Средство для лечения актиномикоза крупного рогатого скота
Владельцы патента RU 2378001:
Государственное научное учреждение Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)
Изобретение относится к области ветеринарии. Средство для лечения актиномикоза содержит водный раствор цитоплазматичсской фракции гриба Aktinomyces bovis, содержащей белки с молекулярной массой от 20 кДа до 90 кДа 1,1-1,3 мг/мл, холестерин, 0,25-0,3 мМ/л, триглицериды 0,9-1,0 мМ/л, при соотношении воды и действующего вещества
1:1 и содержит 0,4% раствор формалина. 1 табл.
Изобретение относится к области ветеринарии, в частности - к препаратам для лечения актиномикоза крупного рогатого скота.
Актиномикоз - инфекционная болезнь, характеризующаяся развитием гранулемы (актиномикомы). Актиномикозом чаще болеет крупный рогатый скот, реже свиньи, овцы, козы и лошади. Известны случаи заболевания человека, собак, кошек и кроликов. Возбудитель болезни - лучистый гриб Aktinomyces. Природным резервуаром патогенных актиномицетов является почва, растения. Заболевание возникает вследствие внедрения в ткани зараженных грибом Aktinomyces остей колосьев при жевании, незначительных повреждениях кожи, эрозиях слизистых оболочек, при загрязнении кастрационной раны соломенной подстилкой. Клиническое проявление актиномикоза у животных зависит от места локализации процесса, степени вирулентности возбудителя и устойчивости организма. Чаще всего процесс локализуется на коже, языке, глотке, нижней челюсти, поражаются подчелюстные лимфатические узлы и костная ткань.
Известен препарат для лечения актиномикоза (см. патент РФ № 2297839 по кл. МПК A61K 33/18, опуб. 27.04.2007), содержащий йод, йодистый калий и гипохлорит натрия. Препарат вводят либо непосредственно в актиномикому (при начальной форме заболевания), либо внутривенно (при поражении внутренних органов).
Однако основным недостатком препарата, как и всех йод-содержащих лекарств), существенно ограничивающим их применение, является сильное раздражающее действие на ткани (см., например, www.katzoo.ru). Кроме этого препарат требует длительного применения - до 16 дней и имеет ограниченный срок хранения - до 20 суток, что неудобно в условиях хозяйств.
Известен также препарат антибиотического действия (см. патент РФ № 2136272 по кл. МПК A61K 31/18, опуб. 10.09.1999), содержащий эпироприн и дапсон.
Эпироприн - (2,4-диамино-5-[3,5-диэтокси-4-(пиррол-1-ил)-бензил] пиримидин (Epiroprim).
Дапсон - (4,4'-диамино-дифенилсульфон (Dapson)).
Эти вещества могут вводиться каждое в отдельности или в виде комбинированного препарата энтерально, парэнтерально или локально.
Однако основным недостатком данного лекарственного средства является его антибиотическое действие, приводящее к ряду таких побочных эффектов, как поражения почек, печени, нервной и кроветворной систем организма, угнетение иммунных реакций, расстройства витаминного и электролитного обменов.
Наиболее близким к заявляемому является лекарственное средство на основе водного раствора действующего вещества, в качестве которого используют растительный экстракт конденсированного эраконда, полученного экстрагированием травы (сена) люцерны экстрагентом, содержащим смесь микроэлементов (см. заявку РФ № 93047353 по кл. МПК A61K 35/78, опуб. 20.06.96 г.).
Однако данное лекарственное средство относится к биологически активным веществам, имеет неизвестное строение, фармакологическое действие его до конца еще не изучено, что не позволяет его широко использовать в лечении актиномикозов.
Изобретение направлено на решение задачи создания средства для лечения актиномикоза крупного рогатого скота, обеспечивающего повышение эффективности лечения при сокращении сроков за счет нормализации обменных процессов в организме животных.
Для решения поставленной задачи средство для лечения актиномикоза на основе водного раствора действующего вещества содержит, согласно изобретению, в качестве действующего вещества цитоплазматическую фракцию гриба Aktinomyces bovis, содержащую:
| - белки с молекулярной массой от 20 кДа до 90 кДа | 1,1-1,3 мг/мл |
| - холестерины | 0,25-0,3 мМ/л |
| - триглицериды | 0,9-1,0 мМ/л, |
при соотношении воды и действующего вещества 1:1.
Средство дополнительно содержит 0,4% раствор формалина.
В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано эффективного средства для лечения актиномикоза, направленного на нормализацию обменных процессов организма животных. Экспериментальным путем подобран состав цитоплазматической фракции гриба Aktinomyces bovis, обеспечивающий лечебный эффект и дальнейшую устойчивость животных к повторному заражению актиномикозом.
Выявлено, что цитоплазматическая фракция гриба только с низкомолекулярной массой белка (20-90 кДа) и содержанием 0,25-0,3 мМ/л холестеринов и 0,9-1,0 мМ/л триглицеридов обладает терапевтическим эффектом.
Введение в состав препарата 0,4% формалина способствует усилению действия цитоплазматической фракции, т.е. формалин, наряду с инактивирующей способностью, выступает в роли нормализатора обменных процессов.
Сказанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении критерия «изобретательский уровень».
Изобретение иллюстрируется фотографией, на которой представлен результат электрофореза препарата в 20% полиакриламидном геле.
Лекарственное средство получают следующим образом.
Выделенную от больных животных культуру Aktinomyces bovis засевают на мясопептонный бульон с глюкозой, выдерживают в термостате при 37°C в течение 42 суток. Затем надосадочную жидкость сливают, а полученный осадок подвергают замораживанию и оттаиванию 20 раз. После этого осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут. К полученной надосадочной жидкости после удаления осадка добавляют равное количество дистиллированной воды и 0,4% раствор формалина.
Электрофорез проводили для выяснения молекулярной массы белков, входящих в состав препарата. Для этого препарат осаждали насыщенным раствором сульфата аммония: на 1 объем антигена брали 3 объема сульфата аммония. Смесь оставляли при +4°C на ночь. Осадок собирали центрифугированием со скоростью 14000 об/мин в течение 20 минут. Полученный осадок растворяли в 200 мкл фосфатного буфера и повторно осаждали 2,5 объемами ацетона и оставляли на ночь при -18°С. Осадок повторно собирали центрифугированием 14000 об/мин 20 минут.
Как видно из результатов электрофореза (см. фото), в препарате обнаружена доминантная полоса молекулярной массой 20 кДа, а также набор белков молекулярной массой от 90 до 60 кДа.
Определяли биохимический состав препарата, в частности - количество белка и липидов (холестеринов и триглицеридов).
Общий белок определяли колориметрическим методом Брэдфорда (см., например, Камышников B.C., справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: Т.1 - Мн.: Беларусь, 2000. 496 с), холестерин-ферментативным колориметрическим методом Триндера (см., например, Rifai N., Bachorik P.S., Albers J.J. Lipids, Lipoproteins and apolipoproteins. In: Burtis C.A., Ashwood E.R., editors. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. 3 rd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Company; 1999. P.809-861), триглицериды - энзиматическим колориметрическим методом по конечной точке (см., например, Климов А., Никульчева Н. Обмен липидов и лопопротеидов и его нарушения. - СПб: Питер Ком, 1999. - 512 с.).
Эффективность действия препарата изучали по биохимическим показателям крови морских свинок как наиболее чувствительных биомоделей. Изучали изменения таких показателей, как активность аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ), креатинкиназы (КК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), содержание общего белка, глюкозы и холестерина.
Средство было проверено на лабораторных животных (24 морских свинки) и сельскохозяйственных животных (12 телятах 6-8-месячного возраста, 10 нетелях, 8 коровах).
Сельскохозяйственным животным препарат вводили 1 раз в неделю в течение 2-3-х недель по 5 мл независимо от возраста и веса животных.
Лабораторным животным препарат вводили в дозе 0,5 мл.
У зараженных животных осуществляли забор крови через 30 дней, а у обработанных препаратом - через 14 дней.
Пример 1. Получение лекарственного средства.
Смыв культуры Aktinomyces bovis в количестве 5 мл засевают на 1 л мясопептонного бульона с глюкозой, выдерживают в термостате при 37°C в течение 42 суток. Затем надосадочную жидкость сливают, а полученный осадок подвергают замораживанию и оттаиванию 20 раз. После этого осадок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут. Затем осадок удаляют и к полученной надосадочной жидкости в количестве 600 г добавляют 600 г дистиллированной воды.
К полученному средству объемом 1200 г добавляют 4,8 мл раствора формалина (36-40% раствора медицинского формальдегида) из расчета 0,4 мл формалина на 100 мл готового средства.
Пример 2.
Изучение эффективности действия препарата по биохимическим показателям крови морских свинок.
Для этого были сформированы три группы животных (две опытных и одна контрольная) - по 8 самцов одного возраста и веса в каждой, при этом первой опытной группе вводили заражающую дозу, второй - препарат для лечения актиномикоза, третья группа свинок была контрольной.
Опытную группу животных заражали культурой Aktinomyces bovis, полученной после культивирования на мясопептонном бульоне с глюкозой в течение 24 часов. Заражающая доза составляла 1 млрд/мл микробных клеток. Заражение осуществляли парентерально (подкожно и внутримышечно) в дозе 1 мл.
В течение срока наблюдения (через 14 дней после введения препарата и 30 дней после инфицирования актиномикозом) клинических признаков заболевания у морских свинок не проявлялось.
Биохимические показатели крови морских свинок опытных и контрольной групп представлены в таблице.
| Биохимические показатели морских свинок при заражении актиномикозом и введении средства для лечения актиномикоза. | ||||||||
| № п/п | Характеристика групп животных | Биохимические показатели | ||||||
| АЛТ | ACT | KK | ЛДГ | Об. белок | Глюк. | Холест. | ||
| 1 | Опытная (вводили заражающую дозу A. bovis) | 121,45±23,1 | 291,76±160,7 | 4026,91±2376,9 | 987,99±426,8 | 57,65±3,6 | 7,43±0,7 | 0,64±0,1 |
| 2 | Опытная (вводили средство для лечения актиномикоза) | 79,32±0,66 | 134,56±2,56 | 5163,92±21,77 | 1357,94±10,08 | 53,73±0,47 | 11,45±0,54 | 1,39±0,14 |
| 3 | Контрольная (интактные) | 51,82±4,3 | 35,92±9,1 | 680,28±149,47 | 251,98±73,5 | 36,38±0,8 | 7,78±0,5 | 0,84±0,1 |
При сравнительном анализе результатов биохимических тестов сыворотки крови зараженных животных по отношению к контролю отмечено достоверное увеличение активности АЛТ и концентрации общего белка в ответ на инфицирование.
Увеличение активности АЛТ указывает на усиление анаэробных процессов в клетках, уменьшение роли реакций цикла Кребса по сравнению с обходными путями метаболизма и, как следствие, снижение резистентности организма.
Изменение прочих биохимических параметров у зараженных морских свинок носило недостоверный характер.
У обработанных препаратом животных активность АЛТ была достоверно выше, чем в контроле, но несколько ниже, чем у зараженных морских свинок. В то же время у обработанных животных отмечалось достоверное повышение содержания глюкозы и холестерина как по отношению к контролю, так и по отношению к зараженным животным, что указывает на активизацию у обработанных препаратом морских свинок глюконеогенеза и увеличение интеграции липидного и углеводного обмена. В данном случае увеличение активности АЛТ, сопровождающееся также достоверным возрастанием активности и ACT, свидетельствует об активизации гепатоцитов и повышении нейтрализующей функции печени к токсинам возбудителя актиномикоза.
Индекс де Ритиса, представляющий собой отношение АСТ/АЛТ и отражающий состояние аэробных катаболических процессов, у обработанных препаратом животных был несколько выше, чем в контроле. Это указывает на тенденцию к активизации кислородзависимых процессов у обработанных животных и повышение резистентности к инфекции, что подтверждается также достоверным увеличением концентрации общего белка и активности КК.
Совместное же увеличение активности АЛТ и ЛДГ свидетельствует об активизации аэробных кислородзависимых катаболических процессов, что увеличивает неспецифическую резистентность организма животных.
Кроме того, достоверное увеличение активности ЛДГ приводит к уменьшению pH, что способствует смещению равновесия в реакции, катализируемой КК, в сторону образования АТФ. Это также повышает резистентность животных.
Необходимо отметить, что достоверное увеличение концентрации общего белка у обработанных препаратом животных по сравнению с контролем является ответной реакцией организма животных по нейтрализации токсинообразующего компонента культуры Aktinomyces bovis.
В реакциях преципитации и агглютинации наличия специфических антител к Aktinomyces bovis после введения средства для лечения актиномикоза не выявлено.
Введение препарата больным актиномикозом телятам (12 голов) привело к их полному выздоровлению (100% эффективность). Из 10 нетелей, обработанных препаратом, выздоровело 7 (70%), а введение препарата 8 больным коровам не обеспечило лечебного эффекта, что может быть объяснено длительным течением болезни и необратимостью происшедших в организме коров патологических изменений.
Таким образом, заявляемое средство для лечения актиномикоза сельскохозяйственных животных обладает терапевтическим эффектом в отношении телят 6-8 месячного возраста и нетелей, удобно в применении, не требует длительных сроков лечения, не вызывает нежелательных побочных эффектов и повышает резистентность животных к возбудителю Aktinomyces bovis путем нормализации обменных процессов.
Лекарственное средство для лечения актиномикоза крупного рогатого скота, содержащее водный раствор действующего вещества, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит 0,4%-ный раствор формалина, а в качестве действующего вещества - цитоплазматическую фракцию гриба Aktinomyces bovis, содержащую:
белки с молекулярной массой от 20 до 90 кДа 1,1-1,3 мг/мл,
холестерины 0,25-0,3 мМ/л,
триглицериды 0,9-1,0 мМ/л,
при соотношении воды и действующего вещества 1:1.
