Иммунореактивный пептид и способ диагностики ревматоидного артрита с его использованием

Изобретение относится к пептидам, происходящим из антигена, узнаваемого аутоантителами, используемым для диагностики ревматоидного артрита. Пептиды представляют собой фрагменты молекулы филаггрина, содержащие модифицированные остатки аргинина и имеющие аминокислотные последовательности, представленные в формуле изобретения. Изобретение раскрывает способ диагностики ревматоидного артрита путем выявления аутоиммунных антител с использованием указанного пептида(ов) путем взаимодействия последнего(их) с сывороткой крови пациентов, страдающих ревматоидным артритом. Присутствие аутоиммунных антител в исследуемом образце диагносцируют по наличию сформированных комплексов пептида с антителом. Пептид по изобретению обладает высокой специфичностью и чувствительностью. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

 

Изобретение относится к пептидам, происходящим из антигена, узнаваемого аутоантителами. Пептиды представляют собой фрагменты молекулы филаггрина, содержащие модифицированные остатки аргинина. Изобретение относится также к способу детекции аутоиммунных антител при ревматоидном артрите путем взаимодействия с аутоиммунными антителами от пациентов, страдающих ревматоидным артритом. Ревматоидный артрит (РА) является одним из наиболее распространенных заболеваний человека. Этим заболеванием по данным ВОЗ страдает 1-2% населения Земли. В России официально зарегистрировано более 1 млн больных РА. РА характеризуется хроническим воспалением суставов. Это приводит к страданиям, ухудшению качества жизни, снижению и потере трудоспособности.

Развитие РА характеризуется чрезвычайным многообразием клинических проявлений и биохимических нарушений. Это существенно затрудняет раннюю диагностику, а следовательно, проведение адекватной терапии, которая особенно эффективна в дебюте болезни. Современная диагностика РА основана на клинических проявлениях заболевания в сочетании с лабораторным определением в крови пациента так называемого ревматоидного фактора (РФ). Однако РФ не является достаточно специфичным маркером. Двумя другими серологическими маркерами РА являются антиперинуклеарный фактор (АПФ) и антикератиновые антитела (АКА), распознающие антигенные детерминанты цитруллинсодержащего белка филаггрина. Несмотря на высокую специфичность АПФ и АКА для диагностики РА эти аутоантитела не нашли широкого применения в клинической лабораторной практике из-за технических трудностей. В последние годы был разработан иммуноферментный (ИФА) метод определения антител к филаггрину (АФ), который обладает высокой специфичностью. АФ обнаруживаются в крови еще до появления клинических признаков РА, что демонстрирует важную роль этих антител в патогенезе этого заболевания и возможность проводить раннюю диагностику по этому показателю. Основой этой методики является антигенный комплекс в виде полипептидов (участков молекулы филаггрина) или сам белок (рекомбинантный).

Из предшествующего уровня техники известны пептиды, которые используются в способе диагностики ревматоидного артрита и описаны US 2004241767, US 2004253644, US 6890720, US 7288634, US 6858438.

Изобретение посвящено созданию нового антигенного комплекса, обладающего большей специфичностью и чувствительностью.

Исходя из теории гетерогенности популяции АФ, отражающей природную вариабельность антигенов, на которые они вырабатываются (наличие АПФ, АКА, АФ), и полиморфизма молекулы филаггрина можно предположить, что существует несколько цитрулинизированных структурных участков этой молекулы, обладающих антигенными свойствами. Компьютерный анализ молекулы подтвердил это.

На основе предсказательного анализа антигенных эпитопов твердофазным методом с использованием f-moc техники было синтезировано четыре пептида, воспроизводящих фрагменты молекулы белка филаггрина: Ф-1, Ф-2, Ф-3, Ф-4.

ASSHEQAXSSAGEXHGSHHQ - Ф-1,

CSSHEQAXSSAGEXHGCHHQ - Ф-2,

QSHQESAXGXSGETSGHSGS - Ф-3,

CSHQESAXGXSGETSCHSGS - Ф-4,

где Х - Cit,

которые иммунологически реактивны в иммунологическом исследовании, направленном на выявление РА, и могут применяться в способе диагностики РА, включающей в себя детекцию аутоиммунных антител в сыворотке пациента, путем взаимодействия, по крайней мере, одного из вышеуказанных пептидов с сывороткой пациента и детекции наличия сформированных комплексов между упомянутым пептидом и антителом.

Все препараты пептидов соответствовали 95% чистоте по данным ВЭЖХ и масс-спектроскопии и содержали 20 амикислот с заменой двух остатков Arg на Cit.

ИФА-методика измерения антигенной активности пептидов по отношению к АФ.

1. Иммобилизация ИФА-планшет.

На полистироловые планшеты (Costar США) наносили растворы пептидов в 0,01 М карбонатно-фосфатном буфере рН 7,4 в концентрации 1 мкг/100 мкл. В каждую лунку планшета вносили 100 мкл раствора. Сорбцию пептида проводили при 2-4°С в течение 16 часов.

По окончании сорбции раствор пептида стряхивали и в каждую лунку вносили 2% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma, США). Инкубацию проводили в течение 2 часов при 37°С.

2. Проведение анализа и детекция иммунных комплексов (антиген-антитело).

Исследуемые пробы разводили в 100 раз раствором 2% БСА и полученный раствор вносили в лунки по 100 мкл. Инкубировали 1,5 часа при 37°С. По окончании инкубации планшет промывали трехкратно фосфатно-солевым раствором с 0,05% твин-20 (ФСР) по 250 мкл в лунку. Затем для образования специфических иммунных комплексов в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора (1:1000) конъюгата IgG антител кролика к IgG человека с пероксидазой хрена или конъюгат белка А с пероксидазой хрена в 2% БСА и инкубировали 1 час при 37°С. После инкубации раствор стряхивали и планшет промывали трижды раствором ФСР. Для осуществления детекции иммунных комплексов в каждую лунку вносили 100 мкл раствора ТМБ с гидроперитом и инкубировали в темноте при комнатной температуре 5-15 мин до развития окраски. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 50% соляной кислоты. Интенсивность окраски измеряли на фотометре вертикального сканирования при 450 нм. Положительными считали сыворотки, у которых величина оптической плотности (ОП) превышала значение 0,2.

При испытании иммунохимических свойств пептидов Ф-3 и Ф-4 выявили их высокую чувствительность по отношению АФ (таблицы 2, 3).

Таблица 2
Выявление антител к филаггрину (пептид Ф-3, Ф-4) в сыворотках больных РА
Общее количество Выявлено больных с AT к Ф-3 Выявлено больных с AT к Ф-4
Больные РА 78 66 73
Чувствительность 85% 93,6%

При сравнении иммунохимических свойств Ф-3 и Ф-4 между собой и со свойствами уже известного активного циклического пептида ЦЦП (HQCHQESTXGRSRCGRSGS, где X-Cit) оказалось, что есть пациенты, у которых АФ определяются одним из этих пептидов, а другим нет. Наибольшей чувствительностью обладает Ф-4 (Таблица 3, чертеж). На основе этих данных создается антигенный комплекс для выявления АФ из смеси пептидов (Ф-3; Ф-4).

Таблица 3
Данные измерения оптической плотности образцов сыворотки доноров и больных РА
Пациенты ЦЦП(ОП450 нм) Ф-3(ОП450 нм) Ф-4 (ОП450)
1 0,147 0,239 0,329 0,333 0,791
2 2,136 0,241 0,525 0,309 0,329
3 0,222 0,258 0,61 0,349 0,525
4 0,28 0,242 0,276 0,271 0,61
5 0,463 0,197 0,295 0,264 0,276
6 0,401 0,217 0,588 0,187 0,295
7 0,743 0,339 0,56 0,283 0,588
8 0,224 0,27 0,342 0,411 0,56
9 0,206 0,251 0,393 0,32 0,342
10 0,972 0,223 0,469 0,274 0,393
11 0,209 0,21 0,861 0,193 0,469
12 0,263 0,229 0,641 0,249 0,861
13 0,364 0,232 0,291 0,233 0,641
14 0,395 0,215 0,101 0,243 0,291
15 0,476 0,245 0,279 0,209 0,101
16 0,331 0,3 0,243 0,403 0,279
17 0,16 0,263 0,31 0,259 0,243
18 0,304 0,21 0,347 0,243 0,31
19 0,195 0,215 0,437 0,266 0,347
20 0,192 0,191 0,711 0,188 0,437
21 0,274 0,203 0,172 0,175 0,711
22 0,626 0,255 0,273 0,202 0,172
23 0,294 0,184 0,323 0,198 0,273
24 0,184 0,221 0,276 0,218 0,323
25 0,272 0,31 0,465 0,184 0,276
26 0,2 0,234 0,472 0,334 0,465
27 0,166 0,217 0,421 0,212 0,472
28 0,158 0,18 0,516 0,316 0,421
29 0,223 0,236 0,255 0,249 0,516
30 0,253 0,161 0,213 0,197 0,255
31 0,357 0,229 0,306 0,23 0,213
32 0,154 1,548 0,251 0,204 0,306
33 1,024 1,334 0,441 0,177 0,251
34 0,17 0,221 0,849 0,366 0,441
Д1 0,117 0,168 0,123 0,135 0,08
Д2 0,122 0,135 0,118 0,165 0,216
Д3 0,084 0,139 0,174 0,173 0,219
Д4 0,105 0,093 0,105 0,131 -
Д5 0,145 0,114 0,115 0,083 -
Д6 0,115 0,099 0,102 0,114 -
Д7 0,103 0,117 0,109 0,091 -
Д8 0,104 0,112 0,116 0,119 -
Примечание: в графе «пациенты» индексом «Д» помечены сыворотки доноров.

1. Пептид, имеющий аминокислотную последовательность и структуру, выбранную из:
ASSHEQAXSSAGEXHGSHHQ,
CSSHEQAXSSAGEXHGCHHQ,
QSHQESAXGXSGETSGHSGS,
CSHQESAXGXSGETSCHSGS,
где Х - Cit, предназначенный для диагностики ревматоидного артрита.

2. Пептид по п.1, иммунологически реактивный в иммунологическом исследовании, направленном на выявление ревматоидного артрита.

3. Способ диагностики ревматоидного артрита, включающий взаимодействие по меньшей мере одного из пептидов по п.1 или смеси пептидов, представленных в п.1, с сывороткой (плазмой) крови больного и диагностирование ревматоидного артрита по наличию сформированных комплексов между пептидом и антителом.

4. Способ по п.3, в котором детектирование включает использование иммуноферментного анализа (ИФА).



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способу выделения бензола из смесей с неароматическими углеводородами с одновременным получением дистиллята экстрактивной ректификацией, характеризующемуся тем, что в качестве селективного растворителя используются смеси, содержащие 14,7-48,5% масс.

Изобретение относится к способу разделения алкан-алкеновых фракций, возможно включающих примесь алкадиена(ов), с применением экстрактивной ректификации в присутствии полярного(ых) экстрагента(ов), при которой основное количество алканов выводят в потоке дистиллята, а основное количество алкенов выводят в потоке десорбата, отгоняемого из экстрагента, характеризующемуся тем, что до экстрактивной ректификации в алкан-алкеновой фракции проводят изомеризацию и/или гидроизомеризацию большей части содержащего(их)ся в ней 1-алкена(ов) в 2-алкен(ы) при температуре не более 100°С в присутствии гетерогенного(ых) катализатора(ов), обладающего(их) активностью при позиционной изомеризации алкенов, и возможно небольшого количества не дезактивирующего катализатор(ы) полярного вещества.

Изобретение относится к области основного органического синтеза, а именно к способу разделения биазеотропной смеси бензол-перфторбензол (ПФБ)-третичный амиловый спирт (ТАС).

Изобретение относится к способу разделения исходной смеси из двух или более компонентов посредством экстрактивной дистилляции, к пригодной для этого снабженной перегородкой разделительной колонне, а также к их применению.

Изобретение относится к способу непрерывного разделения C 4-фракции (C4) экстрактивной дистилляцией с использованием селективного растворителя в колонне экстрактивной дистилляции и характеризуется тем, что в колонне экстрактивной дистилляции в продольном направлении расположена разделительная перегородка, достигающая наивысшей точки колонны, с образованием первой зоны, второй зоны и нижележащей общей зоны колонны, и головной поток (С4Н10 ), содержащий бутаны, отводят из первой зоны, головной поток (C4H8), содержащий бутены, отводят из второй зоны, а поток (С4 Н6), содержащий углеводороды из С 4-фракции, которые более растворимы в селективном растворителе, чем бутаны и бутены, отводят из нижележащей общей зоны колонны.

Изобретение относится к нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности, а именно к способам получения экстракционного деароматизированного компонента из риформата бензиновой фракции, и может быть использовано для производства нефтяных растворителей, например гексановых.

Изобретение относится к способу разделения сырой С 4-фракции, заключающемуся в ректификации сырой С 4-фракции, содержащей бутаны, бутены, 1,3-бутадиен и небольшие количества других углеводородов, включающих С 4-ацетилены, 1,2-бутадиен и С5-углеводороды, экстрактивной дистилляцией с использованием селективного растворителя, при этом сырую С4-фракцию подают в среднюю часть первой экстрактивной дистилляционной колонны, а селективный растворитель подают в колонну выше точки ввода сырой С 4-фракции, и парообразный боковой поток, который содержит С4-ацетилены вместе с 1,3-бутадиеном, 1,2-бутадиеном, С5-углеводородами и селективным растворителем и в котором концентрация С4-ацетиленов ниже предела саморазложения, отводят из первой экстрактивной дистилляционной колонны в точке ниже точки подачи сырой С 4-фракции, а верхний поток, содержащий компоненты сырой С4-фракции, которые в селективном растворителе менее растворимы, чем С4-ацетилены, отводят из верхней части первой экстрактивной дистилляционной колонны.

Изобретение относится к медицинским технологиям, иммунологии, фармакологии и, в частности, к лекарственным средствам для лечения пациентов с ревматоидным артритом (РА) и способам их лечения, которые могут использоваться в ревматологии.

Изобретение относится к группе новых химических соединений или его фармакологически приемлемым солям общей формулы I где А означает СООН; В означает Н; n равно 0; V означает -СН2-, одинарную связь; W означает 5-7-членную гетероароматическую группу с одним гетероатомом, выбранным из N, О, S, которая необязательно может быть замещена 1-3 заместителями, выбранными из группы заместителей А, в том случае, когда V представляет собой -CH2-группу, при этом в том случае, когда V означает одинарную связь, W означает бициклическую конденсированную кольцевую 9-членную гетероциклическую группу с одним гетероатомом, выбранным из О, S, которая необязательно может быть замещена 1-3 заместителями, выбранными из группы заместителей А; Х означает 5-7-членную гетероароматическую группу с одним атомом О и одним или двумя атомами N, которая необязательно может быть замещена 1-3 заместителями, выбранными из группы заместителей A; Y означает С6-С10 арил, который необязательно может быть замещен 1-3 заместителями, выбранными из группы заместителей А, 5-7-членную гетероароматическую группу с одним атомом S, которая необязательно может быть замещена 1-3 заместителями, выбранными из группы заместителей A; Z означает C1-C8 алкил, С3-С7 циклоалкил, которая необязательно может быть замещена 1-5 заместителями, выбранными из группы заместителей А; С6-С10 арил, который необязательно может быть замещен 1-5 заместителями, выбранными из группы заместителей А; С6-С10 арилокси, который необязательно может быть замещен 1-5 заместителями, выбранными из группы заместителей А, или С6-C12 аралкил, который необязательно может быть замещен 1-5 заместителями, выбранными из группы заместителей А; группа заместителей А означает галоген, С1-С 6 алкил, галоген С1-С6 алкил, C 1-С6 алкокси.

Изобретение относится к новым соединениям формулы I где Qa представляет собой фенил или гетероарил, и Qa, возможно, может нести 1 или 2 заместителя, выбранных из гидрокси, галогено, амино, (1-6С)алкила, (1-6С)алкокси, (1-6С)алкиламино и ди-[(1-6С)алкил]амино; R1 и R2 каждый независимо выбран из водорода и (1-6С)алкила; Qb представляет собой фенил или гетероарил, и Qb, возможно, может нести 1 или 2 заместителя, выбранных из гидрокси, галогено, (1-6С)алкила, (3-6С)циклоалкила, (1-6С)алкокси, (1-6С)алкоксикарбонила, амино, (1-6С)алкиламино, ди-[(1-6С)алкил]амино, гидрокси-(1-6С)алкила, (1-6С)алкокси-(1-6С)алкила, амино-(1-6С)алкила, (1-6С)алкиламино-(1-6С)алкила, (1-6С)алкилтио, (1-6С)алкилсульфинила и (1-6С)алкилсульфонила; где любой из заместителей на Qa или Qb, определенных выше, содержащих группу СН 2, которая присоединена к 2 атомам углерода, или группу СН3, которая присоединена к атому углерода, возможно, может нести на каждой указанной группе СН2 или СН 3 один или более чем один заместитель, выбранный из гидрокси, амино, (1-6С)алкила, (1-6С)алкокси, (1-6С)алкиламино и ди-[(1-6С)алкил]амино; где гетероарил представляет собой ароматическое 5- или 6-членное моноциклическое кольцо, которое может содержать вплоть до трех гетероатомов, выбранных из кислорода, азота и серы, и может быть конденсировано с бензольным кольцом или пятичленным азотсодержащим кольцом, содержащим 2 атома азота; а также к их фармацевтически приемлемым солям.
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к лекарственным формам наружного применения, и предназначено для стимуляции регенерации хрящевых тканей.

Изобретение относится к соединениям формулы I или формулы II, к их фармацевтически приемлемым солям, энантиомерам и диастереомерам в качестве ингибиторов металлопротеаз, а также к фармацевтической композиции на их основе и вариантам его применения.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается наружного средства для лечения заболеваний суставов и мягких тканей (остеоартрозов, остеохондрозов, тендовагинитов, бурситов, лигаментитов и других) на основе комплексона производных дифосфоновых кислот с аминами углеводов, который обладает хондропротекторной, кальцийрегулирующей и противовоспалительной активностью.
Изобретение относится к медицине, а именно - к физиотерапии. .
Изобретение относится к медицине, а именно к ортопедии и неврологии, и может быть использовано при лечении пациентов с остеохондрозом позвоночника. .
Изобретение относится к медицине, а именно к физиотерапии. .

Изобретение относится к медицине и касается применения антител, специфически узнающих любой из преобладающих вариантов бета-амилоидного пептида, А 40 и A 42, в приготовлении лекарственного средства, которое применяют для профилактики и/или лечения болезни Альцгеймера.
Наверх