Средство для профилактики и лечения гриппа а и в
Владельцы патента RU 2380100:
Научно-исследовательский институт гриппа Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (НИИ гриппа СЗО РАМН) (RU)
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству с противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А и В. Применение дигидрокверцетина и/или его кальциевой соли в качестве средства с противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А и В. Вышеописанное средство обладает повышенной противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А и В. 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл.
Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии, и касается применения природного вещества дигидрокверцетина и его кальциевой соли для профилактики и лечения гриппа и острых респираторных заболеваний человека.
В настоящее время для профилактики и лечения многих заболеваний предпочтение отдается растительным препаратам, обладающим широким спектром фармакологической активности. Дигидрокверцетин - флавоноид - обладает антиоксидантной, противовоспалительной, ангио- и гепатопротекторной активностью. Известен способ получения дигидрокверцетина из древесины лиственницы [Патент РФ №2158598, приоритет от 21.04.98 г., выд. 10.11.2000 г.].
Авторами предлагаемого изобретения у него выявлена новая активность - воздействие на вирусы гриппа А и В. У кальциевой соли дигидрокверцетина антивирусная активность выше, чем у самого дигидрокверцетина. Установлено, что кальциевая соль дигидрокверцетина более эффективна и при лечении симптомов, вызванных гриппозной инфекцией.
Актуальность поиска средств для экстренной терапии тяжелых форм гриппа диктуется развитием предпандемической ситуации в мире и опасностью появления в человеческой популяции высокопатогенных штаммов вируса гриппа, в частности подтипа H5N1. В настоящее время смертность от этой инфекции составляет порядка 70%, при этом заболевание, как и тяжелые формы гриппа другой этиологии, характеризуется острейшим началом и крайне тяжелым течением: высокой (более 40°) температурой и длительной лихорадкой с резко выраженными симптомами интоксикации (сильной головной болью, ломотой, бессонницей, бредом, анорексией, тошнотой, рвотой, менингиальными симптомами, иногда энцефалитическим синдромом). Вариантом молниеносной формы может быть стремительное развитие геморрагического токсического отека легких и смертельный исход от дыхательной и сердечно-сосудистой недостаточности [Int. J. Tuberc. Lung Dis. 200711(7):710-21].
Главным звеном в патогенезе гриппа является поражение сосудистой системы, которое возникает вследствие токсического действия вируса и проявляется повышением проницаемости сосудов, ломкостью их стенок, нарушением микроциркуляции. Эти изменения обусловливают появление у больных носовых кровотечений, геморрагической сыпи на коже и слизистых, кровоизлияний во внутренние органы [Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2001; 280(4):C719-4L]. Резкое падение тонуса сосудов приводит к возникновению венозной гиперемии кожи и слизистых, застойному полнокровию внутренних органов, нарушению микроциркуляции, а в более поздние сроки - тромбозу вен, капилляров и крупных сосудов, отеку легочной ткани и множественным кровоизлияниям в альвеолы и интерстиций легкого [Сергеев Н.В., Лейтис Ф.А. Поражение сердечно- сосудистой системы при гриппе. М.: МедГиз, 1962]. Сосудистые изменения играют ведущую роль и в развитии неврологических синдромов. Так, нарушение проницаемости сосудов и токсическое влияние вируса на рецепторы сосудистого сплетения мозга вызывают гиперсекрецию спинно-мозговой жидкости с развитием циркуляторных расстройств, приводят к внутричерепной гипертензии и отеку мозга.
На сегодняшний день для лечения гриппа применяется ряд препаратов, таких как противовоспалительные, противовирусные, противоотечные, иммуностимулирующие и антиоксидантные. Каждая из этих групп направлена на специфические мишени в патогенезе гриппозной инфекции и имеет, помимо преимуществ, свои недостатки.
Стероидные противовоспалительные препараты, оказывая системное воздействие, обладают многочисленными побочными эффектами. Противовирусные препараты, индукторы интерферона и иммуностимуляторы эффективны лишь на ранних этапах инфекции, когда реактивные процессы еще не достигают клинически выраженного максимума. Противоотечные препараты вызывают возбуждение и часто бессонницу [Машковский М.Д., Лекарственные средства, ч.2, М.: Медицина, 1993, с.295-306].
Известен противовирусный препарат Ремантадин [Am. J. Med. 1997, 17; 102(ЗА):55-60]. Его применяют для лечения и профилактики гриппозной инфекции, вызванной вирусами гриппа типа А. Особенно хорошие результаты препарат показал в отношении вируса гриппа подтипа H3N2, механизм его действия связан с блокировкой функции вирусного белка внутри мембраны. Подавление инфекционной активности вируса наступает на этапах рецептор-опосредованного эндоцитоза, декапсидации в фаголизосоме, а также сборки и почкования вирусных частиц [Вестник РАМН, 1993, 3:10-15]. Однако у ремантадина есть ограничения для применения. Так, при высоких дозах препарата возможны побочные эффекты со стороны ЦНС. Он также оказывает негативное действие на печень, почки, желудочно-кишечный тракт, что делает невозможным назначение его людям с заболеваниями этих органов. Кроме того, к ремантадину быстро формируется резистентность вируса.
В лечении гриппозной инфекции часто используют композиции для купирования симптомов болезни (колдрексы, фервекс, антигриппины). Такие лекарственные средства - симптоматики - облегчают состояние больных, но не способствуют защите от осложнений инфекции, а в ряде случаев даже создают благоприятный фон для перехода инфекционного процесса в подострую фазу. Это относится, в частности, к лекарственным средствам, содержащим препараты, направленные на защиту сосудов, снижающие ломкость капилляров и тем самым препятствующие геморрагическим процессам. Одним из наиболее распространенных ангиопротекторов является глюконат кальция. Входящие в его состав ионы Са2+ участвуют в передаче нервных импульсов, в сокращении мускулатуры, в том числе гладкой мускулатуры артерий, и реакциях свертываемости крови, т.е. во всех тех процессах, нарушение которых приводит к патогенетической картине тяжелого гриппа.
В то же время окисленные остатки глюкозы, входящие в состав глюконата кальция, представляют собой потенциальный патогенетический фактор. Это связано с высокой реакционной способностью функциональных групп глюконат-иона, способных в очагах воспаления действовать как самостоятельные окислители, а также под действием свободных радикалов окисляться до еще более реакционно-активных соединений. Такие продукты окисления индуцируют разрушение клеток и тканей и способны утяжелять ход патологического процесса при воспалении.
Более того, показано [Mol. Pharmacol. 2004; 66(3):683-93], что продукция катионного белка эозинофилов, играющего ведущую роль в коагуляции крови и адгезии клеток, является процессом, зависящим от глюконата кальция, и что под его действием в сыворотке идет более интенсивная продукция этого белка. Таким образом, применение глюконата кальция приводит к ускорению и интенсификации процессов свертываемости крови, что является нежелательным побочным эффектом.
Одним из способов защиты клеток при окислительных процессах является применение антиоксидантов - соединений, нейтрализующих свободные радикалы в тканях. Антиоксиданты могут быть применены в виде самостоятельного препарата в комбинации с глюконатом кальция или в составе нового химического соединения в качестве противоиона кальция.
Целью данного изобретения являлось создание препарата, обладающего противовирусной активностью в отношении вируса гриппа, имеющего как лечебный эффект, направленный против самой вирусной инфекции, так и обладающего ярко выраженными свойствами симптоматика, влияющего на сосудистую систему.
Задача решена путем использования в качестве противовирусного средства флавоноида дигидрокверцетина, или его кальциевой соли, или смеси дигидрокверцетина и кальциевых солей, применяемых в противогриппозных средствах, в частности глюконата кальция. Сущностью изобретения является то, что у дигидрокверцетина и особенно у его кальциевой соли (хелатная форма) выявлено новое свойство: непосредственное действие на сами вирусы гриппа А и В. Благодаря этой противовирусной активности в отношении вирусов гриппа А и В дигидрокверцетин и его кальциевую соль можно использовать в качестве профилактического средства, а при лечении уже развившегося гриппа действовать ими собственно на патогенез гриппозной инфекции. Благодаря выявленным свойствам, соль дигидрокверцетина может входить в состав лекарственных композиций, заменяя препараты кальция, обладающие перечисленными выше недостатками.
Дигидрокверцетин благодаря своим антиоксидантным и противовоспалительным свойствам использовался как симптоматик в лечении гриппа, т.к. он влияет на течение бронхолегочных и сердечных заболеваний. Известны также такие свойства дигидрокверцетина, как капилляроукрепляющее, антиоксидантное, ангио- и гепатопротекторное [Патент РФ №2158598, приоритет от 21.04.98 г., выдан 10.11.2000 г.].
Однако все перечисленное относится к уже имеющимся проявлениям болезни, когда процесс нарушений запущен.
Использование дигидрокверцетина для профилактики гриппа неизвестно. Его действие на вирус гриппа ранее никогда не проверяли.
Дигидрокверцетин (ДКВ) (2,3-дигидро-3,5,7-тригидрокси-2-(3,4-дигидроксифенил)-4Н-1-бензопиран-4-он) - флавоноид, получаемый из древесины лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и лиственницы даурской (Larix dahurica Turcz.). Мелкокристаллический или аморфный порошок от светло-желтого до желтого цвета, без запаха, слегка горьковатого вкуса, обладает низкой токсичностью.
По химическим свойствам дигидрокверцетин является исключительно активным антиоксидантом, связывающим свободные радикалы (выделяемые при активации нейтрофилов) и лишающим их вредоносной активности на ткани макроорганизма. Кроме того, он оказывает противовоспалительное [J. Ethnopharmacol. 2005; 99(1): 119-24], мембраностабилизирующее и, как следствие, - противоотечное действие (локализует очаг воспаления, препятствует распространению биологически активных веществ и нивелирует их влияние на центр терморегуляции). Также важно отметить гепатопротекторный эффект соединения, направленный на устранение общей инфекционной интоксикации [J. Lipid Res. 2000; 41(12):1969-79].
Препараты группы флавоноидов, к которым относится ДКВ, обладают выраженными хелатирующими свойствами. Это позволяет им формировать устойчивые комплексы с ионами двух- и четырехвалентных металлов. Авторами получены такие комплексы с кальцием: одинарные хелатные комплексы ДКВ с металлом 
Возможно также получение двойного хелатного комплекса ДКВ с двухвалентным металлом:
Возможно, именно приведенные структуры солей ДКВ влияют на механизм реализации противовирусной активности.
В литературе описаны хелатные комплексы флавоноидов с ионами меди, цинка, свинца, никеля, кобальта, марганца и других металлов [J. Serb. Chem. Soc. 72 (2007) p.921-939; J.Agric. Food Chem. 2006, 54, 6343-6351]. Образование таких комплексов является одним из механизмов антиоксидантного действия флавоноидов. Известно, что двухвалентные металлы являются важными компонентами в процессе формирования свободных радикалов. При взаимодействии молекула флавоноида связывает ион металла, препятствуя таким образом процессам переноса электронов. Антиоксидантные свойства флавоноидов усиливаются, если они координированы с ионом металла. Авторы предположили, что применение дигидрокверцетина в комплексе с глюконатом кальция при острых воспалительных процессах может позволить эффективно нивелировать побочные эффекты глюконат-иона. Это действие будет реализовываться как вследствие непосредственно антиоксидантных свойств ДКВ, так и за счет образования хелатного комплекса ДКВ/Са2+, обладающего более выраженной антиоксидантной активностью по сравнению со свободным ДКВ.
Противовирусные свойства дигидрокверцетина в отношении вирусов гриппа изучались на модели экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей, вызванной вирусами гриппа А и В. Испытание дигидрокверцетина, его кальциевой соли и смеси дигидрокверцетина с глюконатом кальция в опытах по профилактике и лечению гриппозной инфекции выявило, что лучшие результаты защиты проявляет соль дигидрокверцетина, меньшая активность - у смеси веществ. Защитным действием, но в меньшей степени, обладает и сам дигидрокверцетин. Результаты испытаний представлены в таблицах. В таблице 1 - смертность в ходе патологического процесса при экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей, вызванной вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в условиях применения препарата дигидрокверцетина. В таблице 2 - смертность в ходе патологического процесса при экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей, вызванной вирусом гриппа B/Lee 40 в условиях применения препарата дигидрокверцетина. В таблице 3 - влияние дигидрокверцетина (DHQ), его комбинации (DHQ Ca-glu) и комплекса (DHQ-Ca) с кальцием на показатели патологического процесса при экспериментальной летальной гриппозной пневмонии, вызванной вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2).
Чертежи убедительно подтверждают вывод, что в опытах дигидрокверцетин, его кальциевая соль и смесь дигидрокверцетина с глюконатом кальция проявляют противовирусную активность в отношении вирусов гриппа А и В.
Фиг.1 - деструкция клеток MDCK под действием вируса гриппа в контроле (а) и в присутствии дигидрокверцетина (b). Ув. 20000.
Фиг.2 - структура популяции вируса гриппа в контроле (а) и в присутствии дигидрокверцетина (b).
Фиг.3 - динамика смертности животных от летальной гриппозной инфекции, вызванной вирусом гриппа А, в условиях применения дигидрокверцетина при заражающей дозе вируса 5 LD50.
Фиг.4 - динамика смертности животных от летальной гриппозной инфекции, вызванной вирусом гриппа В, в условиях применения дигидрокверцетина при заражающей дозе вируса 1 LD50.
Фиг.5 - очаг гриппозной пневмонии в легком мыши на 3 сутки после заражения вирусом гриппа A/Aichi/2/68. Выраженный геморрагический компонент и инфильтрация ядерными элементами. Гематоксилин-эозин, ув. ×240.
Фиг.6 - очаг гриппозной пневмонии в легком мыши на 3 сутки после заражения вирусом гриппа A/Aichi/2/68 в условиях применения дигидрокверцетина. Отсутствие геморрагического отека при умеренной инфильтрации ядерными элементами. Гематоксилин-эозин, ув. ×240.
| Таблица 1. Смертность в ходе патологического процесса при экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей, вызванной вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в условиях применения препарата дигидрокверцетина |
||||||||||||||||
| Препарат | Доза вируса, LD50 | Смертность животных на сроках после инфицирования (дни) | Средняя продолжительность жизни | Индекс защиты (%) | ||||||||||||
| 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 15* | ||||
| Препарат DHQ 150 мг/кг | 1 | 1 | 1/20 | 14,5 | 87,5 | |||||||||||
| 5 | 1 | 4 | 5/20 | 14,4 | 68,8 | |||||||||||
| Препарат DHQ 300 мг/кг | 1 | 1 | 1 | 1/20 | 14,6 | 75,0 | ||||||||||
| 5 | 1 | 1 | 5 | 7/20 | 14,0 | 56,3 | ||||||||||
| Ремантадин | 1 | 1 | 1/15 | 14,6 | 83,3 | |||||||||||
| 5 | 1 | 1 | 1 | 3/15 | 13,9 | 75,0 | ||||||||||
| Контроль без препаратов | 1 | 1 | 2 | 3 | 6/15 | 13,5 | -- | |||||||||
| 5 | 2 | 3 | 2 | 2 | 1 | 2 | 12/15 | 10,5 | - | |||||||
| *- общая смертность (пало/заражено) |
| Таблица 2. Смертность в ходе патологического процесса при экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей, вызванной вирусом гриппа B/Lee 40 в условиях применения препарата дигидрокверцетина |
||||||||||||||||
| Препарат | Доза вируса, LD50 | Смертность животных на сроках после инфицирования (дни) | Средняя продолжительность жизни (дней) | Индекс защиты (%) | ||||||||||||
| 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15* | ||||
| Дигидрокверц етин, 150 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 4/10 | 12,7 | 33,3 | ||||||||
| 5 | 4 | 2 | 1 | 8/10 | 9,1 | 22,2 | ||||||||||
| Дигидрокверц етин, 300 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 4/9 | 13,2 | 33,3 | ||||||||
| 5 | 4 | 3 | 1 | 8/10 | 8,4 | 11,1 | ||||||||||
| Рибавирин | 1 | 1 | 1 | 1 | 3/10 | 13,1 | 50 | |||||||||
| 5 | 1 | 2 | 1 | 1 | 5/10 | 11,3 | 44,4 | |||||||||
| Ремантадин 50 мг/кг | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 5/10 | 12,4 | 16,7 | |||||||
| 5 | 2 | 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 8/10 | 10,4 | 11,1 | |||||||
| Контроль без препаратов | 1 | 2 | 2 | 1 | 1 | 6/10 | 11,2 | - | ||||||||
| 5 | 5 | 3 | 1 | 9/10 | 7,4 | - | ||||||||||
| *- общая смертность (пало/заражено) |
| Таблица 3. Влияние дигидрокверцетина (DHQ), его комбинации (DHQ Ca-glu) и комплекса (DHQ-Ca) с кальцием на показатели патологического процесса при экспериментальной летальной гриппозной пневмонии, вызванной вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2). |
|||||
| Препарат | Доза вируса | Средняя продолжительность жизни, сут. | Смертность, % | Индекс защиты, % | Увеличение СПЖ |
| DHQ 300 | 1 | 14,45 | 5 | 87,5 | 0,9 |
| 5 | 14,4 | 25 | 68,75 | 3,9 | |
| DHQ 150 | 1 | 14,6 | 10 | 75 | 1,1 |
| 5 | 13,95 | 35 | 56,25 | 3,4 | |
| DHQ 300 Ca-glu | 1 | 14,5 | 5 | 89,3 | 1,4 |
| 5 | 14,25 | 25 | 71,2 | 4,3 | |
| DHQ 150 Ca-glu | 1 | 14,6 | 10 | 78,6 | 1,5 |
| 5 | 13,9 | 40 | 53,8 | 3,9 | |
| DHQ-Ca 300 | 1 | 14,6 | 5 | 89,3 | 1,5 |
| 5 | 14,45 | 20 | 76,9 | 4,5 | |
| DHQ-Ca 150 | 1 | 14,7 | 10 | 78,6 | 1,6 |
| 5 | 14,35 | 30 | 65,4 | 4,35 | |
| Ремантадин | 1 | 14,6 | 6,7 | 83,3 | 1,1 |
| 5 | 13,9 | 20 | 75 | 3,4 | |
| Контроль | 1 | 13,5 | 40 | - | 0 |
| 5 | 10,5 | 80 | - | 0 |
При анализе полученных результатов (табл.1-2 и фиг.3-4) было отмечено, что в случае гриппа А противовирусная активность дигидрокверцетина была равна или даже превосходила таковую для препарата сравнения Ремантадина (индексы защиты 30-50% при инфицировании животных 5 LD50 вируса и 87% - при дозе вируса 1 LD50 при активности ремантадина 60-82,5% в зависимости от дозы вируса), в случае инфекции животных, вызванной вирусом гриппа В, устойчивым к ремантадину, показатели активности дигидрокверцетина были ниже, однако также превосходили показатели активности ремантадина, который в случае гриппа В оказался неэффективен (индексы защиты 11-17% в зависимости от инфицирующей дозы), и были сопоставимы с защитной активностью Рибавирина, обладающего противовирусной активностью против гриппа, но не используемого в настоящее время для лечения этого заболевания. Неэффективность Ремантадина в отношении гриппа В обусловлена отсутствием у белка NB (аналога белка М2 вирусов гриппа типа А) сайта связывания с адамантанами.
На основании полученных и представленных ниже данных показано, что дигидрокверцетин проявляет противовирусные свойства на модели экспериментальной летальной гриппозной пневмонии, независимо от того, вызвана она вирусом гриппа типа А или В. Испытания противовирусной активности проводили для индивидуальных соединений дигидрокверцетина и его кальциевой соли.
Как видно из представленных в таблице 2 данных, дигидрокверцетин обладал умеренной протективной активностью при гриппозной пневмонии белых мышей, вызванной ремантадин-устойчивым вирусом гриппа типа В. Это действие проявлялось снижением смертности и увеличением средней продолжительности жизни животных в экспериментальной группе по сравнению с контрольными животными, не получавшими препаратов. Индекс защиты составил 11-33% в зависимости от дозы вируса и препарата.
Применение кальциевой соли дигидрокверцетина оказывало наиболее сильное защитное действие. Несколько меньшую активность проявляла комбинация дигидрокверцетина с глюконатом кальция, еще меньшую - дигидрокверцетин в виде монопрепарата. Таким образом, при равных концентрациях использованного флавоноида оптимальным препаратом оказался комплекс ДКВ с кальцием.
У животных (белые мыши), зараженных вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), были исследованы легкие при помощи гистологического анализа. Было показано, что заражение мышей вирусом гриппа приводит к формированию на 3 сутки очагов пневмонии (фиг.6). Морфологически эти очаги представляли собой поражения легких в виде скоплений нейтрофилов и клеточного дебриса в просветах крупных бронхов, отличающихся вирусспецифическим поражением клеток бронхиального эпителия с формированием в них вирусных включений и отторжением пораженных клеток в просвет бронха, интенсивным серозным интерстициальным отеком, очагами геморрагического отека, нейтрофильной инфильтрации и распада клеток в респираторных отделах, расширением сосудов и спадением альвеол. У всех животных наблюдалась экссудация эритроцитов и серозной жидкости в просвет спавшихся альвеол. Значительная часть нейтрофилов в очагах инфильтрации находилась в стадии распада.
В легких животных, получавших дигидрокверцетин по лечебно-профилактической схеме, также отмечались очаги вирусной пневмонии. Однако их размер был существенно меньше. Большая ткани легкого оставалась интактной, геморрагическая инфильтрация была выражена слабо или не выражена вообще (фиг.7), что свидетельствовало о сохранности аэрогематического барьера, поражаемого при гриппе.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Клетки MDCK обрабатывали дигидрокверцетином за 1 час до заражения вирусом гриппа. Через 24 часа после заражения клетки фиксировали 1,5% раствором глутаральдегида на среде DMEM (рН 7,2) и подготавливали для электронно- микроскопического анализа. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали на электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Japan).
При анализе морфогенеза вируса гриппа в присутствии дигидрокверцетина было отмечено, что клетки опытной культуры выглядят более сохранными по сравнению с контрольными. В них была менее выражена вакуолизация цитоплазмы и деструкция органелл (фиг.1).
При исследовании морфологии вирионов, сформировавшихся в клетках под действием ДКВ (фиг.2), было отмечено, что по сравнению с контрольными культурами присутствие этого препарата существенно увеличивает долю дефектных вирионов, многие из которых не содержат нуклеокапсида и, следовательно, являются неинфекционными, хотя и иммуногенными.
Таким образом, ДКВ способствует, с одной стороны, неспецифической защите клеток от вирусиндуцированного цитопатогенного действия, а с другой стороны - формированию в вирусной популяции дефектных частиц, которые не способны вызывать инфекционный процесс, но, имея антигенные детерминанты гриппа, служат мощными иммуногенами для стимуляции вирусспецифического иммунного ответа. Таким образом, показаны комплексные механизмы протективной активности ДКВ.
Пример 2. Протективная активность дигидрокверцетина в отношении экспериментальной летальной гриппозной пневмонии у белых мышей, вызванной вирусом гриппа А.
В исследованиях противовирусного действия препарата в качестве модели летальной гриппозной инфекции использовали беспородных белых мышей обоего пола массой 10-12 г, полученных из питомника «Рапполово». В работе использовали вирус гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2), адаптированный к белым мышам.
Навеску дигидрокверцетина суспендировали в минимальном количестве твина-80, затем прибавляли необходимое количество физиологического раствора до конечной концентрации препарата 30 мг/мл. Исследуемый препарат вводили животным 2 раза в сутки с 12-часовым интервалом по 50-100 мкл внутрибрюшинно, начиная со срока 24 часа до заражения и заканчивая сроком 5 дней после заражения. В качестве плацебо в контрольной группе животным вводили физиологический фосфатный буфер в равном объеме.
Вирус предварительно титровали на животных и определяли его концентрацию по летальности мышей. Для эксперимента вирус вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом в дозе 1 и 5 LD50. В каждую группу наблюдения брали по 10 мышей.
Наблюдение за животными осуществляли в течение 15 дней, т.е. срока, в течение которого при экспериментальном гриппе отмечается смертность животных. Ежедневно фиксировали вес и смертность животных в контрольных и опытных группах. На основании полученных показателей смертности рассчитывали процент смертности в каждой группе (отношение числа павших за 15 дней животных к общему числу зараженных животных в группе), индекс защиты (отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в контрольной группе) и среднюю продолжительность жизни животных из расчета 15 дней наблюдения.
Показатели гриппозной инфекции при использовании препарата дигидрокверцетин суммированы в табл.1 и на фиг.3.
Как видно из представленных данных, дигидрокверцетин обладал выраженной протективной активностью при гриппозной пневмонии белых мышей. Это действие проявлялось снижением смертности и увеличением средней продолжительности жизни животных в экспериментальной группе по сравнению с контрольными животными, не получавшими препаратов. Индекс защиты (снижение процента летальности животных) составил 30-50% при инфицировании животных 5 LD50 вируса и 87% - при дозе вируса 1 LD50, что является существенным при таких высоких заражающих дозах. Протективное действие дигидрокверцетина было сопоставимо с активностью препарата сравнения Ремантадина (60-82,5% в зависимости от дозы вируса). Следует учитывать, что в клинической практике в большинстве случаев не приходится иметь дело с такими высокими дозами вируса, что позволяет предполагать высокую протективную активность дигидрокверцетина при лечении гриппа у людей.
Пример 3. Протективная активность дигидрокверцетина в отношении экспериментальной летальной гриппозной пневмонии у белых мышей, вызванной вирусом гриппа В.
В условиях примера 2 проводились аналогичные испытания протективной активности дигидрокверцетина в отношении экспериментальной летальной гриппозной пневмонии у белых мышей, вызванной вирусом гриппа B/Lee/40. Полученные данные приведены в табл.2 и на фиг.4.
Пример 4. Кальциевая соль дигидрокверцетина, представляющая собой хелатный комплекс ионов кальция и дигидрокверцетина, была получена следующим способом. 10 г дигидрокверцетина, 6 г Са(ОН)2·8Н2O и 250 мл воды были доведены до кипения. Полученный после охлаждения преципитат был перекристаллизован из воды и промыт 50 мл ацетона. Выход конечного продукта составил 86%. Расчет элементного состава был проведен из расчета 1 молекула дигидрокверцетина на 1 атом кальция. Элементный анализ продукта дал следующие результаты: Са - 12% (вычислено - 11,7%), С - 52,2% (вычислено - 52,6%), Н - 2,9% (вычислено - 2,9%), О - 33,8% (вычислено - 32,7%).
Пример 5. В условиях примера 1 было проведено сравнительное изучение протективной активности собственно дигидрокверцетина, комбинированного применения дигидрокверцетина с глюконатом кальция в дозе 50 мг/кг и кальциевой соли дигидрокверцетина в дозе 150 мг/кг в пересчете на чистый дигидрокверцетин. В результате исследований получены данные, суммированные в табл.3.
В целом, на основании полученных данных показано, что дигидрокверцетин проявляет противовирусные свойства на модели экспериментальной летальной гриппозной пневмонии, независимо от того, вызвана она вирусом гриппа типа А или В. Совместное использование ДКВ с кальцием, в виде сочетания ДКВ с глюконатом кальция и, в большей степени, в виде кальциевой соли, оказывает больший протективный эффект, сопоставимый или превосходящий эффект ремантадина.
1. Применение дигидрокверцетина и/или его кальциевой соли в качестве средства с противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А и В.
2. Применение дигидрокверцетина и/или его кальциевой соли по п.1 для профилактики и/или лечения гриппа А и В и предупреждения развития тяжелой гриппозной пневмонии.
3. Применение дигидрокверцетина по п.2, отличающееся тем, что разовая доза дигидрокверцетина составляет 150-300 мг/кг массы тела млекопитающего.
4. Применение дигидрокверцетина по п.3, отличающееся тем, что дополнительно средство содержит глюконат кальция в разовой дозе 50 мг/кг массы тела млекопитающего.
