином E), не ингибирует дегрануляцию, индуцированную иономицином, что подтверждает избирательное ингибирование данными активными соединениями каскада передачи ранних (или обратных) сигналов IgE-рецепторов.

Эти результаты были подтверждены для определенных соединений путем измерения потоков ионов кальция в CHMC, вызванных антииммуноглобулином IgЕ и иономицином. При тестировании потоков Ca²⁺ было установлено, что соединения R921218 (10 мкмоль) и R902420 (10 мкмоль) ингибируют поток Ca²⁺, вызванный антииммуноглобулином IgЕ, но при этом не оказывают воздействия на поток Ca²⁺, вызванный иономицином (см. Фиг.4).

7.8 Немедленное проявление эффекта ингибирования, производимого соединениями 2,4-пиримидиндиаминов согласно настоящему изобретению

Для проверки незамедлительности эффекта ингибирования некоторые 2,4-пиримидиндиамины, представленные в изобретении, добавляли в вышеописанные составы для анализа активности клеток одновременно с активатором анти-IgE-антител. Все проанализированные соединения блокировали индуцированную IgE-дегрануляцию CHMC в той же степени, какая наблюдалась при предварительной инкубации соединений CHMC на протяжении 10 или 30 мин до перекрестного связывания рецепторов.

7.9 Кинетика фармакологической активности in vitro

Соединения R921218, R921302, R921219, R926240, R940277, R926742, R926495, R909243 и R926782 были проанализированы в экспериментах с промывкой. В ходе экспериментов клетки CHMC либо немедленно активировали антителом к анти-IgE в присутствии 1,25 мкмоля соединения (нулевой момент времени), либо вымывали соединение с последующей активацией антителом к анти-IgE через 30, 60 или 120 мин. Активность ингибирования упомянутых составов резко падала через 30 мин после удаления соединения, что указывает на необходимость постоянного воздействия этих соединений на мастоциты для максимального подавления дегрануляции. Испытания других составов дали схожие результаты.

7.10 Токсичность: T- и B-клетки

Способность представленных в изобретении соединений проявлять ингибиторную активность при отсутствии токсичности для клеток иммунной системы была продемонстрирована в процессе клеточных анализов с B- и T-клетками. Протоколы проведения анализов приводятся ниже.

7.10.1 Токсичность в отношении клетки "Jurkat" (T-клетка)

Клетки Jurkat разводили до концентрации 2x10-⁵ клеток/мл в полной среде RPMI (10% фетальной бычьей сыворотки, инактивированной термообработкой) и инкубировали при 37°C в присутствии 5% CO₂ на протяжении 18 часов. Затем 65 мкл клеток с плотностью 7,7 x 10⁵ клеток/мл добавляли в 96-луночный планшет с глубокодонными лунками (обработанный TC (тканевой культурой), компания-поставщик: Costar), в котором содержалось 65 мкл соединения 2X (окончательная концентрация носителя: 0,5% DMSO, 1,5% MeOH). Смесь перемешивали и инкубировали на протяжении 18-24 часов при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Токсичность оценивали проточным цитометрическим анализом светорассеяния клеток.

7.10.2 Токсичность в отношении клетки "BJAB" (B-клетка)

Линию B-клеток "BJAB" культивировали в лог-фазе в RPMI1640 + 10% фетальной бычьей сыворотки, инактивированной термообработкой, 1x L-глутамина, 1x пенициллина, 1x стрептавидина и 1x бета-меркаптоэтанола при 37°C, 5% CO₂. Сначала клетки BJAB собирали, центрифугировали и повторно суспендировали в питательной среде с концентрацией 7,7×10⁵ клеток/мл. 65 мкл клеток перемешивали с 65 мкл соединения в двух повторах в присутствии 0,1% DMSO в 96-луночном планшете с глубокодонными лунками. Клетки инкубировали с соединением при различных концентрациях при 37°C в атмосфере 5% CO_2. Токсичность оценивали проточным цитометрическим анализом светорассеяния клеток.

7.10.3 Токсичность: анализ титра клетки Glo

50 мкл клеток (1×10⁶/мл) помещали в каждую лунку, содержащую 50 мкл соединения. Окончательная концентрация носителя - 0,5% DMSO, 1,5% MeOH. Планшеты встряхивали в течение одной минуты для перемешивания клеток и соединения. Планшеты затем инкубировали при 37°C (5% CO₂) на протяжении 18 часов. На следующий день отбирали 50 мкл клеток из каждой лунки и вливали в 50 мкл реагента титра клетки Glo (компания-поставщик: фирма Invitrogen). Планшеты встряхивали в течение одной минуты, после чего считывали люминометром.

7.10.4 Результаты

Результаты анализов на токсичность в отношении T- и B-клеток, представленные в виде показателей IC₅₀ (в мкмоль), приведены в Таблице 2. За несколькими исключениями (см. Таблицу 1) все проанализированные соединения не проявили токсичность в отношении T- и B-клеток при эффективной для ингибирования концентрации. Анализы, выполненные на эмбриональных B-клетках, дали аналогичные результаты.

7.11 Переносимость соединений 2,4-пиримидина животными

Способность соединений, представленных в изобретении, проявлять ингибиторную активность при дозах ниже токсичных для животных, продемонстрировали на примере соединений R921218, R921219 и R921302.

7.11.1 Соединение R921218

Соединение R921218 исследовали в рамках широкомасштабной программы неклинических исследований по безопасности, показавших, что данное соединение хорошо переносят как грызуны, так и иные животные. Краткий итог токсикологических/неклинических исследований по безопасности соединения R921218: этот химикат не вызывает токсичности, требующей ограничения дозы, ни при интраназальном применении на животных, не являющихся грызунами (кроликов и приматов), ни при оральном применении на грызунах (мыши и крысы) в ходе 14-дневных токсикологических исследований с многократным введением доз, во много раз превышающих предполагаемые эффективные дозы, достаточные для человека. Отрицательного воздействия на основные показатели функций сердечно-сосудистой, респираторной и (или) центральной нервной системы, изучаемых для определения фармакологической безопасности, не обнаружено. При генетических токсикологических анализах не найдено признаков ни мутагенного, ни кластогенного потенциала; не обнаружено и неблагоприятных последствий после воздействия на глаза и кожу. Приводится краткое описание основных токсикологических исследований.

14-дневное токсикологическое исследование с многократным введением доз внутриназально проводилось на обезьянах Cynomolgus с дозировками 2,1, 4,5 или 6,3 мг/кг/день. Параметры включали в себя клинические наблюдения, массу тела, потребляемую пищу, офтальмологические показатели, кровяное давление, электрокардиографию, гематологические показатели, клинические биохимические показатели, анализ мочи, иммунотоксикологическую оценку, общую аутопсию, массу органов, токсикокинетические оценки и гистопатологию (в т.ч. носовой полости). Ни по одному из параметров исследования не было выявлено отрицательных эффектов, связанных с применением R921218, и доза, при которой отсутствуют наблюдаемые отрицательные проявления, была установлена на уровне 6,3 мг/кг/день.

14-дневное токсикологическое исследование с многократным введением доз внутриназально проводилось на кроликах породы "Белая Новозеландская" с дозировками 1,7, 3,4 или 5,0 мг/кг/день. Элементы наблюдения включали в себя клинические наблюдения, массу тела, потребляемую пищу, офтальмологические показатели, гематологические показатели, клинические биохимические показатели, общую аутопсию, массу органов, токсикокинетические оценки и гистопатологию (в т.ч. носовой полости). Ни по одному из параметров исследования не было выявлено отрицательных эффектов, связанных с применением R921218, и доза, при которой отсутствовали наблюдаемые отрицательные проявления, была установлена на уровне 5,0 мг/кг/день.

7.11.2 Соединение R921219

В экспериментальных исследованиях по определению дозировки однократная пероральная доза 600 мг/кг была принята как доза, при которой отсутствуют наблюдаемые эффекты, тогда как многократные (на протяжении 7 дней) дозы в размере 200 мг/кг/день и выше не переносятся.

Анализ in vitro Salmonella-Escherichia coli/обратной мутации микросом млекопитающих (тест Эймса) показал положительный результат R921219 в линии-анализаторе TA1537 как с метаболической активацией, так и без нее, что подтверждает результаты проведенного ранее исследования. Отрицательного воздействия R921219 ни на одну из остальных четырех линий-анализаторов не выявлено. Установлено, что у R921219 отсутствует кластогенный потенциал при исследовании in vitro хромосомных аберраций.

7.11.3 Соединение R921302

Проведено несколько экспериментальных токсикологических исследований на грызунах неапробированным лабораторным способом. Для мышей выявлена переносимость пероральной дозы до 1 000 мг/кг на протяжении до 7 дней. Проведено 14-дневное токсикологическое исследование на мышах с применением пероральных доз 100, 300 и 1 000 мг/кг. Доза 1 000 мг/кг не переносилась, а доза 300 мг/кг приводила к появлению гистопатологических изменений вульвы. Дозу 100 мг/кг сочли дозой отсутствия наблюдаемых отрицательных проявлений в исследовании. Проведено 28-дневное токсикологическое исследование с применением пероральных доз 100 мг/кг один раз в день, 100 мг/кг два раза в день, 300 мг/кг один раз в день и 300 мг/кг два раза в день. Непереносимость R921302 появилась при дозировках 300 мг/кг один раз в день и два раза в день. Более низкие дозы (100 мг/кг в день или два раза в день) переносились хорошо (результаты клинических и гистопатологических анализов еще не известны). Исследование на крысах с применением пероральных доз 50, 150 и 300 мг/кг на протяжении 32 дней показало хорошую переносимость (результаты клинических и гистопатологических анализов еще не известны).

Анализ in vitro Salmonella-Escherichia coli/обратной мутации микросом млекопитающих (тест Эймса) показал положительный результат R921302 в линии-анализаторе TA98 с S9 и TA1537 как с метаболической активацией, так и без нее. Отрицательного воздействия R921302 ни на одну из остальных трех линий-анализаторов не выявлено. При исследовании in vitro хромосомных аберраций установлено, что у R921302 отсутствует кластогенный потенциал.

7.12 Биодоступность соединений 2,4-пиримидиндиаминов при пероральном применении

Более 50 соединений 2,4-пиримидиндиаминов, представленных в настоящем изобретении, было проанализировано на предмет пероральной биодоступности. В ходе исследования препараты растворяли в различных растворителях (например, раствор PEG 400 и суспензия карбоксиметилцеллюлозы) для внутривенного и перорального введения крысам. После введения препарата отбирали и исследовали образцы плазмы. Концентрацию соединений в плазме определяли способами высокоэффективной жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии (ЖХ/МС/МС). Фармакокинетические анализы проводили на основе данных о концентрации в плазме. Представляющие интерес фармакокинетические параметры включали в себя следующие: клиренс (CL), объем распределения при гомеостазе (Vss), терминальный период полувыведения (t _½) и пероральная биодоступность (%F).

Фармакокинетические исследования указывают на то, что многие соединения 2,4-пиримидиндиамина доступны перорально, при этом %F доходит примерно до 50% (в диапазоне 0-50%). Период полувыведения варьировался от 30 минут до 3 часов. В частности, соединения R940350, R935372, R935193, R927050 и R935391 показали хорошие результаты по пероральной биодоступности и периоду полувыведения при исследованиях на крысах. Таким образом, исследования подтверждают: эти препараты 2,4-пиримидиндиамина пригодны для перорального применения.

7.13 Эффективность соединений при лечении аллергии

Эффективность соединений R926109, R921218, R921219, R921302, R926495, R926508, R926742, R926745 и R945150 in vivo при лечении аллергических явлений оценивали на мышиной модели пассивной кожной анафилаксии (PCA). Эта модель обеспечивает прямое измерение дегрануляции мастоцитов тканей, вызванной IgE. В этой модели животные, сенсибилизированные к IgE, подвергаются воздействию аллергена, и изменение проницаемости кожной сосудистой сети в результате выделения гистамина тучными клетками измеряется по изменению количества проникновения красителя в окружающие ткани. Подавление выброса медиатора соединениями, модулирующими дегрануляцию мастоцитов, легко измеряется путем извлечения красителя из ткани.

7.13.1 Протокол и результаты исследования

При анализе пассивной кожной анафилаксии мышей пассивно сенсибилизируют внутридермальной инъекцией антидинитрофенола (DNP) IgE-антителами (день минус 1). В заранее определенный момент времени животные получают исследуемое вещество (День 0). Модулирующее воздействие препарата на дегрануляцию кожных мастоцитов измеряется после внутривенного введения ДНФ, сопряженного с человеческим сывороточным альбумином (HSA - DNP), вместе с голубым красителем Эванса. Возникающее в результате перекрестное связывание рецептора IgE и последующее повышение сосудистой проницаемости, вызванное дегрануляцией мастоцитов, определяется измерением объема транссудации красителя в прилегающие ткани. Краситель извлекают из ткани формамидом и считывают коэффициент поглощения экстракта при 620 нм. Ингибиторный эффект лечения препаратом выражается как процент ингибирования по сравнению с лечением нейтральным средством, т.е. как процент понижения A_620.

В качестве положительных контролей исследовали два препарата: антагонист гистамина дифенгидрамин и антагонист серотонина ципрогептадин. Оба медиатора (гистамин и серотонин) освобождаются из мастоцитов мыши после IgE-опосредованной дегрануляции. Оба контрольных препарата ингибируют реакцию пассивной кожной анафилаксии; в последующих экспериментах обычно использовали ципрогептадин. Ципрогептадин с воспроизводимым результатом ингибировал реакцию пассивной кожной анафилаксии на 61% +/- 4% (8 мг/кг, внутрибрюшинный, 30 минут - время премедикации, n=23 эксперимента).

7.13.1.1 Результаты

Зависимое от дозы ингибирование FcεR-опосредованой сосудистой проницаемости наблюдалось с увеличением дозы R921218, R926109, R921219 и RR921302. Эти препараты применяли либо в виде раствора (67% PEG/33% цитратный буфер), либо как водную суспензию (1,5% Avicel). Результаты показывают выраженную зависимость между уровнем содержания препарата в плазме, эффективностью in vivo и активность in vitro. Наиболее сильнодействующий препарат R921219 показывал активность при уровне воздействия на кровеносную систему около 10 мкг/мл (68% ингибирование при применении дозы 100 мг/кг) по сравнению с R921302, относительно менее активной молекулой, снижавшей транссудацию плазмы на 42% при применении дозы в 100 мг/кг. Более того, продолжительность воздействия препарата сказалась на продолжительности ингибиторной активности. R921302, который сочли наиболее метаболически стабильным препаратом в ходе фармакокинетических исследований, ингибировал сосудистую проницаемость на протяжении 1-2 часов, предшествующих возникновению сигналов рецептора, вызванных антигеном, после чего эффективность начала понижаться. Все эти данные приведены в таблице 3 и таблице 4.

ТАБЛИЦА 3 Эффективность R921218, R926109, R921219 и R921302 в анализе пассивной кожной анафилаксии
Препарат	Способ приме-нения	Наполнитель	Время премедикации (мин)	Доза (мг/кг)	% Ингиби-рования	Содерж. в плазме (мкг/мл)
R921218	Перор.	67%PEG/33% цитратный буфер	10	50	7	3
				100	11	4
200	50	18
R926109	Перор.	67%PEG/33% цитратный буфер	15	50	22	Н/О
				100	32
200	48
R921219	Перор.	1,5% Авицел/вода	15	30	25	0,4
				100	68	4
300	92	11
R921302	Перор.	1,5% Авицел/вода	60	50	35	25
				100	42	38
				150	56	64
200	93	105
ТАБЛИЦА 4 Продолжительность действия R921219 и R921302 в анализе пассивной кожной анафилаксии
Препарат	Способ приме-нения	Наполнитель	Доза (мг/кг)	Время премедикации (мин)	% Ингиби-рования	Содерж. в плазме (мкг/мл)
RR921302	Перор.	1,5% Авицел/вода	200	30	89	88
				60	83	53
				120	82	61
240	37	8

Схожая активность in vivo наблюдалась у препаратов R926495, R926508, R926742, R926745 и R926150, которые обладали способностью к ингибированию реакции пассивной кожной анафилаксии при пероральном применении в формуле на основе PEG (данные не приводятся).

7.14 Эффективность соединений для лечения астмы

Эффективность соединений R921218, R921302, R926495, R926508, R926742 и R921219 для лечения астмы продемонстрировали на модели аллергической астмы овец. В течение нескольких минут после воздействия вдыхаемого антигена (Ascaris suum) у овец развивается бронхостеноз, при этом максимальная обструкция дыхательных путей наблюдается во время начальной аллергической реакции. Скорее всего, эту начальную фазу обструкции дыхательных путей вызывает освобожение предварительно сформированных медиаторов мастоцитов. Помимо начальной аллергической реакции модель овец позволила нам оценить эффект от воздействия наших препаратов на позднюю астматическую реакцию и неспецифическую гиперчувствительность дыхательных путей, которая развивается в результате локального или местного воздействия аллергена на дыхательные пути. У овец неспецифическая гиперчувствительность дыхательных путей развивается в течение нескольких часов после воздействия антигена и может длиться до двух недель. Изложенные ниже результаты демонстрируют потенциал проанализированных соединений по ингибированию каскада событий, которые могут развиваться в результате освобождения цитокинов из мастоцитов.

7.14.1 Протокол исследования

В модели аллергической астмы овец животных подвергают воздействию испытываемого в аэрозольной форме через эндотрахеальную трубку с последующим воздействием аэрозольного антигена, полученного из круглого червя Ascaris suum, на которого у овец имеется естественная аллергия. Стимуляция аллергеном приводит к прямому бронхостенозу (как начальной аллергической реакции, так и поздней астматической реакции) и устойчивой неспецифической гиперчувствительности дыхательных путей. Эти три характеристики схожи с симптомами, проявляющимися у людей, страдающих аллергической астмой. Активность испытываемого препарата определяют по изменению сопротивления легкого (R_L), которое рассчитывают по измеренному чрезлегочному давлению, потоку воздуха и дыхательному объему. Контрольные данные за предшествующие периоды, полученные от тех же овец после лечения физиологическим раствором, по сравнению с воздействием аллергена показывают резкое повышение R_L во время начальной аллергической реакции, которое длится около 2-3 часов после раздражения аллергеном. Поздняя астматическая реакция дает менее значительное повышение R_L, возникающее около 5-6 часов спустя после воздействия аллергена и исчезающее в течение 8 часов после воздействия. Двадцать четыре часа спустя после воздействия измеряют реакцию на дозу карбахола для измерения неспецифической гиперчувствительности дыхательных путей. Это выражают как дозу карбахола, необходимую для повышения R_L на 400% по сравнению с базовой величиной. (Это измерение называют провокационной концентрацией карбахола, необходимой для повышения R_L на 400% по сравнению с базовой величиной (PC₄₀₀). Данные сравнивают с контрольными данными за предшествующие периоды для того же испытуемого при введении контрольного аэрозоля и воздействии Ascaris suum.

7.14.2 Результат

Все проанализированные препараты показали эффект ингибирования поздней астматической реакции и устойчивой неспецифической гиперчувствительности, а некоторые из этих препаратов ингибировали и начальную аллергическую реакцию. Оптимальные результаты по каждому из препаратов, полученные в результате ряда исследований для оценки активности в случае разной продолжительности премедикации и различных составов растворов и суспензий, приведены в Таблице 5 (см. в графической части описания). Эффективность воздействия R921218 на начальную аллергическую реакцию зависит от состава, при этом наибольший эффект наблюдали при дозировке 30 мг/овца, введение способом аэрозоля раствора в 10% этаноле. R926495, R926742, R926508 и R921219, примененные на четырех различных овцах с дозировкой 45 мг/овца в водной суспензии за 60 минут до воздействия аллергена, показали блокирование поздней астматической реакции и неспецифической гиперчувствительности дыхательных путей. В дополнение к этим поздним проявлениям начальная аллергическая реакция тоже была значительно снижена лечением препаратами R921219, R926508 или R926495. Эффективность препарата RR921302 исследовали с применением наполнителя 45%PEG400/55% цитратного буфера. При таких условиях R921302, введенный в дозе 30 мг/овца за 60 минут до воздействия, блокировал астматическую реакцию и неспецифическую гиперчувствительность дыхательных путей, но начальная аллергическая реакция осталась без изменений.

Эти данные четко продемонстрировали, что упомянутые препараты обладают способностью блокировать астматическую реакцию у овец, имеющих аллергию. Наблюдалось значительное ингибирование всеми препаратами неспецифической гиперчувствительности дыхательных путей и поздней астматической реакции по сравнению с контрольными данными за предшествующие периоды. Начальную аллергическую реакцию в значительной мере ингибировали R921219, R926508 и R926495 (54%, 21% и 33% соответственно). В отличие от них R921218, R921302 и R926742 не ингибировали начальную аллергическую реакцию при использовании препаратов в виде водной суспензии.

7.15 Эффективность препаратов при лечении астмы

Эффективность препаратов R921304 и R921219 при лечении астмы продемонстрировали также на модели аллергической астмы мышей.

7.15.1 Протокол исследования

Мышей сенсибилизируют к овальбумину (куриному белку) в присутствии адъюванта (квасцов) внутрибрюшинным способом в день 0 и день 7. Через неделю мышам внутриназально вводят овальбумин - в дни 14, 15 и 16 (более строгая модель) или в день 14 (менее строгая модель). Такие сенсибилизация и режим воздействия приводят к гиперчувствительности дыхательных путей и воспалительному процессу в легких, а это - две доминантные характеристики аллергической астмы человека. В мышиной модели реакцию дыхательных путей in vivo измеряют общим плетизмографом, который определяет PENH (enhanced Pause, Buxco Electronics). PENH - безразмерный показатель, состоящий из максимальной скорости вдоха, максимальной скорости выдоха, времени вдоха, времени выдоха, времени релаксации и считающийся подтвержденным параметром чувствительности дыхательных путей. Реакцию на воздействие аллергена (OVA) сравнивают с животными, на которых воздействовали чистым физиологическим раствором. Через двадцать четыре часа после воздействия мышам вводят повышающиеся дозы метахолина (агонист мускариновых рецепторов), что вызывает сокращения гладкомышечной ткани. У мышей, подвергнутых воздействию овальбумина, наблюдается значительная гиперчувствительность дыхательных путей к метахолину по сравнению с мышами, получавшими физиологический раствор. Кроме того, в дыхательных путях мышей, подвергнутых воздействию овальбумина, обнаружен клеточный инфильтрат в отличие от мышей, которым вводили физиологический раствор. Инфильтрат состоит в основном из эозинофилов, но присутствует также и некоторое количество нейтрофилов и мононуклеарных клеток.

Использование этой модели для оценки мелкомолекулярных ингибиторов дегрануляции мастоцитов было обосновано несколькими способами. Во-первых, на мышах с дефицитом мастоцитов (W/W^v) было показано, что вызыванные овальбумином реакции зависят от присутствия мастоцитов. У мышей с дефицитом мастоцитов сенсибилизация и воздействие овальбумином не привели к гиперчувствительности дыхательных путей и выделению эозинофилов. Во-вторых, стабилизатором мастоцитов, кромолином, оказалось возможным блокировать вызванные овальбумином гиперчувствительность и воспаление дыхательных путей (данные не приводятся). Применение этой модели для оценки препаратов для лечения астматических реакций, которые могут опосредоваться иными механизмами, помимо стабилизации мастоцитов, обосновывается также ингибирующим эффектом применения стероидов, дексаметазона и будесонида при бронхостенозе, вызванном метахолином.

7.15.2 Результаты

Эффективность R921304 оценивали при интрананазальном применении в течение 10 дней подряд, с 7 по 16 день, при дозировке 20 мг/кг, при этом последние три дозы вводились за 30 минут перед воздействием либо физраствором, либо овальбумином. R921304 успешно ингибировал вызванную овальбумином гиперчувствительность дыхательных путей к метахолину по сравнению с мышами, получавшими только наполнитель.

В рамках менее строгого протокола, при котором овальбумин вводили мышам однократно, в день 14, R921219, введенный подкожно в дозировке 70 мг/кг в 67%PEG400 /33% цитратного буфера за 30 минут до воздействия овальбумином или физраствором, доказал, что R921219 полностью блокирует гиперчувствительность дыхательных путей и клеточную инфильтрацию, вызываемые овальбумином.

Эти результаты ясно демонстрируют эффективность препаратов R921219 и R921304 в ингибировании реакции дыхательных путей в мышиной модели аллергической астмы.

7.16 Ингибирующее воздействие соединений 2,4-пиримидиндиамина на фосфорилирование белков в прямом направлении от Syk-киназы в активированных мастоцитах

Ингибирующее воздействие соединений 2,4-пиримидиндиамина на фосфорилирование белков в прямом направлении от Syk-киназы исследовали с помощью препаратов R921218, R218219 и R921304 в BMMC, активированных IgE- рецепторами.

Для проведения анализа клетки BMMC инкубировали в присутствии различных концентраций исследуемого препарата (0,08 мкмоль, 0,4 мкмоль, 2 мкмоль и 10 мкмоль) на протяжении 1 часа при температуре 37°C. Затем клетки стимулировали анти-IgE антителом изложенным выше способом. Через 10 минут клетки лизировали и клеточные белки выделили электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS PAGE). После электрофореза фосфорилизацию белков, показанных на фиг. 7, 10 и 11A-D, определяли иммуноблотом. Антитела были приобретены в компании "Cell Signaling Technology", г. Беверли, шт. Массачусеттс.

Указанные на фиг.7, 10 и 11A-D исследуемые препараты ингибировали фосфорилизацию белков в прямом, но не в обратном направлении от Syk-киназы, в сигнальном каскаде IgE-рецепторов, что подтверждает как ингибирование препаратами обратной дегрануляции, вызванной IgE, так и реализацию ингибиторной активности препаратов путем ингибирования Syk-киназы.

7.17 Ингибирование Syk-киназы соединениями 2,4-пиримидиндиамина в процессе биохимических анализов

Несколько соединений 2,4-пиримидиндиамина проанализировали для выявления способности ингибировать катализируемую Syk-киназой фосфорилизацию субстрата пептида способом биохимического анализа флюоресцированной поляризации с изолированной Syk-киназой. В данном эксперименте соединения разбавили до 1% DMSO в буфере киназы (20 ммоль N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты, pH 7,4, 5 ммоль MgCl₂, 2 ммоль MnCl₂, 1 ммоль дитиотреитола, 0,1 мг/мл ацетилированного бычьего гамма-глобулина). Препарат в 1% DMSO (0,2% DMSO - окончательно) перемешали с аденозинтрифосфат/субстратным раствором при комнатной температуре. Syk-киназу (Upstate, Lake Placid NY) добавили к окончательному объему реакции, 20 мкл, и инкубировали реакцию на протяжении 30 минут при комнатной температуре. Окончательные условия ферментной реакции: 20 ммоль N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты, pH 7,4, 5 ммоль MgCl₂, 2 ммоль MnCl₂, 1 ммоль дитиотреитола, 0,1 мг/мл ацетилированного бычьего гамма-глобулина, 0,125 нг Syk-киназы, 4 мкммоль аденозинтрифосфата, 2,5 мкмоль пептидного субстрата (биотин-EQEDEPEGDYEEVLE-CONH₂, компания-поставщик: SynPep Corporation). EDTA (10 ммоль - конечная концентрация)/антифосфотирозинное антитело (1X - оконечный)/флюоресцентную метку фосфопептида (0,5X - конечный) добавили в буферный раствор фосфопептида для прекращения реакции и получения общего объема 40 мкл в соответствии с инструкцией изготовителя (фирма PanVera Corporation). Планшет инкубировали на протяжении 30 минут в темноте при комнатной температуре. Планшеты считывали на аппарате флюоресцентной поляризации для планшетов "Полярион" (Polarion) фирмы Tecan. Данные пересчитали в соотвтетствии с количеством имеющегося фосфопептида по калибровочной кривой, полученной конкуренцией с конкурентом фосфопептида, предоставленным в комплекте для анализа тирозинкиназы (зеленый) (компания-поставщик: PanVera Corporation),

Результаты анализа приведены в Таблице 6 (см. в графической части описания).

Эти данные показывают, что все исследованные препараты за исключением R945142 и R909236 ингибируют фосфорилизацию Syk-киназы IC₅₀s в субмикромолярном диапазоне. Все исследованные препараты ингибируют фосфорилизацию Syk-киназы IC₅₀s в микромолярном диапазоне

7.18 Эффективность соединений при лечении аутоимунитета

Оценка эффективности in vivo отдельных соединений 2,4-пиридиндиаминов по отношению к аутоиммунным болезням была получена на примере реверсивной пассивной реакции Артюса, которая является моделью тяжелого повреждения ткани, опосредованной парой антиген-антитело, а также на примере нескольких моделей болезней, связанных с аутоиммунитетом и воспалением. Эти модели аналогичны в том плане, что антитело к определенному антигену опосредует воспалительное заболевание, вызванное иммунным комплексом (ИК), и связанное с ним разрушение ткани. Отложение ИК в определенных анатомических участках (центральная нервная система (ЦНС) в случае экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE) и синовиальная мембрана в случае индуцированного коллагеном артрита (CIA)) ведет к активации клеток, экспрессирующих поверхностные рецепторы FcγR и FcεR, преимущественно мастоциты, макрофаги и нейтрофилы, что приводит к выделению цитокина и хемотаксису нейтрофилов. Активация воспалительной реакции несет ответственность за реакцию нервных окончаний в прямом направлении по потоку, включая отек, кровоизлияние, инфильтрацию нейтрофилов, а также выделение провоспалительных медиаторов. В случае аутоиммунных расстройств последствия этих событий, спровоцированных IC, трудно установить; однако многие исследователи показали, что ингибирование сигнальных путей FcγR-рецепторов в этих животных моделях привели к существенному ослаблению развития болезни и тяжести ее протекания.

7.18.1 Эффективность соединений при реакции Артюса у мышей

In vivo эффективность соединений R921302, R926891, R940323, R940347 и R921303, с точки зрения ингибирования воспалительных каскадов, спровоцированных IC, была продемонстрирована на примере реверсивной пассивной реакции Артюса у мышей (RPA).

7.18.1.1 Модель

Острая воспалительная травма ткани, опосредованная иммунным комплексом (ИК), является частью множества различных аутоиммунных болезней человека, включая васкулитный синдром, сывороточную болезнь, системную красную волчанку (SLE), ревматоидный артрит, синдром Гудпасчера и гломерулонефрит. Классической экспериментальной моделью повреждения ткани, опосредованного IC, является реверсивная пассивная реакция Артюса. Модель этой реакции представляет собой удобный in vivo способ изучения локализованного воспаления, спровоцированного иммунными комплексами, при отсутствии системных эффектов. Подкожная инъекция антител (AТ), специфических для альбумина куриного яйца, (антиOVA иммуноглобулин IgG кролика), с последующей внутривенной инъекцией (IV) антигенов (AГ), а именно альбумина куриного яйца (яичный альбумин, OVA), обуславливает околососудистое отложение иммунных комплексов и немедленную воспалительную реакцию, характеризуемую отеком, инфильтрацией нейтрофилов и кровоизлиянием в местах инъекции. Некоторые аспекты модели RPA реакции на мышах сходны с воспалительной реакцией пациентов, страдающих ревматоидным артритом, SLE и гломерулонефритом.

7.18.1.2 Протокол исследования

В данной модели исследуемые соединения вводятся в определенные моменты времени перед введением антител и антигенов. Раствор антиOVA иммуноглобулина IgG кролика (50 мкг в 25 мкл/мышь) вводится подкожно, после чего следует внутривенная инъекция альбумина, полученного из куриного яйца ( 20 мг/кг веса), в растворе, содержащем 1% голубого красителя Эванса. Степень отечности и кровоизлияния измеряются в коже спины мышей C57BL/6 с использованием голубого красителя Эванса в качестве индикатора локального повреждения ткани. В качестве контрольного вещества использовали очищенный поликлональный иммуноглобулин кролика IgG.

Промежуток времени между введением исследуемых соединений и комплекса антитело/антиген зависит от фармакокинетических (ФК) свойств каждого индивидуального соединения. Четыре часа спустя после индуцирования реакции Артюса мышей усыпляли и брали пробу тканей с целью оценки отека. Такая модель позволяет оперативно проследить in vivo активность большинства ингибиторов.

7.18.1.3 Результаты

Все испытанные соединения были введены пероральным способом.

Препарат R921302 при введении в количестве 50 мг/кг, 100 мг/кг и 200 мг/кг за 60 минут до введения антитела/антигена при испытании на мышах C57Bl6, показал зависимость ингибирования образования отека от введенной дозы (49,9 %, 93,2 % и 99,1 % соответственно). Более того, препарат R921302 показал не только профилактическое ингибирование отека, но также и терапевтическую эффективность, состоящую в 77,5% ингибировании отечности при введении соединения 30 минут спустя после иммунизации при дозе 100 мг/кг.

Соединения R940323 и R926891 показали эффективное ингибирование развития отека на 32,4% и 54,9% соответственно при введении в количестве 200 мг/кг за 60 минут до воздействия антителом/антигеном. Эти соединения значительно менее биологически доступны при введении оральным способом, и системные уровни воздействия примерно в 50 раз меньше по сравнению с соединением R921302 (данные не приводятся). Соединение R940347 ингибировало отек на 89% при введении в количестве 100 мг/кг за 2 часа до воздействия антителом/антигеном.

Соединение R921303 показало 100%, 100% и 3,6%-ное ингибирование образования отека при дозе в 200 мг/кг при приеме за 30, 60 и 120 минут соответственно. Это соединение также продемонстрировало зависимость процента ингибирования (65,4%, 81,2% и 100%) от доз приема, которые составляли 50 мг/кг, 100 мг/кг и 200 мг/кг соответственно. Результаты испытаний различных соединений представлены в Таблице 7 (см. в графической части описания).

7.18.2 Эффективность соединений при моделировании на мышах артрита, индуцированного антителами к коллагену

In vivo эффективность соединения R921302 по отношению к аутоиммунным болезням была продемонстрирована на модели артрита, индуцированного антителами к коллагену (CAIA) у мышей.

7.18.2.1 Модель

Индуцированный коллагеном артрит (CIA) у грызунов часто используется в качестве одной из экспериментальных моделей в случае повреждения ткани, опосредованного иммунным комплексом (ИК). Введение коллагена II типа мышам или крысам приводит к возникновению иммунной реакции, которая характеризуется наличием воспалительного поражения хрящей и костей периферических суставов, которое сопровождается опухолью окружающих тканей. CIA часто используется для оценки эффективности соединений, которые могут потенциально использоваться в качестве лекарств для лечения ревматоидного артрита и других хронических воспалительных состояний.

На протяжении последних лет возникла новая технология моделирования CIA, основанная на использовании антител к антитипу II коллагена с целью индуцирования CIA, опосредованного антителами. Преимущества этого способа заключаются в следующем: короткий промежуток времени, требуемый для индуцирования болезни (болезнь развивается в течение 24-48 часов после внутривенной (IV) инъекции антител); артрит может быть индуцирован как у CIA- восприимчивых, так и CIA устойчивых пород мышей; и в добавок, процедура является идеальной для быстрой проверки работоспособности противовоспалительных терапевтических препаратов.

Смесь моноклональных антител Arthrogen-CIA® (компания-поставщик: Chemicon International Inc.), которая индуцирует артрит, вводят внутривенно мышам линии Balb/c (2мг/мышь) в день 0. Сорок восемь часов спустя вводят внутрибрюшную инъекцию 100 мкл LPS^* (25мкг). На четвертый день может наблюдаться припухлость коготков. На пятый день одна или обе лапки (особенно задние) начинают краснеть и опухать. На шестой день и в течение последующих 1 - 2 недель краснота и припухлость лапок будет сохраняться. В процессе исследования ведут учет клинических характеристик воспаления с целью оценки интенсивности отека лапок. Степень тяжести протекания артрита регистрируют в виде суммы баллов, характеризующих состояние обеих задних лапок каждого животного (максимально возможное количество баллов - 8). Степень воспаленности поврежденных лапок оценивают путем замера диаметра лапок. Также ведут учет изменений массы тела.

Лечение животных начинается с момента индуцирования артрита, начиная с нулевого дня. Экспериментальные и контрольные соединения вводят один или два раза в день перорально (ПO) в зависимости от ранее установленных фармако-кинитических свойств.

По завершении исследования (1-2 недели после индуцирования артрита) мышей усыпляют, отсекают лапки в месте дистальной большой берцовой кости с помощью гильотинных ножниц и взвешивают. Среднюю ± стандартную ошибку (СО) усредненной характеристики для каждой группы определяют каждый день на основании клинических показателей каждого индивидуального животного, а также по окончании исследования подсчитывают и регистрируют вес задних лапок для каждой экспериментальной группы. Также получают гистопаталогическую оценку лапок.

7.18.2.2 Результаты

Введение соединения R921302 в значительной мере подавляло развитие артрита и тяжесть протекания болезни (p<0,005), о чем свидетельствуют изменения средних дневных величин клинических показателей артрита (Фиг.12). Средние дневные величины клинических показателей артрита в группе, проходящей лечение, за период со дня 4 по день 14 оказались на 71-92 % ниже по сравнению с контрольной группой. На основании веса лапок степень их воспаленности у животных, которым вводили препарат R921302, оказался меньше по сравнению с животными контрольной группы (Фиг.13). На завершающем этапе исследования степень воспаленности оценивали на основании веса лапок и установили 99,9% уменьшение в группе, в которой животным вводили препарат R921302, по сравнению со средним весом лапок животных контрольной группы (p<0,002).

В результате гистопатологической экспертизы отсеченных лапок был установлен факт выраженного синовита, характерного для CIA. В то время как у животных, которым вводили солевой раствор или наполнитель, отмечалось наличие выраженных повреждений, в группе животных, получавших инъекции R921302, степень тяжести повреждения была меньше. Наблюдалось утолщение суставов с выраженной пролиферацией синовиальной оболочки. Также наблюдалось увеличение фибробластов с плотной инфильтрацией нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и клеток плазмы. Наблюдалась сосудистая пролиферация с закупоркой, кровоизлиянием и отеком. Отмечалось образование паннуса в суставной щели, а также разрушение хрящей. В группе животных, где проводилось лечение, состояние суставов было близко к норме или с ограниченным воспалением, но без распространения на хрящи.

Таблица 8 Средние гистопаталогические показатели в группе (0-15 баллов)
Способ лечения	Усредненные общие показатели ± Средне-квадратичное отклонение
Солевой раствор	9,8 ± 2,1
Наполнитель	9,3 ± 4,5
R921302 (100 мг/кг), два раза в день	5,1 ± 1,9
Никаких препаратов	0,0 ± 0,0

Клинические показатели артрита и отек лапок оказались в среднем на 20% меньше в группе животных, которым вводили R050 дважды в день в количестве 100 мг/кг, по сравнению с животными контрольной группы, не получавшими лечение (использовался наполнитель, p=0,1). Отек лапок был ингибирован примерно на 26% по сравнению с животными контрольной группы (где использовался наполнитель), что было установлено в результате измерений толщины задних лапок (p=0,1). R050 не оказывал воздействия на артрит при уровне дозы 30 мг/кг.

Препарат R070, являющийся солью R050, который вводили в количестве 50 или 100 мг/кг два раза в день, ингибировал клиническую болезнь в среднем на 39,75 % (p<0,0002) или 35,28% (p<0,0004) соответственно по сравнению с используемым контрольным веществом (наполнителем). Толщина лапок была сокращена примерно на 50%.

Препарат R429, являющийся солью R363, который вводили два раза в день в количестве 50 или 100 мг/кг, показал в среднем 23,81 % (p<0,05) или 20,82 % (p=0,05) ингибирование клинических показателей артрита соответственно по сравнению с животными контрольной группы, которым вводили контрольное вещество (наполнитель). Как и в предыдущем случае, наблюдалось уменьшение толщины лапок.

Препарат R347 не оказал заметного воздействия на показатели артрита при уровнях доз, использованных при испытаниях (30 и 100 мг/кг два раза в день).

7.18.3 Эффективность соединений при лечении индуцированного коллагеном артрита у крыс

In vivo эффективность соединения R921302 по отношению к аутоиммунным болезням была продемонстрирована на модели индуцированного коллагеном артрита (CIA) у крыс.

7.18.3.1 Описание модели

Ревматоидный артрит (RA) характеризуется хроническим воспалением суставов, которое в конечном итоге ведет к необратимому разрушению хрящей. Синовиальные ткани пациентов, страдающих RA, содержат большое количество ИК с иммуноглобулином IgG. Несмотря на продолжающиеся дебаты по поводу роли этих комплексов в этиологии и патологии этой болезни, коммуникация ИК с гематопоэтическими клетками осуществляется с помощью FcγR-рецепторов.

CIA является широко признанной животной моделью RA, результатом которого является хронический воспалительный синовит, характеризуемый образованием паннуса и деградацией суставов. В этой модели подкожное введение нативного коллагена II типа, эмульгированного с неполным адъювантом Фрейнда, приводит к развитию воспалительного артрита в течение 10 или 11 дней и последующему разрушению суставов в промежутке от 3 до 4 недель.

7.18.3.2 Протокол исследования

В день 0 группу изогенных крыс линии LOU иммунизировали нативным коллагеном II типа и проводили оценку эффективности препарата R921302 в режиме профилактики и в режиме лечения. Согласно протоколу профилактики каждый наполнитель либо различные дозы препарата R921302 вводили перорально, начиная со дня иммунизации (день 0). Согласно протоколу лечения лечение препаратом R921302 (300 мг/кг перорально) начинали после развития клинических признаков артрита на десятый день и продолжали до конца исследования (день 28), когда животное усыпляли. Согласно каждому из протоколов клинические показатели снимали на ежедневной основе и замеры массы тела производили два раза в неделю. На двадцать восьмой день получали данные рентгеновского исследования и измеряли уровни содержания антител к коллагену II типа в сыворотке с помощью анализа ELISA^*.

7.18.3.3 Результаты

По истечении 10 дней после иммунизации у крыс развивался клинический CIA, о чем можно судить по возрастанию артритных показателей (Фиг.14). У крыс, которым вводили только наполнитель, средняя величина артритных показателей постепенно возрастала после десятого дня и достигала 6,75 ± 0,57 к двадцать восьмому дню. У животных, которым вводили высокую дозу препарата R921302 (300 мг/кг/день) со дня иммунизации (день 0), на протяжении периода с 10-го по 28-й день эти показатели были значительно меньше (p<0,01) по сравнению с показателями контрольной группы. У крыс, которым вводили 300 мг/кг препарата R921302 с момента начала развития заболевания, наблюдали значительно более низкий уровень показателей артрита, начиная с 16-го дня, и это различие сохранялось до конца эксперимента на 28-й день. Показатели рентгенографического анализа (шкала 0-6), полученные на 28-й день CIA, составили 4,8±0,056 в контрольной группе по сравнению с 2,5±0,016, 2,4±0,006, и 0,13±0,000001 у животных, которым вводили препарат в количестве 75, 150 и 300 мг/кг/день один раз в день соответственно в режиме профилактики, и 0,45±0,031 у животных, которым вводили 300 мг/кг/день препарата один раз в день с момента начала развития болезни. Лечение дозой R921302 в количестве 300 мг/кг/день с целью профилактики (при иммунизации) либо после начала развития болезни позволило предотвратить эрозию и уменьшить опухоль мягких тканей. В аналогичном порядке лечение препаратом R921302 привело к значительному уменьшению антител к антиколлагену II в сыворотке (данные не приводятся).

7.18.4 Эффективность соединений при лечении экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей

In vivo эффективность соединения R921302 по отношению к аутоиммунной болезни была продемонстрирована на модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE) у мышей.

7.18.4.1 Описание модели

EAE является полезной моделью для изучения рассеянного склероза (MS), который представляет аутоиммунное заболевание ЦНС, обусловленное инфильтрацией белого вещества ЦНС имунными клетками. Воспаление и последующее разрушение миелина ведет к прогрессивному параличу. Подобно заболеванию у людей, EAE связан с периферийной активацией T-клеток, являющихся аутореактивными по отношению к протеинам миелина, как, например, базовый протеин миелина (MBP), протеолипидный протеин (PLP) либо олигодендроцитный протеин миелина (MOG). Активированные нейроантигенспецифические Т-клетки пересекают гемоэнцефалический барьер и ведут к фокальной мононуклеатической клеточной инфильтрации и демиелинизации. EAE может быть индуцирован в предрасположенных породах мышей путем иммунизации миелинспецифическими протеинами в сочетании с адъювантом. В модели на мышах линии SJL, использованной в настоящих исследованиях, паралич задних конечностей и хвоста наступает к 10-му дню после иммунизации, в то время как пик болезни приходится на период с 10-го по 14-й день, и циклы частичной самопроизвольной ремиссии с последующими рецидивами могут наблюдаться вплоть до 35-го дня. Приведенные ниже результаты демонстрируют потенциальную способность исследуемого препарата (R921302) подавлять остроту заболевания и предотвращать возобновление симптомов болезни, что может быть результатом FcγR-опосредованного выделения цитокина иммунными клетками.

7.18.4.2 Протокол исследования

Согласно модели EAE с использованием мышей линии SJL каждую мышь сенсибилизировали препаратом PLP/CFA (для индуцирования EAE в четырех местах задней боковой части мыши вводили 0,2 мл эмульсии, состоящей из 150 мкг соединения PLP139-151 в сочетании с 200 мкг CFA в 0,05 мл гомогената). В соответствии с протоколом супрессии контрольный наполнитель или различные дозы R921302 применялись перорально, начиная со дня иммунизации (день 0). В соответствии с протоколом лечения в момент начала развития болезни животных разделяли на группы, имеющие сходные усредненные клинические показатели на момент начала развития болезни, и перорально вводили контрольный наполнитель либо различные дозы исследуемых препаратов с различной частотой. При обоих протоколах клинические показатели проверяли на ежедневной основе и дважды в неделю измеряли массу тела.

7.18.4.3 Результаты

По истечении 10 дней с момента иммунизации PLP у мышей линии SJL развивался клинический EAE, о чем свидетельствовало увеличение их средних клинических показателей (Фиг.15). Паралитические показатели у животных, которым вводили только контрольный наполнитель со дня иммунизации (день 0), постепенно росли и к 14-му дню достигли пика, который составил 5,1+0,3. В период пика болезни (день 14) усредненные клинические показатели у животных, которым вводили 100 мг/кг ежедневно либо 100 мг/кг два раза в день, были значительно меньше (p<0,05, 4,3+1,3 и 4,3+1,4 соответственно). По истечении 16-го дня у всех животных наблюдалась частичная ремиссия средней степени тяжести, что характерно для SJL-модели. Заметно пониженные клинические показатели у животных, которым препарат R921302 вводился два раза в день по 100 мг/кг, сохранялись (p<0,05) на протяжении всего эксперимента до момента усыпления животных на 30-й день. Эти пониженные показатели на протяжении всего периода лечения нашли отражение в существенном уменьшении кумулятивного индекса болезни (КИБ) и увеличении кумулятивного индекса веса (КИВ), как показано в Таблице 9 (см. в графической части описания). В группе животных, которым вводили только контрольный наполнитель, 2/5 мышей испытали рецидив. В группе, получавшей 100 мг/кг/день, 3/8 мышей испытали рецидив. В группе, получавшей 100 мг/кг/день два раза в день, рецидивов не наблюдалось.

Мыши линии SJL, получавшие лечение препаратом R921302 в начале болезни (день 11) при дозе 200 мг/кг два раза в день, показали существенное уменьшение (p=0,003) уровня КИБ (53,5±16,9 у животных, получавших препарат R921302, по сравнению с 72,9±8,9 у животных, получавших только наполнитель). Более того, наблюдалось резкое уменьшение числа рецидивов у животных, получавших R921302 (2/12), по сравнению в числом рецидивов у животных, получавших наполнитель (7/11). Обобщенные результаты приведены в Таблице 10 (см. в графической части описания) и на Фиг.16.

7.18.5 Способность соединений 2,4-пиридиндиаминов согласно настоящему изобретению ингибировать активацию T-клеток

7.18.5.1 Описание

Способность соединения 2,4-пиридиндиаминов согласно настоящему изобретению ингибировать активацию T-клеток была показана с помощью различных анализов с использованием Т-клеток линии Jurkat и первичных культур T-клеток. Ингибирование активации Т-клеток линии Jurkat в ответ на стимуляцию рецепторов T-клеток (TCR) измеряли путем количественного анализа растущей регуляции маркера клеточной поверхности CD69. Ингибирование активации первичных T-клеток измеряли путем количественного анализа выделения цитокинов, включая фактор некроза опухоли альфа (TNF), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкин 4 (IL-4), интерферон гамма (IFNg) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GMSCF), в ответ на костимуляцию TCR/CD28.

7.18.5.2 Проверка ингибирования активации Т-клеток линии Jurkat

Т-клетки линии Jurkat человека (клон N) рутинно культивировали на среде RPMI 1640 (компания-поставщик: Mediatech), в которую добавляли 10% эмбриональной сыворотки теленка (FBS) (компания-поставщик: Hyclone), пенициллин и стрептамицин. Процесс проверки занял три дня.

В первый день проверки культивированные клетки обрабатывали на центрифуге (1000 об/мин, 5 минут) и повторно переводили в состояние суспензии при концентрации 3,0×10⁵ клеток/мл в RPMI + 5% FBS. На второй день проверки клетки обрабатывали на центрифуге при 1000 об/мин в течение 5 минут и повторно переводили в состояние суспензии в RPMI + 5% FBS при концентрации 1,3×10⁵ клеток/мл. 85 мкл суспензии клеток добавляли в лунки 96-луночного планшета (компания-поставщик: Corning). 85 мкл соединения или разведенного RPMI + 5% FBS (в качестве контроля) добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Клетки затем стимулировали антиTCR (C305) при 500 нг/мл путем добавления 8X раствора в 25 мкл к клеткам планшета. Клетки затем инкубировали при 37ºC в течение 20 ч.

На третий день проверки планшеты вращали на центрифуге (модель Beckman GS-6R) при 2500 об/мин в течение 1 минуты, после чего удаляли среду. Далее, в каждую лунку добавляли 50 мкл красящего раствора (разведенный 1:100 раствор антиCD69-APC антитела (компания-поставщик: Becton Dickenson) в забуференном фосфатом физиологичном растворе (PBS+2% FBS), после чего инкубировали планшеты при 4ºC в течение 20 минут в темноте. После этого в каждую лунку добавляли 150 мкл буферного раствора (PBS + 2% FBS) и вращали планшет при 3000 об/мин в течение 1 минуты. Затем снова удаляли супернатант и переводили скомпактированный материал в суспензию путем аккуратного перемешивания. После этого добавляли 75 мкл раствора PBS + 2% FBS + Цитофикс (разведенный в пропорции 1:4), аккуратно перемешивали содержимое планшетов и оборачивали алюминиевой фольгой. Анализ клеток осуществляли с помощью проточного цитометра, подключенного к автоматической системе подачи жидкости.

Различные концентрации соединения сравнивали с самим растворителем с целью определения IC₅₀ ингибирования активации T-клеток различными соединениями. Показательные величины IC₅₀ для соединений 2,4-пиридиндиаминов в соответствии с настоящим изобретением приведены в Таблице 11.

7.18.5.3 Изоляция первичных T-клеток

2E8-4E8 PBMC или пролиферирующие T-клетки, выращенные в rIL-2 из здоровых человеческих доноров, переводили в состояние суспензии в PBS, вращали при 1500 об/мин в течение 8-10 минут и повторно суспендировали в 100 мл полной среды RPMI (1% Пен-Стреп, 1% L-Глютамин, 10 ммоль HEPES). После этого клетки помещали в колбы T175 (37°C, 5% CO₂) и давали моноцитам связаться в течение 2-3 часов. После прикрепления моноцитов несвязанные клетки собирали, подсчитывали с помощью гемоцитомера, промывали несколько раз PBS и повторно суспендировали в полной среде Yssel (среда Искова в модификации Дульбеко (modified IMDM) с 1% человеческой сыворотки AB, 1% Пен-Стреп, 1% L-глютамин, 10 ммоль HEPES) при концентрации 1,5 4 х 10⁶ клеток/мл. 90 мкл разведенных клеток затем добавляли к соединениям, разбавленным до 2X в среде Yssel, и инкубировали в течение 30 минут при 37°C (5% CO₂). После этой преинкубационной стадии смесь соединение/клетки переносили в стимуляционные планшеты, как описано ниже.

7.18.5.4 Проверка на ингибирование производства цитокинов в стимулированных первичных Т-клетках

Планшеты для стимулирования клеток готовили путем покрытия 96-луночных планшетов 5 мкг/мл раствора αCD3 (компания-поставщик: BD PharMingen, каталоговый № 555336) + 10 мкг/мл раствора αCD28 (компания-поставщик: Beckman Coulter, каталоговый № IM1376) в PBS (при отсутствии ионов Ca²⁺/Мg²⁺) при 37°C (5% CO₂) в течение 3-5 часов. По завершении инкубации в присутствии стимулирующих антител смесь удаляли и планшеты промывали 3 раза PBS перед тем, как добавить смесь первичных Т-клеток с препаратом.

Смесь первичных Т-клеток с препаратом помещали в планшеты для стимулирования и подвергали инкубации в течение 18 ч при 37°C (5% CO₂). По завершении стимулирования клеток ~150 мкл супернатанта из каждой лунки переносили в 96-луночный планшет для фильтрования (компания-поставщик: Corning PVDF Filter Plates), вращали на центрифуге (2000 об/мин, 2-3 минуты) и тут же использовали для анализа ELISA или LUMINEX анализа либо замораживали при -80°C для использования в будущем.

ELISA анализы IL-2 осуществляли с помощью набора Quantikine Human IL-2 ELISA (компания-поставщик: R&D Systems, каталоговый № D2050) в соответствии с указаниями производителя и измеряли абсорбцию с помощью спектрофотометра при длине волны 450 нм. После вычитания шумов поглощательность переводили в пг/мл с помощью калибровочной кривой.

Мультиплексирование иммуноанализа Luminex для TNF, IL-2, GMSCF, IL-4 и IFNg осуществляли в соответствии с указаниями производителя (фирма Upstate Biotechnology). В частности, 50 мкл пробы разводили 50 мкл экспериментального разбавителя и 50 мкл инкубационного буфера, после чего инкубировали в присутствии 100 мкл разведенного раствора антитела-детектора в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Планшет для фильтрования промывали 2 раза буфером для промывки и инкубировали в присутствии 100 мкл разбавленного вторичного реагента (SAV-RPE^*) в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. В завершение планшеты промывали 3 раза и проводили измерения с использованием меченых микросфер и флуоресцентного соединения RPE с помощью прибора компании Luminex.

Различные концентрации соединения сравнивали исключительно с раствором с целью определения значений IC₅₀ различных соединений, характеризующих ингибирование активации Т-клеток. Показательные значения IC₅₀ для соединений 2,4-пиридиндиаминов согласно настоящему изобретению приведены в Таблице 11.

7.18.6 Способность соединений 2,4-пиридиндиаминов согласно настоящему изобретению ингибировать активацию B-клеток

7.18.6.1 Описание

Способность соединений 2,4-пиридиндиаминов согласно настоящему изобретению ингибировать активацию B-клеток была продемонстрирована на примере первичных B-клеток при анализе маркеров клеточной поверхности с помощью сортера клеток с флуоресцентной активацией (FACS). Ингибирование активации первичных B-клеток в ответ на стимуляцию рецепторов B-клеток (BCR) измеряли путем количественного анализа маркера клеточной поверхности CD69.

7.18.6.2 Изоляция первичных B-клеток

Первичные B-клетки человека выделяли из светлого слоя кровяного сгустка, который представляет собой слой лейкоцитов, который образуется между эритроцитами и тромбоцитами в результате вращения несворачиваемой крови на центрифуге, или из свежей крови с помощью микросфер CD19-Dynal® и сортера FACS. Светлый слой кровяного сгустка приобретали в Банке Крови Медицинского Центра Стэнфордского Университета, где он был приготовлен в тот же день, сохранен и доствален в охлажденном состоянии (со льдом). Светлый слой кровяного сгустка (примерно 35 мл) помещали в конический стерильный центрифужный контейнер емкостью 500 мл и охлаждали льдом, после чего содержимое разводили холодным PBS, содержащим 0.2% BSA^* (компания-поставщик: Sigma, каталоговый № A7638) и цитрата натрия (0.1%, компания-поставщик: Sigma, каталоговый № S-5570) (P-B-C), до общего объема 200 мл и аккуратно перемешивали. Свежая кровь поступала от доноров в вакуумных контейнерах емкостью 10 мл с содержанием гепарина (1 вакуумный контейнер содержит примерно 8,5 мл крови). Кровь охлаждали льдом, перемещали в пробирки емкостью 50 мл (20 мл/пробирку) или конический стерильный центрифужный контейнер емкостью 500 мл, после чего разводили равным объемом P-B-C.

25 мл разведенной крови или светлого слоя кровяного сгустка наносили слоями на 15 мл охлажденного фиколла и снова помещали на лед. Кровь, нанесенную слоями на фиколл, обрабатывали с помощью центрифуги (модель Beckman GS-6R) в течение 45 минут при 2000 об/мин, 4°C с целью отделения периферийных мононуклеаров крови (PBMC) от эритроцитов (красных кровяных клеток - RBC) и гранулоцитов. Верхний водяной слой затем отсасывали до уровня 1 дюйма (25,4 мм) над слоем PBMC. После этого клетки PBMC переносили из каждых 2 пробирок с фиколлом в одну чистую пробирку Falcon емкостью 50 мл (в количестве примерно 10 мл/пробирку). Перенесенные клетки PBMC затем разводили в 5-ти кратной пропорции охлажденным льдом PBS с 0.2% BSA (P-B) и обрабатывали на центрифуге в течение 20 мин при 1400 об/мин и 4°C. Супернатант (возможно помутнение) затем отсасывали, переводили клетки PBMC в суспензию в 25 мл P-B раствора, подсчитывали (путем разведения в пропорции 1:5) и хранили со льдом.

Далее, клетки подвергали позитивному отбору с помощью антиD19 антител, нанесенных на магнитные микросферы (Dynal®) в соответствии с инструкциями изготовителя. Примерное необходимое количество микросфер CD19-Dynal® (микросфер dyna beads M-450 (pabB) производства компании Dynal, покрытых CD19) подсчитывали в предположении, что число B-клеток составляет 5% от подсчитанного числа PBMC, и добавляли примерно 10 микросфер на клетку из контейнера с микросферами, содержащего 4×10⁸ микросфер/мл. Микросферы CD19-Dynal® промывали 2 раза раствором P-B в пробирке емкостью 5 мл с использованием магнита компании Dynal, после чего добавляли к суспензии клеток PBMC. Эту смесь затем пропускали через магнит компании Dynal и промывали несколько раз с целью отделения прилипших к микросферам клеток.

7.18.6.3 Проверка соединений на предмет ингибирования активации B-клеток

После сепарации микросферы и антитела удаляли с помощью соединения CD19-DETACHaBEAD® компании Dynal в течение 45 мин при 30°C. В результате получали примерно 2×10⁷ B-клеток на светлый слой кровяного сгустка. B-клетки промывали и переводили в состояние суспензии с концентрацией 1×10⁶ клеток/мл в среде RPMI1640+10%FBS+ пенициллин/стрептавидин+ 1 нг/мл IFNα8. Клетки оставляли на ночь при 37°C и 5% CO_2,

На следующий день клетки промывали и переводили в состояние суспензии в среде RPMI1640+2,5% FBS до концентрации 1×10⁶ клеток/мл. Далее, клетки перенесли в кратное количество клиновидных лунок 96-луночного планшета (компания-поставщик: Corning) по 65 мкл клеток на лунку. С помощью автоматической установки 65 мкл 2x соединения добавляли к клеткам до концентрации DMSO 0,2% и инкубировали в течение 1 часа при 37°C. После этого клетки стимулировали в присутствии 20 мкл 7,5x α-IgM иммуноглобулина фирмы Jackson laboratories (окончательная концентрация 5 мкг/мл) в течение 24 часов. На 3-й день клетки обработали на центрифуге, тонировали для CD69 и анализировали с помощью FACS путем стробирования на живых клетках (посредством светорассеяния).

Различные концентрации соединения сравнивали исключительно с раствором с целью определения значений IC₅₀ различных соединений, характеризующих ингибирование активации В-клеток. Показательные значения IC₅₀ для соединений 2,4-пиридиндиаминов согласно настоящему изобретению приведены в Таблице 11.

7.18.7 Способность соединений 2,4-пиридиндиаминов согласно настоящему изобретению ингибировать активацию макрофагов

7.18.7.1 Описание

Способность соединений 2,4-пиридиндиаминов согласно настоящему изобретению ингибировать активацию различных макрофагов была продемонстрирована путем измерения выделения цитокинов стимулированными макрофагами. Выделение фактора некроза опухоли альфа (TNF) и интерлейкина 6 (IL-6) было проанализировано количественно в ответ на стимуляцию IgG или LPS.

7.18.7.2 Очистка и культура макрофагов человека

CD14+ моноциты очищали от PBMC (компания-поставщик: Allcells, каталоговый № PB002) с помощью набора для изоляции моноцитов (компания-поставщик: Miltenyi biotec, каталоговый № 130-045-501) в соответствии с инструкциями изготовителя. Степень чистоты оценивали путем измерения процента CD14+ клеток с помощью проточной цитометрии. Как правило, степень чистоты составляла >90%. Очищенные клетки CD14+ затем высаждали (6×10⁶ клеток на чашку Петри диаметром 150 см в присутствии 15 мл среды) в макрофагальной бессывороточной среде (M-SFM) (компания-поставщик: Gibco, каталоговый № 12065-074) при концентрации M-CSF^* 100 нг/мл (компания-поставщик: Pepro Tech, каталоговый № 300-25) и дифференцировали в течение пяти дней. По истечении этого периода морфология клеток и маркеры клеточной поверхности (CD14, HLA-DR, B7,1, B7,2, CD64, CD32, и CD16) отражали присутствие созревших дифференцированных макрофагов.

7.18.7.3 Стимуляция иммуноглобулином IgG

96-луночные планшеты Immulon 4HBX (компания-поставщик: VWR, каталоговый номер № 62402-959) покрывали IgG человека (компания-поставщик: Jackson Immunoresearch lab, каталоговый номер № 009-000-003) при концентрации 10 мкг/лунку в течение ночи при 4ºC или в течение 1 ч при 37ºC. Негативный контроль, состоящий из F(ab')2 фрагмента, также был покрыт с целью оценки фоновой стимуляции. Несвязанное антитело дважды промывали 200 мкл PBS. 20 мкл 5X соединения добавляли к каждой лунке, после чего добавляли 15000 клеток дифференцированных макрофагов в 80 мкл, которые собирали со стенок планшетов. Клетки инкубировали в течение 16 ч при 37ºC в инкубаторе и собирали супернатанты для дальнейшего анализа с помощью аппаратуры Luminex на предмет IL-6 и TNFα, который проводился аналогично описанному выше в случае первичных Т-клеток.

7.18.7.4 Стимуляция LPS

Для стимуляции с использованием LPS 10 мкл 10X раствора добавляли к преинкубированной смеси клеток с препаратом до достижения окончательной концентрации 10 нг/мл. Клетки затем инкубировали в течение 16 часов при 37ºC анализировали супернатанты аналогично описанным выше способам.

Различные концентрации соединения сравнивали исключительно с раствором с целью определения величины IC₅₀ каждого соединения для каждого цитокина. Показательные значения IC₅₀ для соединений 2,4-пиридиндиаминов согласно настоящему изобретению приведены в Таблице 11 (см. в графической части описания).

Несмотря на детальное описание приведенного выше изобретения с целью облегчения понимания, очевидно, что возможны определенные изменения и модификации в рамках прилагаемой формулы изобретения. В соответствии с этим описанные примеры следует рассматривать в качестве иллюстративных, а не ограничивающих, и не следует ограничивать изобретение приведенными в этих примерах деталями, которые могут быть модифицированы в рамках и в соответствии с эквивалентами прилагаемой формулы изобретения.

Все литературные и патентные источники, ссылки на которые приведены в данной заявке, включены в данную заявку методом ссылки для любых целей.

1. Соединение, выбранное из следующей группы соединений, или его фармацевтически приемлемая соль:
N4-(4-Хлор-3-метоксифенил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксикарбонилметиленоксифенил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-[3-Хлор-4-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-[3-Хлор-4-(2-гидроксиэтиленокси)фенил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,5-Дихлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2-Аминопирид-6-ил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-[2-(N-Ацетиламино)пирид-6-ил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-(3,5-дихлор-4-гидроксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-трифторметоксифенил)-N2-(3,5-дихлор-4-гидроксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Дихлор-4-гидроксифенил)-N4-(2,2-дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Дихлор-4-гидроксифенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-(3,5-дихлор-4-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-трифторметоксифенил)-N2-(3,5-дихлор-4-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-N2-(3,5-дихлор-4-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Дихлор-4-метоксифенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Дихлор-4-метоксифенил)-N4-(2,2-дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Диметоксифенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-3-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-N2-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-трифторметоксифенил)-N2-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-[2-Aминoпиpид-6-ил)-N2-(3,5-димeтoкcифeнил)-5-фтop-2,4-пиpимидиндиaмин
N2-(3,5-Диметоксифенил)-5-фтор-N4-(индол-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-[2-(N-Ацетиламино)пирид-6-ил]-N2-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Дихлорфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(3-метокси-5-трифторметилфенил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(2,6-Диметоксипирид-3-ил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(2,6-Диметилфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2-Аминопирид-6-ил)-N2-(2,6-диметилфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-N2-(2,6-диметилфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(2,6-Диметилфенил)-N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(2,6-Диметилфенил)-5-фтор-N4-(индол-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-[2-(N-Ацетиламино)пирид-6-ил]-N2-(3,5-диметилфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Диметилфенил)-5-фтор-N4-[2-(N-метиламино)карбониламинопирид-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Диметилфенил)-5-фтор-N4-[1-(N-метиламино)карбонилиндол-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2-Аминопирид-6-ил)-N2-(3-хлор-4-трифторметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-трифторметоксифенил)-N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2-Аминопирид-6-ил)-N2-(3-хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N4-(индол-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N4-[1-(N-метиламинокарбонил)индол-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2-Аминопирид-6-ил)-5-фтор-N2-(3-гидроксифенил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Xлop-4-мeтoкcифeнил)-5-фтop-N2[1-(N-мeтилaминoкapбoнил)индoл-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-N2-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Xлop-3,5-димeтилфeнил)-N4-(3,4-этилeндиoкcифeнил)-5-фтop-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Хлор-3,5-диметилфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)-N4-(2,2-Дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-N2-[2-(N-метиламинокарбонил)-2,3-дигидробензофуран-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)-N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-[2-(N,N-диметиламинокарбонил)-2,3-дигидробензофуран-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)-N4-(3-Хлор-4-трифторметоксифенил)-N2-[2-(N,N-диметиламинокарбонил)-2,3-дигидробензофуран-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)-N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-[2-(N-метиламинометилен)-2,3-дигидробензофуран-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-[2(R)-{(1R,2S,5R)-метилоксикарбонил}-2,3-дигидробензофуран-5-ил]-N4-(4-изопропоксифенил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-N2-[2(R)-{(1R,2S,R)-метилоксикарбонил}-2,3-дигидробензофуран-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Диметоксифенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиаминовая соль п-толуолсульфоновой кислоты
N2-(3,5-Диметоксифенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиаминовая соль метансульфоновой кислоты
N2-(3,5-Диметоксифенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиаминовая соль бензолсульфоновой кислоты
Гидрохлорид N2-(3,5-диметоксифенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз
[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамина
N2-(3,5-Диметоксифенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиаминовая соль DL-камфорсульфоновой кислоты
N2-(3,5-Диметилфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиаминовая соль п-толуолсульфоновой кислоты
N2-(3,5-Диметилфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиаминовая соль бензолсульфоновой кислоты
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-(индол-6-ил)-2,4-пиримидиндиаминовая соль п-толуолсульфоновой кислоты
N4-(3,4-Этилендиоксифенил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиаминовая соль п-толуолсульфоновой кислоты
(+)N2-(2-Карбоксил-2,3-дигидробензофуран-5-ил)-N4-(3-хлор-4-трифторметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-(3-Хлор-4-трифторметоксифенил)-5-фтор-N2-[2-(N-2,3-дигидроксипропиламино)карбонил-2,3-дигидробензофуран-5-ил]-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-(3-Хлор-4-трифторметоксифенил)-5-фтор-N2-[2-(N-2-гидроксиэтиламино)карбонил-2,3-дигидробензофуран-5-ил]-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-(3-Хлор-4-трифторметоксифенил)-5-фтор-N2-[2-(N-2-гидроксиэтил-N-метиламино]карбонил-2,3-дигидробензофуран-5-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-трифторметоксифенил)-5-фтор-N2-[2-(N-изопропиламино)карбонил-2,3-дигидробензофуран-5-ил]-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N4-(2-изопропоксипиридин-5-ил)-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-[3-(N-2-гидроксиэтиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-[3-(N-2,3-дигидроксипропиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N2,N4-Бис(4-бензилокси-3-хлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(4-Бензилокси-3-хлорфенил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-[3-(N-циклопропиламино)карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-гидрокси-5-метилфенил)-N4-(3-хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-[3-(N-циклобутиламино)карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-N2-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-гидрокси-5-метилфенил)-N4-(2,2-дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-(3-хлор-4-метокси-5-метилфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-изопропоксифенил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метокси-5-метилфенил)-5-фтор-N2-[3-[(N-метиламино)карбонилметиленокси]фенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-5-фтор-N2-(индол-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-(индол-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(индол-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-[2-(N,N-диметиламинометил)бензофуран-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-N2-[2-(N,N-диметиламинометил)бензофуран-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-N2-[2-(N,N-диметиламинометил)бензофуран-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N4-(2,2-дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(индол-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-N2-[2-(N,N-диметиламинокарбонил)-2,3-дигидробензофуран-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Дифтop-3-oкco-4H-бeнз[l,4]oкcaзин-6-ил)-5-фтop-N2-(3-мeтoкcи-5-трифторметилфенил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Дихлорфенил)-N4-(2,2-дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-[3-Хлор-4-(N-морфолино)фенил]-N2-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-[3-Хлор-4-(N-морфолино)фенил]-5-фтор-N2-(3-метокси-5-трифторметилфенил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиаминовая соль п-толуолсульфоновой кислоты
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-(3,5-дихлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-(3,5-диметилфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-(3-метокси-5-трифторметилфенил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-(3,4,5-триметилфенил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(3,4,5-триметилфенил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N4-[1-(N-метиламинокарбонил)индол-6-ил]-N2-(3,5-диметоксифенил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-гидрокси-5-метилфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метокси-5-метилфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-(2-Этоксикарбонил-2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-[3-(метоксикарбонилметиленокси)фенил]-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N4-[2-метил-2-(N-метиламинокарбонил)-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил]-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(N1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-N2-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-N2-(3-хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-N2-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,4-Дихлорфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-[(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-трет-Бутилфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-[(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(3-гидроксифенил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-N2-(3-фтор-4-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлорфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Дихлорфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-трифторметоксифенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метокси-5-метилфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(3-метоксикарбонилметиленоксифенил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-гидрокси-5-метилфенил)-N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-гидрокси-5-метилфенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Диметил-4-метоксифенил)-N4-(2,2-диметил-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Диметил-4-метоксифенил)-N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метокси-5-метилфенил)-N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-N4-[3-(N-морфолино)карбонил-4-трифторметоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-[3-(N-2-Аминоэтиламино)карбонил-3-трифторметоксифенил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N4-[3-(N-метиламино)карбонил-4-трифторметоксифенил)-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N4-(3-[N-(2-(N-метиламино)этиленамино)карбонил-4-трифторметоксифенил]-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-N4-[3-(N-пиперидинкарбонил-4-трифторметоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(R)-N4-(3-[N-(1,2-Дигидроксипропиламино)карбонил-4-трифторметоксифенил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-[4-(N-трет-Бутоксикарбонил)амино-1-бензопиран-6-ил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(+)5-Фтор-N4-[4-(N-метил)амино-1-бензопиран-6-ил]-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-[4-(N-трет-Бутоксикарбонил-N-метил)амино-1-бензопиран-6-ил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(S)-N4-[4-(N-Бензилоксикарбонил)амино-1-бензопиран-6-ил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(R)-N4-[4-(N-Бензилоксикарбонил)амино-1-бензопиран-6-ил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(S)-N4-(4-Амино-1-бензопиран-6-ил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(R)-N4-(4-Амино-1-бензопиран-6-ил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-[4-(N-трет-Бутоксикарбонил)амино-1-бензопиран-6-ил]-5-фтор-N2-(индазол-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-(4-Амино-1-бензопиран-6-ил)-5-фтор-N2-(индазол-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-(4-Амино-1-бензопиран-6-ил)-N2-(3,5-дихлор-4-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-[4-(N-трет-Бутоксикарбонил)амино-1-бензопиран-6-ил]-N2-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-(4-Амино-1-бензопиран-6-ил)-N2-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-[4-(N-трет-Бутоксикарбонил)амино-1-бензопиран-6-ил]-N2-(3-хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-(4-Амино-1-бензопиран-6-ил)-N2-(3-хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-[4-(N-трет-Бутоксикарбонил)амино-1-бензопиран-6-ил]-N2-(3,4-дихлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)N4-(4-Амино-1-бензопиран-6-ил)-N2-(3,4-дихлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)N2-[4-(N-трет-Бутоксикарбониламино-1-бензопиран-6-ил]-N4-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)N2-[4-(N-трет-Бутоксикарбонил)амино-1-бензопиран-6-ил]-N4-(3,4-дихлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4(R,S)-(N-трет-Бутоксикарбонил)амино-1-бензопиран-6-ил]-5-фтор-N4-[2-(S)-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
(+)N2-(4-Амино-1-бензопиран-6-ил]-N4-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)N2-(4-Амино-1-бензопиран-6-ил)-N4-(3,4-дихлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4(R,S)-Амино-1-бензопиран-6-ил)-5-фтор-N4-(2(S)-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N2-[(1R,2R)-2-Аминоциклогекс-1-ил)-N4-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-[(1R,2R)-2-Аминоциклогекс-1-ил)-N4-(3,5-дихлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-((1R,2R)-2-Аминоциклогекс-1-ил)-5-фтор-N4-[(2S)-2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
(R,R)-N4-(4,4-Диметил-1,3-диоксо-2Н,4Н-изохинолин-7-ил)-5-фтор-N2-(2-аминоциклогексан-1-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-((1R,2R)-2-Аминоциклогекс-1-ил)-5-фтор-N4-[(2R,S)-2-(2-гидрокси)этил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,5-Диметоксифенил)-N2-[4-(2-N,N-диэтиламиноэтиленамино)карбонилфенил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-N2-[4(2-N,N-диэтиламиноэтиленамино)карбонилфенил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(S)-N2-[4-(2-N,N-Диэтиламиноэтиленамино)карбонилфенил]-5-фтор-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(4,4-Диметил-1,3-диоксо-2H,4H-изохинолин-7-ил)-5-фтор-N2-[4-(N,N-диэтиламиноэтиленаминокарбонил)фенил]-2,4-пиримидиндиамин
(+)-N2-[4-(2-N,N-Диэтиламиноэтиленамино)карбонилфенил]-5-фтор-N4-[(2-гидроксиэтил)-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(2-N,N-Диэтиламиноэтиленамино)карбонилфенил]-N4-(2,2-дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Аминокарбонилфенил)-N4-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Аминокарбонилфенил)-N4-(3,4-дихлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(S)-N2-(4-Аминокарбонилфенил)-5-фтор-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(4,4-Диметил-1,3-диоксо-2Н,4Н-изохинолин-7-ил)-5-фтор-N2-(4-аминокарбонилфенил)-2,4-пиримидиндиамин
(+)-N2-(4-Аминокарбонилфенил)-5-фтор-N4-[(2-гидроксиэтилен)-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Аминокарбонилфенил)-N4-(2,2-дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(N-трет-Бутоксикарбониламино)метиленфенил]-N4-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(N-трет-Бутоксикарбониламино)метиленфенил]-N4-(3,4-дихлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(S)-N2-[4-(N-трет-Бутоксикарбониламино)метиленфенил]-5-фтор-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(N-трет-Бутоксикарбониламино)метиленфенил]-N4-(4,4-диметил-1,3-диоксо-2Н,4Н-изохинолин-7-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(N-трет-Бутоксикарбониламинометилен)фенил]-N4-(2,2-дифтор-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Аминометиленфенил)-N4-(3,5-диметоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Аминометиленфенил)-N4-(3,4-дихлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(S)-N2-(4-Аминометиленфенил)-5-фтор-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Аминометиленфенил)-N4-(4,4-диметил-1,3-диоксо-2Н,4Н-изохинолин-7-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Aминoмeтилeнфeнил)-N4-(2,2-дифтop-3-oкco-4H-бeнз[l,4]oкcaзин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,5-Диметоксифенил)-N2-(3-N,N-диэтиламинопропил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-N2-(3-N,N-диэтиламинопропил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(S)-N2-(3-N,N-Диэтиламинопропил)-5-фтор-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(4,4-Диметил-1,3-диоксо-2Н,4Н-изохинолин-7-ил)-N2-(3-N,N-диэтиламинопропил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(+)-5-Фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-N4-[4-(N-п-толуолсульфонил)амино-1-бензопиран-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
(+)-5-Фтор-N4-[4-(N-метансульфонил)амино-1-бензопиран-6-ил)-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(+)-N4-[4-N-(N,N-Диметиламинометилен-карбонил)амино-1-бензопиран-6-ил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(+)-N4-[4-N-(N,N-Диметиламинометилен-карбонил)-N-метиламино-1-бензопиран-6-ил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-Циклопропил-5-фтор-N2-(4-морфолинофенил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-Циклoпpoпил-5-фтop-N4-(4-мopфoлинoфeнил)-2,4-пиpимидиндиaмин
N2-Циклoбyтил-5-фтop-N4-(4-мopфoлинoфeнил)-2,4-пиpимидиндиaмин
N2-[3-(N-Циклопропиламино)карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-N4-(4-морфолинофенил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-(3-метоксикарбонилметиленоксифенил)-N4-(4-морфолинофенил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-[3-(N-Циклобутиламино)карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-N4-(4-морфолинофенил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-Циклопропил-N2-[3-(N-циклопропиламино)-карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-[3-(N-Циклoбyтилaминo)кapбoнилмeтилeнoкcифeнил]-N4-циклoпpoпил-5-фтop-2,4-пиримидиндиамин
N4-Циклопропил-5-фтор-N2-[3-(4-морфолинофенил)аминокарбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-гидрокси-5-метилфенил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил)-N4-(4-морфолинофенил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N4-[4-(4-метоксикарбонилпиперазино)фенил]-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(N-Ацетил-N-метиламино)фенил]-N4-циклопропил-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(4-Ацетилпиперазино)фенил]-N4-циклопропил-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-Циклопропил-5-фтор-N2-[4-(4-метоксикарбонилпиперазино)фенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-Циклопропил-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-Циклопропил-5-фтор-N4-[4-(4-метоксикарбонилпиперазино)фенил]-2,4-пиримидиндиамин
N2-Циклобутил-5-фтор-N4-[4-(4-метоксикарбонилпиперазино)фенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-[4-(N-Ацетил-N-метиламино)фенил]-N2-циклопропил-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2,N4-Бис(циклопропил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-[4-(N-Ацетил-N-метиламино)фенил]-5-фтор-N2-[3-N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
N2,N4-Бис(3-метиламинокарбонилметиленоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-[4-(N-Ацетил-N-метиламино)фенил]-N2-циклобутил-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2,N4-Бис(циклобутил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-[4-(4-Ацетилпиперазино)фенил]-N2-циклопропил-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-[4-(4-Ацетилпиперазино)фенил]-N2-циклобутил-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(N-Aцeтил-N-мeтилaминo)фeнил]-N4-циклoбyтил-5-фтop-2,4-пиримидиндиамин
цис/транс-N4-[4-[4-(трет-Бутоксикарбониламино)циклогексилокси]-3-хлорфенил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(4-Ацетилпиперазино)фенил]-N4-циклобутил-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-Циклобутил-5-фтор-N2-[4-(4-метоксикарбонилпиперазино)фенил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-Циклобутил-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-[3-(N-Циклобутиламино)карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-[3-(N-Циклопропиламино)карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(4-Ацетилпиперазино)фенил]-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-[4-(4-метоксикарбонилпиперазино)фенил]-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-Циклобутил-N2-(3-циклопропиламинокарбонилметиленоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-Циклобутил-N2-(3,4-дихлорфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N4-циклобутил-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-Циклобутил-N2-[3-(N-циклобутиламино)карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-Циклобутил-N2-(3,5-дихлор-4-метоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,4-Дихлорфенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Xлop-4-мeтoкcифeнил)-5-фтop-N4-(2H-3-oкco-4H-5-пиpид[l,4]oкcaзин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Дихлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Диметоксифенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-(3-фтор-4-метоксифенил)-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
цис/транс-N4-[4-(4-Аминоциклогексилокси)-3-хлорфенил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-(4-метоксифенил)-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,4-Этилендиоксифенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-N2-(4-трифторметоксифенил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Этоксифенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Бутоксифенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-(4-феноксифенил)-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Бензилоксифенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
цис/транс-N4-[3-Хлор-4-[4-(N-этиламино)-циклогексилокси]фенил]-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-(4-морфолинофенил)-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-(4-изопропоксифенил)-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Дифтор-2Н-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил)-2,4-пиримидиндиаминовая соль п-толуолсульфоновой кислоты
N4-(2,2-Дифтор-2Н-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил)-2,4-пиримидиндиаминовая соль бензолсульфоновой кислоты
N4-(2,2-Диметил-2Н-3-оксо-4Н-5-пиридо[1,4]оксазин-6-ил]-5-фтор-N2-[4-(4-метоксикарбонилпиперазино)фенил]-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(N-Ацетил-N-метиламино)фенил]-N4-(2,2-диметил-2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(N-Ацетил-N-этиламино)фенил]-N4-(2,2-диметил-2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(4-Ацетилпиперазино)фенил]-N4-(2,2-диметил-2Н-3-оксо-4Н-5-пиридо[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(N-Ацетил-N-метиламино)фенил]-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-[4-(N-Ацетил-N-этиламино)фенил]-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,4-Диметоксифенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(4-морфолинофенил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-[3-(N-Циклобутиламино)карбонилметиленоксифенил]-N4-(2,2-диметил-2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-[4-(4-метилпиперазино)фенил]-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-[4-(4-метилпиперазино)фенил]-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Диметилфенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Диметилфенил)-N4-(2,2-диметил-2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-(3-изопропилфенил)-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метилфенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-(3-метокси-5-трифторметилфенил)-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N2-(индол-6-ил)-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(индол-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Дихлорфенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Бромфенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-трет-Бутилфенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,4-Дифторфенил)-5-фтор-N4-(2Н-3-оксо-4Н-5-пирид[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
(S)-5-Фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(4,4-Диметил-1,3-диоксо-2Н,4Н-изохинолин-7-ил)-5-фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметилендиоксифенил]-2,4-пиримидиндиамин
(R)-5-Фтор-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-гидрокси-5-метилфенил)-N4-(4,4-диметил-1,3-диоксо-2Н,4Н-изохинолин-7-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(S)-N2-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
(R)-N2-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Диметоксифенил)-N4-(4,4-диметил-1,3-диоксо-2Н,4Н-изохинолин-7-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(S)-N2-(3,5-Дихлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]-оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
(R)-N2-(3,5-Дихлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]-оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
(+)-N2-(3,5-Диметоксифенил)-5-фтор-N4-[2-(2-гидроксиэтил)-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
(+)-N2-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N4-[2-(2-гидроксиэтил)-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
(S,S)-N2,N4-Бис-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
(S)-N2-(3,5-Диметоксифенил)-5-фтор-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
(R)-N2-(3,5-Диметоксифенил)-5-фтор-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Дихлор-4-метоксифенил)-N4-(4,4-диметил-1,3-диоксо-2Н,4Н-изохинолин-7-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(4,4-Диметил-1,3-диоксо-2Н,4Н-изохинолин-7-ил)-N2-(индазол-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,3-Диметил-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-N2-(3,5-диметилфенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N4-(3,3-диметил-4Н-бензо[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,3-Диметил-1,4-бензоксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(индазол-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,3-Диметил-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(N1-метилиндазол-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
(R)-N2-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N4-(2-метил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-2,4-пиримидиндиаминовая соль толуолсульфоновой кислоты
N4-(2,6-Диметоксипирид-3-ил)-N2-[1-(2-этоксикарбонилэтил)индазолин-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(4-Xлopфeнил)-5-фтop-N2-{1-[2-(N-мeтилaминo)кapбoнилэтил]-индaзoлин-5-ил}-2,4-пиримидиндиамин
N4-(4-Хлорфенил)-5-фтор-N2-[1-(3-гидроксипропил)индазолин-5-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дифтopфeнил)-N2-[1-(2-этoкcикapбoнилэтил)-индaзoлин-5-ил]-5-фтop-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дифтopфeнил)-5-фтop-N2-{1-[2-(N-мeтилaминoкapбoнил)этил]индaзoлин-5-ил}-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дифторфенил)-5-фтор-N2-[1-(3-гидроксипропил)индазолин-5-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-N2-[1-(2-этоксикарбонилэтил)индазолин-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-5-фтор-N2-{1-[2(N-метиламинокарбонил)этил]индазолин-5-ил}-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-5-фтор-N2-[1-(3-гидроксипропил)индазолин-5-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Этилендиоксифенил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-гидрокси-5-метилфенил)-5-фтор-N4-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-5-фтор-N2-[2-(2-метокси-4-метоксикарбонилбензил)индазолин-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-[2-(2-метокси-4-метоксикарбонилбензил)индазолин-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Этилендиоксифенил)-5-фтор-N2-{1-[2-метокси-4-(N-метиламинокарбонил)бензил]индазолин-6-ил}-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дифторфенил)-5-фтор-N2-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дифторфенил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-N2-[1-(2-этоксикарбонилэтил)индазолин-6-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-5-фтор-N2-{1-[2(N-метиламино)карбонилэтил]индазолин-6-ил}-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-5-фтор-N2-[1-(3-гидроксипропил)индазолин-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-[1-(2-этоксикарбонилэтил)индазолин-6-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-[1-(3-гидроксипропил)индазолин-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-{1-[2-(N-метиламинокарбонил)этил]-индазолин-6-ил}-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N4-(4-фтор-3-метоксифенил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(4-Хлор-3-фторфенил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Диметоксифенил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метокси-5-метилфенил)-5-фтор-N4-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(4-Хлор-3-фторфенил)-5-фтор-N2-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(4-Хлор-3-фторфенил)-5-фтор-N2-(индазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N4-(4-фтор-3-метоксифенил)-N2-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N4-(4-фтор-3-метоксифенил)-N2-(индазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метокси-5-метилфенил)-5-фтор-N4-{4Н-имидазо[2,1-с]-бенз[1,4]оксазин-8-ил}-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3-Хлор-4-метокси-5-метилфенил)-5-фтор-N4-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Диметоксифенил)-5-фтор-N4-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(4-Xлop-2,5-димeтoкcифeнил)-5-фтop-N4-(l-мeтилиндaзoлин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(3,5-Диметоксифенил)-5-фтор-N4-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N4-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-фторфенил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-фторфенил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-фторфенил)-5-фтор-N2-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-фторфенил)-5-фтор-N2-(индазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N4-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиаминовая соль бензолсульфоновой кислоты
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N4-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиаминовая соль п-толуолсульфоновой кислоты
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-N2-[1-(2-этоксикарбонилэтил)индазолин-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-[1-(3-гидроксипропил)индазолин-5-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-{1-[2(N-метиламинокарбонил)этил]индазолин-5-ил}-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-N2-[1-(2-этоксикарбонилэтил)индазолин-6-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-{1-[2-(N-метиламинокарбонил)этил]индазолин-6-ил}-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-N2-[1-(метоксикарбонил)метилиндазолин-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-[1-(N-метиламинокарбонил)метилиндазолин-5-ил}-2,4-пиримидиндиамин
N2-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N4-(индазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N4-(1-метилиндазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N2-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N4-(индазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Диметоксифенил)-5-фтор-N2-(индазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-[1-(2-метокси-4-метоксикарбонилбензил)индазолин-6-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиаминовая соль п-толуолсульфоновой кислоты
N4-(3,4-Дихлорфенил)-5-фтор-N2-(2-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-(2-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-(2-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-N2-[2-(2-этоксикарбонилэтил)-индазолин-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-N2-[2-(2-этоксикарбонилэтил)индазолин-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N4-(4-фтор-3-метоксифенил)-N2-(1-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
5-Фтор-N4-(4-фтор-3-метоксифенил)-N2-(2-метилиндазолин-6-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3,4-Дихлорфенил)-5-фтор-N2-[1-(3-гидроксипропил)индазолин-5-ил]-2,4-пиримидиндиаминовая соль бис(р)-толуолсульфоновой кислоты
N4-(3,4-Диxлopфeнил)-5-фтop-N2-{2-[2-(N-мeтилaминoкapбoнил)этил]индaзoлин-5-ил}-2,4-пиримидиндиамин
N4-(2,2-Диметил-3-оксо-4Н-бенз[1,4]оксазин-6-ил)-5-фтор-N2-{2-[2-(N-метиламинокарбонил)этил]индазолин-5-ил}-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-(1-метилиндазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-(индазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-N2-[1-(2-этоксикарбонилэтил)индазолин-5-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-[1-(3-гидроксипропил)индазолин-5-ил]-2,4-пиримидиндиамин
N4-(3-Хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-N2-{1-[2-(N-метиламинокарбонил)этил]индазолин-5-ил}-2,4-пиримидиндиамин.

2. Фармацевтическая композиция для лечения аутоиммунного заболевания, включающая в себя в эффективном количестве соединение по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель и/или разбавитель.

3. Применение соединения по п.1 для получения лекарственного средства для лечения аутоиммунного заболевания.

4. Применение соединения выбранного из группы состоящей из следующих соединений:
N2,N4-бис(3-аминофенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамин (R921302);
N4-(3-xлop-4-мeтoкcифeнил)-5-фтop-N2-[3-[(N-мeтилaминo)кapбoнилмeтилeнoкcи]-фенил]-2,4-пиримидиндиамин (R926891);
N4-[(2,2-диметил-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он)-6-ил]-5-фтор-N2-[3-(метиламинокарбонилметиленокси)фенил]-2,4-пиримидиндиамин (R940323);
N4-[(2,2-диметил-4Н-5-пиридо[1,4]оксазин-3-он)-6-ил]-5-фтор-N2-[3-(метиламинокарбонилметиленокси)фенил]-2,4-пиримидиндиамин (R940347) и
N4-[(2,2-дифтор-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он)-6-ил]-5-фтор-N2-[3-(метиламинокарбонилметиленокси)фенил]-2,4-пиримидиндиамин (R921303)
для получения лекарственного средства для лечения аутоиммунного заболевания.

5. Применение по любому из пп.3 и 4, согласно которому аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из тиреоидита Хашимото, аутоиммунной гемолитической анемии, аутоиммунного атрофического гастрита пернициозной анемии, аутоиммунного энцефаломиелита, аутоиммунного орхита, синдрома Гудпасчера, аутоиммунной тромбоцитопении, симпатической офтальмии, астенического бульбарного паралича, базедовой болезни, билиарного первичного цирроза печени, гломерулонефрита, хронического агрессивного гепатита, мембранной гломерулопатии и аутоиммунных заболеваний, включающих системные аутоиммунные расстройства.

6. Применение по любому из пп.3 и 4, согласно которому аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из аутоиммунных заболеваний, часто характеризуемых как аутоиммунные расстройства отдельного органа или единого типа клеток, а также заболеваний, часто характеризуемых как включающие в себя системные аутоиммунные расстройства.

7. Применение по любому из пп.3 и 4, согласно которому аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из тиреоидита Хашимото, аутоиммунной гемолитической анемии, аутоиммунного атрофического гастрита пернициозной анемии, аутоиммунного энцефаломиелита, аутоиммунного орхита, синдрома Гудпасчера, аутоиммунной тромбоцитопении, симпатической офтальмии, бульбоспинального паралича, базедовой болезни, билиарного первичного цирроза печени, хронического агрессивного гепатита и мембранной гломерулопатии.

8. Применение по любому из пп.3 и 4, согласно которому аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из системной красной волчанки, ревматоидного артрита, синдрома Шегрена, синдрома Рейтера, полимиозит-дерматомиозита, системного склероза, нодозного полиартериита, рассеянного склероза и буллезного пемфигоида.

9. Применение по п.8, согласно которому аутоиммунным заболеванием является системная красная волчанка.

10. Применение по п.8, согласно которому аутоиммунным заболеванием является ревматоидный артрит.

11. Применение по п.8, согласно которому аутоиммунным заболеванием является рассеянный склероз.

12. Применение по любому из пп.3 и 4, согласно которому аутоиммунным заболеванием является гломерулонефрит.