2-этил-6-метил-3-гидроксипиридинийгидроксибутандиоат, обладающий противоишемической, церебропротекторной, нейротропной и липидрегулируемой активностями, фармацевтические композиции и лекарственное средство
Владельцы патента RU 2377237:
Закрытое акционерное общество "Медимэкс" (ЗАО "Медимэкс") (RU)
Пшеничников Виталий Георгиевич (RU)
Изобретение относится к области медицины, конкретно к новому химическому соединению - производному 3-гидроксипиридина формулы
обладающему противоишемической, церебро-протекторной, нейротропной и липидрегулируемой активностями, а также к твердой и жидкой фармацевтическим композициям на основе этого соединения и применению в производстве лекарственных препаратов для профилактики и лечения сердечно-сосудистых, психических заболеваний, ишемии мозга и ожирения. Технический результат: получено и изучено новое соединение, которое может быть перспективным в производстве лекарственных препаратов для профилактики и лечения сердечно-сосудистых, психических заболеваний, ишемии мозга и ожирения. 8 н. и 4 з.п. ф-лы, 16 табл.
Изобретение относится к области медицины, конкретно к новому химическому соединению - производному 3-гидроксипиридина, обладающему противоишемической, церебро-протекторной, нейротропной и липидрегулируемой активностями, фармацевтическим композициям на основе этого соединения.
Указанные свойства позволяют предполагать возможность применения предлагаемых фармацевтических композиций на основе нового соединения для профилактики и лечения сердечно-сосудистых, психических заболеваний, ишемии мозга и ожирения.
Известное противоишемическое средство из группы β-адреноблокаторов - анаприлин (М.Д.Машковский. Лекарственные средства, М., ООО "Новая волна", 2002, т.I, стр.254-256) реализует свои положительные свойства, в основном, на фоне угнетения сердечной мышцы (кардиодепрессивное действие), имеет ряд нежелательных побочных эффектов (головокружение, бронхоспазм, агрегация эритроцитов и др.).
Известным ноотропным средством, широко применяемым в медицинской практике, является пирацетам (М.Д. Машковский. Лекарственные средства, М., ООО "Новая волна", 2002, т.I, стр.111-113).
Цель изобретения - новое соединение, обладающее противоишемическим, церебропротекторным, ноотропным и липидрегулируемым свойствами, не имеющее в отличие от анаприлина кардиодепрессивного действия и нежелательных побочных эффектов, фармацевтические композиции на основе нового соединения, а также возможность применения предлагаемых фармацевтических композиций на основе нового соединения для профилактики и лечения сердечно-сосудистых, психических заболеваний, ишемии мозга и ожирения.
Поставленная цель достигается новым соединением, а именно: 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридинийгидроксибутандиоатом формулы:
а также фармацевтическими композициями, содержащими новое соединение с рабочим названием Этоксидол: таблетки, растворы для инъекций.
Новое соединение получают известным способом, а именно: взаимодействием 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина с гидроксибутандиовой кислотой в присутствии растворителя при нагревании.
Твердую дозированную фармацевтическую композицию в виде таблетки, содержащую активное вещество и целевые добавки, получают путем предварительного гранулирования с последующим таблетированием. При этом соотношение активного вещества и целевых добавок составляет, мас.%:
| активное вещество | 0,05-40,0 |
| целевые добавки | 60,0-99,95 |
В качестве целевых добавок она содержит необязательно одновременно крахмал, натрия кроскармеллозу, поливинилпирролидоны, сахара, производные целлюлозы, аэросил, глицин, N-ацетил-L-глутаминовую кислоту, 2-(диметиламино)этанол, соли стеариновой кислоты, корригирующие вещества, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| крахмал | 0,0-15,0 |
| натрия кроскармеллоза | 0,0-10,0 |
| поливинилпирролидоны | 0,0-10,0 |
| сахара | 0,0-20,0 |
| производные целлюлозы | 0,0-50,0 |
| аэросил | 0,0-10,0 |
| глицин | 0,0-10,0 |
| N-ацетил-L-глутаминовая кислота | 0,0-15,0 |
| 2-(диметиламино)этанол | 0,0-10,0 |
| соли стеариновой кислоты | 0,0-1,0 |
| корригирующие вещества | 0,0-10,0 |
Присутствие в твердых лекарственных формах крахмала, сахаров, поливинилпирролидонов, натрия кроскармеллозы, производных целлюлозы обеспечивает повышение скорости высвобождения и полноту всасывания активного вещества, увеличивает распадаемость и растворение лекарственной формы, а также создает условия для проникновения воды и ферментов в таблетку. Крахмал предпочтительно используют кукурузный или картофельный.
Присутствие солей стеариновой кислоты обеспечивает эффект скольжения, необходимый на стадии прессования таблеток. В качестве солей целесообразно применять стеарат магния или кальция.
Глицин, N-ацетил-L-глутаминовая кислота, 2-(диметиламино)этанол в качестве целевых добавок к активному веществу способствуют интенсификации процессов клеточного метаболизма и обмена веществ, окислительно-восстановительных процессов, регенерации клеток, липидного обмена, что должно положительно влиять на ход лечения ишемической болезни сердца, ишемии мозга и нейропротекции.
Фармацевтическую композицию в виде раствора для инъекций, содержащую активное вещество и целевые добавки, получают путем постепенного растворения компонентов в воде для инъекций.
При этом соотношение активного вещества и целевых добавок составляет, мас.%:
| активное вещество | 0,05-40,0 |
| целевые добавки | 60,0-99,95. |
В качестве целевых добавок она содержит необязательно одновременно глицин, N-ацетил-L-глутаминовую кислоту, 2-(диметиламино)этанол, трилон Б при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| глицин | 0,0-10,0, |
| N-ацетил-L-глутаминовая кислота, | 0,0-50,0 |
| 2-(диметиламино)этанол | 0,0-20,0 |
| трилон Б | 0,0-5,0 |
Трилон Б в качестве целевой добавки способствует повышению стабильности раствора.
Заявляемые соотношения компонентов найдены экспериментальным путем, являются оптимальными и позволяют получить технический результат, соответствующий поставленной задаче:
фармацевтические композиции отвечают требованиям Государственной Фармакопеи XI издания, имеют срок годности не менее 2-х лет и обеспечивают высокий фармакотерапевтический эффект активного вещества.
Синтез нового вещества, состав и способы изготовления заявляемых фармацевтических композиций приведены в следующих примерах.
Пример 1. 2-Этил-6-метил-3-гидроксипиридинийгидроксибутандиоат.
К 380 мл 2-пропанола добавляют 31,28 г (0,288 моля) 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина, 31,49 г (0,235 моля) гидроксибутандиовой кислоты. Реакционную массу нагревают и перемешивают с обратным холодильником при 65-70°С в течение 5-10 мин, фильтруют, фильтрат охлаждают до 5-10°С. Образовавшийся осадок отделяют, промывают 40 мл охлажденного 2-пропанола, сушат. Получают 58,76 г соединения I (выход 95%), белый кристаллический продукт с температурой плавления 106-107°С.
C12H17NO6
Найдено, %: С 53,05; Н 6,14; N 5,14.
Вычислено, %: С 53,14; Н 6,27; N 5,17.
ИК-спектр, см-1: 1656, 1558, 1298, 1168, 1092, 854 (в вазелиновом масле).
УФ-спектр, нм: 223, 291 (в этаноле).
Пример 2. Твердая фармацевтическая композиция в виде таблетки.
В аппарат загружают 268,56 г целлюлозы микрокристаллической, 8,63 г аэросила, 31,20 г крахмала и 37,440 г сахара молочного, смесь увлажняют водным раствором 2-(диметиламино)этанола и кислоты N-ацетил-L-глутаминовой в количестве 280,97 г и тщательно перемешивают.
Полученную массу гранулируют через сито с диаметром отверстий 2 мм. Гранулы сушат при 45-50°С до постоянного веса и протирают через сито с диаметром отверстий 1 мм. Получают 446,70 г гранулята №1. Выход на стадии составляет 99,03%.
Аналогично получают 125,98 г гранулята №2 из 105,05 г Этоксидола, 20,80 г глицина и 13,45 г 10%-ного водного раствора поливинилпирролодона. Выход на стадии - 99,03%.
Для получения массы для таблетирования в аппарат загружают грануляты №1 и №2, тщательно перемешивают и опудривают смесью порошков: аэросил - 1,24 г, натрия кроскармеллоза - 13,18 г, магния стеарат - 6,18 г и ароматизатор - 6,18 г.
Для получения таблеток полученную смесь таблетируют. Получают 600 г (1000 штук) таблеток Этоксидола в среднем по 100 мг каждая. Выход составляет 95,2%, считая на исходный Этоксидол.
Пример 3. Твердая фармацевтическая композиция в виде таблетки.
Аналогично примеру 2 гранулят №1 получают, исходя из 278,56 г целлюлозы микрокристаллической, 8,63 г аэросила и 37,44 г сахара молочного, смесь увлажняют водным раствором 2-(диметиламино) этанола и кислоты N-ацетил-L-глутаминовой в количестве 280,97 г. Гранулят 2 получают, исходя из 105,05 г Этоксидола и 33,12 г 10%-ного водного раствора поливинилпирролодона. Для получения таблеток смесь гранулятов №1 и №2 опудривают смесью порошков кроскармеллоза - 14,21 г, кальция стеарата - 6,07 г, ароматизатора - 6,31 г и таблетируют.
Получают 600 г (1000 штук) таблеток Этоксидола в среднем по 100 мг каждая.
Выход составляет 95,2%, считая на исходный Этоксидол.
Пример 4. Твердая фармацевтическая композиция в виде таблетки.
Аналогично примеру 2 гранулят №1 получают, исходя из 306,00 г целлюлозы, 8,63 г аэросила и 37,44 г сахара, смесь увлажняют водным раствором 2-(диметиламино) этанола и кислоты N-ацетил-L-глутаминовой в количестве 280,97 г. Гранулят №2 получают, исходя из 105,05 г Этоксидола, 10,40 г глицина и 24,11 г 10%-ного водного раствора поливинилпирролодона. Для получения таблеток смесь гранулятов №1 и №2 опудривают смесью порошков кроскармеллозы - 10,33 г, кальция стеарата - 4,07 г, аэросила - 1,04 г и ароматизатора - 5,83 г и таблетируют.
Получают 600 г (1000 штук) таблеток Этоксидола в среднем по 100 мг каждая.
Выход составляет 95,5%, считая на исходный Этоксидол.
Пример 5. Твердая фармацевтическая композиция в виде таблетки.
Аналогично примеру 2 гранулят №1 получают, исходя из 269,00 г целлюлозы, 8,63 г аэросила, 30,3 г крахмала и 37,44 г сахара, смесь увлажняют водным раствором 2-(диметиламино)этанола и кислоты N-ацетил-L-глутаминовой в количестве 280,97 г. Гранулят №2 получают, исходя из 105,05 г Этоксидола, 33,98 г глицина и 13,45 г 10%-ного водного раствора поливинилпирролодона. Для получения таблеток смесь гранулятов №1 и №2 опудривают смесью порошков кроскармеллозы - 10,33 г, магния стеарата - 6,18 г, аэросила - 1,24 г и ароматизатора - 6,07 г и таблетируют. Получают 600 г (1000 штук) таблеток Этоксидола в среднем по 100 мг каждая. Выход составляет 97,2%, считая на исходный Этоксидол.
Пример 6. Фармацевтическая композиция в виде раствора для инъекций.
В колбу на 2,0 л наливают 700,0 мл воды для инъекций и постепенно при перемешивании загружают 50,0 г Этоксидола, 16,0 г 2-(диметиламино)этанола, 34,0 г кислоты N-ацетил-L-глутаминовой, 0,1 г глицина и 0,5 г трилона Б. После растворения всех компонентов раствор доводят до объема 1000 мл, затем раствор фильтруют в асептических условиях через «миллипор» диаметром 0,22 мкм. Получают 500 ампул по 2 мл.
Пример 7. Фармацевтическая композиция в виде раствора для инъекций.
Аналогично примеру 6 загружают 50,0 г Этоксидола, 20,0 г 2-(диметиламино)этанола, 0,05 г глицина. Получают 500 ампул по 2 мл.
Пример 8. Фармацевтическая композиция в виде раствора для инъекций.
Аналогично примеру 6 загружают 50,0 г Этоксидола, 1,0 г кислоты N-ацетил-L-глутаминовой и 0,05 г трилона Б. Получают 500 ампул по 2 мл.
| Таблица 2 | ||||
| Фармацевтическая композиция Этоксидола в виде раствора для инъекций | ||||
| Наименование показателя качества | Нормы требований качества | Фактические показатели | ||
| Пример 6 | Пример 7 | Пример 8 | ||
| Описание | Бесцветная или слегка окрашенная жидкость | Бесцветная жидкость | Слегка окрашенная жидкость | Бесцветная жидкость |
| Прозрачность | Препарат должен быть прозрачным (ГФХ1, вып.1, с.198) | Прозрачен | Прозрачен | Прозрачен |
| Цветность | Окраска раствора не интенсивнее эталона №7б (ГФ X1, вып.1, с.194) | Не интенсивнее эталона №7б | Не интенсивнее эталона №7б | Не интенсивнее эталона №7б |
| Посторонние примеси | Глутаминовая кислота не более 0,5% | Менее 0,5% | Менее 0,5% | Менее 0,5% |
| Стабильность | 2 года при 20°С | 2 года | 2 года | 2 года |
Противоишемические, церебропротекторные, ноотропные и липидрегулируемые свойства заявляемого вещества установлены на общепринятых стандартных моделях.
Пример 9. Изучение противоишемической активности.
Эксперименты проведены на белых нелинейных крысах-самцах, мышах, кроликах и кошках в сравнении с Анаприлином.
Влияние на соотношение зоны некроза к зоне ишемии при ишемическом повреждении миокарда крыс изучали в дозе 5% от ЛД50. В той же дозе изучали влияние на развитие реперфузионных аритмий. Фибрилляцию желудочков вызывали окклюзией коронарных артерий. Определяли влияние препарата на кардиогемодинамику и перекисное окисление липидов (ПОЛ), индуцированные иммобилизационным стрессом.
Показано, что Этоксидол в дозе 10 мг/кг устраняет фибрилляцию желудочков при окклюзии коронарных артерий и снижает количество животных, у которых возникает фибрилляция желудочков до 2 из 8 опытных в дозе 10 мг/кг и 2 из 9 - в дозе 23 мг/кг.
Этоксидол достоверно увеличивает порог фибрилляции желудочков миокарда кошек в дозе 23,0 мг/кг в период с 5 до 60 мин после окклюзии коронарных артерий, в то время как Анаприлин обладает таким эффектом в изотоксической дозе в период с 30 по 60 мин.
В условиях острой ишемии миокарда в дозе 15 мг/кг оказывает отчетливое кардиопротективное действие на кардиогемодинамику, приближая значения сократимости (dP/dt), АД и другие до уровня интактного контроля.
Этоксидол в дозе 1 мг/кг обладает способностью снижать интенсивность проявления процессов перекисного окисления липидов, вызванных иммобилизацией кроликов в течение 30 дней, о чем свидетельствует снижение уровня малонового диальдегида (МДА) в плазме крови на 46% и в ткани почек. При этом уровень общего холестерина снижается на 41,7%, а индекс атерогенности снижается на 82,9%.
| Таблица 4 | |||
| Изменения показателей кардиогемодинамики (%) у крыс с острой ишемией миокарда в условиях открытой грудной клетки, n=8 | |||
| Время от начала опыта, мин | Регистрируемые параметры | ||
| dp/dt max, % | САД, мм рт.ст. | ЧСС, уд/мин | |
| Исход | 100±4,0 | 98±5,2 | 432±17,0 |
| 5 | -15±2,5 | -15±4,4* | -5±1,4 |
| 10 | -14±5,0 | -18±4,1* | -1±3,6 |
| 15 | -19±4,7 | -18±5,5* | -1±4,0 |
| 20 | -17±4,0 | -22±5,8* | -3±2,7 |
| 30 | -18±4,7 | -22±5,8* | -4±2,2 |
| 40 | -21±4,7 | -23±6,5* | -5±2,7 |
| 50 | -18±4,7 | -24±6,2* | -5±3,0 |
| 60 | -19±4,9 | -20±7,0* | -7±3,0 |
| Примечание: * - различия с исходным уровнем достоверны при р<0,05. |
Таким образом, Этоксидол в эксперименте проявляет выраженное кардиопротективное действие, проявляющееся в снижении альтерации тканей миокарда в условиях ишемии, восстановлении поврежденных ишемией параметров кардиогемодинамики. Кроме того, для него характерно антиоксидантное действие и липидрегулирующий эффект при моделировании стрессобусловленных прооксидантных состояний.
Пример 10. Изучение нейропротективной активности.
Изучение ноотропного действия Этоксидола осуществлялось при использовании 2-х методик:
- изучение влияния Этоксидола на обучаемость условного рефлекса пассивного избегания крыс недоучек;
- изучение влияния Этоксидола на нарушенную память - тест амнезии условного рефлекса пассивного избегания, вызванную скополамином у крыс.
Исследование ноотропных эффектов проводили в сертифицированной установке "Lafayette Instrument Co" (США). Исследование выполнено на белых беспородных половозрелых крысах самцах массой 250-280 г.
Тест на воспроизведение обучаемости проводили через 24 ч после обучения, регистрировали латентный период захода животного в темное отделение и затем регистрировали в течение 180 с число животных, совсем не зашедших в темный опасный отсек и остававшихся на освещенной висячей платформе (крысы, хорошо помнящие ситуацию).
Этоксидол и препарат сравнения Пирацетам вводили однократно внутрь (интрагастрально) при помощи специального зонда в объеме 0,2 мл на 100 г веса крысы за 40 минут до обучения. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду.
Все исследуемые вещества существенно не изменяли латентное время выполнения навыка захода в темную камеру (табл.3). Латентный период захода в темную камеру при выполнении норкового рефлекса при первом помещении животных в камеру не изменялся по сравнению с контролем (табл.5).
После этого осуществляли обучение УРПИ, для чего крыса получала в темной камере небольшое болевое раздражение.
Контрольные животные после обучения и при последующем воспроизведении обученного через 24 ч после обучения помнили о болевом раздражении, полученном в темной камере, и заходили туда с большим латентным периодом. Только 1 крыса из 15-ти совсем не зашла в темную камеру.
Согласно приведенным в таблице 5 результатам Этоксидол в дозе 200 мг/кг и таблетки в дозе 100 мг/кг улучшают обучение условному рефлексу пассивного избегания у крыс недоучек, что выражается в достоверном увеличении латентного времени захода в темную камеру при воспроизведении рефлекса. Пирацетам в дозе 200 мг/кг также улучшал обучение условному рефлексу пассивного избегания по показателю латентного периода выполнения рефлекса и по показателю увеличения процента животных, совсем не зашедших в темную камеру. Таким образом, Этоксидол в дозе 200 мг/кг и таблетки в дозе 100 мг/кг улучшают обучение условному рефлексу пассивного избегания у крыс недоучек и по показателю латентного периода выполнения рефлекса имеет сходную эффективность с Пирацетамом в дозе 200 мг/кг.
Изучение антиамнестического действия Этоксидола в методике скополаминовой амнезии.
Изучение влияния веществ на амнезию осуществляли в сертифицированной установке "Lafayette Instrument Co" (США).
Крысу сажали на ярко освещенную платформу хвостом к открытой гильотинной двери, ведущей в темную камеру. Вследствие норкового рефлекса после нахождения входа в темный отсек камеры крыса переходила в темный отсек. Регистрировали латентное время выполнения этого навыка. Затем крысу оставляли на 180 с в темной камере с целью ее освоения, и крыса почти все время проводила в темной камере.
Для получения амнезии УРПИ животным вводили скополамин (1,0 мг/кг внутрибрюшинно) за 30 минут до обучения. Тест на воспроизведение обученного и амнезию проводили через 24 ч после обучения, для чего крысу опять сажали на платформу хвостом к отверстию и регистрировали:
- латентный период захода животного в темное отделение и
- затем в течение 180 с - число животных, совсем не зашедших в темный опасный отсек и остававшихся на освещенной висячей платформе (крысы, хорошо помнящие ситуацию).
Этоксидол и Пирацетам вводили однократно внутрь в объеме 0,2 мл на 100 г веса крысы за 40 минут до обучения. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду.
В контрольных экспериментах при помещении крысы на освещенную платформу животные с коротким латентным периодом заходят в темную камеру и получают там болевое раздражение (обучение). При воспроизведении рефлекса через 24 часа после обучения крысы помнят обученное, и при помещении их на освещенную платформу животные остаются там и не заходят в темную опасную камеру, где они накануне получили болевое раздражение (обучение) (табл.6).
Скополамин достоверно укорачивает длительность латентного периода захода в темную камеру при воспроизведении рефлекса и достоверно уменьшает (до 20%) число животных, совсем не зашедших в темный отсек камеры при воспроизведении, т.е. помнящих о нанесенном там накануне аверсивном стимуле (табл.6).
Этоксидол в дозе 100 мг/кг достоверно (р≤0,05) увеличивает (в 1,92 раза) длительность латентного периода захода крыс в темный отсек при воспроизведении рефлекса по сравнению с животными, получавшими один скополамин. Наряду с этим, под влиянием препарата наблюдается достоверное повышение (до 50%) числа животных, не зашедших в темный отсек камеры при воспроизведении амнезированного рефлекса, т.е. помнящих о нанесенном аверсивном стимуле (табл.6). Полученные данные свидетельствуют о наличии у Этоксидола в дозе 100 мг/кг отчетливого антиамнестического эффекта.
Пирацетам в дозе 100 мг/кг достоверно (р≤0,05) увеличивает (в 1,8 раза) длительность латентного периода захода в темный отсек при воспроизведении рефлекса, но достоверно не повышает число животных, не зашедших в темный отсек камеры при воспроизведении амнезированного рефлекса.
| Таблица 6 | |||
| Антиамнестическая активность Этоксидола на модели скополаминовой амнезии условного рефлекса пассивного избегания | |||
| Препарат, доза | Латентный период захода в темную камеру (с) | Процент животных, не вошедших в темную камеру | |
| Обучение | Воспроизведение | ||
| Контроль Дист. вода, внутрь |
16,2±2,5 | 163,0±17,0 | 90 |
| Скополамин 1 мг/кг, в/б | 10,1±1,54 | 55,4±21,25* | 20* |
| Этоксидол 100 мг/кг + Скополамин | 14,6±2,63 | 106,42±22,4# | 50# |
| Этоксидол 200 мг/кг + Скополамин | 11,3±2,15 | 75,82±23,0 | 27 |
| Этоксидол раствор 100 мг/кг + Скополамин | 13,9±2,63 | 107,42±22,4# | 50# |
| Пирацетам 100 мг/кг + Скополамин | 12,3±1,91 | 99,23±14,7# | 40 |
| Пирацетам 200 мг/кг + Скополамин | 13,5±1,52 | 105,73±21,4# | 50# |
| * - р<0,05 достоверность различий по t-критерию Стьюдента относительно группы животных, получавших дистиллированную воду; | |||
| * - р<0,05 достоверность значений по критерию Стьюдента относительно контроля с амнезией. |
Таким образом, Этоксидол в дозе 100 мг/кг (раствор) обладает антиамнестическим эффектом, который характеризуется достоверным увеличением латентного времени захода в темную камеру и увеличением числа животных, совсем не зашедших в опасную камеру, по сравнению с показателями контрольных животных с амнезией. Аналогичным эффектом обладает Пирацетам в дозах 100 и 200 мг/кг. По антиамнестическому эффекту Этоксидол в дозе 100 мг/кг не уступает Пирацетаму в дозе 100 мг/кг.
Изучение антиалкогольного действия Этоксидола осуществлялось в опытах на половозрелых беспородных белых крысах-самцах по 2-м тестам: методики открытого поля и методики вращающегося стержня.
Этоксидол и Пирацетам вводили однократно внутрь (интрагастрально) за 40 минут до эксперимента.
Регистрировали горизонтальную двигательную активность по числу пересеченных квадратов, вертикальную двигательную активность по числу вертикальных стоек и исследовательскую активность по числу обследований (заглядываний) отверстий.
Этанол вводили в дозе 1,5 мг/кг внутрибрюшинно и затем через 10 минут вводили исследуемое вещество в дозе 100 мг/кг внутрь (интрагастрально). Регистрацию поведения в открытом поле осуществляли через 40 минут после введения Этоксидола или Пирацетама. При введении дистиллированной воды или одного этанола (контрольные исследования) регистрацию поведения в открытом поле осуществляли через 40 минут после их введения.
В результате проведенных исследований установлено, что этанол в дозе 1,5 г/кг не изменяет горизонтальную двигательную активность, но в то же время достоверно уменьшает вертикальную двигательную активность. Кроме того, этанол значительно и достоверно уменьшает исследовательскую активность, уменьшая число обследованных отверстий (табл.7).
Этоксидол, вводимый в дозе 100 мг/кг (внутрь) интактным животным, вызывает недостоверное снижение горизонтальной и вертикальной двигательной активности и числа обследованных отверстий.
Этоксидол при введении после этанола восстанавливает нарушения поведения крыс в открытом поле, что выражается в достоверном увеличении сниженных под влиянием этанола вертикальных стоек и числа обследованных отверстий (табл.7). При изучении влияния Пирацетама в дозе 100 мг/кг на эффекты этанола установлено, что Пирацетам, так же как Этоксидол, вызывает достоверное увеличение числа вертикальных стоек.
Таким образом, Этоксидол в дозе 100 мг/кг внутрь обладает способностью восстанавливать вызванные этанолом нарушения двигательной активности и ориентировочно-исследовательского поведения животных в открытом поле, что выражается в достоверном увеличении вертикальных стоек и числа обследованных отверстий.
| Таблица 7 | |||
| Антиалкогольный эффект Этоксидола на способность восстанавливать нарушения поведения, вызываемые этанолом, в тесте открытого поля | |||
| Вещество, доза, способ введения | Число горизонтальных перемещений | Число вертикальных перемещений | Число обследованных отверстий |
| Контроль интактный, дист. вода | 24,6±2,02 | 9,5±1,19 | 15,7±1,54 |
| Контроль - Этанол (1,5 г/кг, в/б) | 29,6±2,8 | 5,0±0,7* | 6,9±1,23* |
| Этоксидола (100 мг/кг, внутрь) | 22,1±7,4 | 6,8±1,9 | 9,3±4,7 |
| Этанол (1,5 г/кг, в/б) + Этоксидола (100 мг/кг, внутрь) | 32,3±4,9 | 8,6±1,2# | 9,7±1,4# |
| Этанол (1,5 г/кг, в/б) + Этоксидола (100 мг/кг, внутрь) таблетки | 34,0±4,9 | 7,0±1,9 | 9,8±1,4# |
| Пирацетам (100 мг/кг, внутрь) | 26,4±8,3 | 8,7±2,1 | 12,4±2,1 |
| Этанол (1,5 г/кг, в/б) + пирацетам (100 мг/кг, внутрь) | 21,9±7,1 | 8,2±1,3# | 9,5±2,2 |
| * - р<0,05 достоверность различий по t-критерию Стьюдента относительно группы интактных животных; | |||
| # - р<0,05 достоверность различий по t-критерию Стьюдента относительно группы животных, получавших этанол. |
Пирацетам в дозе 100 мг/кг вызывает только увеличение числа вертикальных стоек. По антиалкогольному действию в тесте открытого поля Этоксидол превосходит Пирацетам.
Нарушение координации движения оценивали в тесте вращающегося стержня (rota rod test) со скоростью оборота - 3 оборота в минуту. При помещении крысы на вращающийся стержень животное в норме, перебирая лапами, удерживается на нем. Животные с побочными эффектами моторного, седативного характера и другими нарушениями не удерживаются на стержне и падают с него. Регистрировали время удерживания на стержне и число животных, упавших с вращающегося стержня в течение 2-х минут.
Установлено, что в контрольной группе крыс, получивших дистиллированную воду, только одно животное из десяти упало со стержня в течение 2-х минут регистрации. Этанол в дозе 1,5 мг/кг резко нарушает у крыс координацию движений: после введения этанола на вращающемся стержне не удержалось 100% животных (табл.8).
Этоксидол в дозе 100 мг/кг внутрь не нарушал координацию движений у крыс на вращающемся стержне. Введение Этоксидола на фоне этанола приводило к восстановлению нарушенной этанолом координации движений. Под влиянием Этоксидола наблюдалось увеличение до 50% числа животных, удержавшихся на стержне (контроль после этанола - 0%) и достоверное увеличение (в 4,6 раза по сравнению с контролем после этанола) времени удерживания на вращающемся стержне.
| Таблица 8 | ||
| Антиалкогольный эффект Этоксидола по способности восстанавливать нарушение координации движений, вызванное этанолом в тесте вращающегося стержня | ||
| Вещество, доза, способ введения | Время удерживания на стержне, с | Процент животных, удержавшихся на стержне в течение 120 с |
| Контроль интактный, дистиллированная вода | 103,5±12,02 | 90 |
| Контроль - Этанол (1,5 г/кг, в/б) | 18,5±7,82* | 0* |
| Этоксидол (100 мг/кг, внутрь) | 110,7±11,9 | 80 |
| Этанол (1,5 г/кг, в/б) + Этоксидол (100 мг/кг, раствор) | 85,8±16,05# | 60# |
| Пирацетам (100 мг/кг, внутрь) | 108,5±17,1 | 90 |
| Этанол (1,5 г/кг, в/б) + пирацетам (100 мг/кг, внутрь) | 58,3±12,8# | 50# |
| * - р<0,05 достоверность различий по t-критерию Стьюдента относительно группы интактных животных. | ||
| # - р<0,05 достоверность различий относительно группы животных, получавших этанол. |
Пирацетам в дозе 100 мг/кг внутрь не нарушал координацию движений у крыс на вращающемся стержне. Введение Пирацетама на фоне этанола приводило к восстановлению нарушенной этанолом координации движений. Под влиянием Пирацетама наблюдалось повышение до 50% числа животных, не удерживающихся на стержне (контроль после этанола - 0%), и достоверное увеличение (в 3,1 раза по сравнению с контролем после этанола) времени удерживания на вращающемся стержне.
Таким образом, Этоксидол в дозе 100 мг/кг раствор обладает выраженным антиалкогольным действием в тесте вращающегося стержня, что выражается в восстановлении под влиянием препарата нарушенной этанолом координации движений. Под влиянием Этоксидола достоверно увеличивается (в 4,6 раза) время удерживания крыс на вращающемся стержне и увеличивается до 60% число животных, удержавшихся на стержне (контроль с этанолом - 0%). По влиянию на нарушенную этанолом координацию движений Этоксидол превосходит Пирацетам.
Пример 11. Экспериментальное изучение эффективности применения Этоксидола при ишемии мозга (церебропроторная активность).
Для исследования использовали здоровых половозрелых животных (крысы), прошедших карантин 14 дней, в эксперименте использовали животных одной возрастной группы (6 месяцев).
Исследования проведены на 3 группах лабораторных животных:
- контрольная - животные с моделированием ишемии мозга;
- животные с ишемией мозга, которым вводили Этоксидол в дозе 5 мг/кг;
- животные с ишемией мозга, которым вводили Этоксидол в дозе 20 мг/кг.
Этоксидол вводили внутрибрюшино профилактически (за 30 минут до моделирования патологии) и терапевтически (сразу после ишемии).
1. Для создания ишемии головного мозга использовали несколько стандартных моделей [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под ред. Р.У.Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.; Сернов Л.Н., Гацура В.В. Элементы экспериментальной фармакологии. - М., 2000. - 352 с.]:
гравитационные перегрузки в кранио-каудальном положении;
пережатие обеих сонных артерий у белых крыс на 10-15 мин на фоне системной артериальной гипотензии до 40 мм рт.ст.;
в качестве модели ишемии мозга использовали билатеральную окклюзию обеих сонных артерий в течение 24-х часов.
Тотальную ишемию мозга моделировали с помощью гравитационных перегрузок в кранио-каудальном положении. Проведенные исследования показали, что при моделировании гравитационных перегрузок [Гаевый М.Д., Аджиенко Л.М., Макарова Л.М. Ишемия головного мозга, вызванная гравитационной перегрузкой. // Экспер. и клин. фармакол. - 2000. - Т.63, №3, с.63-64] в кранио-каудальном направлении происходит снижение артериального давления в сонной артерии до 0, т.е. у животных имеет место тотальная ишемия мозга. Для моделирования гравитационных перегрузок использовали центрифугу диаметром 2 м. Бодрствующих крыс помещали в специальные контейнеры-пеналы, укрепленные к концам рычагов центрифуги, а мощный двигатель в течение 10 с создавал необходимую степень гравитации. На первом этапе работы проводили исследования по выявлению наиболее эффективных доз Этоксидола, способствующих увеличению выживаемости животных при гипергравитации. С этой целью животным вводили Этоксидол внутрибрюшинно в дозах 5, 10 и 100 мг/кг профилактически в течение 3 суток до моделирования патологии. Величина гравитационных перегрузок в данном случае подбиралась так, чтобы летальность животных в контрольной группе составляла не более 20%. Критерием церебропротективного действия являлось увеличение выживания животных (в %) в сравнении с контрольными животными.
Объемную скорость мозгового кровотока (МК) у крыс регистрировали методом водородного клиренса с помощью платинового электрода, расположенного на поверхности сагиттального синуса в области стока синусов. Метод основан на регистрации скорости вымывания предварительно введенного водорода из мозговой ткани и позволяет определить объемную скорость МК [Гаевый М.Д., Аджиенко Л.М., Макарова Л.М. Ишемия головного мозга, вызванная гравитационной перегрузкой. // Экспер. и клин. фармакол. - 2000. - т.63, №3, с.63-64].
Оценку МК проводили по кривой изменения напряжения водорода на электроде полярографическим способом и рассчитывали по формуле (1) для вычисления органного кровотока в расчете на 100 г мозга.
где Т 1/2 - время (в минутах), за которое значение кривой клиренса снижается в два раза по логарифмической шкале;
λ - отношение количества водорода в 1 г ткани к количеству водорода в 1 мл крови.
Для стабилизации дыхания у наркотизированных крыс использовали боксовый дыхательный аппарат.
Определение ауторегуляторных реакций сосудов мозга
Необходимым условием для изучения регуляторных реакций сосудов мозга является моделирование острых сдвигов системного артериального давления (САД). Для этой цели использовали кровопускание, позволяющее снизить САД до любого уровня, а последующая инфузия крови в артериальное русло позволяет поднимать САД до исходного уровня.
Учитывая то, что глубокий наркоз угнетает регуляторные реакции мозговых сосудов, исследования проводились под легким наркозом. Поскольку условием для изучения регуляции мозгового кровотока является стабильный режим оксигенации крови, опыты проводились при искусственном дыхании под контролем pO2 и рН крови с помощью биологического микроанализатора.
О характере цереброваскулярных реакций судили по показаниям МК и сопротивлении сосудов мозга (ССМ) при различных уровнях перфузионного давления. Оценку регуляторных возможностей системы внутричерепного кровообращения производили на основании коэффициента регуляции, который рассчитывали по формуле (2):
где К - коэффициент регуляции;
Ro и Po - исходные значения сопротивления (мм рт.ст./100 г/ мин/ мл) и давления (мм рт.ст.) в сосудах мозга;
ΔR и ΔР - изменения сопротивления (мм рт.ст./100 г/ мин/ мл) и давления (мм рт.ст.) в сосудах мозга при воздействии на систему.
При анализе коэффициента регуляции учитывали, что если К=0, регуляция в системе отсутствует, значение К>0 свидетельствует о наличии ауторегуляции, причем при К<1 происходит неполная ауторегуляция, при К=1 - полное регулирование. Когда К>1 - это свидетельствует о гиперкомпенсации, К<0 свидетельствует об извращенных патологических реакциях, приводящих к углублению нарушений, вызванных внешней действующей силой.
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭТОКСИДОЛА НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ТОТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ МОЗГА
Изучение Этоксидола на модели тотальной ишемии головного мозга проведено на модели, вызываемой гравитационными перегрузками в кранио-каудальном положении. Критерием церебропротекторного действия явился % выживания животных. Этоксидол вводили внутрибрюшинно профилактически в дозах 1, 5, 20 и 100 мг/кг (субстанция, таблетки и раствор).
| Таблица 9 | |
| Влияние Этоксидола на выживаемость животных при гравитационных перегрузках в кранио-каудальном положении | |
| Условие опыта | Выживаемость, % |
| Контроль | 33,3±6,7 |
| Этоксидол 1 мг/кг | 50,0±7,1 |
| Этоксидол 5 мг/кг | 66,6±6,7* |
| Этоксидол 20 мг/кг | 66,6±6,7* |
| Этоксидол 100 мг/кг | 50,0±7,1 |
В контрольной серии опытов выживаемость животных составила в среднем 33.3% (табл.9). Введение этоксидола в дозе 5 и 20 мг/кг оказывало положительное влияние на изучаемый показатель, увеличивая выживаемость до 66,6% (табл. 9), т.е. на 33,4% относительно животных контрольной группы. Применение Этоксидола в дозах 1 и 100 мг/кг не приводило к статистически значимому изменению выживаемости крыс в условиях тотальной ишемии головного мозга (табл.9).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о целесообразности изучения Этоксидола в качестве потенциального церебротпротектора в дозах 5 и 20 мг/кг.
Пример 12. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭТОКСИДОЛА НА МОЗГОВОЙ КРОВОТОК И ЕГО АУТОРЕГУЛЯЦИЮ В ПОСТИШЕМИЧЕСКОМ ПЕРИОДЕ
Для оценки влияния Этоксидола на мозговой кровоток и его ауторегуляцию в условиях острой ишемии мозга использовалась модель циркуляторной ишемии мозга, которая создавалась путем окклюзии обеих сонных артерий у крыс в течение 12 мин с одновременным снижением САД до 40 мм рт.ст.
Контрольные опыты по исследованию изменения динамики показателей мозгового кровотока (МК), системного артериального давления (САД) и сопротивления сосудов мозга (ССМ) проводились на 2-х группах животных. В первой группе находились животные, у которых не моделировалась ишемия, во второй - животные с ишемией, у которых изучали показатели в постишемическом периоде.
В 1 группе крыс на протяжении всего опыта (60 мин) не было выявлено существенных изменений со стороны МК, САД, ССМ (табл. 10). Противоположная картина наблюдалась у животных после ишемии (табл. 10). Так, уже на 5 минуте реперфузии наблюдаются выраженные изменения всех изучаемых показателей: уменьшение объемной скорости МК на 47,6% и увеличение ССМ на 71% по сравнению с исходом (табл.10). Кроме того, на 5-15 минутах реперфузии у животных контрольной группы регистрировали снижение САД на 19,9% (табл.10). Выраженные нарушения церебральной гемодинамики у животных с острой ишемией мозга сохранялись до конца периода наблюдения: снижение МК (на 49,2%) и САД (на 32,7%), а также увеличение ССМ (на 33,7%) (табл.10). Таким образом, в постишемическом периоде констатировали существенное снижение общего кровотока в головном мозге, обусловленное как гипотензией, так и повышением тонуса церебральных сосудов.
| Таблица 10 | |||
| Динамика изменений показателей МК, САД и ССМ в контрольных опытах в до- и постишемическом периоде | |||
| Время наблюдений (мин) | Исследуемые показатели | До ишемии (1 группа) | После ишемии (2 группа) |
| Исходные показатели | МК | 89,2±6,1 | 101,4±8,4 |
| САД | 119,4±2,3 | 122,5±3,9 | |
| ССМ | 1,34±0,10 | 1,24±0,10 | |
| Изменения показателей в % от исходных величин | |||
| 5 | МК | -4,8±2,9 | -47,6±1,8x* |
| САД | -2,7±2,1 | -18,2±2,6x* | |
| ССМ | +2,2±4,3 | +71,0±20,1х* | |
| 15 | МК | -8,7±5,2 | -37,7±5,2x* |
| САД | -4,1±3,1 | -19,9±3,9x* | |
| ССМ | +5,2±4,6 | +40,3±16,7х* | |
| 30 | МК | -8,3±2,8 | -40,8±4,5x* |
| САД | -6,20±4,2 | -27,1±6,1x* | |
| ССМ | +2,2±2,5 | +60,1±17,8x* | |
| 60 | MK | -8,5±5,2 | - |
| 51,8±5, | |||
| 5x* | |||
| САД | -8,30±3,8 | -31,8±6,1x* | |
| CCM | 0,0±4,1 | +49,5±13,2x* | |
| Примечание: | |||
| обозначены статистически достоверные (Р<0,05) сдвиги параметров | |||
| х - относительно исходных значений, | |||
| * - во 2-й группе в сравнении с 1-й группой. |
При изучении ауторегуляторных реакций сосудов головного мозга было установлено, что у животных без ишемии снижение САД до 60 мм рт.ст. сопровождалось снижением мозгового кровотока в среднем на 17,4±6,4% и существенным снижением сосудистого сопротивления мозга (36,3±4,8%) [Виленский Б.С. Инсульт: профилактика; диагностика, лечение. / СПб.: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2002. - 327 с.]. Это свидетельствует о способности мозговых сосудов сохранять регуляторные механизмы при изменении САД в указанных пределах. Снижение САД до 40 мм рт.ст. сопровождается значительным уменьшением сосудистого сопротивления мозга на 47,9±0,6 (табл. 11). Следовательно, срыв ауторегуляторных реакций мозговых сосудов у наркотизированных животных без ишемии происходит при САД ниже 60 мм рт.ст.
| Таблица 11 | |||
| Динамика изменений показателей ауторегуляторных реакций мозговых сосудов в контрольных опытах | |||
| САД мм рт.ст. | Исследуемые показатели | Животные без ишемии | Животные после ишемии |
| Исходные показатели | |||
| 120 | МК | 127,0±8,1 | 107,6±4,3 |
| ССМ | 0,98±0,07 | 1,10±0,04 | |
| Изменения показателей в % от исходных величин | |||
| 100 | МК | -0,1±2,0 | -26,6±2,3х* |
| ССМ | -16,7±0,1x | +18,8±3,6x* | |
| Ка | 0,75 | -0,80 | |
| 80 | МК | -11,4±6,7 | -38,3±2,1x* |
| ССМ | -21,7±5,7x* | +13,8±4,0x* | |
| Ка | 0,85 | -0,63 | |
| 60 | МК | -17,4±6,4x | -44,1±1,2х* |
| ССМ | -36,3±4,8x | -6,8±4,3* | |
| Ка | 0,97 | 0,20 | |
| 40 | МК | -15,6±6,1x* | -53,3±1,0x* |
| ССМ | -58,5±4,8x | -25,5±3,4x | |
| Ка | 0,70 | 0,51 | |
| Примечание: | |||
| обозначены статистически достоверные (Р<0,05) сдвиги параметров | |||
| х - относительно исходных значений, | |||
| * - по сравнению с животными без ишемии мозга. |
В контрольных опытах в постишемическом периоде у крыс снижение САД до 100 мм рт.ст. приводило к достоверному снижению мозгового кровотока (26,6±2,3%) и увеличению сопротивления (18,8±3,6%) сосудов мозга относительно исходного уровня, а также к значительному падению коэффициента ауторегуляции (0,80) (табл.11). Таким образом, у данной группы животных уже при снижении САД до 100 мм рт.ст. происходит извращение ауторегуляторных реакций сосудов мозга. При дальнейшем снижении САД мозговой кровоток продолжал снижаться и при 40 мм рт.ст, составлял менее 50% от исходного уровня (табл.11). Полученные данные свидетельствуют о расстройстве в постишемическом периоде ауторегуляции мозгового кровообращения.
Введение Этоксидола в дозе 5 мг/кг в условиях экспериментальной нормы на 60 минуте опыта снижает тонус мозговых сосудов на 19,2±2,5% относительно исходных величин. На мозговой кровоток Этоксидол в дозе 5 мг/кг статистически значимое влияния оказывал лишь на 15 минуте, повышая его на 7,0±3,6% выше исходных значений (табл.12).
При изучении влияния Этоксидола в дозе 5 мг/кг на реактивность мозговых сосудов при ступенчатом снижении САД выявлено, что в условиях экспериментальной нормы объект исследования значительным образом способствует поддержанию МК даже при САД 40 мм рт.ст., о чем свидетельствует Ка, равный 0,84 (табл. 13).
Профилактическое введение объекта исследования в дозе 5 мг/кг препятствует развитию постишемической гипоперфузии (табл.12). При анализе показателя САД установлено, что Этоксидол препятствует развитию постишемической гипотензии и патологической вазоконстрикции в течении всего периода реперфузии.
При оценке ауторегуляторных реакций в постишемическом периоде на фоне предварительного введения Этоксидола в дозе 5 мг/кг установлено, что ступенчатое снижение САД до 60 мм рт.ст. приводит к гиперауторегуляторным реакциям сосудов мозга (табл.13).
Терапевтическое введение Этоксидола способствует не только сохранению ауторегуляторных реакций сосудов мозга, но даже приводит к гиперауторегуляции при снижении САД от 100 до 40 мм рт.ст., т.е. при лечебном применении более эффективно, чем при профилактическом. Этоксидол способствует сохранению стабильного мозгового кровотока при дозированной гипотензии (табл.13).
| Таблица 13 | ||||
| Влияние Этоксидола в дозе 5 мг/кг на показатели ауторегуляторных реакций сосудов мозга | ||||
| САД мм. рт.ст. | Исследуемые показатели | Экспериментальная норма | Профилактическое | Терапевтическое введение |
| Исходные показатели | ||||
| 120 | МК | 101,0±7,0 | 88,6±5,7 | 74,8±7,3 |
| CCM | 1,20±0,07 | 1,37±0,14 | 1,66±0,13 | |
| Изменения показателей в % от исходных величин | ||||
| 100 | MK | +1,5±1,0 | -2,2±1,2* | +20,5±9,0х* |
| CCM | -14,0±1,5x | -6,8±1,3x* | -18,5±5,7 | |
| Ка | 1,20 | 0,96 | 1,40 | |
| 80 | MK | +4,7±4,5 | +2,4±7,3* | +42,0±10,8х* |
| CCM | -19,3±3,6x | -24,0±5,8х* | -47,0±4,0x* | |
| Ка | 1,26 | 0,91 | 1,64 | |
| 60 | MK | -0,8±11,9 | +8,8±2,8х* | +37,5±6,9x* |
| CCM | -36,7±8,8x | -49,6±1,2x* | -60,3±1,8x* | |
| Ка | 1,08 | 1,41 | 1,53 | |
| 40 | MK | -15,5±2,2x | -15,4±3,1x* | +6,3±4,0* |
| CCM | -45,2±3,4х* | -55,2±2,9х* | -66,0±1,5x* | |
| Ка | 0,84 | 0,72 | 1,37 | |
| Примечание: | ||||
| обозначены достоверные сдвиги (Р<0.05) относительно: | ||||
| х - исходных значений, | ||||
| * - животных контрольной группы. |
Пример 13. Исследование липидрегулирующей активности Этоксидола
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Оценка липидрегулирующей активности Этоксидола. Поскольку необходимым условием изучения гиполипидемической активности новых соединений является оценка их влияния на показатели липидного обмена у животных с нормальным содержанием липидов в сыворотке крови (нормолипидемические животные), было изучено влияние Этоксидола на данный показатель. Оценка липидрегулирующей активности исследуемого препарата in vivo производилась при его курсовом 10 дневном введении нормолипидемическим крысам в дозе 10,0 мг/кг (внутрижелудочно в 2% крахмальном геле).
2. Липидрегулирующую активность Этоксидола in vitro изучали на модели индуцированного этанолом липосинтеза в гомогенате печени крыс. Отмытую физиологическим раствором печень гомогенизировали, используя в качестве среды раствор Кребса-Рингера (128 ммоль NaCl, 1,4 ммоль CaCl2, 1,4 ммоль MgSO4, 5,2 ммоль KCl, 0.18 ммоль NaH2PO4, рН 7.4), и в пробы, содержащие в 1 мл 100 мг гомогената, добавляли спиртовый раствор Этоксидола в концентрации 1×10-5 М. В качестве контроля использовали пробы, содержащие 20 мкл этанола. После инкубации (1 час, 37°С) из гомогената экстрагировали липиды и анализировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).
3. Оценка гиполипидемической активности Этоксидола на модели экспериментальной гиперлипидемии.
Гиперлипидемию индуцировали у беспородных крыс-самцов массой 220-250 г атерогенным рационом, содержавшим в масляной суспензии 10% холестерина и 1% холевой кислоты (из расчета 1,0 мл жировой нагрузки на 100 г массы тела) [Парфентьева Е.П., Василенко Ю.К., Лисевицкая Л.И. и др. Влияние урсоловой кислоты на некоторые показатели липидного обмена при экспериментальном атеросклерозе. - Вопр. мед. химии.- 1980, №2, c.174-179].
Экспериментальным животным вводили жировую суспензию (зондом, внутрижелудочно) в течение 10 дней и одновременно внутрижелудочно вводили Этоксидол (в 2% крахмальном геле) в дозе 10,0 мг/кг и используемую в качестве препарата сравнения никотиновую кислоту в той же дозе.
Для исследования извлекали образцы крови, печени, мозга и аорты после декапитации, проводимой после 16-18-часового голодания.
1.2. Биохимические методы исследования
Гиполипидемическую активность Этоксидола оценивали по степени торможения индуцированной гиперлипидемии, анализируя следующие биохимические показатели:
1) в сыворотке крови
- общий холестерин (ХС-общий),
- холестерин ЛПВП (ХС-ЛПВП),
- холестерин ЛПНП (ХС-ЛПНП),
- холестерин ЛПОНП (ХС-ЛПОНП),
- триглицериды (ТГ)
2) в печени
- ХС-общий,
- липидный состав: фосфолипиды (ФЛ), свободный холестерин (СХС), неэтерифицированные жирные кислоты (НЭЖК), триглицериды (ТГ) и эфиры холестерина (ЭХС).
Содержание ХС в сыворотке крови определяли методом Илька [Родионова Л.П. Модификация метода определения содержания триглицеридов в сыворотке крови. - Лаб. Дело. - 1980, №5, с.297-299], ХС-ЛПВП оценивали в супернатанте после гепарин - марганцевой преципитации ЛПОНП+ЛПНП [Лабораторные методы исследования в клинике. Под ред. В.В. Меньшикова, М.: Медицина, 1987]. Определение ХС-ЛПНП проводили путем расчета по формуле [Кейтс М. Техника липидологии. - М.: Мир, 1975, с.74-76]:
ХС-ЛПНП=ХС-общий - (ТГ/5+ХС-ЛПВП),
где отношение ТГ/5 соответствует содержанию ХС - ЛПОНП.
Холестериновый коэффициент атерогенности (Кхс) рассчитывали по [Величко Л.Н., Тимофеев В.П., Шефер И.А. Микрометод денситометрического определения фракций фосфолилидов крови тонкослойной хроматографией на пластинах "silufol UV-254". - Вопр. мед. химии. - 1980, №2, с.275-277].
Содержание в сыворотке крови ТГ определяли общепринятым методом [Грибанов ГА., Сергеев С.А. Экспресс-микроанализ общих липидов сыворотки крови и их фракций. - Вопр. мед. Химии, - 1975, т.21, №6, с.652-655].
Содержание ХС в печени и аорте оценивали модифицированным методом Илька, проводя предварительную экстракцию липидов [Мирошкиченко В.П., Громашевская Л.А., Касаткина М.Г. и др. Определение содержания желчных кислот и холестерина в печени. - Лаб. Дело, 1978, №3, с.149-153].
Экстракцию липидов из гомогената печени проводили по методу Фолча в модификации Кейтса. Анализ липидного состава тканей и органов осуществляли методом ТСХ на пластинках "силуфол", используя для оценки общих липидов систему растворителей гександиэтиловый эфир-уксусная кислота (80:20:2), а для фосфолипидого спектра - систему растворителей хлороформ - метанол (65:25:4). Индивидуальные фракции липидов оценивали спектрофотометрически (Спекол-221) после элюирования зон липидов, обнаруженных 10% спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты.
Статистическую оценку достоверности полученных результатов проводили с использованием параметрического критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Изучение гиполипидемической активности Этоксидола.
Проведенные исследования показали, что Этоксидол не вызывал изменений содержания ТГ и ХС-общего в сыворотке крови и не оказывал влияния на соотношение атерогенных и антиатерогенных фракций липопротеидов у крыс с нормальным уровнем липидов. При курсовом введении Этоксидола не отмечено также повышение содержания ХС в печени экспериментальных животных (табл.14).
2. Первичная оценка липидрегулирующей активности Этоксидола in vitro была проведена на модели этанол-индуцированного липосинтеза в гомогенате печени крыс. Результаты влияния Этоксидола на липидный состав гомогената печени представлены в табл.15. Как видно из приведенных данных, в модельной системе по сравнению с интактным материалом наблюдалась тенденция к увеличению содержания всех липидных компонентов. Инкубация гомогената печени в присутствии 1×10-5 M Этоксидола сопровождалась уменьшением содержания липидных фракций. Положительная направленность действия препарата выразилась в уменьшении содержания общего ХС за счет его свободной формы, а также значительном уменьшении содержания ТГ - более чем в 2 раза в сравнении с контрольной группой (табл.15).
| Таблица 14 | |||
| Влияние Этоксидола в дозе 10 мг/кг на содержание холестерина и триглицеридов в сыворотке крови и печени нормолипидемических крыс (М±m, n=10) | |||
| Показатель | Единицы измерения | Интактные животные | Этоксидол |
| Сыворотка крови | |||
| Холестерин (ХС) общий | мг/100 мл | 82,3±5,1 | 85,9±6,2 |
| ХС-ЛПВП | -"- | 56,3±5,8 | 55,5±4,9 |
| ХС-(ЛПНП+ЛПОНП) | -"- | 24,2±3,3 | 28,7±3,8 |
| Триглицериды | -"- | 66,1±6,5 | 70,5±6,2 |
| Печень | |||
| ХС-общий | мг/г ткани | 1,67±0,14 | 1,88±0,18 |
| Таблица 15 | |||
| Влияние Этоксидола в концентрации 10-5М на липидный состав гомогената печени крыс, мг/г ткани (М±m, n=10) | |||
| Показатель | 1. Гомогенат печени интактных животных | 2. Гомогенат печени + этанол (контроль) | 3. Гомогенат печени + этанол + Этоксидол |
| Холестерин общий | 1,52±0,11 | 1,70±0,11 | 1,14±0,012** |
| Фосфолипиды | 1,94±0,16 | 2,25±0,25 | 1,63±0,26 |
| Холестерин свободный | 1,24±0,08 | 1,40±0,08 | 0,91±0,11** |
| НЭЖК | 0,71±0,06 | 0,85±0,07 | 0,70±0,05 |
| Триглицериды | 0,85±0,08 | 1,15±0,07 | 0,50±0,11*** |
| Эфиры холестерина | 0,60±0,07 | 0,69±0,08 | 0,52±0,07 |
| Примечание: | |||
| ** - Р<0,01 к группе 2 контроль, | |||
| *** - Р<0,001 к группе 2 контроль. |
3. Сравнительное изучение гиполипидемической активности Этоксидола и никотиновой кислоты
Исследование гиполипидемического действия Этоксидола и препарата сравнения: известного гиполипидемического средства никотиновой кислоты, проведено на модели экспериментальной гиперлипидемии у крыс.
Как видно из данных, приведенных в табл.16, воздействие атерогенной нагрузки в течение 10 дней сопровождалось повышением уровня ТГ и общего ХС в сыворотке крови крыс, причем наблюдаемая гиперхолестеринемия развилась за счет атерогенных фракций липопротеидов на фоне снижения уровня ХС-ЛПВП. Индекс атерогенности возрос до 2,66±0,39, превышая этот показатель группы интактных животных более чем в 3 раза. Гиперхолестеринемия сопровождалась накоплением ХС в печени (7,12±0,70 по сравнению с показателем в контрольной группе 1,85±0,17).
Введение экспериментальным животным Этоксидола в дозе 10 мг/кг в течение 10 дней замедлило развитие патологического процесса: снизился уровень ТГ (в 1,6 раза) и ХС в составе атерогенных фракций липопротеидов (в 1,8 раза). За счет значительного повышения уровня ХС-ЛПВП величина коэффициента атерогенности снизилась в 4,2 раза.
В аналогичных условиях для препарата сравнения - никотиновой кислоты - отмечен выраженный гиполипидемический эффект: никотиновая кислота снижала уровень ТГ и общего ХС, способствуя накоплению антиатерогенных липопротеидов.
Следует отметить, что при сравнимых показателях коррекции липидного обмена, выявленных для Этоксидола и никотиновой кислоты, Этоксидол обладал преимуществом, способствуя нормализации содержания ХС в печени до нормы, тогда как при введении никотиновой кислоты отмечалось 4-кратное по сравнению с нормой превышение этого показателя.
Таким образом, проведенные исследования показали, что Этоксидол в отличие от Анаприлина не проявляет нежелательного кардиодепрессивного действия, напротив, он проявляет выраженное кардиопротективное действие, кроме того, для него характерно антиоксидантное действие и липидрегулирующий эффект при моделировании стрессобусловленных прооксидантных состояний.
Этоксидол не уступает по ноотропному действию широко применяемому в медицинской практике препарату Пирацетам, а по антиалкогольному действию превосходит последний.
В условиях лабораторного эксперимента показано положительное влияние Этоксидола в профилактике и лечении ишемии мозга в качестве церебропротектора.
Показано, что Этоксидол обладает выраженной гиполипидемической активностью в условиях экспериментальной гиперлипидемии, способствуя снижению в крови уровня триглицеридов и холестерина, атерогенных липопротеидов и не вызывает изменений липидного обмена при курсовом введении нормолипидемическим крысам.
Важным компонентом противоатерогенного влияния Этоксидола является его способность повышать содержание холестерина в составе антиатерогенной фракции липопротеидов, что обеспечивает препарату преимущество перед известным гиполипидемическим средством антиоксидантной природы - пробуколом, для которого известно потенциально неблагоприятное снижение уровня ЛПВП.
Установлено, что по выраженности гиполипидемического действия Этоксидол сходен с известным лекарственным средством - никотиновой кислотой, однако обладает преимуществом, заключенным в способности существенно снижать содержание холестерина в печени, тогда как никотиновая кислота усиливает обусловленное гиперлипидемией накопление холестерина в этом органе.
Зарегистриророванные эффекты Этоксидола определяют его потенциальную эффективность при использовании у человека в качестве препарата, обладающего липидрегулирующей активностью, снижающего содержание атерогенных фракций холестерина и триглицеридов и повышающего уровень антиатерогенных фракций холестерина в составе липопротеидов высокой плотности. Полученные результаты позволяют рассматривать Этоксидол в том числе и как средство профилактики и лечения поражений сосудов при их повреждении атеросклеротическими бляжками - коронарных, церебральных и других, играющих определяющую роль при инфарктах и инсультах.
Все вышеперечисленные свойства Этоксидола делают его перспективным в производстве лекарственных препаратов для профилактики и лечения сердечно-сосудистых, психических заболеваний, ишемии мозга и ожирения.
1. 2-Этил-6-метил-3-гидроксипиридинийгидроксибутандиоат формулы
2. Применение соединения 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридинийгидроксибутандиоат, отличающееся тем, что оно обладает противоишемической активностью.
3. Применение соединения 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридинийгидроксибутандиоат, отличающееся тем, что оно обладает церебропротекторной активностью.
4. Применение соединения 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридинийгидроксибутандиоат, отличающееся тем, что оно обладает нейротропной активностью.
5. Применение соединения 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридинийгидроксибутандиоат, отличающееся тем, что оно обладает липидрегулирующей активностью.
6. Твердая дозированная фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит соединение 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридинийгидроксибутандиоат, обладающее противоишемической, церебропротектерной, нейротропной и липидрегулирующей активностью.
7. Твердая дозированная фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что она выполнена в виде таблетки при соотношении действующего вещества и целевых добавок, мас.%:
| действующее вещество | 0,05-40,0 |
| целевые добавки | 60,0-99,95 |
8. Твердая дозированная фармацевтическая композиция по любому из пп.6 и 7, отличающаяся тем, что в качестве целевых добавок она содержит необязательно одновременно крахмал, натрия кроскармеллозу, поливинилпирролидоны, сахара, производные целлюлозы, аэросил, глицин, N-ацетил-L-глутаминовую кислоту, 2-(диметиламино)этанол, соли стеариновой кислоты, коррегирующие вещества при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| крахмал | 0,0-15,0 |
| натрия кроскармеллоза | 0,0-10,0 |
| поливинилпирролидоны | 0,0-10,0 |
| сахара | 0,0-20,0 |
| производные целлюлозы | 0,0-50,0 |
| аэросил | 0,0-10,0 |
| глицин | 0,0-10,0 |
| N-ацетил-L-глутаминовая кислота | 0,0-15,0 |
| 2-(диметиламино)этанол | 0,0-10,0 |
| соли стеариновой кислоты | 0,0-1,0 |
| коррегирующие вещества | 0,0-10,0 |
9. Жидкая фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она содержит соединение 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридинийгидроксибутандиоат, обладающее противоишемической, церебропротектерной, нейротропной и липидрегулирующей активностью.
10. Жидкая фармацевтическая композиция по п.9, отличающаяся тем, что она выполнена в виде раствора для инъекций при соотношение действующего вещества и целевых добавок, мас.%:
| действующее вещество | 0,05-40,0 |
| целевые добавки | 60,0-99,95 |
11. Жидкая фармацевтическая композиция по любому из пп.9 и 10, отличающаяся тем, что в качестве целевых добавок она содержит необязательно одновременно глицин, N-ацетил-L-глутаминовую кислоту, 2-(диметиламино)этанол, трилон Б при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| глицин | 0,0-10,0, |
| N-ацетил-L-глутаминовая кислота, | 0,0-50,0 |
| 2-(диметиламино)этанол | 0,0-20,0 |
| трилон Б | 0,0-5,0 |
12. Применение соединения 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридинийгидроксибутандиоат по любому из пп.1-11 в производстве лекарственных препаратов для профилактики и лечения сердечно-сосудистых, психических заболеваний, ишемии мозга и ожирения.
