Штамм бактерий brevibacillus laterosporus, подавляющий и предотвращающий развитие планктонных и биопленочных форм микроскопических водорослей в водных системах
Владельцы патента RU 2382075:
Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) (RU)
Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9844 получен путем многоступенчатой селекции из природного штамма, выделенного из почвы. Разрушение планктонных и биопленочных форм микроскопических водорослей под воздействием штамма Brevibacillus laterospoms ВКПМ В-9844 сопровождается изменением цвета, а в дальнейшем - обесцвечиванием. При оптической микроскопии наблюдается разрушение клеток микроводорослей. При определении альгицидной активности штамма, оцениваемой по остаточной оптической плотности (ОП), показано, что наиболее чувствительны к альгицидному действию штамма планктонные формы микроскопических водорослей Nostoc, Anabaena и Microcystis, относящиеся к сине-зеленым водорослям (цианобактериям). Пресноводные зеленые водоросли Cosmarium и Chlorella, а также микроскопические водоросли, обитающие преимущественно в морской воде Amphidinium, Prorocentrum, Thalassiosira требуют более длительного времени воздействия штамма ВКПМ В-9844 для полного лизиса клеток. Это позволяет расширить арсенал штаммов, обладающих альгицидным действием. 4 табл.
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности производству и применению биологических средств борьбы с микроскопическими водорослями.
Микроскопические водоросли (фитопланктон), присутствующие в открытых водоемах, в большой степени формируют качество воды. Микроводоросли могут развиваться в морской и пресной воде. Фитопланктон представляет собой базовое автотрофное звено, превращающее солнечную энергию и компоненты минеральных веществ в первичное органическое вещество, обеспечивающее все последующие пищевые цепи в водных экосистемах. Следствием мощного развития энергетики и промышленности в последние десятилетия явилось создание большого числа искусственных и технологическим водоемов (водохранилищ и прудов), а также систем водоснабжения промышленных предприятий. Динамика численности микроводорослей зависит от множества внешних факторов. Массовое увеличение численности микроводорослей в водоемах приводит к неблагоприятным последствиям, таким как «цветение» воды [1] и образования трехмерных структурированных биопленок - так называемых «матов», а в системах водоснабжения - к формированию устойчивых биологических обрастаний (биообрастаний) [2]. Поступление промышленных, хозяйственно-бытовых и сельскохозяйственных сточных вод приводит к загрязнению водоемов, приводящему к «цветению» воды за счет развития различных типов микроскопических водорослей. Среди микроводорослей, возбудителей «цветения» воды и биообрастаний, наибольшее распространение получили цианобактерии, такие как Nostoc, Anabaena, Microcystis aeroginosa,
В ходе эволюции микроводоросли выработали эффективные механизмы адаптации к неблагоприятным факторам внешней среды. Способность микроводорослей к быстрому размножению связана, прежде всего, с их устойчивостью к экстремальным температурам и концентрациям солей, слабой освещенности, малому количеству кислорода. Микроводоросли приспособились жить в водных коммуникациях, каналах, трубах, плавательных бассейнах, аквариумах. «Цветение воды» приводит к значительному ухудшению качества воды, нежелательному для промышленного, энергетического, сельскохозяйственного, рыбохозяйственного, бытового и рекреационного использования. В результате массового развития микроводорослей наблюдаются существенные помехи в питьевом и технологическом водоснабжении. Процесс разложения и гниения составляющих биопленки («маты») микроводорослей сопровождается выбросом в воду ряда токсических соединений (фенолы, индол, скатол). Высокая численность клеток водорослей при их отмирании может приводить к гипоксии и гибели всех аэробных организмов [3-5]. Некоторые виды микроводорослей продуцируют специфические нейро- и гепатотоксины, представляющие серьезную угрозу здоровью людей и животных. Антидотов к токсинам микроводорослей не существует. Кроме того, микроводоросли вызывают ряд аллергических заболеваний. Распространение микроводорослей приобретает характер глобальной мировой проблемы [6]. Энергетические и промышленные предприятия несут колоссальные финансовые потери. Серьезный экономический ущерб, а также токсическое воздействие микроводорослей на окружающую среду диктует необходимость разработки методов контроля и прогнозирования состояния водных экосистем.
Таким образом, «цветение» водоемов вызывает ряд серьезных социальных и экономических последствий, что определяет необходимость борьбы с цветением фитопланктона и продуктами их метаболизма.
Используемые в мировой практике различные физические и химические методы "борьбы" с микроводорослями: спуск воды из водоемов с последующим механическим удалением биомассы, аэрирование огромных водных пространств, использование ультрафиолетового облучения и ультразвука - малоэффективны и связаны, кроме того, с большими финансовыми затратами [7-8]. Физические методы контроля микроводорослей направлены на создание условий, либо препятствующих развитию водорослей, либо разрушающих уже образовавшиеся сообщества микроводорослей - «маты». Ультразвуковая обработка «цветущей» воды приводит к нежелательным последствиям, хотя и является достаточно эффективной по альгицидному действию. Обработка «цветущей» воды ультразвуком снижает рН, количество общего азота и фосфора в воде и повышает температуру воды.
Для снижения численности водорослей могут быть использованы химические гербициды (диурон, симазин, атразин), оказывающие альгицидный эффект. Однако отрицательное влияние на водные биоценозы фактически исключает возможность использования этих веществ для борьбы с цветением и биообрастанием. Кроме того, химические препараты не обладают избирательностью действия и оказывают ряд отрицательных биологических эффектов (летальный, мутагенный, тератогенный и т.д.) как в целом на водные биоценозы, так и на отдельные растительные и животные организмы. Использование химических альгицидов для обработки водоемов ограничено по санитарно-гигиеническим нормам, а также неблагоприятно сказывается на жизнедеятельности других обитателей водоемов (гидробионтов).
В качестве биологического метода контроля численности микроводорослей могут быть использованы микроорганизмы и их метаболиты, оказывающие антагонистический эффект на микроводоросли, вирусы и соединения растительного происхождения [9-10]. В настоящее время выделен ряд микроорганизмов, обладающих альгицидным эффектом. Бактерии-антагонисты могут являться хорошим источником для создания современных биологических препаратов - альгицидов.
В качестве ближайшего аналога заявляемого объекта рассмотрен штамм Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9405, обладающий альгицидным действием [11].
Задача заявляемого изобретения - расширить арсенал штаммов, обладающих альгицидным действием.
Задача решена путем получения штамма бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9844.
Заявляемый штамм получен в результате многоступенчатой селекции из природного штамма того же вида Brevibacillus laterosporus 16-36, выделенного из почвы и депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-9844, и отличается от ближайшего аналога Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9405 более быстрым альгицидным эффектом (лизис микроводорослей наступает через 2 и 24 часа соответственно), а также способностью лизировать планктонные и биопленочные формы микроскопических водорослей.
1. Культивирование штамма
В качестве питательных сред использовали NBY, ASC, SG, YM следующего состава (мас.%):
среда NBY:
| питательный бульон «Difco» | 0,8 |
| дрожжевой экстракт « Difco» | 0,3 |
вода остальное
среда ASC:
| дрожжевой экстракт «Difco» | 0,5 |
| сахароза | 2,0 |
| лимонная кислота | 1,17 |
| Na2SO4 | 0,4 |
| (NH4)2НРO4 | 0,42 |
| КСl | 0,076 |
| MgCl2×6H2O | 0,042 |
| вода | остальное |
среда SG:
| сукцинат натрия | 0,5 |
| глицерин | 1,5 |
| MgSO4 | 0,02 |
| (NH4)2HPO4 | 0,5 |
| KCl | 0,2 |
| вода | остальное |
среда YM
| гидролизные дрожжи | 4,5 |
| вода | остальное |
Для приготовления агаризованных питательных сред в жидкие среды дополнительно добавляли агар-агар (2,0 мас.%).
2. Культурально-морфологические признаки
Грамположительные подвижные палочки, перитрихи, размером 0,5-0,7×3,5-5,0 мкм, цепочек не образуют. Хорошо спорулирует в жидкой и на твердой питательной среде NBY.
При культивировании на агаризованной среде NBY через 48 часов при температуре 28-30°С штамм образует округлые колонии диаметром 3-4 мм белого цвета с гладкой поверхностью и неровным краем. Через 72-96 часа роста на питательной среде NBY штамм образует споры. В процессе споруляции образуется каноэвидная структура, примыкающая к споре. Свободные споры имеют эллиптическую форму. Размер спор 0,8-1,2×1,4-1,7 мкм.
3. Физиолого-биохимические свойства
Культивирование штамма заявляемого штамма осуществляют в диапазоне температур 28-30°С при рН 6,8-7,2. Оптимальными являются температура для культивирования штамма В-9844 30°С и рН 7,0.
Штамм образует каталазу. Гидролизует казеин и желатину, не гидролизует крахмал. Мочевину не расщепляет. Не сбраживает сахарозу, арабинозу, ксилозу, лактозу. Сбраживает глюкозу, мальтозу, маннит, фруктозу. Глюкозу сбраживает без газа. Не образует ацетоина. Образует лецитиназу, твин-эстеразу. Растет в присутствии лизоцима.
На основании морфологических (наличие каноэвидной структуры, прикрепленной к споре) и физиолого-биохимических признаков штамм ВКПМ В-9844 отнесен к Brevibacillus laterosporus [12]
3. Альгицидные свойства штамма
Штамм характеризуется широким спектром альгицидной активности и подавляет развитие следующих микроскопических водорослей (таблица 1).
| Таблица 1 Таксономия использованных микроводорослей |
|
| Вид микроводорослей | Таксономический тип |
| Anabaena sp.5781 | Cyanophyta |
| Nostoc sp.A-10 | Cyanophyta |
| Microcystis aeruginosa 562 | Cyanophyta |
| Microcystis aeruginosa 905 | Cyanophyta |
| Cosmarium sp. | Chlorophyta |
| Chlorella vulgaris | Chlorophyta |
| Thalassiosira weissflogii | Dinoflagellata |
| Prorocentrum micans | Dinoflagellata |
| Amphidinium carterae | Dinophyta |
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Культивирование штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9844 в средах ASC и SG
Среды ASC и SG готовили на дистиллированной воде, доводили значение рН до 7,0, разливали в пробирки по 5-10 мл и стерилизовали в автоклаве при давлении 0,8 атм при температуре 120°С в течение 30 мин. После стерилизации пробирки с содержащейся в них средой охлаждали до +20°С. Стерильность и рН контролировали путем отбора соответствующих проб. Затем в пробирки со средой ASC или SG вносили по 1 мл посевного материала, приготовленного следующим образом: в стандартную пробирку с 5 мл стерильной питательной среды NBY помещали бактериальную культуру, собранную петлей с твердой агаризованной среды NBY, и инкубировали в течение 16 часов при температуре 30°С со встряхиванием 250 об/мин. Содержимое пробирки, после светооптического контроля на отсутствие посторонней микрофлоры, использовали как посевной материал.
Заявляемый штамм культивировали в стандартных пробирках в 5 мл в жидких питательных средах ASC или SG в течение 96 часов при 28-30°С со встряхиванием при 250 об/мин. Наблюдали равномерный рост культуры по всему объему среды. Методом световой микроскопии и высевом на питательный агар оценивали наличие бактериальных клеток и спор и отсутствие посторонней микрофлоры. К 96 часам культивирования наблюдали незначительное спорообразование - 5-10% спор, преимущественно - 90-95% вегетативных клеток. Микробиологическим методом оценивали титр колоний образующих единиц (КОЕ) штамма ВКПМ В-9844, который составлял ~1-2×109/мл.
Пример 2.
Культивирование штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9844 в среде NBY
Для культивирования заявляемого штамма использовали стандартные стеклянные конические плоскодонные колбы Эрленмейера объемом 750 см3, в которые вносили 50-100 мл стерильной среды. Среду NBY готовили на дистиллированной воде, доводили значение рН до 7,0, разливали в колбы по 50 мл и стерилизовали в автоклаве при давлении 0,8 атм при температуре 120°С в течение 30 мин. После стерилизации колбы с содержащейся в них средой охлаждали до +20°С. Стерильность и рН контролировали путем отбора соответствующих проб. Затем в колбы вносили по 5 мл посевного материала, приготовленного следующим образом: в стандартную пробирку с 5 мл стерильной питательной среды NBY помещали бактериальную культуру, собранную петлей с твердой агаризованной среды NBY, и инкубировали в течение 16 часов при температуре 30°С со встряхиванием 250 об/мин. Содержимое пробирки, после светооптического контроля на отсутствие посторонней микрофлоры, использовали как посевной материал.
Штамм выращивали при 28-30°С при встряхивании (250 об/мин) в течение 72-96 часов. В процессе культивирования осуществляли контроль на отсутствие посторонней микрофлоры светооптическим методом или путем визуального контроля за морфологией колоний, выросших после высева культуральной жидкости штамма на чашки с агаризованной питательной средой NBY. Наблюдается равномерный рост культуры по всему объему среды. К 96 часам культивирования наблюдается преимущественно 90-95% спор и 5-10% вегетативных клеток. Микробиологическим методом оценивали титр КОЕ штамма ВКПМ В-9844, который составлял ~1×109 мл.
Поддержание штамма ВКПМ В-9844 проводили на косяках в стандартных пробирках с агаризованной средой NBY, которые пересевали каждые две недели. Хранение штамма осуществляли после его лиофилизации. Вегетативную культуру клеток выращивали на агаризованной среде NBY до образования спор. Споры и оставшиеся клетки смывали защитной средой, содержащей стерилизованное обезжиренное молоко. Ампулы с суспензией клеток и спор выдерживали 15 мин при -70°С, а затем быстро переносили в камеру для сушки, соединенную с вакуумной системой лиофилизации (модель 75150 фирмы "Labkonko"). Время сушки составляло 4 часа. Лиофилизированные образцы хранили при температуре +4°С.
Пример 3.
Культивирование микроскопических водорослей, используемых для выявления альгицидных свойств штамма
Использовали штаммы азотфиксирующих нитчатых видов микроскопических водорослей цианобактерий: Anabaena sp.5781 - получен с кафедры микробиологии ЛГУ; Nostoc sp. А-10 - получен из коллекции 1МЕТ, Йена, ГДР; два штамма азот не фиксирующих цианобактерий Microcystis aeruginosa 562 и 905 получены из Института гидробиологии Китайской Академии наук (провинции Хубей, г.Ухань); штаммы зеленых (Cosmarium, Chlorella) и морских водорослей (Amphidinium, Prorocentrum, Thalassiosira) получены с кафедры гидробиологии Биологического факультета МГУ.
Штаммы цианобактерий Anabaena, Nostoc и зеленых водорослей Cosmarium выращивали в модифицированной среде BG-11 [13].
Среды
В качестве жидкой питательной среды использовали среду BG-11.
Среда BG-11 состоит из двух смесей - А и В.
| Состав А | (мас.%) |
| NaNO3 | 0,15 |
| К2НРO4 | 0,004 |
| MgSO4×7H2O | 0,0075 |
| CaCl2×2H2O | 0,0036 |
| Лимонная кислота | 0,0006 |
| Аммонийный цитрат железа | 0,0006 |
| Nа2ЭДТА | 0,0001 |
| Nа2СО3 | 0,002 |
| Состав В: | 1 мл |
| Состав В: | (мас.%) |
| Н3ВО3 | 0,286 |
| MnCl2×4 H2O | 0,181 |
| ZnSO4×7H2O | 0,0222 |
| Na2MoO4×2H2O | 0,039 |
| CuSO2×5H2O | 0,0079 |
| Co(NO3)2×6H2O | 0,0494 |
| вода | остальное |
Штамм Chlorella vulgaris выращивали в среде Тамийя [14]
Среда Тамийя состоит из двух смесей - А и В.
| Состав А | (мас.%) |
| КNО3 | 0,5 |
| К2НРO4 | 0,125 |
| MgSO4×7H2O | 0,25 |
| FeSO4×7H2O | 0,0003 |
| Na2ЭДТА | 0,0037 |
| Состав В: | 1 мл |
| Состав В: | (мас.%) |
| Н3ВО3 | 0,286 |
| MnCl2×4 H2O | 0,181 |
| ZnSO4×7H2O | 0,0222 |
| Na2MoO4×2H2O | 0,039 |
| CuSO2×5H2O | 0,0079 |
| Со(NО3)2×6Н2O | 0,0494 |
| вода | остальное |
После автоклавирования и охлаждения pH сред BG-11 и Тамийя 7,0-7,2.
Штамм Microcystis aeruginosa 562 и 905 выращивали в среде B-12 [15].
Среда В-12 состоит из:
| (мас.%) | |
| NaNO3 | 0,01 |
| К2НРO4 | 0,001 |
| MgSO4×7H2O | 0,0075 |
| СаСl2×2H2O | 0,004 |
| Nа2СО3 | 0,0001 |
| Аммонийный цитрат железа | 0,0006 |
| Nа2ЭДТА | 0,0001 |
| Витамин В 12 | 0,0001 |
| вода | остальное |
После автоклавирования и охлаждения рН среды 9,0.
Культуральные среды для морских водорослей: диатомовых - Thalassiosira weissflogii и динофициевых - Amphidinium carterae и Prorocentrum micans готовили на искусственной морской воде соленостью 30%, которую перед внесением добавок трехкратно пастеризовали. Затем в эту воду вносили добавки согласно прописи среды f/2 [16].
Штаммы микроводорослей Anabaena, Nostoc и Cosmarium выращивали в среде BG-11, штаммы Microcystis - в среде В-12, Chlorella - в среде Тамийя в 50-100 мл в стеклянных плоскодонных колбах емкостью 250 мл при 25-30°С без аэрации при комнатной температуре, круглосуточном освещении. Использовали люминесцентные лампы дневного белого света СВЕ ЛБУ-30, которые обеспечивали освещенность 40 мкмоль квантов м-2 с-1 в области ФАР.
Культуры морских водорослей: диатомовых - Th. weissflogii и динофициевых - А carterae и Р. micans выращивали в помещенных на шейкер 1 л колбах (объем клеточной суспензии 0,5 л) при температуре 20°С и освещенности 30 мкмоль квантов
м- c1 в области ФАР, создаваемой люминесцентными лампами дневного света. Продолжительность светового периода составляла 14 часов в сутки.
Пример 4.
Определение альгицидной активности штамма ВКПМ В-9844
Альгицидную активность штамма выявляли при совместном культивировании. Для количественной оценки альгицидного эффекта к жидкой культуре сине-зеленых (Nostoc, Anabaena, Microcystis) и зеленых водорослей (Cosmarium, Chlorella) добавляли 96-часовую культуру бацилл в соотношении 5:1 и определяли остаточную оптическую плотность (ОПо) как (ОПт/ОПн)×100, где ОПн - начальная ОП, ОПт - ОП после инкубации в течение Т часов соответственно.
Измеряли оптическую плотность (при длине волны 590 нм) смеси в нулевой момент времени и после совместной инкубации.
Альгицидную активность заявляемого штамма оценивали по падению оптической плотности через 24 часа инкубации. Штамм ВКПМ В-9844 вызывал падение оптической плотности смеси с Nostoc и Anabaena примерно в 10 раз, а Microcystis, Cosmarium, Chlorella в полтора-два раза, что свидетельствовало о его литическом действии на микроводоросли (таблица 2). Лизис клеток микроводорослей выявляли также при оптической микроскопии.
| Таблица 2 Альгицидная активность штамма ВКПМ В-9844, выращенного в среде ASC |
|||||
| Остаточная оптическая плотность через 24 часа инкубации, % | |||||
| Nostoc | Anabaena | Microcystis | Cosmarium | Chlorella | |
| Без обработки | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 100,0 |
| Обработка штаммом В-9844 | 10,5 | 12,5 | 45,2 | 50,5 | 56,5 |
| Обработка штаммом В-9405 | 20,1 | 22,2 | 63,1 | 65,5 | 66,8 |
Следует отметить значительную мутность инкубационных смесей Microcystis, Cosmarium, Chlorella со штаммом ВКПМ В-9844. При этом происходит обесцвечивание полученной смеси. Следует отметить, что цианобактерии Anabaena и Nostoc более чувствительны к воздействию культуральной жидкости изучаемого штамма и обесцвечивание клеток водорослей наступает уже к 1-2 часам совместного культивирования. Микроскопически выявляли лизис вегетативных клеток микроводорослей.
Пример 5.
Определение спектра действия альгицидного фактора штамма ВКПМ В-9844
Для оценки антагонистического (альгицидного) эффекта определяли изменение окраски инкубационных смесей планктонных форм микроводорослей и штамма ВКПМ В-9844. Микроскопические водоросли синтезируют различные пигменты (хлорофилл, фикобилины, каротиноиды), которые определяют их цвет. Однако во всех опытах наблюдали обесцвечивание инкубационных смесей водорослей со штаммом ВКПМ В-9844.
Измерение оптической плотности смеси морских водорослей Amphidinium, Prorocentrum, Thalassiosira со штаммом ВКПМ В-9844 не представлялось возможным из-за физико-химических свойств - высокой мутности полученных суспензий.
| Таблица 3 Спектр альгицидного действия культуральной жидкости штамма ВКПМ В-9844 |
||||
| Таксономический тип водорослей | Предпочтительная среда обитания | Первоначальная окраска смеси | Уровень изменения окраски через | |
| 24 часа | 96 часов* | |||
| Anabaena 5781 | пресная вода | сине-зеленый | +++ | +++ |
| Nostoc A-10 | пресная вода | сине-зеленый | +++ | +++ |
| Microcystis aeruginosa 562 | пресная вода | желто-зеленый | ++ | +++ |
| Microcystis aeruginosa 905 | пресная вода | желто-зеленый | ++ | +++ |
| Cosmarium sp. | пресная вода | зеленый | + | +++ |
| Chlorella vulgaris | пресная вода | зеленый | + | ++ |
| Prorocentrum micans | морская вода | светло-зеленый | + | ++ |
| Prorocentrum micans | морская вода | светло-зеленый | + | ++ |
| Amphidinium carterae | морская вода | коричневый | + | ++ |
| * (+) - изменение цвета смеси до светло-зеленого (или желтого), (++) - осветление смеси, (+++) - полное обесцвечивание смеси микроводорослей и штамма В-9844 |
Как следует из таблицы 3, все штаммы водорослей чувствительны к альгицидному действию штамма В-9844, но уровень их чувствительности различен в зависимости от времени воздействия. При оптической микроскопии выявляли лизис вегетативных клеток микроводорослей изученных таксономических типов.
Пример 6.
Изучение локализации альгицидных факторов штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9844
Для определения локализации альгицидного фактора(ов) к цианобактериям добавляли культуральную жидкость штамма В-9844, различные фракции культуральной жидкости (осадок и надосадочную жидкость), а также смесь осадка и надосадочной жидкости, выращенного в средах NBY, ASC и SG.
| Таблица 4 Альгицидный эффект на цианобактерии Nostoc различных фракций штамма В-9844, выращенного в питательных средах NBY, ASC и SG |
|||
| Фракция штамма В-9844, добавленная к цианобактериям | Остаточная оптическая плотность через 24 часа, ОПO,24 (%) | ||
| NBY | ASC | SG | |
| Культуральная жидкость | 20,1 | 12,1 | 16,1 |
| Осадок (воднаясуспензия) | 36,4 | 31,4 | 32,2 |
| Надосадочная жидкость | 30,5 | 23,2 | 26,5 |
| Смесь надосадочной жидкости и осадка | 22,6 | 20,0 | 21,6 |
Как следует из таблицы 4, все фракции штамма, выращенного в средах NBY, ASC и SG, обладали альгицидной активностью, хотя уровень активности отдельных фракций был ниже, чем у культуральных жидкостей в целом или смеси фракций, однако следует отметить, что активность надосадочных фракций была выше, чем активность осадков. Следовательно, альгицидная активность штамма В-9844 обусловлена действием, как минимум, двух факторов, локализованных в надосадочной жидкости и осадке.
При культивировании в средах ASC и SG при световой микроскопии наблюдали лишь единичные споры, а пониженный уровень спорообразования ведет к увеличению накопления в надосадочной жидкости секретируемого альгицидного фактора. Применение синтетических питательных сред ASC и SG для продуцирования штаммом высокого уровня альгицидной активности при пониженном уровне спорообразования предотвращает загрязнение окружающей среды спорами бактерий в случае применения альгицида на основе этого штамма.
Пример 7.
Разрушение биопленок - трехмерных структур микроводорослей
Изучали возможность образования биопленок в лабораторных условиях при выращивании цианобактерий Nostoc, Anabaena, Microcystis в высокой концентрации как при их индивидуальном, так и при совместном культивировании. А также воздействие заявляемого штамма ВКПМ В-9844 на биопленки микроводорослей из воды, взятой из природного водоема Саратовской области, содержащей различные природные штаммы микроводорослей. В процессе дальнейшего культивирования штаммов микроводорослей 1,5-2-месячного возраста в описанном режиме в течение последующих 3-4 недель происходило образование биопленок - трехмерных структур. В опытные чашки Петри с образовавшимися биопленками вносили по 3 мл культуральной жидкости штамма ВКПМ В-9844 путем равномерного распыления по всей поверхности.
В контрольные чашки вносили равный объем (3 мл) среды BG-11 или В-12.
В опытных чашках уже через 15-20 часов наблюдали изменение цвета биопленок - трехмерных структур микроводорослей, контактирующих со штаммом ВКПМ В-9844 сначала до светлого желто-зеленого, а затем до полного обесцвечивания. Микроскопически выявляли лизис вегетативных клеток микроводорослей.
В контрольных чашках (без добавления штамма) не наблюдали изменение окраски микроводорослей - биопленки оставались сине-зеленого цвета и микроскопически лизиса клеток не обнаружено.
А в чашках с использованием штамма-аналога ВКПМ В-9405 наблюдали изменение цвета трехмерных структур биопленок через 24 часа.
Таким образом, штамм ВКПМ В-9844 оказывает выраженное разрушающее воздействие и на трехмерные структуры биопленок, образованные микроводорослями в процессе своего развития.
Список литературы
1. Preston T., Stewart W.D.P., Reynolds C.S. Nature. 1980. V. 288. 365-367.
2. Flemming H.-C. J.Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V59. 629-640.
3. Tyagi M.M., Thkur J.K., Singh D.P. Kumar A., Prasuna E.G. J. Appl.Microbiol. Biotechnol. 1999. V.9. 9-21.
4. Kaebernic M., Rohlack Т., Christoffersen К., Neilan B.A. Environ. Microbiol. 2001. V.3. №11. 669-679.
5. Rohlack Т., Dittman E., Henning M. et al. Appi.Environ. Microbiol. 1999. V.65. 737-739.
6. Kurmayer R., Dittman E., Fatner J., Chorus I. Microbiol Ecol. 2002. V.43. 107-118.
7. Alam M.Z., Otaki M., Furumai H., Ohgaki S. Water Res., 2001, т.35, 1008-1014.
8. Ahn C.Y., Park M.H., Joung S.H., Kim H.S., Jang K.Y., Oh H.M.Environ Sci Technol., 2003, т.37(13), 3031-3037.
9. Ahn C.Y., Jouns S.H., Jeon J.W., Kim H.S., Yoon B.D., Oh H.M. Biotechnol Lett., 2003, т.14, 1137-1142.
10. Yoshida Т., Takashima Y, Tomaru Y, Shirai Y, Takao Y. Hiroishi S, Nagasaki K. Appi. Environ. Microbiol., 2006, т.72(2), 1239-1247.
11. Патент РФ №2323968.
12. Shida O., Takagi H., Kadowaki К., Komagata К. 1996. Proposal for new genera, Brevibaciillus gen.nov. and Aneurinibacillus gen.nov. Int. J. Sysyt.Bacteriol., 45: 939-946.
13. Stanier R.Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Basire G. Bacteriool. Rev. 1971, т.35 (2), 171-205.
14. Воншак А. Микроводоросли: технология лабораторного культивирования биомассы в установках на открытом воздухе. В кн.: Фотосинтез и биопродуктивность: методы определения. M.: Агропромиздат. 1989. С.310-328.
15. Nakagawa, M., Y.Takamura, and O.Yagi. 1987. Isolation of the slime from a cyano-bacterium, Microcystis aeruginosa K-3A. Agric. Biol. Chem. 51:329-337.
16. Guillard R.R.L., Ryther J.H. // Can. J. Microbioe. 1962. V.8. P.923-931.
Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-9844, подавляющий и предотвращающий развитие планктонных и биопленочных форм микроскопических водорослей в водных системах.
