Термореактивная нейтрализованная композиция хитозана, образующая гидрогель, ее лиофилизат и способы получения
Группа изобретений относится к медицине и фармакологии. Предложена водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана, образующая свободный от фосфата прозрачный гидрогель при температуре выше 5°С, которая включает, в пересчете на общую массу композиции, 0,1-5,0% реацетилированного хитозана с молекулярной массой не менее 100 кДа и степенью деацетилирования от 40 до 70%, нейтрализованного гидроксилированным основанием, и 1-30% комплексообразующего вещества, выбранного из полиоз и происходящих из них полиолей. Предложен лиофилизат, полученный при лиофилизации водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана. Предложен способ получения водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана. Предложен способ получения лиофилизата, который включает лиофилизацию водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана. Предложено применение водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана и лиофилизата для получения системы доставки лекарственных веществ, для получения лекарственной формы для инъекций. Изобретение обеспечивает получение водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана, образующей свободный от фосфата прозрачный гидрогель с улучшенными свойствами и приемлемый для биомедицинского применения, которая легко хранится и сохраняет свойства термозастывания после хранения. 6 н. и 14 з.п. ф-лы, 8 ил.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана, образующей свободный от фосфата прозрачный гидрогель при температуре выше 5°С, а также способа ее получения.
Настоящее изобретение также касается лиофилизата, полученного при лиофилизации термореактивной нейтрализованной композиции хитозана по настоящему изобретению, и способа его получения.
Предшествующий уровень техники
Гидрогели привлекательны для биомедицинского применения. Более того, гидрогели, проявляющие специфическую способность к повышению своей вязкости с повышением температуры и известные как “термочувствительные/термоактивные/псевдотермореактивные/термозастывающие гидрогели”, как оказалось, легко наносятся и вместе с тем долго остаются на месте нанесения, поэтому они могут с успехом применяться для введения лекарственных веществ или наращивания тканей. Как сообщают О. Felt et al. in The Encyclopedia of Controlled Drug Delivery, 1999, такие термочувствительные гидрогели могут с успехом основываться на полимерах природного происхождения, например на хитозане, представляющем собой коммерчески доступный недорогой полимер, получаемый из хитина, второго по распространенности полисахарида после целлюлозы.
Хитозан является производным хитина и его получают при частичном или почти полном щелочном N-деацетилировании хитина, также называемого поли(N-ацетил-D-глюкозамином), который является природным биополимером. Хитозан содержит свободные аминогруппы (-NH2) и может характеризоваться по соотношению N-ацетил-D-глюкозаминовых звеньев и D-глюкозаминовых звеньев, что выражается в виде степени деацетилирования (СД) полностью ацетилированного полимера хитина. Степень деацетилирования (СД), понимаемая как содержание деацетилированных мономеров, и молекулярная масса (м.м.) хитозана являются параметрами, влияющими на такие важные свойства, как растворимость и вязкость,
Хитозан известен как биодеградируемый, биосовместимый, биоадгезивный и обладает свойствами бактериостатика, к тому же он способствует заживлению ран, всасыванию лекарственных веществ и восстановлению тканей. Благодаря присущим ему вышеотмеченным свойствам, хитозан обладает множественным косметическим и фармацевтическим действием, а также подвергается обширным исследованиям для разнообразного применения в виде гелей.
Таким образом, учитывая полезные свойства хитозана, существует постоянная потребность в улучшении свойств известных термочувствительных гидрогелей хитозана, которые по-прежнему считаются очень перспективными для широкого круга биомедицинских применений.
В WO-A-99/07416 (Biosynthec) раскрыт pH-зависимый терморегулируемый гидрогель хитозана, который обладает такими термочувствительными свойствами при нейтральных значениях pH, что он имеет низкую вязкость при низкой температуре, но застывает при температуре тела. Этот термочувствительный гидрогель хитозана получают при нейтрализации коммерческого хитозана, имеющего степень деацетилирования около 80%, монофосфатными двухосновными солями полиолей или сахаров, в частности, к примеру, β-глицерофосфатом (β-GP).
Однако присутствие β-GP в гидрогеле приводит к следующим недостаткам. β-GP заряжен отрицательно, поэтому он может реагировать с положительно заряженным биоактивным компонентом, что ведет к выпадению осадка или к нарушению выделения его из гидрогеля. Таким образом, присутствие β-GP делает гидрогели типа хитозан/β-GP непригодными для использования со многими лекарственными веществами.
Более того, свойства такого гидрогеля, как-то продолжительность застывания и вязкость, зависят от концентрации β-GP и поэтому ограничены растворимостью β-GP. В частности, для достижения низкой продолжительности застывания требуется высокая концентрация β-GP, чтобы избежать быстрого удаления гидрогеля после применения. Однако при высокой концентрации β-GP ухудшаются механические свойства гидрогеля. Следовательно, продолжительность застывания должна уравновешиваться консистенцией гидрогеля, поэтому невозможно получить гели, имеющие низкую продолжительность застывания и высокую вязкость, что было бы желательным сочетанием характеристик. К тому же слишком высокая концентрация β-GP может вызвать выпадение осадка гидрогеля на месте нанесения.
Кроме того, такие термочувствительные гидрогели типа хитозан/β-GР являются мутными, что делает их непригодными для определенных способов применения, таких как офтальмологическое или местное. К тому же содержащие фосфат материалы могут оказаться непригодными в плане биосовместимости (G.Molinaro et al., Biomaterials, 23:2717-2722 (2002)).
Для преодоления недостатков гидрогелей типа хитозан/β-GP в WO-A-2005/097871 (Universite de Geneve) была предложена термореактивная нейтрализованная композиция хитозана, образующая свободный от фосфата прозрачный гидрогель при температуре выше 5°С, причем данная композиция содержит однородно реацетилированный хитозан с молекулярной массой не менее 200 кДа и степенью деацетилирования 30-60%, нейтрализованный гидроксилированным основанием.
В WO-A-2005/097871 также сообщается, что данная композиция может дополнительно содержать 1,3-пропандиол для модулирования вязкоупругих свойств гидрогеля. Однако 1,3-пропандиол не значится как "общепризнанно безопасный" (GRAS) и не значится как признанная добавка в Фармакопее США, Европейской фармакопее или Японской фармакопее, так что его применение в биомедицине ограничено. Кроме того, термореактивная нейтрализованная композиция хитозана, содержащая 1,3-пропандиол, теряет термочувствительные свойства при лиофилизации.
В связи с существующей потребностью в получении улучшенных термочувствительных гидрогелей хитозана для биомедицинского применения, авторы настоящего изобретения продолжили свои исследования для преодоления недостатков известных термочувствительных гидрогелей.
Целью настоящего изобретения является получение водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана, образующей свободный от фосфата прозрачный гидрогель с улучшенными свойствами и приемлемый для биомедицинского применения.
Другой целью настоящего изобретения является получение такой водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана, которая легко хранится и сохраняет свойства термозастывания после хранения.
Следующей целью настоящего изобретения является получение такой водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана, которая легко наносится, например, при инъекции с помощью иглы или минимально инвазивным способом.
Эти цели достигаются настоящим изобретением.
Сущность изобретения
В соответствии с первым аспектом, настоящим изобретением предусмотрена водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана (в дальнейшем также именуется “композицией настоящего изобретения”), как определено в независимом пункте 1 и зависимых от него пунктах 2-11.
В соответствии со вторым аспектом, настоящим изобретением предусмотрен лиофилизат водной термореактивной композиции согласно первому аспекту, как определено в независимом пункте 12.
В соответствии с третьим аспектом, настоящим изобретением предусмотрен способ получения водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана согласно первому аспекту, как определено в независимом пункте 13 и зависимых от него пунктах 14-15.
В соответствии с четвертым аспектом, настоящим изобретением предусмотрен способ получения лиофилизата согласно второму аспекту, как определено в независимом пункте 16.
В соответствии с пятым аспектом, настоящим изобретением предусмотрено применение композиции согласно первому аспекту или лиофилизата согласно второму аспекту, как определено в независимых пунктах 17-20.
Согласно настоящему изобретению, добавление комплексообразующего вещества, выбранного из полиоз (полисахаридов) и происходящих из них полиолей, в заданную композицию хитозана позволяет успешно получить свободный от фосфата прозрачный гидрогель с улучшенными свойствами, приемлемый для биомедицинского применения и удобный в хранении. Другие преимущества настоящего изобретения станут ясными из следующего описания.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробным образом.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлено устройство для измерения инъецируемости композиции настоящего изобретения.
На фиг.2 представлена эволюция модуля упругости G' (модуля сохранения) и модуля вязкости G'' (модуля разрушения) прозрачного гидрогеля, содержащего трегалозу, полученного в Примере 1, по сравнению с таким же гидрогелем без трегалозы, в зависимости от времени при повышении температуры с 4 до 37°С.
На фиг.3 представлена эволюция модуля упругости G' (модуля сохранения) и модуля вязкости G'' (модуля разрушения) прозрачного гидрогеля, содержащего трегалозу, полученного в Примере 1, сразу после получения (А) и после оттаивания (В), в зависимости от времени при повышении температуры с 4 до 37°С.
На фиг.4 представлена эволюция модуля упругости G' (модуля сохранения) и модуля вязкости G'' (модуля разрушения) прозрачного гидрогеля, содержащего трегалозу, полученного в Примере 1, после лиофилизации и восстановления, по сравнению с таким же гидрогелем без трегалозы, в зависимости от времени при повышении температуры с 4 до 37°С.
На фиг.5 представлена эволюция модуля упругости G' (модуля сохранения) и модуля вязкости G'' (модуля разрушения) прозрачного гидрогеля, содержащего трегалозу, полученного в Примере 4, по сравнению с таким же гидрогелем без трегалозы, в зависимости от времени при повышении температуры с 4 до 37°С.
На фиг.6 представлена эволюция модуля упругости G' (модуля сохранения) и модуля вязкости G'' (модуля разрушения) прозрачного гидрогеля, содержащего 1,3-пропандиол, полученного в Примере 5 (сравнительном), сразу после получения (А) и после лиофилизации и восстановления (В), в зависимости от времени при повышении температуры с 4 до 37°С.
На фиг.7 представлена эволюция модуля упругости G' (модуля сохранения) и модуля вязкости G'' (модуля разрушения) прозрачного гидрогеля, содержащего маннит, полученного в Примере 6, после лиофилизации и восстановления, в зависимости от времени при повышении температуры с 4 до 37°С.
На фиг.8 представлена эволюция модуля упругости G' (модуля сохранения) и модуля вязкости G'' (модуля разрушения) прозрачного гидрогеля, содержащего глицерин, полученного в Примере 7, в зависимости от времени при повышении температуры с 4 до 37°С.
Раскрытие изобретения
Следует отметить, что в настоящем описании и формуле изобретения выражение "термореактивная" в отношении композиции настоящего изобретения означает, что температура не вызывает застывания композиции, а скорее действует в качестве катализатора, сильно сокращающего продолжительность гелеобразования при ее повышении.
Следует также отметить, что в настоящем описании выражение “гидрогель” или “гидрогель настоящего изобретения” применяется вместо выражения “композиция настоящего изобретения”, если нужно.
Также нужно отметить, что в настоящем описании и формуле изобретения термин “нейтрализованные” означает pH 6,7-7,1.
Согласно настоящему изобретению, водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана, образующая свободный от фосфата прозрачный гидрогель при температуре выше 5°С, содержит реацетилированный хитозан, нейтрализованный гидроксилированным основанием, и комплексообразующее вещество, выбранное из полиоз (полисахаридов) и происходящих из них полиолей.
Средняя молекулярная масса (м.м.) реацетилированного хитозана, входящего в композицию настоящего изобретения, как правило, составляет не менее 100 кДа. Молекулярная масса хитозана может быть определена методом электрокинетического фракционирования в асимметрическом потоке (AFFF) в сочетании с многоугольным светорассеянием (MALS), как описано, к примеру, В. Wittgren and K.-G. Wahlund in Journal of Chromatography A 760:205-215 (1997). Реацетилированный хитозан с м.м. не менее 100 кДа особенно подходит для применения в настоящем изобретении, так как он позволяет получить термореактивную композицию, образующую плотный гель.
Предпочтительно реацетилированный хитозан в настоящем изобретении имеет м.м. не менее 200 кДа. Верхняя граница м.м. реацетилированного хитозана в настоящем изобретении зависит от количества реацетилированного хитозана, входящего в композицию настоящего изобретения, и определяется удобством применения, которое зависит от конкретного применения.
Реацетилированный хитозан в настоящем изобретении должен иметь степень деацетилирования 40-70%, что означает, что хитозан содержит от 40 до 70% D-глюкозаминовых звеньев и от 60 до 30% нейтральных N-ацетил-D-глюкозаминовых звеньев, соответственно. Степень деацетилирования хитозана может быть определена методом ядерного магнитного резонанса, как описано в литературе, к примеру, Lavertu et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 32:1149-1158 (2003).
Если степень деацетилирования реацетилированного хитозана составляет менее 40%, то реацетилированный хитозан превращается в полимер, близкий хитину, то есть нерастворимый в кислых условиях и поэтому не применимый в настоящем изобретении. Если степень деацетилирования реацетилированного хитозана составляет более 70%, то реацетилированный хитозан не позволяет получить композицию, образующую свободный от фосфата прозрачный гидрогель. Предпочтительно степень деацетилирования реацетилированного хитозана, входящего в композицию настоящего изобретения, составляет от 45 до 65%.
Реацетилированный хитозан с м.м. не менее 100 кДа и степенью деацетилирования 40-70% для настоящего изобретения может быть получен в соответствии со способом, изложенным в WO-A-2005/097871, или получен из фирмы Novamatrix (Осло, Норвегия).
Количество реацетилированного хитозана, входящего в композицию настоящего изобретения, должно составлять от 0,1 до 5,0 мас.%, от всей композиции. Содержание реацетилированного хитозана менее 0,1% не позволяет получить гидрогель, а содержание реацетилированного хитозана более 5,0% вызывает образование такой композиции, которая впрыскивается с трудом. Количество реацетилированного хитозана, входящего в композицию настоящего изобретения, нужно выбирать в зависимости от м.м. хитозана и от предназначения.
Предпочтительно содержание реацетилированного хитозана в композиции настоящего изобретения составляет от 0,5 до 3,0 мас.%, от всей композиции.
Количество комплексообразующего вещества, входящего в композицию настоящего изобретения, должно составлять от 1 до 30 мас.%, от всей композиции и зависит от молекулярной массы реацетилированного хитозана, а также от требуемого времени застывания и консистенции гидрогеля. Содержание комплексообразующего вещества в композиции настоящего изобретения предпочтительно составляет от 5 до 15 мас.%, от всей композиции.
Такое комплексообразующее вещество, выбранное из полиоз и происходящих из них полиолей, входящее в композицию настоящего изобретения, позволяет модулировать такие свойства гидрогеля, как время застывания и вязкость гидрогеля.
В одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения комплексообразующим веществом, которое может использоваться в настоящем изобретении, является полиоза, более предпочтительно полиоза, выбранная из моносахаридов и дисахаридов.
В качестве предпочтительных примеров моносахаридов, которые можно использовать в настоящем изобретении, можно привести D-глюкозу (декстрозу), фруктозу и тагатозу, которые известны как наполнители для фармацевтических композиций согласно фармакопеям Европы, США и Японии. В качестве предпочтительных примеров дисахаридов, которые можно использовать в настоящем изобретении, можно привести трегалозу, сахарозу, мальтозу и лактозу, которые известны как наполнители для фармацевтических композиций согласно фармакопеям Европы, США и Японии, причем особенно предпочтительна трегалоза. В качестве других примеров полиоз, которые можно использовать в настоящем изобретении, можно привести полисахариды, выбранные из полидекстрозы и амилозы, которые известны как наполнители для фармацевтических композиций.
В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения комплексообразующим веществом, которое может использоваться в настоящем изобретении, является происходящий из полиозы полиол (сахароспирт), выбранный из глицерина, маннита, сорбита, ксилита, эритрита, лактита и мальтита, которые известны как наполнители для фармацевтических композиций согласно фармакопеям Европы, США и Японии, причем особенно предпочтителен глицерин.
Композиции настоящего изобретения можно замораживать для хранения, при этом сохраняются их свойства термозастывания, а перед применением их нужно оттаивать при 4°С. Более того, композиции настоящего изобретения, за исключением тех, в состав которых в качестве комплексообразующего вещества входит глицерин, можно с успехом лиофилизировать, получая лиофилизат для облегчения хранения и транспортировки, и восстанавливать добавлением к лиофилизату охлажденной воды с перемешиванием при 4°С перед применением, при этом сохраняются их свойства термозастывания.
Композиции настоящего изобретения могут быть получены способом, составляющим часть настоящего изобретения.
На стадии а) данного способа реацетилированный хитозан с м.м. не менее 100 кДа, предпочтительно не менее 300 кДа, и степенью деацетилирования 40-70%, предпочтительно 45-65%, растворяют в водной среде с HCl, а после полного растворения хитозана раствор охлаждают до температуры менее 5°С, например, на ледяной бане.
Затем, на стадии b) данного способа охлажденный раствор хитозана нейтрализуют до pH 6,7-7,1, предпочтительно pH 6,8, добавляя по каплям, с перемешиванием при температуре менее 5°С, необходимое количество содержащего гидроксилированное основание водного раствора, предварительно охлажденного до температуры менее 5°С. Более высокие значения pH неприменимы, так как они вызывают осаждение хитозана.
В соответствии с данным способом, в качестве гидроксилированного основания для нейтрализации предпочтительно используют NaOH. Недостаточное перемешивание или слишком быстрое добавление водного гидроксилированного основания вызывает осаждение хитозана.
На стадии с) данного способа добавляют комплексообразующее вещество, выбранное из полиоз и происходящих из них полиолей, во время или после стадии а) либо до, во время или после стадии нейтрализации b).
Отметим, что описание касательно хитозана, комплексообразующего вещества и их количества в отношении композиции настоящего изобретения также применимо в отношении способа настоящего изобретения.
Способ получения композиции настоящего изобретения может дополнительно включать, если нужно, стадию стерилизации реацетилированного хитозана перед стадией растворения а). Чтобы получить стерильный гидрогель, способ получения выполняется в асептических условиях (напр., в ламинаре), а каждый добавляемый раствор заранее фильтруют через фильтр на 0,22 мкм или стерилизируют паром. Например, стерилизация может проводиться посредством облучения или еще лучше стерилизации паром реацетилированного хитозана, суспендированного в воде, как описано в работе Yen S.F. et al., 1998, US-A-5,773,608.
Способ получения композиции настоящего изобретения может дополнительно включать, если нужно, стадию замораживания данной композиции для облегчения хранения. В этом случае замороженную композицию необходимо оттаивать при 4°С перед применением.
В особенно предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению может завершаться дальнейшей лиофилизацией композиции настоящего изобретения, за исключением композиций, содержащих в качестве комплексообразующего вещества глицерин, получая лиофилизат, составляющий часть настоящего изобретения. Такой лиофилизат можно удобно хранить и перевозить для медицинского применения, а также восстанавливать добавлением холодной воды с перемешиванием при 4°С.
При повышении температуры термореактивной нейтрализованной композиции хитозана по настоящему изобретению, например, после нанесения, происходит термозастывание, ведущее к образованию свободного от фосфата, прозрачного плотного гидрогеля. Чем выше температура, тем короче время застывания.
Соответственно, композиции настоящего изобретения могут с успехом применяться в качестве системы доставки лекарственных веществ, а ввиду их специфических свойств могут с успехом применяться для получения лекарственных форм для инъекций.
Для того чтобы продемонстрировать улучшение упругих свойств свободных от фосфата прозрачных гидрогелей хитозана по настоящему изобретению, проводили реологические измерения различных гидрогелей настоящего изобретения и сравнительных гидрогелей в соответствии со следующим методом, если не указано иначе.
Вязкоупругие свойства гидрогелей определяли сразу же после их получения на приборе Rheostress 1 (Haake, Karlsruhe, Германия) с конусом и пластинкой (диаметр 60 мм, угол 4°). Температуру контролировали с помощью термостата Haake DC 30 и охлаждающего устройства Haake K10 (Haake, Karlsruhe, Германия), подсоединенных к реометру. Гидрогели помещали между конусом и пластинкой (охлажденными до 4°С) и через 10 мин выполняли измерения. Все измерения проводили в линейном диапазоне вязкости и упругости и определяли G' (модуль сохранения) и G'' (модуль разрушения) при постоянной деформации (у=0,05) при 1,00 Гц в течение 180 мин. Температуру повышали с 4 до 37°С при 6,6°С/мин за первые 5 мин и поддерживали при 37°С на протяжении следующих 175 мин. Испарение воды, ведущее к высыханию гидрогелей, сводили к минимуму при помощи крышки, закрывающей конус с пластинкой.
Тестировали следующие гидрогели:
(1) гидрогель настоящего изобретения, полученный в Примере 1, содержащий 2% хитозана (DD=47%) фирмы Novamatrix и 8% трегалозы, а также сравнительный гидрогель без трегалозы (см. фиг.2);
(2 гидрогель настоящего изобретения, полученный в Примере 1, содержащий 2% хитозана (DD=47%) фирмы Novamatrix и 8% трегалозы, сразу после получения и после лиофилизации в соответствии с Примером 2 (см. фиг.3А и 3В);
(3) гидрогель настоящего изобретения, полученный в Примере 1, содержащий 2% хитозана (DD=47%) фирмы Novamatrix и 8% трегалозы, после лиофилизации и восстановления в соответствии с Примером 3, а также сравнительный гидрогель без трегалозы (см. фиг.4);
(4) гидрогель настоящего изобретения, полученный в Примере 4, содержащий 0,9% хитозана (DD=61%), полученного в соответствии с Препаративным примером 1, и 5% трегалозы, а также сравнительный гидрогель без трегалозы (см. фиг.5);
(5) сравнительный гидрогель, полученный в Примере 5 (сравнительном), содержащий 1% хитозана (DD=47%), полученного в соответствии с Препаративным примером 2, и 10% 1,3-пропандиола, сразу после получения и после лиофилизации и восстановления (см. фиг.6А и 6В);
(6) гидрогель настоящего изобретения, полученный в Примере 6, содержащий 0,9% хитозана (DD=61%), полученного в соответствии с Препаративным примером 1, и 5% маннита, после лиофилизации и восстановления (см. фиг.7);
(7) гидрогель настоящего изобретения, полученный в Примере 7, содержащий 2% хитозана (DD=47%) фирмы Novamatrix и 10% глицерина, а также сравнительный гидрогель без глицерина (см. фиг.8).
На фиг.2-8 представлена эволюция модуля упругости G' (модуля сохранения) и модуля вязкости G'' (модуля разрушения) исследуемых гидрогелей в зависимости от времени при повышении температуры с 4 до 37°С. Самое начало образования каркаса геля, которое соответствует точке гелеобразования, задается временем пересечения G' и G''.
Как видно из фиг.2, при добавлении такой полиозы, как трегалоза по настоящему изобретению, у гидрогеля возрастают значения G' и G'' по сравнению с таким же гидрогелем без трегалозы.
На фиг.3А представлены вязкоупругие свойства гидрогеля сразу после получения (приведенного на фиг.2), а на фиг.3В представлены вязкоупругие свойства того же гидрогеля после замораживания и оттаивания. Как видно из фиг.3В, свойства термозастывания у композиции настоящего изобретения сохраняются после замораживания и оттаивания.
На фиг.4 представлены вязкоупругие свойства гидрогеля, приведенного на фиг.2, после лиофилизации и восстановления. Как видно из фиг.4, свойства термозастывания у композиции настоящего изобретения сохраняются после лиофилизации и восстановления.
Как видно из фиг.5, композиция настоящего изобретения, содержащая трегалозу, проявляет точку застывания в 30 мин, тогда как такая же композиция, не содержащая трегалозы, образует гель через 150 мин.
Как видно из фиг.6А и 6В, сравнительная композиция, содержащая 1,3-пропандиол, образует гидрогель при измерении вязкоупругих свойств сразу после получения (фиг.6А), но не сохраняет свойства термозастывания после лиофилизации и восстановления, как свидетельствует отсутствие точки застывания на фиг.6В.
Как видно из фиг.7, композиция настоящего изобретения, содержащая маннит, сохраняет свойства термозастывания после лиофилизации и восстановления, как свидетельствует наличие точки застывания.
Как видно из фиг.8, композиция настоящего изобретения, содержащая глицерин, образует гидрогель, как свидетельствует наличие точки застывания, тогда как такая же композиция, не содержащая глицерина, не проявляет точки застывания и через 180 мин.
Следующие примеры предназначаются для иллюстрации настоящего изобретения. Однако их ни в коем случае не следует рассматривать как ограничивающие область действия настоящего изобретения.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
В следующих примерах степень деацетилирования хитозанов определяли методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР), как описано в литературе, к примеру, Lavertu et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 32: 1149-1158 (2003).
Молекулярную массу хитозанов определяли методом электрокинетического фракционирования в асимметрическом потоке (AFFF) в сочетании с многоугольным светорассеянием (MALS) следующим образом.
Фракционирование раствора хитозана (2 мг/мл в ацетатном буфере pH 4,5) проводили в трапециевидном канале длиной 26,5 см и высотой 350 мкм, соединенном с системой Eclipse F (Wyatt Technology Europe, Dernbach, Германия). Дно канала было облицовано мембраной из восстановленной целлюлозы с пределом отсечения в 10 кДа (Microdyn-Nadir GmbH, Wiesbaden, Германия). Среда элюирования состояла из ацетатного буфера pH 4,5. Устанавливали скорость потока в канале 1 мл/мин, а в инжекторе 0,2 мл/мин. Разделение начинали с фокусирования при 1 мл/мин в течение 3 мин, а затем запускали перекрестный поток в 0,2 мл/мин в течение 15 мин. К фракционирующему каналу были подключены многоугольный детектор светорассеяния (Wyatt Technology, Santa Barbara, США) и детектор показателя преломления (RI) (дифференциальный рефрактометр Waters, Milford, MA, США). Детектор светорассеяния снабжен лазером GaAs (длина волны: 690 нм) с 18 детекторами. Рассеянный свет собирали под углами от 14 до 163°. Детектор RI калибровали с помощью NaCl. Данные получали и анализировали с помощью программы Astra версии 4.90.08 при приращении показателя преломления (dn/dc) в 0,153 мл/г.
В следующих примерах определяли впрыскиваемость некоторых композиций с помощью устройства, состоящего из вертикального штатива для шприца на 1,0 мл с люэровским наконечником, заполненного гидрогелем при 3°С, и чаши весов, стоящей на поршне шприца, как показано на фиг.1. На шприц, установленный в штативе, насаживали иглу 27G1/2×0,5 дюймов. На чашу ставили гирю весом 500 г или 1 кг и отмечали время, за которое композиция выходила из шприца.
В следующих примерах 1-3 и 7 для получения гидрогеля использовали реацетилированный хитозан фирмы Novamatrix (серия FU-507-03) со значением DD=47% (измеряли методом ЯМР) и средней молекулярной массой (м.м.) 3600 кДа (измеряли методом AFFF-MALS).
В следующих примерах 4 и 6 для получения гидрогеля использовали реацетилированный хитозан, полученный в соответствии с Препаративным примером 1.
В следующем примере 5 для получения гидрогеля использовали реацетилированный хитозан, полученный в соответствии с Препаративным примером 2.
Препаративный пример 1
Получение реацетилированного хитозана “Fagal Lot 21” со значением DD=61% в соответствии с методом, изложенным в WO-A-2005/097871
Растворяли 25,5 г хлопьев хитозана (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, США, номер продукта 41,941-9, серия 14418LB) в 1 л смеси из 10% раствора уксусной кислоты и метанола (50/50) в течение 1 ч с перемешиванием. Добавляли 550 мл метанола. После 2 ч перемешивания смесь фильтровали через фильтр на 100 мкм для удаления нерастворимых частиц. Затем вязкий раствор диализировали (диализные мембраны Spectra/Por® 1 с пределом отсечения м.м. 6000-8000, по. 132665, Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, США) против деионизированной воды в течение 72 ч, ежедневно меняя воду. Затем раствор фильтровали через фильтр на 5 мкм. С перемешиванием добавляли 400 мл смеси 0,2 М NH4OH/метанол (50/50), чтобы вызвать выпадение осадка. После 1 ч перемешивания суспензию фильтровали через фильтр на 100 мкм. Осадок промывали метанолом до нейтральной реакции. Полученный очищенный хитозан сушили в присутствии силикагеля под вакуумом при комнатной температуре, защищая от света.
Растворяли 10 г этого очищенного хитозана в 500 мл смеси из 10% уксусной кислоты и метанола (50/50). Смесь перемешивали в течение 1 ч и оставляли на ночь. Добавляли 400 мл метанола. Раствор перемешивали в течение нескольких часов и оставляли на ночь. Добавляли 150 мл метанола и охлаждали раствор хитозана до температуры менее 5°С на ледяной бане. Раствор из 2,4 мл уксусного ангидрида и 200 мл метанола охлаждали до температуры менее 5°С и по каплям добавляли в раствор хитозана с энергичным механическим перемешиванием. Этот раствор, содержащий однородно реацетилированный хитозан, держали с перемешиванием при температуре менее 5°С в течение 1 ч для завершения реакции и оставляли на ночь при комнатной температуре. Для удаления солей, образовавшихся при реацетилировании, и для дальнейшего удаления нерастворимых частиц этот вязкий раствор диализировали против деионизированной воды в течение 12 дней (такие же диализные мембраны, как и выше), ежедневно меняя воду. Затем вязкий раствор хитозана фильтровали через фильтр на 5 мкм. С перемешиванием добавляли 200 мл смеси 0,2 М NH4OH/метанол (50/50), чтобы вызвать выпадение осадка. После 4 ч перемешивания хитозан пропускали через фильтр на 100 мкм и промывали метанолом. Наконец, однородно реацетилированный хитозан сушили в присутствии силикагеля под вакуумом при комнатной температуре, защищая от света.
Полученный реацетилированный хитозан имел значение DD=61% (измеряли методом ЯМР) и среднюю молекулярную массу (м.м.) 7900 кДа (измеряли методом AFFF-MALS).
Препаративный пример 2
Получение реацетилированного хитозана “Fagal Lot 25” со значением DD=47% в соответствии с методом, изложенным в WO-A-2005/097871
Хлопья хитозана (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, США, номер продукта 41,941-9, серия 14418LB) подвергали очистке, как в Препаративном примере 1. Затем хитозан реацетилировали при помощи раствора из 2,0 мл уксусного ангидрида и 200 мл метанола по такой же методике, как в Препаративном примере 1.
Полученный реацетилированный хитозан имел значение DD=47% (измеряли методом ЯМР).
Пример 1
Получение композиции по настоящему изобретению, содержащей 2% реацетилированного хитозана (DD=47%) фирмы Novamatrix и 8% трегалозы
Суспензию из 700 мг реацетилированного хитозана фирмы Novamatrix (серия FU-507-03) со значением DD=47% (измеряли методом ЯМР) в воде при концентрации 4% подвергали стерилизации в автоклаве. Добавляли 145 мкл HCl и перемешивали суспензию в течение 18 ч при комнатной температуре до полного растворения хитозана. Растворяли 3,09 г трегалозы в 6,5 мл 0,15 М NaOH. Этот раствор охлаждали на ледяной бане и по каплям с перемешиванием добавляли в охлажденный раствор хитозана. Затем гель доводили до pH 6,8, добавляя по каплям охлажденный разбавленный NaOH. Наконец, добавляли холодную воду до общего веса в 35 г. Полученный прозрачный гидрогель проявлял повышение вязкоупругих свойств по прошествии времени при 37°С, как видно из фиг.2 и фиг.3А, и обладал временем застывания 111 мин. Измерение впрыскиваемости дало 30 с при нагрузке в 1 кг.
Пример 2
Замораживание-оттаивание гидрогеля, полученного в Примере 1
Замораживали 10 г препарата из Примера 1 в жидком азоте и хранили при -20°С. Затем его оттаивали при 4°С и определяли его реологические свойства. Как видно из фиг.3В, свойства термозастывания сохранялись.
Пример 3
Лиофилизация гидрогеля, полученного в Примере 1
Замораживали 10 г препарата из Примера 1 в жидком азоте и хранили при -20°С, а затем лиофилизировали в течение 24 ч в лиофилизаторе Edwards Modulyo (плита при -50°С, вакуум 10-1 мбар). Полученный лиофилизат восстанавливали добавлением холодной воды с перемешиванием при 4°С. Как видно из фиг.4, свойства термозастывания сохранялись.
Пример 4
Получение композиции по настоящему изобретению, содержащей 0,9% реацетилированного хитозана “Fagal Lot 21” (DD=61%), полученного в соответствии с препаративным примером 1, и 5% трегалозы
Растворяли 270 мг реацетилированного хитозана, полученного в соответствии с Препаративным примером 1 со значением DD=61% (измеряли методом ЯМР), в 15 мл 0,1 N HCl с перемешиванием в течение 18 ч при комнатной температуре. Растворяли 1,66 г дигидрата трегалозы в 8 мл 0,15 М NaOH. Этот раствор охлаждали на ледяной бане и по каплям с перемешиванием добавляли в охлажденный раствор хитозана. Затем гель доводили до pH 6,8, добавляя по каплям охлажденный разбавленный NaOH. Наконец, добавляли холодную воду до общего веса в 30 г. Полученный прозрачный гидрогель проявлял повышение вязкоупругих свойств по прошествии времени при 37°С, как видно из фиг.5. Содержащая трегалозу композиция проявляла точку гелеобразования через 30 мин, тогда как композиция, не содержащая трегалозы, образовывала гель через 150 мин. Измерение впрыскиваемости дало 30 с при нагрузке в 500 г.
Пример 5 (сравнительный)
Получение сравнительной композиции, содержащей 1% реацетилированного хитозана “Fagal Lot 25” (DD=47%), полученного в соответствии с Препаративным примером 2, и 10% 1,3-пропандиола
Растворяли 200 мг реацетилированного хитозана, полученного в соответствии с Препаративным примером 2 со значением DD=47% (измеряли методом ЯМР), в 10 мл 0,1 N HCl с перемешиванием в течение 18 ч при комнатной температуре. К растворенному хитозану добавляли 2 г охлажденного 1,3-пропандиола. Затем гель доводили до pH 6,8, добавляя по каплям охлажденный разбавленный NaOH. Наконец, добавляли холодную воду до общего веса в 20 г. Полученный прозрачный гидрогель проявлял повышение вязкоупругих свойств по прошествии времени при 37°С, как видно из фиг.6А.
После замораживания (при -80°С), лиофилизации (в течение 24 ч) и восстановления холодной водой с перемешиванием при 4°С полученный препарат больше не проявлял впрыскиваемости (игла 27G1/2, нагрузка 1 кг) при тестировании. Более того, он не проявлял свойства термозастывания, как видно из фиг.6В.
Пример 6
Получение композиции по настоящему изобретению, содержащей 0,9% реацетилированного хитозана “Fagal Lot 21” (DD=61%), полученного в соответствии с Препаративным примером 1, и 5% маннита
Растворяли 630 мг реацетилированного хитозана, полученного в соответствии с Препаративным примером 1, в 35 мл 0,1 N HCl с перемешиванием в течение 18 ч при комнатной температуре. Этот раствор хитозана охлаждали примерно до 5°С, а затем добавляли 3,5 г маннита. Затем гель доводили до pH 6,8, добавляя по каплям охлажденный разбавленный NaOH. Наконец, добавляли холодную воду до общего веса в 70 г. 10 г этого препарата замораживали в жидком азоте и хранили при -20°С, а затем лиофилизировали в течение 24 ч в лиофилизаторе Edwards Modulyo (плита при -50°С, вакуум 10-1 мбар). Полученный лиофилизат восстанавливали добавлением холодной воды с перемешиванием при 4°С. Полученный прозрачный гидрогель проявлял повышение вязкоупругих свойств по прошествии времени при 37°С, при этом время застывания составляло 1 ч, как видно из фиг.7.
Пример 7
Получение композиции по настоящему изобретению, содержащей 2% реацетилированного хитозана (DD=47%) фирмы Novamatrix и 10% глицерина
Суспензию из 700 мг реацетилированного хитозана фирмы Novamatrix в воде при концентрации 4% подвергали стерилизации в автоклаве. После охлаждения суспензии до комнатной температуры добавляли 145 мкл HCl и перемешивали смесь в течение 18 ч до полного растворения хитозана. Раствор хитозана охлаждали примерно до 5°С на ледяной бане и добавляли 3,5 г охлажденного глицерина. Затем гель доводили до pH 6,8, добавляя по каплям охлажденный разбавленный NaOH. Наконец, добавляли холодную воду до общего веса в 35 г. Содержащий глицерин прозрачный гидрогель проявлял повышение вязкоупругих свойств по прошествии времени при 37°С, при этом время застывания составляло 135 мин, как видно из фиг.8, тогда как композиция, не содержащая глицерина, не проявляла точки гелеобразования и через 180 мин.
1. Водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана, образующая свободный от фосфата прозрачный гидрогель при температуре выше 5°С, которая включает, в пересчете на общую массу композиции, 0,1-5,0% реацетилированного хитозана с молекулярной массой не менее 100 кДа и степенью деацетилирования от 40 до 70%, нейтрализованного гидроксилированным основанием, и 1-30% комплексообразующего вещества, выбранного из полиоз и происходящих из них полиолей.
2. Водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана по п.1, в которой реацетилированный хитозан составляет 0,5-3,0% от общей массы композиции.
3. Водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана по п.1, в которой степень деацетилирования реацетилированного хитозана составляет 45-65%.
4. Водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана по п.1, в которой молекулярная масса реацетилированного хитозана составляет не менее 200 кДа.
5. Водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана по п.1, в которой комплексообразующее вещество составляет 5-15% от общей массы композиции.
6. Водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана по п.1, в которой комплексообразующим веществом является полиоза.
7. Водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана по п.6, в которой полиоза выбрана из моносахаридов и дисахаридов.
8. Водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана по п.7, в которой полиоза представляет собой моносахарид, выбранный из D-глюкозы, фруктозы и тагатозы.
9. Водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана по п.7, в которой полиоза представляет собой дисахарид, выбранный из трегалозы, сахарозы, мальтозы и лактозы.
10. Водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана по п.9, в которой дисахарид представляет собой трегалозу.
11. Водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана по любому из пп.1-5, в которой комплексообразующим веществом является происходящий из полиозы полиол, выбранный из глицерина, маннита, сорбита, ксилита, эритрита, лактита и мальтита.
12. Лиофилизат, полученный при лиофилизации водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана по любому из пп.1-11, за исключением композиций, содержащих в качестве комплексообразующего вещества глицерин.
13. Способ получения водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана по любому из пп.1-11, который включает стадии:
a) растворение реацетилированного хитозана с молекулярной массой не менее 100 кДа и степенью деацетилирования 40-70% в водной среде с HCl и охлаждения данного кислого раствора хитозана до температуры менее 5°С;
b) нейтрализация охлажденного раствора хитозана, полученного на стадии а), путем добавления водного раствора гидроксилированного основания, предварительно охлажденного до температуры менее 5°С, в охлажденный раствор хитозана до тех пор, пока охлажденный раствор хитозана не проявит значение pH 6,7-7,1;
c) добавление комплексообразующего вещества, выбранного из полиоз и происходящих из них полиолей, во время или после стадии растворения а) либо до, во время или после стадии нейтрализации b); и
d) необязательно замораживания полученной водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана.
14. Способ по п.13, дополнительно включающий стадию стерилизации реацетилированного хитозана перед стадией растворения а).
15. Способ по п.13 или 14, в котором на стадии b) гидроксилированное основание представлено NaOH.
16. Способ получения лиофилизата по п.12, который включает лиофилизацию водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана, полученной способом по любому из пп.13-15, при условии, что композиция не содержит глицерин в качестве комплексообразующего вещества.
17. Применение водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана по любому из пп.1-11 для получения системы доставки лекарственных веществ.
18. Применение водной термореактивной нейтрализованной композиции хитозана по любому из пп.1-11 для получения лекарственной формы для инъекций.
19. Применение лиофилизата по п.12 для получения системы доставки лекарственных веществ.
20. Применение лиофилизата по п.12 для получения лекарственной формы для инъекций.
