Агароза и способ ее получения
Способ получения агарозы включает получение сухих морских водорослей Gracilaria spp., предпочтительно Gracilaria dura из природных источников или культивированных в полиэтиленовых мешках или на плотах, обработку сухих водорослей щелочью. Промывают обработанные водоросли водой до рН промывных вод в пределах от 7 до 8, добавляют воду. Проводят автоклавирование и последующее гомогенизирование с получением экстракта. Обрабатывают экстракт активированным углем и целитом при температуре 85-95°С для получения горячего экстракта. Проводят вакуумную фильтрацию экстракта через слой целлита. Замораживают фильтрат с образованием массы и оттаивают полученную массу. Для удаления оттаявшей жидкости осуществляют сжатие продукта, полученного на стадии замораживания-оттаивания, и последующий отжим. Полученную при этом агарозу растворяют в воде путем нагревания в автоклаве. Повторяют стадию замораживание-оттаивание и сжатие-отжим продукта. Полученный продукт растворяют в воде и сушат распылением для получения тонкодисперсного порошка. Предложена также агароза, полученная указанным способом. Изобретение позволяет получить агарозу с высокой прочностью геля и низкой температурой гелеобразования. Прочность 1% геля составляет ≥1900 г/см2, а температура гелеобразования 35-35,5°С. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 6 табл.
Область техники
Предложен простой, прямой и экономичный способ получения агарозы с высокой прочностью геля и низкой температурой гелеобразования из природной или культивированной Gracilaria spp., более конкретно из Gracilaria dura.
Предшествующий уровень техники
На сайте www.sporework.com указано, что агар прежде всего находит применение в пищевой, медико-фармацевтической и косметической промышленностях. Агар применяется также и в других промышленных областях, таких как производство упаковочного пенопласта, в частности биоразрушаемого упаковочного пенопласта. В этом сайте, кроме того, описываются наиболее важные свойства высококачественного бактериологического агара. Утверждается, что такой агар должен иметь температуру гелеобразования 34-35°С, чтобы свести к минимуму возможное разложение теплочувствительных антибиотиков, добавляемых к культуральной среде после стерилизации. Далее утверждается, что более холодный агар легче обрабатывать, а образование конденсата в чашке Петри не является проблемой. Другим важным свойством высококачественного бактериологического агара является то, что он должен обладать минимальной прочностью геля 800 г/см2 в стандартных условиях измерения.
В каталоге Fluka 2003-2004 приводится техническое описание ряда агаровых продуктов.
В каталоге Sigma 2003-2004 указано, что агароза представляет собой очищенный линейный галактановый гидроколлоид, выделенный из агара или содержащих агар морских водорослей. Описываются продукты агарозы с пределами прочности геля от 650 до 1200 г/см2 (1%-ный раствор) с температурой гелеобразования 36-42°С. Одним из недостатков таких продуктов является их высокая стоимость, которая вероятно обусловлена применением стадий тщательной очистки.
На www.sporeworks.com утверждается, что из морских водорослей Gelidium можно получить агар и агарозу наиболее высокого качества.
В статье, посвященной получению бактериологического агара из Gelidium, сообщается, что продукты, выделенные из этих морских водорослей, характеризуются высокой прочностью геля (R.Armisen, J. Appl. Phycology, 1955, 7: 231-243 J. Cosson et al. в Progress in Phycological Research, F.E.Round and D.J.Chapman, Eds., Biopress Ltd. 1995. Vol.11; pp.269-324).
В статье Andres Lemus et al. (Food Hydrocolloids, 1991, 5:469-479) сообщалось, что агар из разных видов Gelidiurn имеет температуру гелеобразования от 34.0 до 37.5°С и прочность геля от 687 до 1470 г/см2 и получается способом, который включает предварительную щелочную обработку морских водорослей с последующим доведением рН (предположительно с помощью кислоты) до 6-6.5 перед экстракцией и очисткой экстрагированного агара с помощью двух циклов замораживания-оттаивания.
В статье "Process for producing agar-agar from fn algae extration juce" авторов Lebbar et al. (US 4780534; 1988), описан способ получения агар-агара из экстрактов водорослей (Gelidium, Gracilaria и Pterocladia spp.), включающий: (а) введение экстракционного сока в контакт с катионной ионообменной смолой в Na+-форме, затем (b) введение сока в контакт с анионообменной смолой, кондиционированной с образованием Cl и/или 
-формы, затем (с) возможное введение сока в контакт с катионной ионообменной смолой, кондиционированной с образованием OH--формы, (d) превращение сока в гель, (е) экстракция агар-агара из полученного геля, и, при необходимости, (f) обработка полученного порошка путем контактирования его с озонсодержащим газом-носителем. Такой способ позволяет производить при малых затратах высококачественный агар-агар, используемый, в частности, в медицинской, фармацевтической и биоинженерной областях. Сообщается о прочности геля в пределах от 820 до 910 г/см2 в 1.5% геле.
В статье M.Y.Roleda et al. (Botanica Marina 1997, 40: 63-69) сообщается, что агары из Gelidiella acerosa с температурами гелеобразования от 38 до 47°С и прочностью геля от 493 до 200 г/см2 соответственно, были получены способом, включающим предварительную обработку уксусной кислотой перед экстракцией.
В статье О.Р.Mairh et al. (Botanica Marina 1978, 21:169-174) сообщается, что агар из культивированной Gelidium pusillum в Арабском море у западного берега Индии обладает прочностью геля 210 г/см2, что считается недостаточным в контексте настоящего изобретения. При этом какая-либо информация в отношении температуры гелеобразования отсутствует.
В работе Krishnamurthy et al. (Proceedings, symposium on marine algae of Indian Ocean Region (Труды Симпозиума по морским водорослям региона Индийского океана) Central Salt & Marine Chemicals Research Institute, Bhavnagar, 1979, p.41) утверждается, что для Gelidiella acerosa получена максимальная прочность геля 325 г/см2, в то время как соответствующая температура гелеобразования составляла 38-52°С.
В статье K.S.Pillai (J.Phycol., 13 (Suppl.), 1977, p. 54) сделана попытка оптимизировать условия процесса с целью максимизации качества агара и сообщается, что при использовании Gelidiella acerosa, выход доходил до 48%, но с максимальной прочностью геля 300 г/см2, в то время как соответствующие числа для Gracilaria (виды не указаны) составляли 45-50% и 125 г/см2.
В статье Patel et al. (J. Phycol. 13 (Suppl), 1977, p. 52) получен выход 24.3% и прочность геля 790 г/см2 для Gelidiella acerosa, произрастающей в прибрежной зоне Индии.
Таким образом, наилучший сообщенный для Gelidium результат включает температуру гелеобразования 37.5°С и прочность геля 1470 г/см2 для 1.5% геля, в то время как наилучшая сообщенная прочность геля в случае разновидностей Gelidiella составляла 790 г/см2. Если требуются продукты такие, как агароза с еще более высокими характеристиками, то в этом случае агар нуждается в дополнительной очистке. Было бы желательно, если бы такие продукты могли быть получены из водорослевых источников без тщательной очистки.
В работе "Purification of agar" (Очистка агара) авторов Kiyoshi Arai et al. (JP 7017, 130, January 13, 1970; Chemical Abstr. 74, 32889r, 1971) сообщается, что для выделения высокочистой агарозы неочищенный агар экстрагировали диметилформамидом. 10 г агара, смешанного с 500 мл ДМФ при перемешивании, погружали на 10 ч в горячую воду, центрифугировали, выливали надосадочную жидкость в 2 л ацетона, осадки помещали на стеклянный фильтр, промывали 500 мл ацетона, растворяли в горячей воде и отфильтровывали, получая порошок агарозы.
В работе "Isolation of partially purified agarose with a quaternary base" (Выделение частично очищенной агарозы с помощью четвертичного основания) авторов Craigie и Leigh (в Handbook of Phycological Methods, издатели J. A. Hellebust и J. S. Craigie, Cambridge University Press, Cambridge, 1978; р.126) описан способ, согласно которому 250 мг неочищенного агара растворяли в 100 мл кипящей дистиллированной воды. После этого добавляли 25 мг λ-карагенана и затем при 80-100°С добавляли к раствору 10 мл 2%-ного Cetavlon (цетилпиридинийхлорида). Горячий экстракт фильтровали на Целите и затем фильтровали под давлением через мембрану (0.8 µм), после чего продукт подвергали замораживанию-оттаиванию, получая частично очищенную агарозу.
В работе "Agarose purification method using glycol" (Способ очистки агарозы с помощью гликоля) автора R.В.Provonchee (US 4990611, February 1991) очищенную агарозу выделяли из агара или грязной агарозы путем растворения агара или агарозы в низшем алкиленгликоле при повышенной температуре с последующим охлаждением содержащего агар или агарозу гликолевого раствора с целью индуцирования осаждения очищенного агарозного продукта и выделения очищенного агарозного продукта.
В патенте США № 4983268 (Kirkpatrick et al.) описывается получение очищенной агарозы, пригодной для быстрого электрофореза и характеризующейся содержанием сульфата менее 0.2 вес.% и прочностью геля не менее 1200 г/см2 (1%). Агарозы очищают растворением агарозы или модифицированного щелочью агара в водной среде, забуфериренной до рН от 0 до 8.0 и содержащей не более 2.0 нМ соли в виде хлорида, и осаждением агарозы путем введения ее в контакт с низшим алканолом.
В работе Alfred Poison (Chemical Abstract 65: p 5865a; 1965) описано фракционирование смеси агарозы и агаропектина при получении агарозы. Названную смесь обрабатывали водным раствором полиэтиленгликоля с молекулярным весом 300, в результате чего был получен обогащенный агарозой осадок. В этом способе растворяли в 2 л воды 80 г lonagar No.2. К горячему (80°С) раствору добавляли 2 л 40%-ного (по объему) полиэтиленгликоля с молекулярным весом 6000 и образовавшийся осадок отделяли фильтрацией через нейлоновое полотно 110 меш. После этого осадок промывали в течение 2-3 мин при 40°С, суспендировали в воде при 15°С, перемешивали в течение ночи в 5 л воды, собирали на нейлоновом сите, промывали ацетоном и сушили теплым воздухом.
В публикации R.Armisen (J. Appl. Phycol. 1995, 7: 231-243) сообщалось, что первым в мире источником агара с середины семнадцатого столетия был Gelidium из Японии, но в начале двадцатого столетия спрос на фикоколлоид превысил поставку названных водорослей, что привело к необходимости изыскивать альтернативные водорослевые источники. Было также заявлено, что разработка производственного процесса, включающего щелочной гидролиз сульфатов, позволила получить высококачественный пищевой агар из Gracilaria.
В статье A.Q.Hurtado-Ponce et al. (Botanica Marina 1988, 31: 171-174) сообщалось об агарах с плохими гелевыми характеристиками, специфически различающимися температурой гелеобразования и прочностями геля (низкой и высокими и наоборот) для разных видов Graciilaria, как это следует ниже: (i) агар из Gracilaria spp. (детали о видах не сообщаются) с температурой гелеобразования 41.3°С и прочностью геля 470 г/см2; (ii) агар из Gracilaria edulis с температурой гелеобразования 55°С и прочностью геля 140 г/см2; (iii) агар из Gracilaria verrucosa с температурой гелеобразования 53°С и прочностью геля 270 г/см2; (iv) агар из Gracilaria eucheumoides с температурой гелеобразования 34°С и прочностью геля 130 г/см2.
В статье J. Rebello et al. (J Appl. Phycol. 1997, 8: 517-521) сообщается об агаре Gracilaria gracilis с высокой температурой гелеобразования (59°С) и низкой прочностью геля (350 г/см2).
На интернет-сайте (www.rheofature.com) и в статье Y.Freile-Pelegrin et al. (J. Appl. Phycol. 1997, 9: 533-539), в которых сообщается, что при предварительной обработке Gracilariia с целью экстракции агара оптимальная концентрация щелочи является видоспецифичной. Авторы последней статьи, кроме того, сообщают, что щелочь нейтрализуется при замачивании предварительно обработанных морских водорослей в 0.025%-ной H3PO4 в случае легкой щелочной предварительной обработки и в 0.025%-ной H2PO4 в случае предварительной обработки 3%- и 5%-ным NaOH. Было обнаружено, что такая предварительная обработка в случае Gracilaria cornea из Юкатана, Мексика, обеспечивает прочность геля агара в пределах от 974 до 1758 г/см2. Однако, при увеличении прочности геля температура гелеобразования также повышается и агар с прочностью геля 1758 г/см2 обладает температурой гелеобразования 42-43°С, в то время как для многих применений требуются низкая температура гелеобразования и высокая прочность геля.
В статье R.D.Villanueva et al. (Botanica Marina Vol.40, 1997, pp. 369-372), в которой сообщается об оптимизированной экстракции агара из Gracilaria eucheumoides Harvey. В этом способе водоросли подвергали предварительной обработке NaOH и затем промывали 0.5%-ной уксусной кислотой. При оптимизированных условиях процесса максимальная достигнутая прочность геля была 423±43 г/см2. О соответствующей температуре гелеобразования при этом не сообщается.
Ма. R.J.Luhan также провел исследование подобное описанному выше {Botanica Marina, 35, 1992, pp.169-172) для Gracilaria heteroclada, собранной в lloilo, Центральные Филиппины, и при этом было обнаружено, что прочность геля лежит в пределах 510-794 г/см2 для водорослей, собранных в начале сухого сезона, и 43-101 г/см2 для материала, собранного во время влажного сезона. О температуре гелеобразования при том не сообщается.
Е.Marinho-Soriano сообщает об экстракции полисахаридов агара из разных видов Gracilaria (Rhodophyta, Gracilariaceae), в том числе из Gracilaria dura (Journal of Biotechnology, 89: 81-84, 2001), с использованием экстракции водой при 110°С в течение 1 часа без предварительной обработки водорослей. Сообщается о прочности геля агара, равной 319±49 г/см2.
Е.Murano et al. (Hydrobiologia 204/205: 567-571, 1990) сообщают о существовании в Адреатическом море Gracilaria dura.
Е.Murano et al. (Carbohydrate Polymers 1992, 18: 171-178) сообщают о том, что агар был проэкстрагирован из Gracilaria dura, произрастающей в северной части Адриатического моря, как с предварительной щелочной обработкой, так и без нее. После предварительной щелочной обработки и перед экстракцией проводилась нейтрализация с помощью HCI. Сообщается, что прочность геля нативного и обработанного щелочью агара составляют 160 и 390 г/см2.
Е.Murano, С.Brandolin, F.Zanetti, S.Paoletti and R, Rizzo (Hydrobiologia 204/205: 567-571, 1990) дают характеристику агаровой фракции, экстрагированной из Gracilaria dura (Gracilariales, Rhodophyta), встречающейся в северной части Адриатического моря в виде экспериментально культивируемых водорослей в комбинированных многокультурных системах с использованием горячей воды (90°С) и 4 0.5 М NaOH (90°С, 3 часа) с последующей ферментной обработкой амилазой. Кроме того, факта, что сообщаемые результаты не предлагают ничего необычного с точки зрения качества агара, предлагаемый способ обработки более сложен по сравнению с традиционным способом экстракции агара.
Е.Marinho-Soriano (Journal о/ Biotechnology 89: 81-84, 2001), который сообщает о том, что Gracilaria dura встречается в Средиземном море в лагуне Тау (43°24′N; 03°32′Е).
R.M.Oza and S.H.Zaidi (A revised checklist of Indian marine algae (Пересмотренная карта проверки индийских морских водорослей), Национальный морской информационный центр по водорослям и химическому составу моря. Отдел освоения океана, Правительство Индии; Научно-исследовательский институт по солям и химическому составу моря, Bhavnagar, Gujarat, India, 2001; p. 25) сообщают о том, что Gracilaria dura (С.Agardh) J. Agardh (Rhodophyta, Gracilariaceae) естественным образом встречаются у западного побережья Индии.
А.K.Siddhanta, et al. (Seaweed Research and Utilisation 19 (1&2); 95-99, 1997), которые сообщают о получении агара из природного сырья Gracilaria dura, собранного на западном побережье Индии. Сухие водоросли обрабатывали 1 н. серной кислотой с последующей нейтрализацией 1.5%-ной щелочью. Этим способом был получен агар с прочностью геля 260 г/см2.
Из приведенных выше сведений становится очевидным, что отсутствуют сообщения о получении агара из видов Gracilaria, обладающего одновременно высокой прочностью геля (>1500 г/см2 для 1% геля) и низкой температурой гелеобразования (35-36°С).
Из приведенных выше сведений также следует, что во всех случаях водоросли Gracilaria либо непосредственно экстрагировались водой, либо подвергались предварительной обработке с целью осуществления щелочного гидролиза с последующей нейтрализацией избытка щелочи кислотами (HCl, H2SO4, СН3СООН и ортофосфорной кислотой) перед экстракцией агара.
В статье Н.Н.Selby и R.L.Whistler (Industrial gums - Polysaccharides and their Derivatives (Промышленные камеди - полисахариды и их производные), издатели R.L.Whistler и J.N.BeMiller, 3rd Edition, Academic Press Inc., New York, 1993, pp. 87-103) сообщается о том, что для получения агаровой композиции с желаемыми характеристиками могут быть смешаны несколько типов водорослей. Однако упоминания о составах на основе Gracilaria dura там отсутствуют.
Из предшествующего уровня техники становится очевидным, что качество агара, полученного из Gracilaria dura, произрастающей в различных регионах мира, является низким, а также отсутствуют сообщения о полученных из этих водорослей продуктах типа агарозы, которые бы обладали высокой прочностью геля и низкой температурой гелеобразования.
Краткое описание изобретения
Основной целью изобретения является получение агарозы из Gracilaria dura, произрастающей в водах Индийского океана.
Другой целью является получение агарозы, обладающей очень высокой прочностью геля (>1900 г/см2; 1% гель при 20°С), низкой температурой гелеобразования (примерно 35°С), малым (0.25) сульфатным остатком и низкой зольностью (<1%) при малых затратах.
Еще одной целью является получение агарозы путем предварительной обработки водорослей при оптимальной концентрации щелочи.
Еще одной целью изобретения является удаление остаточной щелочи (после предварительной обработки) с помощью промывки только водой вместо традиционного способа нейтрализации кислотой.
Еще одной целью является продемонстрировать, что указанный выше способ удаления избытка щелочи приводит к получению продукта со значительно повышенной прочностью геля.
Еще одной целью является получение высушенной распылением агарозы с целью более легкого растворения продукта.
Еще одной целью является подтверждение того, что в агарозе, полученной из высушенных водорослей Gracilaria dura, которая хранилась в пластиковых мешках при температуре окружающей среды более одного года, не происходит значительного разрушения.
Еще одной целью настоящего изобретения является подтверждение того, что эти морские водоросли пригодны для культивирования даже в местах, удаленных от их природного происхождения.
Еще одной целью настоящего изобретения является подтверждение того, что качество агарозы, получаемой из природной и культивированной Gracilaria dura, одинаково.
Еще одной целью является подтверждение того, что производство агарозы из Gracilaria dura в достаточном количестве выполнимо, несмотря на то, что ее природные запасы ограничены.
Настоящее изобретение относится к простому, прямому и экономичному способу получения агарозы с высокой прочностью геля и низкой температурой гелеобразования из природной или культивированной Gracilaria spp, более конкретно Gracilaria dura, который (способ) включает стадии предварительной обработки сухой водоросли щелочью, промывки предварительно обработанной водоросли до рН промывной воды в пределах от 7 до 8, добавления воды, автоклавирования до получения экстракта, обработки экстракта древесным углем и целитом до получения горячего экстракта, вакуумной фильтрации экстракта через слой целита, замораживания фильтрата с образованием массы и оттаивания этой массы, повторного растворения массы в воде при нагревании в автоклаве, повторения цикла замораживание-оттаивание, легкого сдавливания продукта для удаления оттаянной жидкости и последующим отжимом с целью по возможности полного выдавливания остатка жидкости, в результате чего получается агароза, и к агарозе, получаемой этим способом.
Подробное описание изобретения
Соответственным образом, настоящее изобретение относится к простому, прямому и экономичному способу получения агарозы с высокой прочностью геля и низкой температурой гелеобразования из природной или культивированной Gracilaria spp, более конкретно Gracilaria dura, который включает стадии предварительной обработки сухих водорослей щелочью, промывки предварительно обработанных водорослей до рН промывной воды в пределах от 7 до 8, добавления воды, автоклавирования до получения экстракта, обработки экстракта древесным углем и целитом до получения горячего экстракта, вакуумной фильтрации экстракта через слой целита, замораживания фильтрата с образованием массы и оттаивания этой массы, повторного растворения массы в воде при нагревании в автоклаве, повторения цикла замораживание-оттаивание, легкого сдавливания продукта для удаления оттаянной жидкости и последующим отжимом с целью по возможности полного выдавливания остатка жидкости, в результате чего получается агароза.
В одном из воплощений настоящее изобретение относится к агарозе, имеющей следующие характеристики:
i. прочность 1% геля при примерно 20°С приблизительно ≥1900 г/см2,
ii. температура гелеобразования 35-35,5°С,
iii. содержание сульфатов ≤0,25% и
iv. зольность ≤0,9%.
В еще одном воплощении настоящего изобретения агарозу получают из Gracilaria spp, более конкретно из Gracilaria dura.
В еще одном воплощении настоящего изобретения агарозный гель имеет температуру гелеобразования в пределах от 98 до 100°С.
В еще одном воплощении настоящего изобретения простой, прямой и экономичный способ получения агарозы с высокой прочностью геля и низкой температурой гелеобразования из природной или культивированной Gracilaria spp., более конкретно из Gracilaria dura, включает стадии:
- получение сухих морских водорослей Gracilaria spp,
- предварительная обработка сухих водорослей 35 частями (об./вес.) примерно 1-15%-ной щелочи при 25-95°С в течение 0,5-5,0 ч,
- промывка предварительно обработанных водорослей водой для удаления избытка щелочи до рН промывной воды в пределах от 7 до 8,
- добавление примерно 35 частей (об./вес.) на примерно 1 часть исходных водорослей и автоклавирование при примерно 115-125°С в течение времени от 1,5 до 2,0 ч, в результате чего получают экстракт,
- обработка экстракта примерно 0,05-0,07% древесного угля или примерно 10-15% целита при температуре от 85 до 95°С, в результате чего получают горячий экстракт,
- вакуумная фильтрация горячего экстракта через слой целита,
- замораживание фильтрата с образованием массы при примерно -20°С в течение 12-15 ч и оттаивание массы,
- повторное растворение массы в примерно 25 частях воды при нагревании в автоклаве,
- повторение при необходимости цикла замораживание-оттаивание,
- легкое сдавливание продукта стадии (i) для удаления оттаянной жидкости и последующий отжим для по возможности полного выдавливания остатка жидкости, в результате чего получают агарозу, и
- возможное растворение твердого материала и сушка распылением, в результате чего получают тонкий порошок.
В еще одном воплощении настоящего изобретения щелочью является гидроксид натрия.
В еще одном воплощении настоящего изобретения концентрация щелочи равна примерно 10%.
В еще одном воплощении настоящего изобретения время автоклавирования на стадии (d) составляет преимущественно примерно 1,5 ч.
В еще одном воплощении настоящего изобретения выход агарозы находится в пределах от 20 до 23% от веса сухих водорослей.
В еще одном воплощении настоящего изобретения предварительная обработка водорослей проводится при температуре преимущественно около 85°С.
В еще одном воплощении настоящего изобретения предварительная обработка водорослей проводится преимущественно в течение 2,0 ч.
В еще одном воплощении настоящего изобретения автоклавирование проводится преимущественно при температуре около 120°С.
В еще одном воплощении настоящего изобретения концентрация древесного угля составляет примерно 0,06%.
В еще одном воплощении настоящего изобретения концентрация целита составляет примерно 12,5%.
В то время как предшествующий уровень техники утверждает, что высококачественные агар и агароза получаются в основном из морских водорослей Gelidium Gelidiella, а агар, экстрагированный из Gracilaria dura, обладает прочностью геля лишь в пределах от 160 до 390 г/см2 (1,5%), настоящее изобретение описывает получение агарозы из Gracilaria dura, встречающейся местами в Арабском море у западного побережья Индии, и из тех же водорослей, успешно культивируемых с целью увеличения биомассы для практического использования, в случае чего свежие водоросли собирают, сушат на месте, повторно замачивают в лаборатории при комнатной температуре, обрабатывают водным NaOH, промывают водой для удаления избытка щелочи, вымачивают в избытке воды, вываривают под давлением, после чего гомогенизируют горячий экстракт, затем кипятят в присутствии осветляющих добавок, фильтруют через слой целита, фильтрат подвергают циклу замораживания-оттаивания, полученный твердый материал повторно растворяют, повторяют цикл замораживания-оттаивания для дополнительного уменьшения примесей, после чего материал сушат и размалывают или, предпочтительно, повторно растворяют в воде и сушат распылением.
В одном из воплощений настоящего изобретения водоросли собирают на побережье Веравал на западе Индии, 20°54′N, 70°22′E.
В другом воплощении настоящего изобретения предварительную обработку щелочью проводят в течение 1-2 ч при 80-85°С с использованием в качестве щелочи гидроксида натрия.
В еще одном воплощении настоящего изобретения концентрация щелочи для предварительной обработки находится в пределах от 0 до 15% (вес./об.) и предпочтительно равна 10%.
В еще одном воплощении настоящего изобретения объем используемой щелочи составляет 300 мл на каждые 10 г водорослей.
В еще одном воплощении настоящего изобретения избыток щелочи после предварительной обработки удаляют промывкой водорослей водой, избегая тем самым применения какой-либо кислоты, и при этом в конечной промывной воде обеспечивается рН в пределах от 7 до 8.
В еще одном воплощении настоящего изобретения влажные водоросли после предварительной обработки помещают в воду в автоклаве, где количество воды составляет 300 мл на каждые 10 г сухих водорослей.
В еще одном воплощении настоящего изобретения предварительно обработанные водоросли вываривают в воде в течение 1,5-2,0 ч при 120°С.
В еще одном воплощении настоящего изобретения горячий экстракт выгружают при 70-80°С, после чего добавляют древесный уголь и целит и кипятят при атмосферном давлении.
В еще одном воплощении настоящего изобретения кипящий экстракт фильтруют под вакуумом через слой целита.
В еще одном воплощении настоящего изобретения прозрачный горячий экстракт выливают на плоские стальные противни и оставляют охлаждаться до комнатной температуры, в результате чего образуется гель.
В еще одном воплощении настоящего изобретения гель нарезают ножом с равными интервалами вдоль осей х и у и после этого охлаждают в течение 2-5 ч до -20°С, в результате чего масса замораживается, и выдерживают ее при низкой температуре в течение 12-15 ч.
В еще одном воплощении настоящего изобретения операцию замораживания-оттаивания при необходимости повторяют.
В еще одном воплощении настоящего изобретения агароза, полученная при оптимальных условиях экстракции, обладает прочностью геля более 1900 г/см2 при концентрации 1% и температуре 20°С.
В еще одном воплощении настоящего изобретения гель, полученный из агарозы, полученной при оптимальных условиях экстракции, имеет температуру плавления 98-100°С, в то время как золь имеет температуру гелеобразования 35,0-35,5°С.
В еще одном воплощении настоящего изобретения агароза, полученная при оптимальных условиях экстракции, характеризуется содержанием сульфата 0,25% и зольностью 0,9%.
В еще одном воплощении настоящего изобретения горячий золь агарозы высушивают распылением с целью легкого растворения при нагревании.
В еще одном воплощении настоящего изобретения Gracilaria dura оказалась пригодной для культивирования полиэтиленовом мешке или на плоту в заливе Маннар у юго-восточного побережья Индии с суточным приростом до 5% на плоту на острове Крусадаи (9°16′N, 79°19′E).
В еще одном воплощении настоящего изобретения природные или культивированные водоросли позволили получить агарозу близкого качества, что делает изобретение практически реализуемым с учетом большого количества биомассы, которое может быть наработано путем культивирования.
В еще одном воплощении настоящего изобретения качество агарозы, экстрагированной из сухих водорослей, хранившейся в пластиковых мешках в течение времени до 1 года, оказалось близким к качеству агарозы, полученной из свежевысушенных водорослей.
Таким образом, настоящее изобретение описывает получение агарозы с высокой прочностью геля и низкой температурой гелеобразования из природной или культивированной Gracilaria dura с помощью способа, включающего: (i) отвешивание сухих водорослей, (ii) предварительную обработку сухих водорослей 35 частями(об./вес.) 10%-го гидроксида натрия в течение 2 ч при 85°С, (iii) тщательную промывку водорослей водой с целью удаления избытка щелочи до рН промывной воды 7-8, (iv) добавление 35 частей (об./вес.) воды на 1 часть исходных водорослей и автоклавирование в течение 1,5 ч при 120°С, (v) обработку экстракта 0,06% древесного угля и 12,5% целита (содержания относятся к сухому весу взятых водорослей) при температуре 85-90°С, (vi) вакуумную фильтрацию горячего экстракта через слой целита, (vii) замораживание фильтрата при -20°С в течение 15 ч с последующим оттаиванием массы, (viii) повторное растворение массы в 25 частях воды при нагревании в автоклаве, (ix) повторение при необходимости цикла замораживание-оттаивание, (х) легкое сдавливание для удаления оттаянной жидкости с последующим отжимом для по возможности полного выдавливания остатка жидкости, (xi) повторное растворение твердого материала и сушку распылением, в результате чего получают тонкий порошок.
Прочность геля измерялась на гель-тестере типа Nikkansui в 1,5% агаровом геле при 20°С. Термогравиметрический анализ проводился на TGA-машине Star-Toledo (Швейцария). Определение молекулярного веса производилось измерением характеристической вязкости на вискозиметре Оствальда (см. С.Rochas and M.Lahaye. Carbohydrate Polymers 1989, 10:289). Температуры гелеобразования и плавления определялись по методу, описанному Craige et al. (Handbook of Physiological methods, 1978 (изд. Hellebust, J.A. и Craigie J.S. Cambridge University press), pp.127). Зольность измерялась сжиганием твердого материала при 800°С в течение 6 ч. Содержание сульфатов определялось обработкой золы концентрированной азотной кислотой, упариванием досуха, растворением остатка в воде, фильтрацией и проведением анализа на серу методом ICP-OES (индуктивная плазма - оптическая эмиссионная спектроскопия).
Основной аспект изобретения состоит в отходе от традиционного представления о том, что Gelidium и Gelidiella являются единственными, встречающимися на побережье Индии водорослями, из которых возможно производство высококачественного агара.
Другой аспект изобретения состоит в возвращении к водорослям Gracilaria dura, от которых вначале отказались из-за их малой полезности как по причине заурядного качества получаемого агара, так и по причине ограниченности биомасссы в природе.
Еще один аспект изобретения состоит в установлении оптимальной концентрации NaOH для предварительной обработки водорослей.
Еще один аспект изобретения состоит в отказе от традиционной операции нейтрализации избытка щелочи (после предварительной обработки) кислотой, замененной промывками водой только для удаления этого избытка щелочи, благодаря чему предотвращается катализируемое кислотой разложение полисахарида, которое может происходить из-за высоких локальных концентраций кислоты.
Еще один аспект изобретения состоит в том, что малые запасы водорослей в природе не стали обескураживающим фактором и было предпринято культивирование их в подходящих для этого местах.
Еще один аспект изобретения состоит в выборе культивирования на плотах в качестве перспективного способа культивирования, который на подходящих прибрежных участках может давать ежесуточный прирост более 5%.
Еще один аспект изобретения состоит в возвращении к водорослям, от которых первоначально отказались из-за их малой пригодности.
Еще один аспект изобретения состоит в том, что малая биомасса водорослей в природе не стала обескураживающим фактором и было предпринято их культивирование в подходящих условиях в местах, сильно отличающихся от места ее происхождения в природе.
Еще один аспект изобретения состоит в культивировании водорослей путем нарезки живых водорослей на плоту, расположенном в открытом спокойном море, что позволяет получать высокий ежесуточный прирост.
Еще один аспект изобретения состоит в установлении того, что в предшествующем уровне техники для разных водорослевых субстратов могут потребоваться разные количества щелочи на стадии предварительной обработки, и в последующей оптимизации концентрации щелочи.
Еще один аспект изобретения состоит в установлении того, что проводимое в предшествующем уровне техники удаление щелочи, а именно нейтрализация избытка щелочи кислотой, может создать трудности в отношении мгновенного нарастания высокой локальной концентрации кислоты в системе, что может оказаться разрушительным для устойчивости линейной молекулы галактана.
Еще один аспект изобретения состоит в получении высушенного распылением продукта для легкого растворения при нагревании.
Еще один аспект изобретения состоит в систематическом исследовании, приведшем к установлению того, что водоросли после высушивания на солнце обладают адекватным сроком пригодности для продолжительного хранения, которое необходимо, так как активность культивирования не может сохраняться на протяжении всего года.
Еще один аспект изобретения состоит в получении агара и анарозы без использования растворителей.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Приведенные ниже примеры даются в качестве иллюстрации и, следовательно, не должны восприниматься как ограничение объема настоящего изобретения. Примеры 1 и 2 относятся к предшествующему уровню техники, а примеры 3-8 иллюстрируют описанное в заявке изобретение.
ПРИМЕР 1
Gracilaria dura из Веравала, Индия (20°54′N, 70°22′E) была собрана в апреле 2003 года и высушена на солнце. 15 г водорослей вымачивают в водопроводной воде в течение 1 часа при комнатной температуре (30-35°С), после чего воду удаляют. Затем влажные водоросли помещают в дистиллированную воду (водоросли/вода 1:35, вес./об.) и автоклавируют в течение 1,5 часа при 120°С. Экстракт гомогенизируют и кипятят с осветляющими агентами (древесный уголь и целит) с последующей фильтрацией через слой целита под пониженным давлением. Фильтрат замораживают при -20°С на 15 час и затем оттаивают. Содержимое помещают в сукно и отжимают воду в максимально возможной степени. Остаток высушивают на воздухе при комнатной температуре (30-35°С) и затем сушат в течение 2 ч в печи при 50°С. В результате было получено 4,42 г агара (выход 32,5% в расчете на абсолютно сухие водоросли) с прочностью геля (1,5% гель, 20°С) 265 г/см2, температурой гелеобразования 32°С, зольностью 8,04% и содержанием сульфата 3,26%.
ПРИМЕР 2
Gracilaria dura примера 1 вначале вымачивают в воде, воду удаляют и влажные водоросли обрабатывают в течение 2 ч 5%-ным NaOH при 80-85°С с последующей промывкой водорослей водой для удаления избытка щелочи. Остаточную щелочь нейтрализуют в одном случае 0,5%-ной уксусной кислотой и в другом случае 0,025%-ной H2SO4. Водоросли после этого подвергают автоклавированию и затем обрабатывают как описано в примере 1. Полученные результаты приведены в таблице 1.
| Таблица 1 | ||||
| Агар, полученный с использованием щелочной обработки и нейтрализации остаточной щелочи кислотой | ||||
| Количес-тво водоро-слей | Условия предварительной обработки | Выход (г); (выход в % на абсолютно сухие водоросли) | Прочность геля (г/см2) при 20°С (% гель) | Температура гелеобразо-вания (°С) |
| 20 г | 5,0% щелочь, кислотная промывка 0,25% H2SO4 | 3,6 (21,0) | 470°С (1,0%) | 33,5 |
| 10 г | 5,0% щелочь, кислотная промывка 0,5% АсОН | 1,31 (15,0) | 465°С (1,0%) | 33,0 |
ПРИМЕР 3
20 г сухой Gracilaria dura обрабатывают, как в примере 2, за исключением того, что водоросли после щелочной обработки подвергают только промывке водой для удаления щелочи без использования кислоты. Как следует из приведенной ниже таблицы 2, результатом модифицирования является значительное увеличение прочности геля.
| Таблица 2 | ||||||
| Агар, полученный после удаления остаточной щелочи из водорослей промывкой водой | ||||||
| Количе-ство водорос-лей | Условия предварительной обработки | Выход (г); (выход в % на абсолютно сухие водоросли) | Прочность геля (г/см2) при 20°С (% гель) | Темпера-тура гелеобразования (°С) | Зольность (%) | Сульфат (%) |
| 20 г | 5% щелочь, промывка водой | 3,8 (21,0%) | 1620 (1,0%) | 35,0 | 2,02 | 0,50 |
ПРИМЕР 4
Gracilaria dura обрабатывают разными количествами щелочи, повторяя способ примера 3. Результаты исследования представлены в таблице 3. Из таблицы следует, что 10% является оптимальной концентрацией щелочи, которая обеспечивает максимальную прочность геля, и в то же время избегается применение концентраций за пределами необходимой концентрации.
| Таблица 3 | ||||||
| Свойства агара/агарозы в случае разных щелочных обработок | ||||||
| Количе-ство водоро-слей | Условия предварительной обработки | Выход (г); (выход в % на абсолютно сухие водоросли) | Прочность геля (г/см2) при 20°С (% гель) | Температура гелеобразова-ния (°С) | Зольность (%) | Сульфат (%) |
| 15 г | 1,5% щелочь, промывка водой | 3,10 (20,7) | 275 (1,0%) | 33,0 | 4,5 | >0,5 |
| 10 г | 3% щелочь, промывка водой | 1,98 (22,0) | 800 (1,0%) | 35,0 | 3,4 | >0,5 |
| 20 г | 5% щелочь, промывка водой | 3,80 (21,0) | 1600(1,0%) | 35,0 | 2,02 | 0.50 |
| 10 г | 7% щелочь, промывка водой | 1,80 (20,0) | 1875 (1,0%) | 35,0 | 1,80 | <0.50 |
| 10 г | 10% щелочь, промывка водой | 1,85 (20,5) | >1920 (1,0%) 1450 (0,75%) 900 (0,5%) | 35,0 | ≤0,9 | ≤0,25 |
| 15 г | 15% щелочь, промывка водой | 3,20( 23,0) | >1920 (1,0%) 1465 (0,75%) 900 (0,5%) | 35,0 | ≤0,9 | ≤0,28 |
ПРИМЕР 5
Продукт примера 4 сравнивался с продуктом, полученным с использованием обработки Gracilaria dura 10%-ной щелочью, как в примере 4, но где остаточная щелочь была нейтрализована 0,5%-ной АсОН, как в одном из случаев примера 2. Из таблицы 4 следует, что уменьшение прочности геля, сопровождающее нейтрализацию АсОН, приводит к одновременному снижению молекулярного веса линейного галактана. Это убедительно свидетельствует о том, что уменьшение прочности геля обусловлено катализируемым кислотой гидролитическим разложением полисахарида.
| Таблица 4 | ||||
| Агар, экстрагированный в условиях предварительной обработки разными концентрациями щелочами с последующей промывкой кислотой | ||||
| Количе-ство водорос-лей | Условия предварительной обработки | Выход (г); (выход в % на абсолютно сухие водоросли) | Прочность геля (г/см2) при 20°С (% гель) | Среднечисленный молекулярный вес (Дальтон) |
| 10 г | 10% щелочь, кислотная промывка 0,5% АсОН | 1,63 (18,1) | 1025 (1,0%) | 0,199·105 |
| 10 г | 10% щелочь, промывка водой | 1,85 (20,5) | >1920 (1%) | 1,23·105 |
ПРИМЕР 6
Gracilaria dura, собранная в различное время на побережье Веравал в Гуджарате, была обработана, как в примере 3, с использованием 5%-ной щелочи. Данные представлены в таблице 5. Из таблицы следует, что сезонные изменения свойств водорослей незначительны.
| Таблица 5 | |||||||
| Агар, полученный из Gracilaria dura, собранной в разное время года | |||||||
| Дата сбора водорос-лей | Количество водорослей | Условия предварительной обработки | Выход (г); (выход в % на абсолютно сухие водоросли) | Прочность геля (г/см2) при 20°С (% гель) | Температура гелеобразо-вания (°С) | Зольность (%) | Сульфат (%) |
| Февраль 2003 | 20 г | 5% щелочь, промывка водой | 4,1 (22,8) | 1650 (1,0%) | 35,0 | 2,0 | 0,50 |
| Апрель 2003 | 20 г | 5% щелочь, промывка водой | 3,8 (21,0) | 1620 (1,0%) | 35,0 | 2,02 | 0,50 |
| Июнь 2003 | 20 г | 5% щелочь, промывка водой | 4,2 (23,0) | 1600 (1,0%) | 35,0 | 2,0 | 0,50 |
| Декабрь 2003 | 10 г | 5% щелочь, промывка водой | 1,85 (20,5) | 1600 (1,0%) | 35,0 | 2,0 | 0,50 |
| Январь 2004 | 15 г | 5% щелочь, промывка водой | 2,90 (20,0) | 1630 (1,0%) | 35,0 | 2,0 | 0,50 |
ПРИМЕР 7
Gracilaria dura примера 1 была собрана в январе 2004 года и транспортирована в свежем виде в залив Маннар, Тамил Наду (9°17′N, 78°8′E). Результаты культивирования в трех разных местах (Thonihurai, Ervadi, Krusadai Island) показаны в таблице 6. Суточный прирост рассчитывался с помощью следующей формулы
r=(Wt/W0)1/t×100,
где r обозначает суточный прирост в %, Wt обозначает вес во влажном состоянии на день t, W0 обозначает исходный вес во влажном состоянии. Из таблицы 6 следует, что культивирование выполнимо с суточным приростом до 4,34%.
| Таблица 6 | ||
| Культивирование в дырчатых полиэтиленовых мешках и на плотах в трех разных местах в залив Маннар, Тамил Налу, Индия | ||
| Способ культивирования | ||
| Thonihurai | Полиэтиленовые мешки | Плот канаты |
| Исходный вес (09.01.04) | 250 г (10 мешков × 25 г каждый | 1800 г (18 1,5-м канатов × 100 г в каждом) |
| Конечный вес (23.02.04) | 883 г | 5076 г |
| Прирост %/сутки | 2,8 | 2,3 |
| Ervadi | Полиэтиленовые мешки | Плот канаты |
| Исходный вес (13.01.04) | 100 г (10 мешков × 25 г каждый) | 900 г (18 канатов × 100 г в каждом) |
| Конечный вес (27.02.04) | 306 г | 2318 |
| Прирост %/сутки | 2,5 | 2,1 |
| Krusadai Island | Полиэтиленовые мешки | Плот канаты |
| Исходный вес (12.01.04) | 100 г (10 мешков × 10 г каждый) | 800 г (16 канатов × 50 г в каждом) |
| Конечный вес (26.02.04) | 692 г | 11312 г |
| Прирост %/сутки | 4,29 | 4,34 |
ПРИМЕР 8
5 кг свежей Gracilaria dura, культивированной на острове Krusadai Island, как описано в примере 7, высушивают до веса 795 г.15 г сухих водорослей обрабатывают, как описано в примере 4, используя для предварительной обработки 10%-ный NaOH и получая 2,84 г (выход 20%) продукта, характеризующегося прочностью геля
1920 г/см2 (1% гель, 20°С), температурой гелеобразования 35°С и зольностью 0,9%. Из сравнения этих результатов с соответствующими данными в примере 4 следует, что выход и качество агарозы из культивированного материала такие же, как и те, которые получают для природных водорослей (см. пример 4).
Преимущества настоящего изобретения
Главным преимуществом настоящего изобретения является то, что агароза с желаемыми техническими характеристиками может быть получена из произрастающей в индийских водах Gracilaria dura.
Другим преимуществом является то, что выход агарозы достигает 20-30% в расчете на сухой вес водорослей.
Еще одним преимуществом является то, что сухие водоросли обладают адекватным сроком хранения в пластиковых мешках в условиях окружающей среды.
Еще одним преимуществом является то, что получение агарозы является простым в выполнении.
Еще одним преимуществом является то, что водоросли можно культивировать в водах Индийского океана.
1. Способ получения агарозы из видов Gracilaria, включающий стадии:
a. получение сухих морских водорослей Gracilaria spp, предпочтительно Gracilaria dura, из природных источников или путем культивирования в полиэтиленовых мешках или на плотах, при котором прирост составляет от 2,1 до 4,34% в день,
b. обработка сухих водорослей 30 частями (об./мас.) 1-15%-ной щелочи при температуре от 25 до 95°С в течение от 0,5 до 5,0 ч,
c. тщательное промывание обработанных морских водорослей водой для удаления избытка щелочи до предпочтительно рН промывных вод от 7 до 8,
d. добавление приблизительно 30 частей (об./мас.) воды на каждую часть исходных морских водорослей и автоклавирование при температуре от 115 до 125°С в течение от 1,5 до 2,0 ч, с последующим гомогенизированием для получения экстракта,
e. обработка экстракта 0,05-0,07% активированного угля и 10-15% целита при температуре от 85 до 95°С для получения горячего экстракта,
f. вакуумное фильтрование горячего экстракта через слой целита,
g. замораживание фильтрата с образованием массы при температуре от -15 до -20°С в течение 12-15 ч и оттаивание массы,
h. сжатие продукта, полученного на стадии (g), для удаления оттаявшей жидкости и последующий отжим для максимально возможного выдавливания остаточной оттаявшей жидкости для получения агарозы,
i. растворение агарозы, полученной на стадии (h) в 25 частях деминерализованной воды путем нагревания в автоклаве,
j. повторение цикла замораживание-оттаивание, указанного на стадии (g),
k. сжатие продукта, полученного на стадии (j), для удаления оттаявшей жидкости и последующий отжим для максимально возможного выдавливания остаточной оттаявшей жидкости для получения агарозы, и
l. растворение твердого материала в воде и сушка распылением для получения тонкодисперсного порошка.
2. Способ по п.1, в котором высушенные на солнце морские водоросли перед стадией (b) замачивают в воде при соотношении вода: морские водоросли 20:50 при температуре от 30 до 35°С в течение от 30 до 60 мин.
3. Способ по п.1, в котором обработанные и промытые морские водоросли вываривают в деминерализованной воде при соотношении вода: морские водоросли 30:1.
4. Способ по п.1, в котором горячий экстракт смешивают с активированным углем при процентном содержании от 0,05 до 0,07% (мас./мас.) по отношению к массе взятых морских водорослей для удаления компонентов, придающих окраску.
5. Способ по п.1, в котором горячий экстракт смешивают с целитом при процентном соотношении от 10 до 15% (мас./мас.) по отношению к массе взятых морских водорослей для обеспечения быстрого фильтрования.
6. Агароза, полученная способом по любому из пп.1-5, характеризующаяся следующими свойствами:
i. прочность 1% геля при примерно 20°С приблизительно ≥1900 г/см2,
ii. температура гелеобразования 35-35,5°С,
iii. содержание сульфатов ≤0,25% и
iv. зольность ≤0,9%.
