Способ индуцирования мутаций у растений рода луков

Авторы патента:

Трофимов Александр Владимирович (RU)

Трофимов Владимир Александрович (RU)

A01H1/06 - способы изменения наследственных признаков, например путем обработки химикалиями или облучением (мутации или генная инженерия C12N 15/00)

Владельцы патента RU 2388215:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева" (RU)

Семена растений рода луков обрабатывают фторидом алюминия в течение 8-10 часов, а затем мутагеном в течение 7-10 часов. В качестве мутагена используют раствор перекиси водорода и маннитола в соотношении 1:1. Концентрация перекиси водорода составляет 2-10 ммоль, концентрация маннитола 4-5 ммоль. Обработанные семена промывают в проточной воде, высушивают и облучают потоком отрицательных аэроионов кислорода. Обработка обеспечивает увеличение выхода хромосомных аббераций за счет использования природной способности активных форм кислорода к окислительной модификации биомолекул, в том числе ДНК, в клетках с активированным ФИ-циклом. 1 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений, и может быть использовано в мутационной генетике для создания новых сортов растений.

Известно применение модификаторов частоты индуцирования мутаций у растений, цитологических красителей - фуксина основного, азурамина и кармина - методом вакуум-фильтрации с последующей обработкой семян мутагеном - ионизирующим излучением радиоактивного изотопа ¹³⁷С, в дозах 50-100 Гр. (SU №1316602, МПК⁷ А01Н 1/04, 15.06.87 г.).

Недостатком применения известных модификаторов является ковалентная модификация ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) семян растений токсичными химическими соединениями, что может приводить к угнетению жизненных функций.

Известен способ обработки семян растений раствором сульфата железа (II) с концентрацией 4-5 ммоль в течение 5-10 ч с последующей промывкой в проточной воде и облучением их потоком отрицательных аэроионов на расстоянии 23-25 см в течение 40-80 мин (RU №2269258, МПК⁸ А01Н 1/06, 10.02.2006 г.).

Недостатком известного способа является то, что обработка семян раствором сульфата железа (II) приводит к отсутствию достаточной предварительной стимуляции мутагенной активности семян растений для частоты мутаций в искусственном мутагенезе.

Технический результат заключается в повышении частоты мутаций в искусственном мутагенезе и увеличении выхода хромосомных аберраций за счет использования природной способности активных форм кислорода к окислительной модификации биомолекул, в том числе ДНК клеток с активированным фосфоинозитидным циклом.

Технический результат достигается тем, что в способе индуцирования мутаций у растений рода луков, включающем обработку его семян мутагеном, промывку в проточной воде и высушивание с последующим облучением потоком отрицательных аэроионов, семена растений рода луков предварительно обрабатывают фторидом алюминия в течение 8-10 часов, а в качестве мутагена используют раствор перекиси водорода и маннитола в соотношении 1:1 в течение 7-10 часов. Концентрация перекиси водорода составляет 2-10 ммоль, а концентрация маннитола 4-5 ммоль.

Перекись водорода с концентрацией менее 2 ммоль не обладает выраженной мутагенной активностью.

Концентрация маннитола более 5 ммоль может привести к ингибированию мутагенного действия перекиси водорода и ионизированного воздуха.

Время обработки семян растений рода луков раствором перекиси водорода и маннитола не должно превышать 10 часов, так как более длительная обработка негативно влияет на процесс прорастания семян, менее 7 часов недостаточно для образования мутаций.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1

В качестве тест-объекта из растений рода луков взят лук батун (Allium fistulosum L).

Для повышения эффективности воздействия перекиси водорода воздушно-сухие семена лука батун предварительно обрабатывают активатором фосфоинозитидного цикла раствором фторида алюминия (общепринятой концентрацией 50 ммоль AlCl₃, 10 ммоль NaF) в течение 8-10 часов. Затем семена лука батун обрабатывают раствором перекиси водорода с концентрацией 2-10 ммоль и маннитола с концентрацией 4-5 ммоль в соотношении 1:1. Время экспозиции 7-10 часов с последующей промывкой в проточной воде и просушиванием. Следующим этапом является воздействие на семена лука батун потоком отрицательных аэроионов кислорода, для этого их помещают под электроэффлювиальный ионизатор воздуха, который образует отрицательно заряженный кислород супероксид в процессе тихого разряда без примесей озона и положительных аэроионов. В качестве источника использован электроэффлювиальный ионизатор воздуха (аэроионизатор "Сетеон", произведенный НПЦ "Альфа-Ритм"). Семена лука батун помещают на расстоянии 23-25 см от кончиков игл и воздействуют в течение 40, 60, 80 минут. Содержание отрицательных аэроионов кислорода, определенное в месте обработки, составляло при 40 мин стимуляции 1,3×10⁶, при 60 мин - 2×10⁶, при 80 мин - 2,7×10⁶ в 1 см³.

Семена лука батун высевают для выращивания первого поколения (Mi) после обработки, во втором поколении (М₂) получают измененные растения лука батун, в третьем поколении проверяют мутационную (наследственную) природу, отбирают мутации и рассчитывают их частоту по известным методикам экспериментального мутагенеза, например, на 100 семей М₂. В таблице показано увеличение выхода хроматидных аберрации, что характеризует данный подход как эффективный в получении исходного, обладающего высокой жизнеспособностью, материала при селекции.

В основе реализации мутагенного эффекта лежит имитация природного процесса ограниченной свободнорадикальной модификации ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) активными формами кислорода. При этом применение антиоксиданта позволяет сводить к минимуму появление в ходе реакции Фентона гидроксильного радикала, модулируя тем самым мутагенный эффект активных форм кислорода. Высокая эффективность действующих стимулов, к тому же направленная на повышение жизнеспособности и всхожести семян лука батун, обеспечивается обработкой фторидом алюминия.

Посредством воздействия ионизированным воздухом и перекисью водорода с концентрацией 2-10 ммоль моделируют мягкий окислительный стресс, развитие которого ограничивают антиоксидантом (маннитолом). В качестве мутагенов используют супероксид - радикал кислорода (основной ион ионизированного воздуха) и перекись водорода с концентрацией 4-5 ммоль - начальные наименее реакционноспособные продукты восстановления кислорода.

При проведении цитогенетического анализа показано, что ионизированный воздух усиливает выход хроматидных аберраций при стимуляции в течение 40-60 мин, при действии перекиси водорода, стимулирующей процессы пероксидации, выход аберрантных клеток повышается в среднем на 30% по сравнению с контролем. Совместное действие ионизированного воздуха и перекиси водорода приводит к усилению мутагенного эффекта.

Установлено, что ионизированный воздух может способствовать образованию в семенах лука батун перекиси водорода и нарушать динамическое равновесие в системе прооксиданты/антиоксиданты, активировать свободнорадикальные реакции, что в свою очередь усиливает выход хроматидных аберраций, имеющих для клеток растения адаптационно-приспособительное значение и поддерживающих высокую жизнеспособность семян лука батун.

Перекись водорода играет важную роль в процессах окисления, так как является источником образования мощного окислителя - гидроксильного радикала ОН*, образующегося в ходе реакций Фентона (H₂O₂+Fe²⁺→Fe³⁺+ОН*+ОН″) и Хабера-Вайса (H₂O₂+O₂″→О₂+ОН*+H₂O). Собственно выраженное мутагенное действие ионизированного воздуха и перекиси водорода происходит через образование гидроксильного радикала.

В концентрациях 2-10 ммоль, стимулирующих пролиферативные процессы, перекись водорода действует через фосфоинозитидный (ФИ) цикл. Именно ФИ-циклу принадлежит важная роль в быстром ответе клеток на действие различных агентов (CoccoL. et al., 2004). При участии ФИ-цикла активируются МАР-киназы и гены, ответственные за деление и пролиферацию клетки. Нами показано, что активация ФИ-цикла является одной из причин, усиливающих пролиферативные процессы в семенах лука батун.

Фторид алюминия активирует G-белки, в число эффекторов которых входит фосфоинозитидспецифичная фосфолипаза С, запускающая ФИ-цикл.

Поэтому совместное действие ионизированного воздуха, перекиси водорода и фторида алюминия является в плане активации пролиферативных процессов и увеличения выхода хроматидных аберраций наиболее эффективным.

Поскольку ФИ-цикл является универсальным молекулярным механизмом трансдукции внешнего сигнала и запуска программ клеточного поведения, широко распространенным в живой природе, то очевидно, что реализация митогенного и мутагенного эффектов активных форм кислорода в клетках с активированным ФИ-циклом может воспроизводиться на растениях рода луков и на других видах растений.

Таблица 1.
семена лука батун	Время облучения, мин	Клетки с хроматидными аберрациями, %	Всхожесть, %
Замоченные в воде (контроль)	0	0,50±0,01	40,3±0,33
	40	0,66±0,01	87,6±1,20
	60	0,43±0,01	77,6±1,20
80	0,14±0,01	68,1±1,00
Обработанные раствором перекиси водорода	0	0,50±0,04	34,3±0,33
	40	0,66±0,02	85,1±1,00
	60	0,33±0,03	79,1±0,58
80	0,50±0,04	67,1±0,58
Обработанные раствором фторида алюминия, ионизированным воздухом, перекисью водорода	0	0,16±0,01	36,5±0,58
	40	0,36±0,01	90,5±0,33
	60	0,43±0,01	80,1+0,33
80	0,33±0,01	70,3±1,20
р<0,001 - достоверность по отношению к исходным данным

Способ индуцирования мутаций у растений рода луков, включающий обработку его семян мутагеном, промывку в проточной воде и высушивание с последующим облучением потоком отрицательных аэроионов кислорода, отличающийся тем, что семена растений рода луков предварительно обрабатывают фторидом алюминия в течение 8-10 ч, а в качестве мутагена используют раствор перекиси водорода и маннитола в соотношении 1:1 в течение 7-10 ч, при этом концентрация перекиси водорода составляет 2-10 ммоль, а концентрация маннитола - 4-5 ммоль.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано при возделывании гибридов кукурузы. .

Способ получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности brassica napus, имеющих хорошее агрономическое качество // 2373698

Изобретение относится к способу получения двухнулевых линий-восстановителей фертильности рапса Brassica napus с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) Ogura, представляющего собой интрогрессию редьки, несущую ген-восстановитель фертильности Rfo, вырезанный из аллели Pgi-2 редьки и рекомбинированный с геном Pgi-2 Brassica oleracea, имеющих хорошее агрономическое качество, отличающееся женской фертильностью, хорошим уровнем переноса Rfo и высокой вегетационной мощностью.

Масло, семена и растения подсолнечника с модифицированным распределением жирных кислот в молекуле триацилглицерина // 2337530

Рекомбинантная полинуклеотидная последовательность, характеризующая уникальный трансформационный акт между генетической конструкцией, включающей ген cryiiia, и геномной днк картофеля сорта луговской, ее применение и содержащие эту последовательность клетка, трансгенное растение и его потомство // 2337529

Изобретение относится к области генетической инженерии и направлено на получение устойчивого к колорадскому жуку и отвечающего условиям биологической и пищевой безопасности трансгенного картофеля на основе высокопродуктивного отечественного сорта и разработку надежного средства для идентификации соответствующего трансформационного события в геноме растения.

Способ стимуляции митотической активности клеток растений // 2332841

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для повышения митотической активности меристем однодольных и двудольных растений. .

Способ индукции эпигенетической изменчивости у мягкой пшеницы // 2322801

Изобретение относится к области генетики и селекции и может быть использовано при создании исходного материала для селекции сельскохозяйственных растений. .

Способ получения фотомутантов сельскохозяйственных культур // 2312482

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекционной работе. .

Способ получения генетически модифицированных растений капусты белокочанной // 2286669

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения генетически модифицированных растений капусты белокочанной. .

Рекомбинантная полинуклеотидная последовательность, характеризующая уникальный трансформационный акт между генетической конструкцией, включающей ген cryiiia, и геномной днк картофеля сорта невский, ее применение и содержащие эту последовательность клетка, трансгенное растение и его потомство // 2286386

Изобретение относится к области генетической инженерии, в частности к получению устойчивого к колорадскому жуку и отвечающего условиям биологической и пищевой безопасности трансгенного картофеля.

Рекомбинантная полинуклеотидная последовательность, характеризующая уникальный трансформационный акт между генетической конструкцией, включающей ген cryiiia, и геномной днк картофеля сорта елизавета, ее применение и содержащие эту последовательность клетка, трансгенное растение и его потомство // 2286385

Способ мутагенной обработки семян ячменя // 2425485

Изобретение относится к биотехнологии

Способ мутагенной обработки растений ячменя // 2456796

Способ мутагенной обработки семян ячменя // 2464779

Изобретение относится к области генетики и селекции и может быть использовано для индукции мутаций при создании исходного материала для селекции сельскохозяйственных культур

Растения томата, обладающие повышенными уровнями устойчивости к botrytis // 2469094

Изобретение относится к области биотехнологии

Гибридный инсектицидный белок, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такой белок, трансгенные растения и их семена, содержащие такой белок, способ получения белка и его применение // 2497830

Группа изобретений относится к области белковой инженерии, молекулярной биологии растений и борьбы с вредителями и касается гибридного инсектицидного белка и его применений. Описанный гибридный инсектицидный белок включает от N-конца до С-конца N-концевой участок белка Cry3A, слитого с С-концевым участком белка Cry1Ab, причем позиция кроссинговера белка Cry3A и белка Cry1Ab расположена в консервативном блоке 2, в консервативном блоке 3 или в консервативном блоке 4 и обладает активностью против западного кукурузного корневого жука. Также представлены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие новые белки, способы получения белков, способы их применения, а также трансгенные растения и их семена, содержащие такие белки. Группа изобретений позволяет получить экономически выгодные средства для борьбы с жуками рода Diabrotica. 13 н. и 26 з.п. ф-лы, 8 ил., 9 табл., 46 пр.

Масло, семена и растения подсолнечника с модифицированным распределением жирных кислот в молекуле триацилглицерина // 2502793

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения семян подсолнечника, которые содержат эндогенное масло, содержащее по меньшей мере 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот, в котором содержание олеиновой кислоты выше содержания линолевой кислоты и в котором коэффициент распределения насыщенных жирных кислот α между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,28. Раскрыто масло семян подсолнечника, имеющее по меньшей мере 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот, более высокое содержание олеиновой кислоты, чем линолевой кислоты, и коэффициент распределения насыщенных жирных кислот α между положениями sn-1 и sn-3, составляющий по меньшей мере 0,28, а также пищевой продукт его содержащий. Также раскрыт способ получения растения подсолнечника, образующего семена, содержащие эндогенное масло, содержащее по меньшей мере 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот, и в котором коэффициент распределения насыщенных жирных кислот α между положениями sn-1 и sn-3 составляет по меньшей мере 0,38. Изобретение позволяет эффективно получать масло, содержащее по меньшей мере 12% стеариновой кислоты от общего содержания жирных кислот, более высокое содержание олеиновой кислоты, чем линолевой кислоты, и коэффициент распределения насыщенных жирных кислот α между положениями sn-1 и sn-3, составляющий по меньшей мере 0,28. 5 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 ил., 8 табл., 3 пр.

Способ стабилизации транскрипции хлоропластных генов рапса в условиях хлоридного засоления // 2514641

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства. В способе растения обрабатывают раствором биологически активного вещества, в качестве которого используют 24-эпибрассинолид. При этом через 3 недели культивирования растений рапса на жидкой питательной среде последующие две недели растения подвергают хлоридному засолению 125 мМ с однократным внесением в раствор 24-эпибрассинолида в концентрации 10-8 М в начале засоления. Способ позволяет повысить устойчивость растений рапса к повреждающему действию интенсивного хлоридного засоления и экологическую безопасность производимой продукции. 4 ил., 1 табл., 1 пр.

Белок-фактор транскрипции dst с доменом "цинковые пальцы" риса и его применение для регуляции устойчивости к засухе и к действию солей // 2558249

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способам получения растения с повышенной устойчивостью к засухе и действию солей по сравнению с диким видом растения путем снижения экспрессии/функции белка-фактора транскрипции у растения. Также изобретение относится к растению с повышенной устойчивостью к засухе и действию солей, полученное вышеуказанным способом. Изобретение позволяет эффективно получать растения с повышенной устойчивостью к засухе и действию солей по сравнению с диким видом растения. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 6 пр.

Способ предпосевной стимуляции семян и устройство для его осуществления // 2565822

Группа изобретений относится к сельскому хозяйству, в частности к методам предпосевной стимуляции семян низкоинтенсивным лазерным излучением в инфракрасной и красной областях оптического диапазона. Способ характеризуется тем, что на проклюнувшиеся семена после суточного замачивания однократно воздействуют при освещении 10-15 лк низкоинтенсивным сканирующим лазерным излучением сначала инфракрасного диапазона излучения лазером типа ADL-85502-TL. После чего проклюнувшие семена подвергают воздействию излучения лазером типа HLDH-660-A-50-01 в красном диапазоне излучения, дополнительно промодулированным пространственным модулятором. Устройство включает контейнерный блок, соединенные в технологической последовательности блок формирования управляющей программы, блок формирования потока излучения, установленный на вращающейся каретке и имеющий два лазера, пространственный модулятор. Последний размещен в контейнерном блоке и представляет собой многослойную анизотропную квазижидкокристаллическую дифракционную решетку, заключенную между двумя прозрачными пластинами, для образования в каждой точке падения промодулированного лазерного луча интерференционного лазерного поля со своей спекл-структурой. Группа изобретений обеспечивает повышение эффективности и качества стимуляции за счет обеспечения условий согласования пространственного распределения интенсивности поля лазерного излучения со структурой обрабатываемых семян. 2 н.п. ф-лы, 1 пр., 1 табл., 4 ил.

Способы полива растений с помощью 1-мср // 2615442

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу увеличения устойчивости к засухе сельскохозяйственного растения путем полива. Способ включает внесение 1-метилциклопропена в воде для полива растений на сельскохозяйственную культуру при расходе от 1-20 г на гектар, где концентрация 1-метилциклопропена в воде для полива составляет от 200 до 500 ppm. Изобретение позволяет эффективно увеличивать устойчивость сельскохозяйственных растений к засухе. 4 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 9 пр.