Вакцина против вируса гриппа для введения через слизистую и способ предотвращения гриппа

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и медицины. Предложено применение вакцины, включающей двунитевую РНК, включающую Poly (I:C), и антиген вируса гриппа для введения через слизистую оболочку. Изобретение обеспечивает возможность легкого способа вакцинации против вируса гриппа. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл.

 

Настоящее изобретение относится к новой вакцинной композиции. Конкретнее, настоящее изобретение относится к новой композиции, где в качестве адъюванта используется двунитевая РНК.

Описание предшествующего уровня техники

Имеющиеся в настоящее время утвержденные вакцины имеют описанные ниже ограничения. Например, в вирусах гриппа (в частности, в вирусе гриппа типа А), происходят значительные мутации антигена, приводящие к частому возникновению вирусов, которые не нейтрализуются антителами, продуцируемыми ранее введенными вакцинами (т.е. уже приобретенными инфекциями); эффект вакцины часто продолжается только в течение одного сезона. Также часто возникают иммунологически отличные новые штаммы вследствие точечных мутаций (антигенного дрейфа) в генах, которые кодируют поверхностные гликопротеины (гемагглютинин [HA] и нейраминидаза [NA]), и антигенного сдвига. Следует отметить, что в этом случае белки сохраняются на относительно высоких уровнях даже в пределах постоянно мутирующих штаммов и в пределах прерывисто мутирующих штаммов. Ввиду того, что иммунизация имеющимися в настоящее время вакцинами вызывает лишь гуморальный иммунитет среди однородных штаммов, а не общий иммунитет среди неоднородных штаммов, основанный на клеточном иммунитете, эффект вакцины будет уменьшаться, если эпидемический штамм и штамм вакцины отличаются.

Другой недостаток состоит в том, что иммунизацию нужно выполнять каждый год, потому что титр антител уменьшается, даже если преобладающий эндемический штамм вируса гриппа не подвергся до следующего года значительному антигенному сдвигу или антигенному дрейфу. Сообщалось, что антитела для ингибирования гемагглютинации (HI) и нейтрализации сохраняются в течение периода от нескольких месяцев до нескольких лет, а затем постепенно уменьшаются. Однако даже без таких уменьшений рекомендуется прививка 1 раз в год. Это происходит потому, что в течение одного года после вакцинации титр антител может снижаться.

Есть возможность улучшить эффективность вакцины. Это связано с тем, что разработка вакцины для наступающего сезона зависит от прогноза поступающего эпидемичного штамма. Следовательно, этот прогноз связан с неточностью, и может возникнуть несоответствие между штаммом, используемым для вакцины, и штаммом, который является действительно эпидемичным во внешней среде. Также если возникает штамм нового типа, то прогнозируемая вакцина часто неэффективна, например, против возникновения нового штамма H3N2 (A/Beijing/92) во время сезона гриппа в 1992 и 1993 гг. Новый тип вируса часто клинически не выявляется до наступления поздней стадии сезона гриппа, и защита существующей вакциной часто неудовлетворительна ввиду времени, требуемого для получения и производства одобренной вакцины. Даже если штамм вакцины и эпидемичный штамм достаточно соответствуют друг другу, считается, что утвержденные вакцины предотвращают заболевание только примерно у 70% детей и подростков и 30-40% пожилых лиц.

При обычных вакцинах почти невозможно выполнить иммунизацию слизистой оболочки (например, носовой полости); в частности, было известно, что имеющиеся в настоящее время инактивированные вакцины, компонентные вакцины и т.п., используемые для подкожной прививки, которая является основным путем вакцинации в связи с вирусами гриппа, не способны обеспечить иммунитет слизистых оболочек; существует большая потребность в вакцинной композиции, способной обеспечить иммунитет слизистых оболочек.

Также ввиду того, что обычные вакцины не способны вызвать перекрестный иммунитет даже между различными штаммами, существует также настоятельная потребность в разработке вакцины, способной выработать перекрестный иммунитет по меньшей мере между различными штаммами или между различными подтипами. Для гриппозных вакцин, для которых основной путь представляет собой смесь двух видов штаммов типа А и одного вида штамма типа В, существует потребность, в частности, в разработке вакцины, которая позволит избежать или по меньшей мере снизит необходимость в прогнозе эндемичного штамма.

Кроме того, очень нужна также вакцина, эффективная для прививки через слизистую оболочку, что является удобным способом вакцинации. Поскольку это не было достигнуто для вирусов гриппа и т.п., решения этой проблемы ожидают также в интересах облегчения массовой иммунизации. Альтернативно, существует также большая потребность в вакцине, которая увеличивает длительность существования антител.

В непатентном документе 1 (J. Clinical Investigation, 110(8), 1175-1184 (2002)) указано, что инактивированный УФ цельный вирус гриппа с Poly(I:C) в качестве адъюванта вводили через дыхательные пути. Однако тот факт, что подъем уровня IgG-антител не различается между группами с добавлением и без добавления Poly(I:C), показан на фиг.2 непатентного документа 1. Следовательно, было высказано предположение, что Poly(I:C) не очень эффективен в качестве адъюванта. В том же документе описана также комбинация с короткоцепочечным фосфолипидом для подъема уровня антител.

В непатентном документе 2 (Invest. Ophthalmol., 10(10), 750-759 (1971)) и в непатентном документе 3 (Invest. Ophthalmol., 10(10), 760-769 (1971)) описана интраназальная прививка инактивированным вирусом коровьей оспы с Poly(I:C) в качестве адъюванта. Однако в непатентном документе 2 описана повышенная продукция IgA-антител в слезной жидкости, но не упоминается эффект, предотвращающий инфекцию.

В патентом документе 1 (прошедшая экспертизу заявка на патент Японии № SHO-50-2009 (патент США № 3906092), Merck & Co.) раскрыто, что реакции антител на гриппозные вакцины усиливаются с добавлением полинуклеотида (включающего в себя Poly(I:C)) к адъюванту адсорбционного типа. Однако в патентном документе 1 не упоминается эффект, предотвращающий инфекцию.

В непатентном документе 4 (Veterinary Microbiology, 88(4), 325-338 (2002)) сообщается о значительно повышенных уровнях IgG и IgM после внутрибрюшинной инокуляции инактивированной вакциной с Poly(I:C) в качестве адъюванта, но в нем не показан эффект при введении в слизистую носовой полости и подобным образом, и, к тому же, в нем не упоминается эффект предотвращения инфекции.

В непатентном документе 5 (Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., 133, 334-338 (1970)) сообщается, что уровни антител в крови повышаются, когда овечьи эритроциты с Poly(I:C) в качестве адъюванта инъецируют внутривенно для иммунизации, но в нем не упоминается эффект, предотвращающий инфекцию.

В непатентном документе 6 (The Journal of Immunology, 149, 981-988 (1992)) описана возможность применения холерного токсина в качестве адъюванта, но вообще не описана двунитевая РНК.

Патентный документ 1: Прошедшая экспертизу заявка на патент Японии № SHO-50-2009

Непатентный документ 1: J. Clinical Investigation, 110(8), 1175-1184 (2002)

Непатентный документ 2: Invest. Ophthalmol., 10(10), 750-759 (1971)

Непатентный документ 3: Invest. Ophthalmol., 10(10), 760-769 (1971)

Непатентный документ 4: Veterinary Microbiology, 88(4), 325-33Н

Непатентный документ 5: Proc. Soc. Exp. Biol. & Med., 133, 334-338 (1970)

Непатентный документ 6: The Journal of Immunology, 149, 981-988 (1992)

Краткое описание сущности изобретения

Проблемы, которые предстоит решить с помощью настоящего изобретения

В описанных выше обстоятельствах настоящее изобретение предназначено для предоставления адъюванта, который проявляет адъювантный потенциал, превышающий таковой любого обычного адъюванта и способный вызвать защитные реакции в отношении различных штаммов при введении через слизистые оболочки.

Пути решения проблемы

Описанная выше проблема была решена с обнаружением того факта, что двунитевая РНК (например, Poly(I:C)) неожиданно проявляет описанный выше потенциал при использовании в комбинации с субъединичным антигеном.

Хотя имеющиеся в настоящее время инактивированные вакцины НА против гриппа являются эффективными вакцинами, как описано выше, индукция IgA-антител в эпителии слизистой дыхательных путей, являющихся вратами для поступления вирусов гриппа, очень низка; поэтому считается, что улучшение такой индукции дополнительно усилит этот эффект.

Имея это ввиду, авторы изобретения предприняли попытку получения секреторного IgA-антитела, проявляющего высокую перекрестную реактивность в отношении слизистой оболочки дыхательных путей при использовании интраназальной вакцины в комбинации с адъювантом на модели гриппа у мышей. Хорошие результаты были получены, когда субъединицу В холерного токсина (СТВ*) использовали в качестве адъюванта. Однако есть сообщения, что при интраназальном введении человеку холерный токсин вызывает побочные эффекты, такие как паралич лицевого нерва; поэтому считается, что вакцина станет более безопасной при условии, что IgG-антитело может быть индуцировано без использования адъюванта, не включающего в себя холерный токсин. IgA активирует второй путь системы комплемента и играет важную роль в местных иммунных реакциях при инфекциях слизистых оболочек; ввиду того, что IgA сам по себе метаболизируется, с периодом полувыведения из плазмы от 5 до 6 дней, считают, что невозможно прогнозировать предотвращающий инфекцию эффект, например, даже если увеличивается содержание IgA в слезной жидкости.

Следовательно, авторы провели исследование с целью определения того, может ли лиганд, Toll-подобного (Toll) рецептора, который распознает микробные компоненты в организме и стимулирует природную иммунную систему, быть высоко безопасным, сильным адъювантом для вакцин слизистых оболочек, и получили вакцину для введения через слизистые оболочки, имеющую неожиданный, защищающий от инфекции эффект.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает следующее:

(1) Вакцину для введения через слизистые оболочки, включающую в себя

А) двунитевую РНК; и

В) субъединичный антиген или инактивированный антиген патогена.

(2) Вакцину по п.(1), причем описанная выше слизистая оболочка включает в себя оболочку носовой полости.

(3) Вакцину по п.(1), причем описанный выше патоген выбран из группы, состоящей из вируса ветряной оспы, вируса кори, вируса эпидемического паротита, вируса полиомиелита, ротавируса, вируса гриппа, аденовируса, вируса герпеса, вируса краснухи, вируса тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Haеmophilus influenzae типа b, Streptococcus pneumoniae и Vibrio cholerae.

(4) Вакцину по п.(1), причем описанный выше патоген представляет собой вирус гриппа.

(5) Вакцину по п.(1), где описанная выше субъединица включает в себя по меньшей мере одну субъединицу, выбранную из группы, состоящей из субъединиц HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA и NS2 вируса гриппа.

(6) Вакцину по п.(1), где описанная выше двунитевая РНК присутствует в концентрации, достаточной для выработки секреторного IgA.

(7) Вакцину по п.(1), где описанная выше двунитевая РНК присутствует в концентрации от 0,1 до 10 мг/мл.

(8) Вакцину по п.(1), где размер описанной выше двунитевой РНК составляет от 10² до 10⁸ пар оснований.

(9) Вакцину по п.(1), где описанная выше субъединица включает в себя по меньшей мере NA или HA.

(10) Вакцину по п.(1), где описанная выше двунитевая РНК включает в себя Poly(I:C).

(11) Способ предотвращения инфекционного заболевания, включающий в себя

стадию введения через слизистую оболочку по меньшей мере однократно

А) вакцины для введения через слизистые оболочки, включающей в себя

а) двунитевую РНК; и

b) субъединичный антиген или инактивированный антиген патогена.

(12) Способ по п.(11), где описанная выше вакцина вводится по меньшей мере дважды.

(13) Способ по п.(11), где описанная выше вакцина вводится с интервалом по меньшей мере в 1 неделю или более, предпочтительнее, 3 недели или более.

(14) Способ по п.(11), где описанная выше двунитевая РНК включает в себя Poly(I:C).

(15) Набор вакцины для предотвращения инфекционного заболевания, обеспеченный

А) вакциной для введения через слизистые оболочки, включающей в себя

а) двунитевую РНК; и

b) субъединичный антиген или инактивированный антиген патогена; и

В) листок с инструкцией, предписывающей вводить описанную выше вакцину в слизистую оболочку по меньшей мере однократно.

(16) Набор по п.(15), где описанная выше вакцина вводится по меньшей мере дважды.

(17) Набор по п.(15), где описанная выше вакцина вводится с интервалом по меньшей мере в 1 неделю или более, предпочтительнее, 3 недели или более.

(18) Набор по п.(15), где описанная выше двунитевая РНК включает в себя Poly(I:C).

(19) Применение двунитевой РНК для введения вакцины через слизистую оболочку.

(20) Применение по п.(19), где описанная выше двунитевая РНК включает в себя Poly(I:C).

(21) Применение двунитевой РНК для производства вакцины для введения через слизистые оболочки.

(22) Применение по п.(21), где описанная выше двунитевая РНК включает в себя Poly(I:C).

Эффект изобретения

Настоящее изобретение предоставляет форму вакцины, которая обеспечивает возможность легкой вакцинации путем введения через слизистую оболочку и получения перекрестного иммунитета. Например, в случае вирусов гриппа можно таким образом получить эффективную вакцину без прогнозирования эпидемического штамма, и, следовательно, принять эффективные профилактические меры.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлены данные, свидетельствующие об адъювантном эффекте Poly(I:C), как проиллюстрировано в разделе «Примеры». На левой панели приведены лекарственные формы; на средней панели указано содержание IgA в промывных жидкостях носовой полости; на правой панели - содержание IgA в сыворотке.

На фиг.2 представлены данные, свидетельствующие об адъювантном эффекте Poly(I:C), как проиллюстрировано в разделе «Примеры». На левой панели указаны лекарственные формы; на правой панели - статус выживания вируса.

Фиг.3 представляет собой чертеж, на котором показаны эффекты вакцинации согласно изобретению по продуцированию IgA на различных вирусных штаммах.

На фиг.4 представлен чертеж, на котором показаны супрессивные эффекты вакцинации согласно изобретению в отношении роста вирусов на различных вирусных штаммах.

Фиг.5 представляет собой чертеж, на котором показана токсичность вакцинации согласно изобретению при внутримозговом введении. На верхней панели показаны данные для Poly(I:C) согласно изобретению; на нижней панели приведены данные для положительного контроля СТВ*.

На фиг.6 показаны иммунные эффекты частиц инактивированного вируса, используемого в качестве гриппозной вакцины для интраназального введения в комбинации с Poly(I:C), т.е. титры анти-НА- и анти-NA-антител в промывных жидкостях носовой полости и сыворотке.

На фиг.7 показаны иммунные эффекты частиц инактивированного вируса, используемого в качестве гриппозной вакцины для интраназального введения в комбинации с Poly(I:C) различных размеров (L, M, H), т.е. титры анти-НА- и анти-NA-антител в промывных жидкостях носовой полости и сыворотке.

На фиг.8 показаны иммунные эффекты двунитевой РНК или однонитевой РНК, используемой в качестве интраназальной гриппозной вакцины, в комбинации с субъединицей НА, т.е. титры анти-НА- и анти-NA-антител в промывных жидкостях носовой полости и сыворотке.

На фиг.9 приведены результаты, показывающие эффективность интраназальной гриппозной вакцины в комбинации с Poly(I:C), вводимой дважды или более с интервалом в 1 неделю или более.

На фиг.10 приведены результаты, показывающие, что Poly(I:C) также повышает защитный иммунитет коклюшной вакцины и также эффективен при усилении защитного иммунитета при вакцинации против негриппозных инфекций.

Наилучшие способы осуществления изобретения

Настоящее изобретение далее описано более подробно. Во всем описании, при отсутствии других указаний, любое выражение в форме единственного числа следует понимать как охватывающее его форму множественного числа. Кроме того, при отсутствии других указаний используемые в описании термины следует понимать как значения, обычно используемые в данной области.

Определения

Используемый в настоящем описании термин «вакцина» относится к антигенной суспензии или раствору, обычно содержащему инфекционный фактор или часть инфекционного фактора, вводимого в организм для создания активного иммунитета. Антигенная часть, которая составляет вакцину, может представлять собой микроорганизм (например, вирус или бактерию и пр.) или натуральный продукт, очищенный из микроорганизма, синтетический или полученный способами генной инженерии белок, пептид, полисахарид или подобный продукт. Примеры живых вакцин включают в себя, не ограничиваясь ими, БЦЖ, вакцины против оспы, полиомиелита, ветряной оспы, кори, краснухи, эпидемического паротита, чумы рогатого скота, NDV (вирус ньюкаслской болезни), болезни Марека и подобные им. Инактивированные вакцины включают в себя, не ограничиваясь ими, вакцины против коклюша, дифтерии (токсоид), столбняка (токсоид), гриппа, японского энцефалита и т.п.

Используемый в настоящем описании термин «инактивированный антиген» относится к антигену, лишенному инфективности, используемому в качестве антигена вакцины; такие антигены включают в себя, не ограничиваясь ими, вирионы полных вирусных частиц, неполные вирусные частицы, частицы, составляющие вирион, вирусные неструктурные белки, антигены, которые защищают против инфекций, эпитопы нейтрализующих эпитопов и т.п. Используемый в настоящем описании термин «инактивированный антиген» относится к антигену, лишенному инфективности, но сохраняющему иммуногенность; когда такой антиген используется в качестве вакцины, он называется «инактивированной вакциной». Примеры таких инактивированных антигенов включают в себя, не ограничиваясь ими, антигены, инактивированные физическим (например, рентгеновским облучением, нагреванием, ультразвуком), химическим (формалин, ртуть, спирт, хлор) или иным воздействием. Субъединичный антиген как таковой также подпадает под определение инактивированного антигена, потому что такие антигены обычно утрачивают инфективность. Альтернативно, можно использовать убитый вирус.

Используемый в настоящем описании термин «субъединичный антиген» вируса также называется «компонентом»; такой субъединичный антиген может быть очищен из такого патогена, как естественно встречающийся вирус, или может быть получен с помощью синтетической или рекомбинантной технологии. Такие способы хорошо известны и обычно используются в данной области и могут выполняться с использованием имеющегося в продаже оборудования, реагентов, векторов и т.п. Например, в случае вирусов гриппа субъединичный антиген предпочтительно представляет собой молекулу, представленную на поверхности частицы, такую как гемагглютинин (НА), нейраминидаза (NA), матрицы (М1, М2), не структуры (NS), полимеразы (PB1, PB2: основные полимеразы 1 и 2, кислая полимераза (РА)) и ядерные белки (NP). В настоящее время известно, что НА встречаются в 15 видах, а NA в 9 видах; изменения их вида может создать новый штамм.

Используемый в настоящем описании термин «адъювант» относится к веществу, которое усиливает или другим образом изменяет иммунные реакции при смешивании с введенным иммуногеном.

Используемый в настоящем описании термин «холерный токсин» относится к экзотоксину, продуцируемому Vibrio cholerae, который представляет собой причинное вещество симптомов диареи вследствие инфекции Vibrio cholerae. Хотя холерный токсин используется в качестве эффективного адъюванта, он не нашел клинического применения ввиду его токсичности. Поэтому холерный токсин обычно используется в качестве положительного контроля при поиске эффективного адъюванта для вакцины.

Используемый в настоящем описании термин «двунитевая РНК» относится к необязательно выбранной двунитевой РНК. Ее размер можно измерить, например, с помощью гель-электрофореза и подобных способов. Традиционно предпринимались попытки использования двунитевой РНК в качестве адъюванта для вакцины, но почти не было сообщений о том, что вакцина была эффективной в защите против инфекций. Такие двунитевые РНК включают в себя, но не ограничиваются ими, Poly(I:C), Poly(A:U), Poly(G:C) и им подобное.

Используемый в настоящем описании термин «Poly(I:C)» относится к двунитевой РНК, включающей в себя полиинозиновую кислоту (pI) и полицитидиновую кислоту (pc), и подпадает под описанный выше объем двунитевой РНК.

В настоящем описании в качестве антигена можно использовать любой инактивированный антиген и субъединичный антиген.

Используемый в настоящем описании термин «введение в слизистые оболочки» относится к лекарственной форме, вводимой через слизистую оболочку. Используемый в настоящем описании термин «слизистая оболочка» относится к внутренней стенке полого органа, в частности органа, который сообщается с внешней стороной тела, такого как желудочно-кишечный орган, дыхательный орган или мочеполовой орган, у позвоночного животного. Соответственно, примеры таких путей введения в слизистые оболочки включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, введение в носовую полость (интраназальное введение), защечное введение, внутривлагалищное введение, введение в верхние дыхательные пути, альвеолярное введение и им подобное. Предпочтительно введение в носовую полость. Это связано с тем, что носовая полость является также вратами инфекции при респираторных инфекционных заболеваниях, в частности, вирусов гриппа, и следовательно, может вызвать реакции IgA введением в слизистую оболочку.

Используемый в настоящем описании термин «интраназальное введение» относится к способу введения через слизистую оболочку носовой полости.

Используемый в настоящем описании термин «патоген» относится к организму, способному вызывать заболевание или расстройство у хозяина. Примеры патогенов для человека включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, вирусы, бактерии, простейшие, риккетсии, хламидии, грибы и пр. Патогены, против которых вакцины эффективны, обычно включают в себя, но не ограничиваются ими, вирусы, бактерии и им подобное.

Вирус, являющийся мишенью в настоящем изобретении, может быть любого вида и включает в себя, но не ограничивается ими, ДНК-вирусы, РНК-вирусы и им подобное.

Примеры вирусов, которые являются для человека патогенными, включают в себя, но не ограничиваются ими, вирус ветряной оспы, вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус полиомиелита, ротавирус, вирус гриппа, аденовирус, вирус герпеса, вирус краснухи, вирус SARS (вид коронавируса) и ВИЧ. Вирус предпочтительно представляет собой вирус гриппа.

Бактерии, являющиеся мишенью в настоящем изобретении, могут представлять собой любую бактерию и включают в себя, не ограничиваясь ими, грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии.

Бактерии, которые являются патогенами для человека, включают в себя, но ими не ограничиваются, Bordetella pertussis, Neisseria meningitides, Haemophilus influenzae типа b, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae и им подобные.

Используемый в настоящем описании термин «вирус гриппа» относится к вирусу однонитевой РНК, относящемуся к семейству Orthomyxoviridae. Вирус имеет оболочку из двойной липидной мембраны, поддерживаемой М1 (мембранным белком), в которую встроены характерные мембранные белки, такие как М2, НА (гемагглютинин), NA (нейраминидаза) и гликопротеид М2. РНК встречается в восьми сегментах, которые, наряду с ядерными белками, образуют сложный RNP (рибонуклеозидный капсид) и слабо связаны с поддерживающим оболочку белком М1.

Из белков вируса гриппа НА и NA продуцируются в виде встроенных в мембрану эндоплазматического ретикулума и экспонируемых на клеточной поверхности через аппарат Гольджи. Поэтому и НА, и NA являются хорошими иммуногенами и используются в качестве основных исходных материалов для вакцин.

Используемый в настоящем описании термин «концентрация, достаточная для продуцирования секреторного IgA» относится к способности адъюванта или вакцины как таковых, т.е. концентрации адъюванта или вакцины как таковых, которая обеспечивает возможность продуцирования секреторного IgA после начала иммунной реакции после введения. Такая концентрация может быть достигнута in vitro или in vivo с использованием способа, общеизвестного в данной области.

Используемый в настоящем описании термин «секреторный IgA» относится к IgA, который секретируется. IgA представляет собой основной иммуноглобулин в экзокринных жидкостях и помогает в защите против инфекций на поверхности слизистых оболочек. Хотя IgA в изобилии обнаруживается в слюне, выделениях из носовой полости и жидкостях, секретируемых из кишечника, трахеи и им подобных органов, или в молозиве, он также присутствует и в сыворотке. Содержание IgA как такового можно измерить, например, способом иммунодиффузии, который, однако, не следует рассматривать как ограничивающий; в качестве примеров предпочтительно используемых способов можно упомянуть способы, описанные в разделе «Примеры».

Описание общих биохимических методик, которые можно использовать в настоящем изобретении

Способ получения вакцины

В настоящем описании субъединичный антиген или инактивированный антиген, содержащиеся в вакцине, можно получить из натурального материала путем инактивации, очистки и подобными способами, как описано выше, или же искусственно, путем получения полипептида, используя технологию генетической инженерии или синтеза. Обычно вакцину согласно изобретению можно получить, выращивая вирус или подобный патоген с использованием развившегося яйца и ему подобной среды и инактивируя выращенный вирус или подобный патоген или отделяя и очищая из него компонент.

В настоящем описании вакцина согласно изобретению может поставляться в жидкой или высушенной форме в плотно закупоренном флаконе, шприце, распылителе или подобных контейнерах или в термически запаянной ампуле.

При производстве вакцины вируса гриппа можно использовать следующие процедуры, но их не следует рассматривать как ограничивающие.

Примеры желательного штамма вируса гриппа включают в себя, но не ограничиваются ими, A/Beijing/352/89(H3N2); A/Texas/36/91(H1L1); B/Panama/45/90; A/Georgia/03/93; A/New Caledonia/20/99(H1L1), A/Panama/2007/99(H3N2); B/Shangdong/7/97; B/Johannesburg/5/99 и т.п.

Эти вирусы выращивают, например, путем инкубации пересевом в 9-11-дневные развивающиеся эмбрионы яиц, при необходимости, выращивают в культивируемых клетках (например, клетках MDCK). Вирусы можно очистить способом, описанным Massicot et al. (Virology 101, 242-249 (1980)), или его модификацией. Вкратце, суспензию вирусов осветляют центрифугированием при 8000 об/мин (например, на центрифуге Sorvall RC5C, роторе GS-3), затем осаждают центрифугированием с использованием ротора модели Beckman 19 при 18000 об/мин в течение 2 часов.

Осажденный вирус ресуспендируют в среде STE (0,1 М NaCl, 20 мМ Tris, рН 7,4, 1 мМ ЭДТА) и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 минут (центрифуга Hermle Z360K), и агрегат удаляют. 2 мл надосадочной жидкости наслаивают на ступенчатый градиент сахарозы, состоящий из 2 мл 60% сахарозы и 7 мл верхнего слоя 30% сахарозы, забуференной STE, и центрифугируют при 36000 об/мин (ротор SW-40, Beckman) в течение 90 минут.

Сегментированный вирус собирают на границе раздела, 10-кратно разводят STE и осаждают при 30000 об/мин в течение 2 часов (ротор Beckman Ti45). Затем осажденный вирус замораживают при -70°С.

Субъединичный антиген вируса можно получить путем культивирования (например, клеток СНО-К1) с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Векторы экспрессии, которые можно использовать, включают в себя, не ограничиваясь ими, pCXN (Matsunami K. Et al. (Clinical & Experimental Immunology 126(1), 165-172 (2001)) и ему подобные. Трансформированные клетки растворяют в солюбилизирующем буферном растворе (8% Triton X-100, 2 M HCl, 10 мМ буфер фосфата натрия (рН 7,0)) или подобном растворе и суспендируют, добавляя равный объем PBS (солевой раствор с фосфатным буфером), с последующим, например, центрифугированием при 360000 об/мин (например, центрифуге Beckman XL-70 с ротором типа 55.1Ti), посредством чего извлекается растворимая фракция. Извлеченная растворимая фракция может быть адсорбирована на аффинной колонке, где белок, пептид или подобное вещество, такое как моноклональное антитело или поликлональное антитело, обладающее специфическим аффинитетом к желательному антигену или пептидной последовательности, добавленной к ней, соединяется с носителем, и элюируют и очищают, используя раствор, который ослабляет силу связывания вследствие изменения рН или другого влияния, такого как 0,1 М глицин-HCl или 0,1% Tween 80 (рН 2,7). Также можно использовать такие методики как экстракция растворителя, обессоливание выпадением в осадок под воздействием осаждения сульфатом аммония, осаждение органическим растворителем, анионообменная хроматография с использованием такой смолы, как диэтиламиноэтил (DEAE)-сефароза или DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chamical Corporation), хроматография гидрофобности с использованием такой смолы, как бутил-сефароза или фенил-сефароза, гель-фильтрация с использованием молекулярного сита, хроматофокусировка и изоэлектрическая фокусировка. Очищенный антиген диализуют против буферного раствора, такого как PBS, и он может быть заморожен, например, при -70°С.

В таких формах может быть получена вакцина.

Адъювант

Термин «адъювант» в целом относится веществам, которые увеличивают продукцию антител и усиливают иммунные реакции при комбинации с антигеном; в более предпочтительном варианте способа осуществления используется модуляторный или эффективный, нетоксичный адъювант. Требуется, чтобы адъюванты использовались наряду с обычным вакцинным антигеном, с тем, чтобы вызвать более быстрые, более сильные или длительные реакции. Адъюванты как таковые можно также использовать в случаях, когда подача антигена ограничена или продукция антигена является дорогостоящей.

Адъюванты относятся, например, к минералам, бактериям, растениям, синтетическим продуктам или продуктам организма-хозяина.

Адъюванты первого класса представляют собой минеральные адъюванты, например, соединения алюминия. Первое применение соединения алюминия в качестве адъюванта было описано в 1926 г. С тех пор антигены, совместно осажденные с соединением алюминия или антигенами, смешанными или адсорбированными к ранее образованному соединению алюминия использовались для усиления иммунных реакций у животных и человека. Представляется, что соединения алюминия и подобные адъюванты действуют по описанному выше механизму. Алюминий физически связывается с антигеном для образования частиц и замедляет скорость поглощения антигена в ткани после инъекции, таким образом, продлевая период взаимодействия между антигеном и клетками, представляющими антиген, например, макрофагами или фолликулярными-дендритными клетками. Альтернативно, адъюванты, кроме того, активируют такие взаимодействия. Показано, что частицы алюминия появляются локально в лимфоузлах кролика через 7 дней после иммунизации и могут направлять антиген в область, содержащую Т-клетки в самих лимфоузлах с другой функцией. Было показано, что активность адъюванта коррелирует с активацией релевантного лимфоузла. Хотя в большом количестве исследований продемонстрировали, что антиген, введенный вместе с алюминием, активирует гуморальный иммунитет, представляется, что клеточный иммунитет увеличивается лишь незначительно. Было также описано, что алюминий активирует пути комплементов. Этот механизм может играть роль в местных воспалительных реакциях и иммуноглобулиновой памяти.

Соединения алюминия представляют собой почти единственный безопасный адъювант, который в настоящее время используется у человека. Однако вакцины, содержащие алюминий, иногда вызывают местные реакции. Хотя начало аллергий обычно не вызывает большого клинического беспокойства, сообщается, что соединения алюминия привлекают эозинофилы в участки инъекции посредством механизма, зависимого от Т-клеток, для индукции реакций IgE после примирования антигеном и активации популяции специфических клеток, имеющих хелперную функцию, для реакций IgE.

Недавно были очищены и синтезированы адъюванты бактериального происхождения (например, муранилдипептид, липид А). Также были клонированы полученные в организме хозяина иммунологически активные белки (интерлейкин 1 и интерлейкин 2). В последние годы на лабораторном уровне начал использовать Bordetella pertussis, липополисахариды и полный адъювант Фрейнда (FCA).

В качестве адъюванта начали также использовать и разные другие вещества. Они включают в себя растительные продукты, например, сапонин, животные продукты, например, хитин, и большое количество синтетических химических веществ.

В настоящем описании в качестве адъюванта используется двунитевая РНК. Эту двунитевую РНК можно получить в соответствии с описанным выше способом получения молекулы нуклеиновой кислоты, и можно использовать способ, хорошо известный в данной области. В качестве примеров, можно использовать наборы от компании Sigma Aldrich Japan, YAMASA Corporation, Fluka.

Poly(I:C) можно получить с использованием способов, хорошо известных в данной области. Такие способы описаны в непатентных документах 1-3 и прочих, и примеры предпочтительных способов включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, смешивание двух отобранных гомополимеров в растворе, забуференном фосфатом, при рН 7,0 (0,006 моль фосфата натрия, 0,15 моль хлорида натрия) в эквимолярной концентрации, и пр. Комплекс может образовываться сразу после смешивания.

Компьютерный скрининг

Для скрининга конформационных данных можно использовать фактор (например, антиген или инактивированный антиген, антитело), полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Скрининг можно выполнять с использованием системы in vitro, in vivo или другой системы с использованием существующего вещества или с использованием библиотеки, созданной с использованием системы скрининга в кремнии. Понятно, что соединения желательной активности, полученные путем скрининга, также охватываются объемом настоящего изобретения. В настоящем изобретении также предполагается, что препарат, созданный с помощью компьютерного моделирования, предоставляется на основе описания настоящего изобретения. Соответственно, препарат, полученный путем такого скрининга, можно также использовать в качестве компонента для вакцины согласно изобретению.

Заболевания

Заболевания, на которые может быть направлено настоящее изобретение, согласно описанию, можно предотвратить введением вакцины. Такие заболевания включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, бактериальные заболевания, вирусные заболевания, аллергические заболевания и пр.; примеры включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, ветряную оспу, корь, эпидемический паротит, полиомиелит, ротавирусную инфекцию, грипп, краснуху, тяжелый острый респираторный синдром (SARS), коклюш, менингит и холеру, инфекцию вирусом RS (респираторного синцития), Haemophilus influenzae типа b, инфекции Streptococcus pneumoniae, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) и др.

Демонстрация терапевтической активности или профилактической активности

Соединение или фармацевтическая композиция согласно изобретению предпочтительно тестируют для выявления желательной терапевтической активности или профилактической активности in vitro, затем in vivo и на уровне организма животных перед применением у человека. Воздействия соединения или композиции на клеточный штамм и/или образец ткани можно определить с использованием методики, известной специалистам в данной области. В качестве анализов in vitro, которые можно использовать для определения того, показано ли введение конкретного соединения в соответствии с настоящим изобретением, можно упомянуть наблюдение связывания антигена с антителом и подобные способы. При тестировании на уровне организма животных суждение возможно в результате введения испытуемой вакцины, например, человеку, и подтверждения увеличения титра антител (определяемого, например, способом ELISA (иммуноферментный анализ)) или активации цитотоксических Т-клеток и тому подобных явлений.

Композиция и ее ведение для профилактики

Фармацевтически приемлемые носители, которые можно использовать в композиции, вакцине и подобных препаратах согласно изобретению, включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, антиоксиданты, консерванты, красящие вещества, ароматизирующие агенты и разбавители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, растворители, наполнители, вещества, придающие объем, агенты, придающие буферные свойства, носители доставки, разбавители, эксципиенты и/или фармацевтические адъюванты. Обычно фармацевтическое средство согласно изобретению вводят в виде композиции, включающей в себя вакцину или ее модификацию или производное, наряду с одним или несколькими физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или разбавителями. Например, соответствующим носителем может быть вода для инъекций, физиологический раствор или искусственная спинномозговая жидкость, и в них могут быть добавлены другие вещества, обычно используемые в композициях для непероральной доставки.

Приемлемый носитель, эксципиент или стабилизатор, используемый в настоящем изобретении, нетоксичен для реципиента и является предпочтительно инертным в используемой дозе и концентрации; примеры включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, фосфаты, цитраты или соли других органических кислот; аскорбиновую кислоту, α-токоферол; низкомолекулярные полипептиды; белки (например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулин); гидрофильные полимеры (например, полифенилпирролидон); аминокислоты (например, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин); моносахариды, дисахариды и другие углеводороды (включая глюкозу, маннозу или декстрин); хелатобразующие вещества (например, ЭДТА); сахарные спирты (например, маннит или сорбит); образующие соль противоионы (например, натрий); и/или неионные поверхностно-активные вещества (например, Tween, Pluronic или полиэтиленгликоль (PEG)) и пр.

В качестве примеров соответствующего носителя можно упомянуть нейтрально забуференный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином. Предпочтительно, если продукт составлен в композицию в виде лиофилизированного продукта с использованием соответствующего эксципиента (например, сахарозы). При желании могут быть включены другие стандартные носители, разбавители и эксципиенты. Другие репрезентативные композиции включают в себя Tris-буфер при рН 7,0-8,5 или ацетатный буфер при рН 4,0-5,5, и они могут, кроме того, включать сорбит или соответствующую альтернативу.

Общий способ получения фармацевтической композиции согласно изобретению описан ниже. Следует отметить, что композиции препаратов для животных, квази-препараты, композиции препаратов водных культур, пищевые композиции, косметические композиции и пр. можно также получить общеизвестными способами.

Вакцину и подобные препараты согласно изобретению можно вводить неперорально при смешивании с фармацевтически приемлемым носителем.

Фармацевтический препарат согласно изобретению может быть получен путем смешивания, при необходимости, физиологически приемлемого носителя, эксципиента или стабилизатора и композиции сахарной цепи желательного уровня чистоты (см. XIV Фармакопею Японии или ее последнее издание, 18-е издание руководства Remington's Pharmaceutical Sciences, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, и подобные публикации) и храниться в форме лиофилизированной лепешки или водного раствора.

Различные системы доставки препарата общеизвестны, а в настоящем изобретении предполагается введение через слизистую оболочку. В качестве методик, используемых для введения соединения согласно изобретению, можно упомянуть липосомы, микрочастицы, микрокапсулы и подобные средства. Способы их введения включают в себя, не ограничиваясь перечисленным, пути введения через слизистую оболочку, такие как пути введения через интраназальную, внутривлагалищную слизистую оболочку, слизистую оболочку верхних дыхательных путей, щек, прямой кишки. В этом случае соединение согласно изобретению можно ввести наряду с другим биологически активным препаратом. Введение может быть системны или местным. В случае введения через слизистую оболочку легочное введение можно также применять, например, используя ингалятор или аэрозольный распылитель и композицию в виде аэрозольного средства.

В определенном виде осуществления желательно, чтобы соединение или композиция согласно изобретению вводились местно не только на поверхность слизистой оболочки в участке введения, но также на поверхность слизистой оболочки другой ткани, где может быть увеличена секреция IgA.

Количество композиции, используемое в профилактическом способе настоящего изобретения, могут легко определить специалисты в данной области в соответствии с целью применения, подлежащего лечению заболевания (вид и тому подобное), возрастом, массой тела, анамнеза заболевания пациента и тому подобными факторами. Частоту применения способа лечения согласно изобретению у субъекта (или пациента) также могут легко определить специалисты в данной области с учетом цели применения, подлежащего лечению заболевания (вид, тяжесть и тому подобное), возраста, массы тела, анамнеза заболевания пациента, течения заболевания и тому подобных факторов. В качестве примеров частоты введения можно упомянуть введение от одного раза в день до одного раза в несколько месяцев (например, введение от 1 раза в неделю до 1 раза в месяц) или перед каждым эпидемическим сезоном, и подобные частоты. Предпочтительно проводить введение от 1 раза в неделю до 1 раза в месяц при контроле течения заболевания, и предпочтительно проводить повторную иммунизацию с интервалом по меньшей мере примерно в 1 неделю. Предпочтительнее, если интервал до повторной иммунизации может составлять по меньшей мере примерно 3 недели.

Хотя доза вакцины и подобных препаратов в соответствии с настоящим изобретением варьируют, в зависимости от возраста, массы тела субъекта, симптомов или способа введения и подобных им факторов, и не подлежат ограничению, они обычно могут составлять от 10 мг до 1 г в день для перорального введения у взрослого. В случае введения через слизистую оболочку (например, интраназально) доза составляет от 0,001 мг до 10 мг и может предпочтительно составлять от 0,1 мг до 1 мг.

Используемый в настоящем описании термин «вводить» означает, что вакцина и подобный препарат в соответствии с настоящим изобретением или фармацевтическая композиция, содержащая ее, вводится подлежащему лечению хозяину отдельно или в комбинации с другим терапевтическим средством. Комбинацию можно вводить, например, одновременно в виде смеси, отдельно, но одновременно или совместно или последовательно. Это включает в себя случай, когда комбинированные препараты вводятся вместе в виде терапевтической смеси, а также включает в себя процедуры, где комбинированные препараты вводятся отдельно, но одновременно (например, одному и тому же индивиду через разные слизистые оболочки). «Комбинированное» введение, кроме того, включает в себя отдельное введение сначала одного из соединений или препаратов, а затем введение второго.

Используемый в настоящем описании термин «листок с инструкцией» относится к документу, содержащему информацию о том, как вводить фармацевтическое средство, и подобную информацию согласно изобретению, или как поставить диагноз и подобную информацию, для лица, которое выполняет введение, такого как врач или пациент, и лица, которое ставит диагноз (это может быть пациент). Этот листок с инструкцией содержит изложение распоряжений, касающихся процедур введения диагностического средства, профилактического средства, фармацевтического средства и тому подобного, в соответствии с настоящим изобретением. Этот листок с инструкцией составляют в соответствии с формой, определяемой контролирующими уполномоченными органами страны, в которой осуществляется настоящее изобретение (например, Министерство здравоохранения, труда и социального развития Японии, Администрация пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) США и пр.), и в ней указано, что получено утверждение контролирующих уполномоченных органов. Листок с инструкцией представляет собой то, что называется вкладышем в упаковку, и он обычно предоставляется на бумажном носителе, который, однако, не должен рассматриваться как ограничивающий; листок с инструкцией может также предоставляться, например, в форме пленки, нанесенной на флакон, или электронного носителя (например, в виде домашних страниц (сайты, предоставляемые Интернетом, сообщения электронной почты).

О завершении профилактического лечения способом настоящего изобретения можно судить подтверждением вызванной продукции антител с использованием имеющегося в продаже анализа или оборудования.

Настоящее изобретение также предоставляет фармацевтическую упаковку или набор, имеющий один или несколько сосудов, содержащих один или несколько компонентов фармацевтической композиции согласно изобретению. Такие сосуды могут иметь необязательно приложенное уведомление в форме, определяемой правительственной организацией, которая регулирует изготовление, применение или продажу фармацевтических продуктов или биологических продуктов, причем в уведомлении указано утверждение правительственной организацией изготовления, применения или продажи для введения человеку.

Описание предпочтительных способов осуществления

Далее описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Представленные ниже варианты осуществления описаны в интересах лучшего понимания изобретения, и понятно, что объем настоящего изобретения не ограничивается следующим описанием. Поэтому очевидно, что специалисты в данной области могут модифицировать любой способ осуществления, который целесообразен в пределах объема настоящего изобретения, при рассмотрении представленного здесь описания.

В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет вакцину для введения через слизистые оболочки. Эта вакцина включает в себя А) двунитевую РНК; и В) субъединичный антиген или инактивированный антиген вируса. Здесь двунитевая РНК и вирусный субъединичный антиген и инактивированный антиген можно получить способами, обычно известными в данной области. Соответствующие формы для введения через слизистые оболочки хорошо известны в настоящей области, и примеры включают в себя, но не ограничиваясь ими, жидкости или аэрозоли и т.п. Было продемонстрировано, что настоящее изобретение повышает титр секреторного IgA слизистой оболочки дыхательных путей и действительно оказывает защитный эффект против инфекции комбинацией двунитевой РНК и вирусного субъединичного антигена или инактивированного антигена. Этот эффект может считаться неожиданно примечательным, с учетом наличия большого количества сообщений о том, что двунитевая РНК в качестве адъюванта продуцирует антитело, но не оказывает действенного эффекта защиты против инфекции.

Ввиду того, что вакцина согласно изобретению осуществляет заметный эффект при введении через слизистую оболочку, можно использовать любой путь, пока ее введение производится через слизистую оболочку (например, интраназальное введение, буккальное введение и т.п.); однако в предпочтительном способе введения можно использовать интраназальный путь.

В предпочтительном варианте осуществления патоген, являющийся мишенью вакцины согласно изобретению, может, например, представлять собой патоген, выбранный из группы, состоящей из вируса ветряной оспы, вируса кори, вируса эпидемического паротита, вируса полиомиелита, ротавируса, вируса гриппа, аденовируса, вируса герпеса, вируса краснухи, вируса SARS, ВИЧ, Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae типа b, Streptococcus pneumoniae и Vibrio cholerae. Предпочтительно, когда патоген представляет собой вирус гриппа. Настоящее изобретение обеспечивает отличный эффект, предоставляя вакцину, которая впервые в истории проявляет перекрестную реактивность среди подтипов в пределах штамма (например, H1N1 и т.п.) в пределах типа вируса гриппа (типа А, тип В). Ввиду того, что настоящее изобретение в некоторых случаях проявляет перекрестную реактивность за этими пределами, настоящее изобретение оказывает эффект, который не был осуществлен на предшествующем уровне техники. Поскольку эпидемический тип вируса гриппа изменяется каждый год, с изменениями самого вируса, обычная практика заключалась в прогнозе вероятного эпидемического типа и ежегодном получении соответствующей вакцины для вируса гриппа. Однако настоящее изобретение осуществляет перекрестную реактивность в отношении различных штаммов и подвидов и, таким образом, обеспечивает возможности получения эффективной противогриппозной вакцины без прогноза эпидемического типа. Кроме того, исключение необходимости прогноза обеспечивает возможность использования длительно хранящихся вакцин.

В предпочтительном варианте осуществления субъединица патогена, используемая в настоящем изобретении, включает в себя субъединицу, выбранную из группы, состоящей из субъединиц HA, NA, M1, M2, NP, PB1, PB2, PA и NS2 вируса гриппа. Предпочтительнее, если используется представленная на поверхности субъединица (например, HA, NA). В более предпочтительном варианте преимущественно используют множество (например, HA и NA) этих представленных на поверхности субъединиц. Это связано с тем, что использование представленных на поверхности субъединиц обеспечивает возможность индукции более эффективных взаимодействий между антигеном и антителом и, следовательно, индукции нейтрализующего антитела.

Предпочтительно, когда двунитевая РНК присутствует в концентрации, достаточной для продукции секреторного IgA. Такие концентрации двунитевой РНК составляют, например, от 0,1 до 10 мг/мл, предпочтительнее, от 0,5 до 2 мг/мл, а еще предпочтительнее, примерно 1 мг/мл (например, от 0,8 до 1,2 мг/мл).

Предпочтительно, если двунитевая РНК имеет размер, достаточный для продукции секреторного IgA. Примеры таких размеров включают в себя 10² пар оснований или более, предпочтительно, от 0 до 3×10⁶ пар оснований, предпочтительнее, 300 пар оснований или более, однако эти размеры не следует рассматривать как ограничивающие. Верхний предел размера двунитевой РНК согласно изобретению не подлежит ограничению; примеры верхнего предела размера включают в себя, не ограничиваясь им, 10⁸ пар оснований.

В предпочтительном варианте осуществления преимущество проявляется тогда, когда субъединица, используемая в вакцине согласно изобретению, включает по меньшей мере NA или HA. Это связано с тем, что при содержании одной из них, предпочтительнее, обеих, обеспечивается возможность эффективной индукции нейтрализующего антитела и, следовательно, осуществления противовирусного эффекта.

Хотя двунитевая РНК предпочтительно включает в себя Poly(I:C), можно использовать и другие двунитевые РНК (например, Poly(A:U), Poly(G:C)), их смеси и т.п.. Poly(I:C) может относиться к любому типу, при измененном или неизмененном нуклеотиде.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ предотвращения инфекционного заболевания. Этот способ включает в себя стадию введения через слизистую оболочку по меньшей мере однократно А) вакцины для введения через слизистую, содержащей а) двунитевую РНК (предпочтительно Poly(I:C)); и b) субъединичный антиген вируса. Введение вакцины через слизистую оболочку можно выполнить в подходящей форме в соответствии с участком введения. В случае интраназального введения можно использовать различные способы, такие как орошение, покрытие или непосредственное погружение в жидкость вакцины.

Введение вакцины эффективно предпочтительно при по меньшей мере двукратном ее введении. Этот способ иммунизации иногда называется бустерной иммунизацией. Выполнение бустерной иммунизации обеспечивает возможность получения более высокого эффекта защиты от инфекции.

Когда введение вакцины выполняется множество раз, предпочтительно, чтобы интервал составлял по меньшей мере 1 неделю или более, предпочтительнее, 3 недели или более. Типы двунитевой РНК, Poly(I:C), антигена и пр. можно получить, как описано выше в настоящем описании.

В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет набор вакцины для предотвращения инфекционного заболевания. Этот набор обеспечен А) вакциной для введения через слизистые оболочки, содержащей а) двунитевую РНК; и b) субъединичный антиген или инактивированный антиген вируса; и В) листок с инструкцией вводить вакцину по меньшей мере однократно. Этот набор может продаваться в виде лекарственного средства в упаковке. Листок с инструкцией содержит указание об утверждении, полученном регулирующими уполномоченными структурами, такими как Министерство здравоохранения, труда и социального развития, и указание, как использовать набор. Способы получения и введения вакцины такие же, как описано выше.

Полипептидная форма субъединичного антигена гриппозной вакцины

В одном аспекте настоящее изобретение предоставляет композицию для профилактики, лечения или прогноза заболевания, расстройства или состояния при инфекционном заболевании, содержащую профилактически, терапевтически или прогностически эффективное количество субъединичного антигена гриппозной вакцины или его фрагмент или модификацию, и двунитевую РНК. Здесь профилактически, терапевтически или прогностически эффективное количество можно определить с использованием методики, хорошо известной в данной области специалистам в данной области, в связи с различными показателями; такое количество могут легко определить специалисты в данной области с учетом, например, цели применения, подлежащего лечению заболевания (вид, тяжесть и подобные им факторы), возраст, масса тела, анамнез заболевания пациента и подобные им факторы (см., например, «Руководство по вакцинам» под редакцией старшего научного сотрудника (Gaku-yuu-kai) Национального института здоровья (1994); «Руководство по профилактическим прививкам, 8-е издание», под редакцией Mikio Kimura, Munehiro Hirayama и Harumi Sakai, Kindai Shuppan (2000); «Минимальные требования к биологическим продуктам» под редакцией Ассоциации биологических производителей Японии (1993) и подобные источники)).

Далее настоящее изобретение описано со ссылкой на следующие примеры, причем примеры приведены исключительно с целью иллюстрации. Соответственно, объем настоящего изобретения не ограничен только примерами, но ограничен объемом формулы изобретения.

Примеры

В следующих примерах эксперименты выполняли после того, как все лица предоставили информированное согласие. С животными обращались в соответствии со стандартами, установленными Национальным институтом инфекционных заболеваний и Университетом Осаки. Реагенты, использованные в приведенных ниже примерах, были получены или от компании Sigma Aldrich Japan; YAMASA Corporation или Fluka.

Пример 1. Адъювантное действие Poly(I:C), синтетической двунитевой РНК

В этом примере возможность индукции нейтрализующего антитела и, следовательно, защитный эффект против инфекции инактивированного вируса или субъединичного антигена, верифицировали с использованием Poly(I:C), синтетической двунитевой РНК, в качестве адъюванта.

Материалы

Мыши: Мыши BALB/c (возраст 6 недель, самки)

Вирус: Вирус гриппа штамм H1N1 (A/PR8) (полученный из Национального института инфекционных заболеваний (1-23-1, Toyama, Shinjyuku-ku, Tokyo))

Вакцины: Вирус гриппа штамм H1N1 (A/PR8) и штамм H1N1 (A/Beijing) (Национальный институт инфекционных заболеваний); штамм H1N1 (A/Yamagata) (Национальный институт инфекционных заболеваний); штамм H3N2 (A/Guizhou) (Национальный институт инфекционных заболеваний); инактивированная простым эфиром вакцина НА (Фонд исследований микробных заболеваний Университета Осаки, 2-9-41, Yahatacho, Kan-onji, префектура Kagawa)

Адъюванты: СТВ* (СТВ (субъединица В холерного токсина), содержащая 0,1% СТ (холерного токсина) в качестве положительного контроля, Poly(I:C).

Способ

Использовали 5 6-недельных мышей BALB/c на группу (Japan SLC, Inc., Tokyo). 5 мкл смеси 1 мкг каждой вакцины PR8HA ((Национальный институт инфекционных заболеваний; Фонд исследований микробных заболеваний Университета Осаки) и 0,1 мкг, 1 мкг, 3 мкг или 10 мкг Poly(I:C) в качестве адъюванта для каждой вакцины вносили в носовую полость каждого животного; через 3 недели в носовую полость вводили равное количество вакцины с адъювантом или без него; через 2 недели в каждую сторону носовой полости вводили 1,2 мкл 100 pfu (бляшкообразующих единиц) вируса гриппа для того, чтобы вызвать инфекцию. Для контроля были выделены дополнительные группы животных, получавшие отдельно 10 мкг или 1 мкг Poly(I:C), отдельно вакцину PR8HA, или не получавшие лечения. Через 3 дня после инфекции получали промывные жидкости носовой полости и сыворотку; IgA в промывных жидкостях носовой полости и IgG в сыворотке измеряли, используя способ ELISA, и титр вируса в промывных жидкостях носовой полости измеряли анализом бляшек, используя клетки MDCK.

Аналогичным образом интраназально иммунизированных мышей инфицировали 20 мкл вируса в летальной дозе 40 LD₅₀ (10^4,7 EID₅₀ (примерно в 50000 раз превышающее количество вируса, проявляющего инфективность для 50% развившихся яиц)) и исследовали их выживание.

Для оценки защитных эффектов на перекрестные инфекции интраназальных гриппозных вакцин с использованием Poly(I:C) в качестве адъюванта, интраназально вводили вакцины различных подтипов вируса гриппа штамма H1N1 (A/PR8), штамма H1N1 (Beijing), штамма H1N1 (A/Yamagata) и штамма H3N2 (A/Guizhou), наряду с 3 мкг Poly(I:C); через 3 недели вводили каждую вакцину отдельно; через 2 недели в каждую сторону носовой полости вводили 1,2 мкл 100 pfu вируса гиппа PR8 для того, чтобы вызвать инфекцию. Через 3 дня после инфекции брали промывные жидкости носовой полости и сыворотку; IgA в промывных жидкостях носовой полости и IgG в сыворотке измеряли, используя способ ELISA, и титры вируса в промывных жидкостях носовой полости измеряли анализом бляшек, используя клетки MDCK.

Результаты

Индукция антител и защита против инфекции интраназальными гриппозными вакцинами с использованием Poly(I:C) в качестве адъюванта

Оценивали адъювантный потенциал Poly(I:C) при введении через слизистую оболочку. За 6 недель до исследования интраназально вводили 1 мкг каждой вакцины PR8 наряду с вариабельным количеством от 0,1 мкг до 10 мкг Poly(I:C); за 2 недели до исследования интраназально вводили такое же количество вакцины, отдельно или наряду с адъювантом. Реакции IgA антител в слизистой оболочке носовой полости и реакции IgG в крови показаны на фиг.1. Для определения адъювантного эффекта в зависимости от дозы Poly(I:C), исследование адъюванта исследовали при ступенчатом увеличении количества Poly(I:C) от 0,1 мкг до 10 мкг. В результате, реакции IgA в слизистой оболочке носовой полости наблюдали, когда в первый раз иммунизации использовали 0,1 мкг Poly(I:C). Количество IgA, индуцированное в слизистой оболочке носовой полости, зависело от количества Poly(I:C); адъювантный эффект Poly(I:C) усиливался с увеличением его количества. Когда при обеих иммунизациях использовали 1 мкг Poly(I:C), в промывных жидкостях носовой полости наблюдалась секреция 100 нг/мл или более IgA; когда Poly(I:C) использовали только при первой иммунизации, 100 нг/мл или более специфического IgA индуцировалось при добавлении 3 мкг Poly(I:C). IgG в сыворотке определяли в то же время, и его количество коррелировал с секрецией IgA; когда 1 мкг вакцины PR8, наряду с Poly(I:C), вводили для иммунизации дважды с интервалом в 4 недели, был получен уровень IgG в крови 1,5 мкг/мл.

Также в таких же условиях иммунизации через 2 недели после второй иммунизации 1,2 мкл 100 pfu вируса PR8 вводили в каждую сторону полости носа для того, чтобы вызвать инфекцию. У невакцинированной контрольной группы наблюдали вирусный рост при титрах вируса 10³ pfu/мл или более в промывных жидкостях носовой полости (фиг.2). Однако у группы, получавшей 2 интраназальные вакцинации в комбинации с Poly(I:C), вирусный рост полностью подавлялся; у группы, дважды иммунизированной 1 мкг или более одной вакцины, и у группы, получавшей 3 мкг или более Poly(I:C), используемого только во время первой иммунизации, эффект подавления вирусов вообще не наблюдался (фиг.2).

Также даже в группах, получавших 1 мкг или 0,1 мкг Poly(I:C), используемого в комбинации только при первой иммунизации, вирусный рост значительно подавлялся соответственно до 10^0,8  pfu/мл и 10^1,6  pfu/мл. У группы, получавшей одну вакцину дважды, эффект подавления вирусов вообще не наблюдался.

Для демонстрации того, что двунитевая структура РНК важна для адъювантного действия Poly(I:C), Poly(I:C) нагревали при 100°С в течение 5 минут и сразу охлаждали на льду; 1 мкг вводили интраназально наряду с вакциной. В результате, реакции IgA, которые наблюдались при 121 мкг/мл без денатурации, резко снизились до 21 мкг/мл, а реакция IgG крови снизилась с 1,5 мкг/мл до 0,7 мкг/мл.

Эффект подавления роста вирусов также больше не наблюдался после денатурации Poly(I:C).

Затем исследовали защитный эффект интраназальной вакцинации в комбинации с Poly(I:C) против пневмонии вследствие инфекции летальной дозой вируса гриппа. За 6 недель до этого интраназально вводили 1 мкг вакцины PR8 в комбинации с 10 мкг, 3 мкг или 1 мкг Poly(I:C); за 2 недели до этого выполняли бустерную иммунизацию одной вакциной; после инфекции 20 мкл 40 LD₅₀ вируса PR8, исследовали потенциал предотвращения пневмонии. У невакцинированной группы 5 из 5 мышей погибли в пределах 1 недели при легочном титре вирусов через 3 дня, достигающем 10⁶ pfu или более. Однако в группе вакцинации все мыши выжили при иммунизации комбинацией 1 мкг или более Poly(I:C). Результаты показаны ниже в таблице.

Таблица
Вакцинация	Провокационная проба (40 LD50)	Легочный вирусный титр (PFU/мл; 10n)	Количество выживших мышей/ тестируемых мышей
Первичная				Вторичная
PR8 (мкг)	Poly (I:C) (мкг)	PR8 (мкг)	Poly (I:C) (мкг)
1	10	1	10	A/PR8	<0*	5/5
1	10	1	-	A/PR8	Не определялось	5/5
1	3	1	-	A/PR8	Не определялось	5/5
1	1	1	-	A/PR8	Не определялось	5/5
1	СТВ*	1	СТВ*	A/PR8	<0*	5/5
-	-	-	-	A/PR8	6,2±5,4	0/5

Как показано выше, было обнаружено, что Poly(I:C) способен вызвать реакции IgA антител в слизистой оболочке, достаточные для создания защиты против инфекции в качестве адъювантов.

Пример 2: Защита против перекрестных инфекций с использованием интраназальных вакцин в комбинации с Poly(I:C)

В отношении защиты против вирусов гриппа, вызванной интраназальными гриппозными вакцинами в комбинации с Poly(I:C), были исследованы возможности защиты против перекрестных инфекций. Каждую из вакцин штаммов вируса гриппа подтипов, отличающихся от PR8, т.е. штамма H1N1 (A/Beijing), штамма H1N1 (Yamagata) и штамма H3N2 (A/Guizhou), наряду с 3 мкг Poly(I:C), вводили для первой иммунизации; через 4 недели вводили вакцину того же штамма отдельно; через 2 недели животных инфицировали 100 pfu штамма H1N1 (A/PR8); через 3 дня измеряли IgA, проявляющий перекрестные реакции с PR8 в промывных жидкостях носовой полости, и IgG в сыворотке, и исследовали защиту против перекрестных инфекций, используя вирус PR8.

Как показано на фиг.3 и 4, реакции и IgA, и IgG наблюдались для штамма H1N1 (A/Beijing) и штамма H1N1 (A/Yamagata), которые относятся к одному и тому же подтипу; вирусная инфекция была полностью подавлена. Для штамма H3N2 (A/Guizhou), который относится к другому подтипу, небольшие количества IgA и IgG проявили перекрестные реакции; наблюдалась частичная защита против вирусных инфекций.

Следовательно, была верифицирована защита против перекрестных инфекций при использовании интраназальных гриппозных вакцин в комбинации с Poly(I:C).

Пример 3: Безопасность Poly(I:C) для центральной нервной системы

Когда Poly(I:C) используется в качестве интраназальной вакцины для человека, важна безопасность для центральной нервной системы ввиду близости носовой полости к мозгу. Имея это ввиду, была предпринята попытка внутримозговой инокуляции мышам BALB/c для верификации безопасности Poly(I:C). 0,25 мкг, 2,5 мкг или 25 мкг Poly(I:C) растворяли в 25 мкл PBS, и внутримозговую инокуляцию выполняли, используя шприц с двумя иглами. После инокуляции измеряли изменения массы тела и контролировали выживание. Для контроля 2,5 мкг, 10 мкг или 25 мкг СТВ* (СТВ, включающий 0,1% СТ) растворяли в 25 мкл PBS и выполняли внутримозговую инокуляцию таким же образом.

Как показано на фиг.5, все мыши во всех группах, подвергнутых внутримозговой инокуляции Poly(I:C), выжили в течение 2 недель или более с потерей массы тела на 5%, наблюдавшейся только в группе инокуляции 25 мкг. С другой стороны, в группах, получавших внутримозговую инокуляцию контрольным СТВ* (СТВ с 0,1% СТ), 1 из 5 животных при введении 10 мкг и 2 из 5 животных при введении 25 мкг погибли на 4 день при потери массы тела, достигающей 15%.

Обсуждение

Из результатов большого количества исследований очевидно, что секреторные IgA антитела в слизистой оболочке более эффективны в защите против инфекций вирусом гриппа, чем IgG антитела, индуцированные имеющимися в настоящее время вакцинами. Хотя интраназальные вакцины эффективны в индукции IgA в слизистой оболочке, несмотря на множественные попытки, еще небыли установлены адъюванты, которые можно использовать у людей. Poly(I:C), синтетическая двунитевая РНК, которая успешно вводилась людям внутривенной инъекцией, эффективна в индукции IgA и считается, что ее можно использовать для применения у людей в качестве адъюванта для интраназальных вакцин.

Судя по результатам экспериментов этого примера, Poly(I:C), очень полезна в качестве адъюванта для интраназальных вакцин, которые эффективны в защите против инфекций вирусом гриппа в слизистых оболочках. Кроме того, вероятно также применение вакцин слизистых оболочек для других патогенов.

Специфические IgA антитела, секретируемые из слизистой, высокоэффективны в защите против таких респираторных инфекций, как грипп. Защита против перекрестных инфекций различными типами вируса обеспечивается главным образом IgA-антителами, секретируемыми в слизистой; у человека, достигшего выздоровления при спонтанном заражении гриппом, есть такое индуцированное IgA-антитело, и, следовательно, он приобретает устойчивость к инфекциям при эпидемии, вызванной таким же подтипом мутантных вирусов. Хотя имеется вакцинация в качестве способа защиты против инфекций у неинфицированных индивидов, имеющиеся в настоящее время вакцины для подкожной прививки не вызывают иммунных реакций слизистых оболочек; существует необходимость в разработке более эффективной вакцины, имеющей потенциал защиты против перекрестных инфекций. Хотя имеется способ интраназальной прививки антигеном для индукции секреторного IgA в слизистой оболочке, при прививке одним антигеном не наблюдают достаточных реакций антител; для достижения более эффективных иммунных реакций одновременно с вакциной необходимо ввести адъювант.

В этом примере авторы продемонстрировали секрецию IgA в слизистой оболочке носовой полости, реакции IgG в сыворотке и защиту против инфекций летальными количествами вирусов гриппа при использовании Poly(I:C), синтетической двунитевой РНК в качестве адъюванта, эффективного в индукции иммунитета слизистой.

Итоговые иммунные реакции включали в себя индукцию антител против вирусов различных подтипов из штамма вакцины, а также защиту против инфекций вирусами различных подтипов из штамма вакцины; был верифицирован потенциал защиты против перекрестных инфекций. Также при рассмотрении применения интраназальных вакцин у человека обеспокоенность вызывает безопасность адъюванта. Поскольку интраназальная прививка, путь введения, использованный в данном примере, включает участок введения, очень близко расположенный к центральной нервной системе, Poly(I:C) в количестве от 0,25 мкг до 25 мкг/мышь вводили путем внутримозговой инокуляции для оценки его воздействия и безопасности в отношении нервной системы. В результате при введении контрольного холерного токсина (СТВ), который получали добавлением 0,1% цельного токсина к субъединице В холерного токсина, некоторые мыши погибли на 4 день (1 из 5 в группе дозы 10 мкг, 2 из 5 в группе дозы 25 мкг) при наблюдавшейся потере массы тела 15% или более, тогда как в группах введения дозы Poly(I:C) все мыши выжили в течение 8 дней при потере массы тела лишь около 5%, преходяще наблюдавшейся в группе прививки дозой 25 мкг; не было случаев смерти, и безопасность была подтверждена даже при избыточном количестве внутримозговой инокуляции.

Хотя имеющиеся в настоящее время инактивированные гриппозные вакцины НА представляют собой эффективные вакцины, их потенциалы индукции IgA-антитела в эпителии слизистой оболочки дыхательных путей, которые являются вратами, через которые вирус гриппа попадает в организм, низкие; поэтому считается, что улучшение потенциалов обеспечивают возможность дальнейшего усиления эффектов вакцин. Эксперименты в этом примере показали, что вирус-специфический IgA эффективно индуцируется на поверхности слизистой оболочке, когда имеющиеся в настоящее время инактивированные гриппозные вакцины НА, наряду с Poly(I:C), добавляемым в качестве адъюванта, вводятся интраназально. Также эксперименты на мышах свидетельствовали о том, что предотвращаются фатальные инфекции вследствие провокационной пробы с вирусом, и что вакцины также эффективны против провокационной пробы другими штаммами вирусов.

Также, в отношении возможности применения, в дополнение к вирусу гриппа, Poly(I:C), вероятно, можно использовать в качестве адъюванта для инактивированных антигенных вакцин патогенов, которые инфицируют через слизистые оболочки дыхательных путей и других органов (вируса ветряной оспы, вируса кори, вируса эпидемического паротита, вируса полиомиелита, ротавируса, коронавируса, аденовируса, вируса герпеса, вируса краснухи, вируса SARS, ВИЧ, Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae типа b, Streptococcus pneumoniae и Vibrio cholerae и подобных им).

Пример 4: Профилактический эффект инактивированных вирусных частиц, используемых в качестве интраназальной гриппозной вакцины в комбинации с Poly(I:C)

Возможность использования интраназальной вакцины в комбинации с Poly(I:C) был верифицирован не только для имеющихся в настоящее время обработанных простым эфиром НА (вакцина расщепленного продукта), но также для другой формы вакцины.

Материалы: Обработанная простым эфиром НА вакцина (продуцируемая Фонд исследований микробных заболеваний Университета Осаки), инактивированная формалином вакцина из цельных частиц вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1) (продуцируемая Фонд исследований микробных заболеваний Университета Осаки)

Мыши: мыши BALB/c (возраст 6 недель, самки)

Способ

Инактивированную формалином вакцина из цельных частиц вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1) (0,1 мкг) в качестве вакцинного компонента интраназальной гриппозной вакцины в комбинации с Poly(I:C) (100-1000 пар оснований, Sigma) (0,1 мкг) вводили мышам BALB/c (возраст 6 недель, самки); через 3 недели ту же вакцину вводили второй раз.

Через 1 неделю измеряли реакции антител на НА и NA в промывных жидкостях носовой полости и сыворотке, полученных у мышей, в качестве индикаторов соответственно иммунитета слизистых оболочек и системного иммунитета.

Результаты

Также, когда инактивированные, цельные вирусные частицы использовались в качестве вакцинного компонента интраназальной гриппозной вакцины в комбинации с Poly(I:C), и защитный иммунитет слизистой оболочки, и системный защитный иммунитет усиливались.

Более того, даже когда использовали каждую из вакцин и Poly(I:C) в количестве 0,1 мкг, комбинация вызывала реакции, эквивалентные реакциям, наблюдавшимся в группе положительного контроля активности адъюванта, который, как ожидалось, обеспечивает полную защиту против вирусных инфекций с использованием вакцины расщепленного продукта в комбинации с СТВ*. Кроме того, эти реакции были выше, чем реакции, наблюдавшиеся при использовании вакцины расщепленного продукта в комбинации с Poly(I:C). Поэтому было очевидно, что интраназальную вакцину в комбинации с Poly(I:C) можно было использовать не только когда вакцина расщепленного продукта применялась отдельно, но также когда использовалась другая форма вакцины (фиг.6).

Пример 5: Молекулярные размеры Poly(I:C) в качестве адъюванта для интраназальной гриппозной вакцины

Исследовали молекулярные размеры Poly(I:C), которые можно использовать для адъюванта интраназальной гриппозной вакцины.

Материалы

Вирус: вирус A/New Caledonia/20/99 (H1N1)

Размеры Poly(I:C): (L) 10-300 пар оснований (Fluka), (M) 100-1000 пар оснований (Sigma), (H) >3,3×10⁶ пар оснований (Fluka)

Мыши: мыши BALB/c (возраст 6 недель, самки)

Способ

Вакцина расщепленного продукта вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1) (0,4 мкг), наряду с 0,1 мкг различных размеров Poly(I:C): (L) 10-300 пар оснований (Fluka), (M) 100-1000 пар оснований (Sigma), (H) >3,3×10⁶ пар оснований (Fluka), вводили интраназально мышам BALB/c (возраст 6 недель, самки); через 3 недели ту же вакцину вводили второй раз. Через 1 неделю измеряли реакции антител на НА и NA в промывных жидкостях носовой полости и сыворотке мышей как показатели соответственно иммунитета слизистых оболочек и системного иммунитета.

Результаты

В экспериментальной группе с использованием Poly(I:C) с размером молекул 10-300 пар оснований, наблюдались меньшие иммунные реакции, чем в двух других группах. Поэтому считается, что Poly(I:C) с размерами молекул примерно 300 пар оснований или более можно использовать в качестве адъюванта для интраназальной гриппозной вакцины (фиг.7).

Пример 6: Адъювантное действие не Poly(I:C) двунитевой РНК

Действие Poly(I:C) в качестве адъюванта для интраназальных гриппозных вакцин сравнивали с Poly(A:U), другой двунитевой РНК, и Poly(A,U), однонитевой РНК.

Материалы

Субъединица: Очищенная НА

Адъюванты: Poly(I:C), Poly(A:U) и Poly(A,U).

Способ

Молекулу НА очищали из вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1), используя колонку, соединенную со специфическим моноклональным антителом против НА и 1 мкг его наряду с 1 мкг Poly(A:U) (Sigma) или однонитевой РНК Poly(A,U) (Sigma) вводили интраназально мышам BALB/c (в возрасте 6 недель, самкам); через 3 недели одну НА вводили во второй раз. Через 1 неделю измеряли реакции антител на НА в промывных жидкостях носовой полости и сыворотке мышей как показатели соответственно иммунитета слизистых оболочек и системного иммунитета.

Результаты

Адъювантную активность наблюдали также при использовании Poly(A:U) и однонитевой РНК Poly(A,U). По сравнению с адъювантной активностью Poly(I:C), Poly(A:U) и однонитевая РНК Poly(A,U) были менее активны в этом порядке (фиг.8). Следовательно, было верифицировано, что не Poly(I:C) двунитевая РНК также проявляет адъювантную активность при использовании в комбинации с интраназальной гриппозной вакциной.

Пример 7: Индукция защитного иммунитета некоторыми субъединицами вируса гриппа в условиях интраназального введения в комбинации с Poly(I:C)

Было подтверждено, что в условиях интраназального введения в комбинации с Poly(I:C) некоторые субъединицы вируса гриппа вызывают защитный иммунитет.

Материалы

Субъединицы: HA, NA, M1 и NP

Адъювант: Poly(I:C) (100-1000 пар оснований, Sigma)

Мыши: мыши BALB/c (возраст 6 недель, самки)

Способ

Сравнивали возможности индукции защитного эффекта субъединиц HA, NA, M1 и NP вируса гриппа, введенных интраназально наряду с Poly(I:C). В частности, молекулы HA, NA, M1 и NP очищали из вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1) с использованием колонки, сопряженно связанной со специфическим анти-моноклональным антителом; порцию 1 мкг каждого очищенного продукта вводили интраназально наряду с 1 мкг Poly(I:C) (100-1000 пар оснований, Sigma) мышам BALB/c (в возрасте 6 недель, самкам); через 3 недели каждый вид молекул вводили во второй раз. Через 1 неделю измеряли реакции антител на каждый вид молекул в промывных жидкостях носовой полости и сыворотке мышей как показатели соответственно иммунитета слизистых оболочек и системного иммунитета.

Результаты

Было показано, что Poly(I:C) усиливал иммунные реакции слизистой оболочки и системные иммунные реакции на все субъединицы. Однако хотя профилактический эффект был увеличен усилением гуморального иммунитета против НА и NA, профилактический эффект нельзя было увеличить путем усиления гуморального иммунитета против NP. Следовательно, было обнаружено, что НА и NA являются сильными защитными антигенами и что возможность индукции профилактического эффекта различается среди различных субъединиц.

Пример 8: Частота и интервал введения, которые увеличивают эффективность интраназальной гриппозной вакцины в комбинации с Poly(I:C)

Определяли частоту и интервал введения, которые увеличивали эффективность интраназальной гриппозной вакцины в комбинации с Poly(I:C).

Материалы

Вакцина: вакцина расщепленного продукта вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1) (1 мкг)

Адъювант: Poly(I:C) (100-1000 пар оснований, Sigma)

Мыши: мыши BALB/c (возраст 6 недель, самки)

Способ

Для определения частоты и интервала введения, которые увеличивают эффективность интраназальной гриппозной вакцины в комбинации с Poly(I:C), вакцину расщепленного продукта вируса A/New Caledonia/20/99 (H1N1) (1 мкг) наряду с 1 мкг Poly(I:C) (100-1000 пар оснований, Sigma) вводили интраназально мышам BALB/c (возраста 6 недель, самкам); через 1, 3, 4 и 6 недель ту же вакцину вводили второй раз. Через 1 или 2 недели измеряли реакции антител на НА и NA в промывных жидкостях носовой полости и сыворотке мышей как показатели, соответственно, иммунитета слизистых оболочек и системного иммунитета. Дополнительные экспериментальные группы распределяли для введения только однократно и для исследования через 1 и 8 недель.

Результаты

Введение 2 или более раз с интервалом в 1 неделю или более было эффективно при увеличении эффективности интраназальной гриппозной вакцины в комбинации с Poly(I:C) (фиг.9).

Пример 9: Профилактический эффект интраназальной гриппозной вакцины в комбинации с Poly(I:C) у человека

Эффективность интраназальной гриппозной вакцины в комбинации с Poly(I:C) у человека подтверждается на основании реакций противогриппозных антител.

Материалы

Вакцина: Имеющаяся в настоящее время трехвалентная гриппозная вакцина [вакцина расщепленного продукта, полученная из трех вирусных штаммов A/New Caledonia (H1N1), A/Panama (H3N2) и В/Shangdong] (Фонд исследований микробных заболеваний Университета Осаки)

Адъювант: Poly(I:C) (100-1000 пар оснований, Sigma)

Субъекты

2 и более здоровых человек

Способ

300 мкл (по 150 мкл в каждую из левой и правой половин носовой полости) жидкости, содержащей 400 мкг/мл трехвалентной вакцины, и 700 мкг/мл Poly(I:C) вводят распылением здоровым взрослым людям; через 4 недели ту же жидкость вводят снова. Через 2 недели после повторного введения берут материалы слюны и сыворотки и анализируют на наличие реакции антител на НА и NA. Путем сравнения титров антител перед введением и после двукратного введения оценивают возможность индукции реакции антител этой интраназальной вакцины.

Результаты

В слюне субъектов наблюдается увеличение содержания IgA антител против трех штаммов в вакцине.

У некоторых субъектов также наблюдается увеличение содержания анти-NA-IgG антител в сыворотке.

Пример 10: Усиление иммунного потенциала интраназальным введением коклюшной вакцины наряду с Poly(I:C)

Усиление иммунного потенциала было подтверждено, когда вакцину, применяемую по поводу коклюша, негриппозного инфекционного заболевания, вводили интраназально наряду с Poly(I:C).

Материалы

Вакцина: коклюшная вакцина (выпускаемая Фондом исследований микробных заболеваний Университета Осаки)

Адъювант: Poly(I:C) (100-1000 пар оснований, Sigma)

Мыши: мыши BALB/c (возраст 6 недель, самки)

Способ 1

Коклюшную вакцину (выпускаемую Фондом исследований микробных заболеваний Университета Осаки) (1-3 мкг), наряду с 0,1-10 мкг Poly(I:C) (100-1000 пар оснований, Sigma) вводили интраназально мышам BALB/c (в возрасте 6 недель, самкам); через 3 недели ту же вакцину вводили второй раз. Через 1 неделю после второго введения реакции антител на коклюшную вакцину в промывных водах носовой полости и сыворотке мышей измеряли способом ELISA и использовали в качестве показателей защитного иммунитета слизистых оболочек и системного иммунитета.

Результаты

Poly(I:C) также увеличивал защитный иммунитет против коклюшной вакцины, и свидетельствовал также о его эффективности в плане усиления защитного иммунитета вакцин против инфекций, отличных от гриппа (фиг.10).

Способ 2

Коклюшную вакцину (выпускаемую Фондом исследований микробных заболеваний Университета Осаки) (1-3 мкг), наряду с 0,1-10 мкг Poly(I:C) (100-1000 пар оснований, Sigma) вводили интраназально мышам BALB/c (в возрасте 6 недель, самкам); через 3 недели ту же вакцину вводили второй раз. Через 1 неделю после второго введения реакции антител на коклюшную вакцину в промывных водах носовой полости и сыворотке мышей измеряли способом ELISA и использовали в качестве показателей защитного иммунитета слизистых оболочек и системного иммунитета. Через 2-3 недели после второго введения вирулентный штамм Bordetella pertussis вводили в мозг или носовую полость (орошением) каждой иммунизированный мыши, и животных наблюдали в течение 14 дней; эффекты оценивали по выживаемости иммунизированных мышей.

Результаты

Судя по выживаемости мышей, было верифицировано, что Poly(I:C) также увеличивает защитный иммунитет против коклюшной вакцины и также эффективен в плане усиления защитного иммунитета вакцин против инфекций, отличных от гриппа.

Пример 11: Профилактический эффект вакцины против ветряной оспы, введенной интраназально наряду с Poly(I:C) человеку

Для оценки безопасности и эффективности интраназальной живой вакцины против ветряной оспы в комбинации с Poly(I:C), введенной бустерным введением взрослым людям выполняют прививку через слизистую оболочку носовой полости, и гуморальный иммунитет и клеточный иммунитет сравнивают с группой, получающей интраназальную прививку одной вакциной против ветряной оспы.

Материалы

Вакцина: живая вакцина против ветряной оспы (выпускаемая Фондом исследований микробных заболеваний Университета Осаки)

Адъювант: Poly(I:C) (100-1000 пар оснований, Sigma)

Здоровые люди: от 2 до нескольких субъектов на группу

Способ

Физиологический солевой раствор для инъекций добавляют в 2 флакончика/человека с живой вакциной против ветряной оспы, и этот раствор вводится интраназально здоровым взрослым людям с использованием распылителя. Также распылением вводят 300 мкл (по 150 мкл в каждую из левой и правой половин носовой полости) вакцинной жидкости, содержащей имеющуюся в настоящее время вакцину и Poly(I:C) (100-1000 пар оснований, Sigma). Измерением гуморального иммунитета и клеточного иммунитета верифицируют профилактические эффекты.

Результаты

Poly(I:C) также увеличивает защитный иммунитет живой вакцины против ветряной оспы и свидетельствует также о его эффективности в плане усиления защитного иммунитета вакцин против инфекционных заболеваний, отличных от гриппа.

Хотя настоящее изобретение было проиллюстрировано посредством предпочтительных вариантов осуществления описанного выше изобретения, понятно, что объем настоящего изобретения должен ограничиваться только объемом формулы изобретения. Следует понимать, что все положения патентов, патентных заявок и документов, приведенных в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение предоставляет форму вакцины, которая обеспечивает возможность легкого способа вакцинации путем введения через слизистую оболочку и получения перекрестного иммунитета. Посредством этого, в качестве мер борьбы против вирусов гриппа можно получить эффективную вакцину, которая, вероятно, будет широко использоваться для обеспечения профилактических мер в фармацевтической и других отраслях промышленности.

1. Применение вакцины против вируса гриппа для введения через слизистую, включающей
a) двунитевую РНК, включающую Poly (I:C); и
b) субъединичный антиген или инактивированный антиген вируса гриппа.

2. Применение по п.1, где указанная слизистая включает в себя слизистую носовой полости.

3. Применение по п.1, где указанная субъединица включает в себя по меньшей мере одну субъединицу, выбранную из группы, состоящей из субъединиц НА, NA, M1, М2, NP, PB1, РВ2, РА и NS2 вируса гриппа.

4. Применение по п.1, где указанная двунитевая РНК присутствует в концентрации, достаточной для выработки серкеторного IgA.

5. Применение по п.1, где указанная двунитевая РНК присутствует в концентрации от 0,1 до 10 мг/мл.

6. Применение по п.1, где размер указанной двунитевой РНК составляет от 10² до 10⁸ пар оснований.

7. Применение по п.1, где указанная субъединица включает в себя по меньшей мере NA или НА.

8. Способ предотвращения гриппа, включающий в себя
стадию введения через слизистую по меньшей мере однократно вакцины для введения через слизистую, включающей в себя
a) двунитевую РНК, включающую Poly (I:C); и
b) субъединичный антиген или инактивированный антиген вируса гриппа.

9. Способ по п.8, где указанную вакцину вводят по меньшей мере дважды.

10. Способ по п.8, где указанную вакцину вводят с интервалом по меньшей мере 1 неделю или более.