Способ приготовления бактериального удобрения на основе бактерий рода azotobacter

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть реализовано в микробиологической промышленности для получения различных бактериальных удобрений. Способ включает культивирование бактерий на плотной среде Эшби, отличающийся тем, что предварительно из жидких элективных культур выделяют свободные аэробные азотофиксаторы с последующим их культивированием в чистые культуры на плотной питательной среде. Из чистых культур отбирают наиболее активно развивающиеся штаммы и переносят их в жидкую питательную среду, не содержащую азот. В полученную устойчивую бактериальную суспензию, стимулирующую рост сельскохозяйственных растений, добавляют микробиологический препарат на основе бактерий рода Псеводомонад и почвенный фильтрат. Все тщательно перемешивают, затем добавляют профильтрованную среду Эшби для азотобактера и олигонитрофилов с раствором микроэлементов по Федорову и осуществляют культивирование в ферментере при температуре 22-28°C при скорости вращения мешалки 180 об/мин в течение 10 суток - 4 раза в сутки по 2 часа. Изобретение позволяет получить устойчивую, хорошо тиражируемую бактериальную суспензию на исключительно синтетических средах. 4 ил., 1 табл.

 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и может быть реализовано в микробиологической промышленности для получения различных бактериальных удобрений.

Широко известно использование штаммов азотобактера при производстве удобрений для стимуляции роста и повышения хозяйственной продуктивности сельскохозяйственных растений, произрастающих на обедненных азотом почвах.

Микробная ассоциация обладает определенными морфологическими, биохимическими и физиологическими характеристиками, способна длительное время (в течение периода вегетации) функционировать в песчаной почве, обеспечивая нормальный рост и развитие таких сельскохозяйственных культур, как томат и огурец.

Микробная ассоциация в питательном растворе (далее суспензия) представляет собой бурую, достаточно прозрачную жидкость без опалесценции (рН 6,9-7,2), с едва заметным земляным запахом, без определенного вкуса. Суспензия способна хранится при комнатной температуре без видимых изменений более 1 месяца (затем на ее поверхности начинает нарастать бело-серая пленка, структура которой под микроскопом дает основание предполагать, что она образована ассоциацией аэробных бактерий, которые присутствовали в суспензии), в холодильнике около года. В состав микробной ассоциации входят представители следующих родов Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, Arthrobacter, Cellnmonas, Clostridium, Azotobacter, Azomonas (Краткий определитель бактерий Берги, 1980) и цианобактерии порядков Chroococcales, Nostocales. Микробная ассоциация хорошо закрепляется в песчаной почве, способна к свободной азотофиксации, быстро размножается, разрастаясь в виде буро-зеленого налета.

Известен штамм Azotobacter chroococum, используемый для получения бактериального удобрения под огурцы (пат. РФ №2074157, кл. C05F 11/08 2002 г. - аналог), включающий штамм бактерий Azotobacter chroococum ВКПМ-6012.

Недостатком данного штамма является относительно низкая конкурентная способность по сравнению с другими микроорганизмами, которые могут его вытеснять, а также и низкая ростовая активность. За счет этого он не может обеспечить необходимым количеством азота в почвах им обедненных такую требовательную к азоту культуру, как огурец.

В качестве прототипа может быть рассмотрен способ приготовления бактериального удобрения на основе бактерий рода Azotobacter (пат. РФ №2286324, кл. C05F 11/08, 2005 г.), включающий приготовление бактериального удобрения путем предварительного культивирования бактерий на питательной среде.

Недостатком данного прототипа является то, что добавляют к синтетическим средам Берка и Эшби элементы натуральной питательной среды, а именно кормовые дрожжи и не в постоянной концентрации, что не позволяет со 100% гарантией тиражировать один и тот же результат культивирования бактерий.

Техническим результатом данного изобретения является приготовление устойчивой, хорошо тиражируемой бактериальной суспензии на исключительно синтетических средах.

Этот результат достигается тем, что в способе приготовления бактериального удобрения на основе бактерий рода Azotobacter, включающем культивирование бактерий на плотной среде Эшби, предварительно из жидких элективных культур выделяют свободные аэробные азотофиксаторы с последующим их культивированием в чистые культуры на плотной питательной среде, из чистых культур отбирают наиболее активно развивающиеся штаммы и переносят их в жидкую питательную среду, не содержащую азот, в полученную устойчивую бактериальную суспензию, стимулирующую рост сельскохозяйственных растений, добавляют микробиологический препарат на основе бактерий рода Псеводомонад и почвенный фильтрат, представляющий собой жидкость, полученную после фильтрации надосадочной части раствора черноземной почвы в воде, через бумажный фильтр и фильтр Беркефельда, все тщательно перемешивают, затем добавляют профильтрованную среду Эшби для азотобактера и олигонитрофилов с раствором микроэлементов по Федорову и осуществляют культивирование в ферментере при температуре 22-28°С и скорости вращения мешалки 180 об/мин в течение 10 суток - 4 раза в сутки по 2 часа.

Примеры приготовления бактериального удобрения

Пример 1

Способ заключается в получении устойчивой ассоциации почвенных микроорганизмов, обладающих ярко выраженной способностью к свободной азотофиксации и хорошо приживающихся в легких почвенных смесях, обедненных азотом.

Микробную ассоциацию, условно «Стим», получаем за счет создания в ферментере «Биореактор З» сообщества микроорганизмов, а именно суспензии, стимулирующей рост сельскохозяйственных растений.

Из почвенных образцов (черноземы Мичуринского района) в жидких элективных культурах выделили свободные аэробные азотофиксаторы и осуществили пересев их на твердую питательную среду, выделили их в чистую культуру. Затем в чистых культурах на плотной питательной среде их культивировали. Потом бактерии были идентифицированы (без выделения 16S РНК). Из чистых культур были отобраны наиболее активные развивающиеся штаммы, которые были перенесены в жидкую питательную среду (без азота) и через несколько пересевов получена устойчивая бактериальная суспензия, в состав которой входили представители родов Azotobacter и Azomonas, причем бактерии рода Azotobacter составили не менее 70% от общей численности микробов.

Полученная суспензия хорошо пересевается, стабильно растет при комнатной температуре без постоянного встряхивания.

Суспензия представляет собой бурую, достаточно прозрачную жидкость без опалесценции (рН 6,9-7,2) с едва заметным земляным запахом.

Затем в 2 литровую колбу вносим 100 мл полученной суспензии, 15 мл препарата на основе бактерий рода Псеводомонад - Байкал М-1 (ТУ 9291-001-507-10575-00) и 100 мл почвенного фильтрата (1 кг черноземной почвы залили 5 литрами теплой воды, тщательно перемешали, затем дважды профильтровали через двойной фильтр и отобрали нужное количество жидкости), все тщательно перемешали и довели объем жидкости до литра средой Эшби для азотобактера и олигонитрофилов с раствором микроэлементов по Федорову, затем осуществили культивирование в ферментере «Биореактор 3» при температуре 22-28°С, при скорости вращения мешалки 180 об/мин.

Вращение проводили периодически по 2 часа только в дневное время суток в течение 10 суток. Следует отметить, что в опытах с более длительным культивированием в ферментере микробного консорциума после слива культуры на лопастях мешалки образуется рыхлый, обильно циано-бактериальный налет.

Сразу же после культивирования «Стим» профильтровали через двойной бумажный фильтр, затем в фильтрате замачивали на 4 часа семена и проращивали во влажной камере в чашках Петри. В качестве биологических объектов были взяты семена огурца, томата, капусты, укропа. Через 7 дней после замачивания в воде и «Стим» были получены следующие результаты (таблица).

Пример 2

Аналогично примеру 1, но вместо препарата «Байкал М-1» добавляют препарат «Восток» (ТУ 92-91001654-51587-05).

Пример 3

Аналогично примеру 1, но полученную смесь культивируют в ферментере «Биореактор 3» при температуре 28°С.

В качестве биологических объектов были взяты семена огурца, томата, капусты, укропа. Через 7 дней после замачивания семян были получены следующие результаты (таблица).

Культуры	Среднее количество проросших семян, шт
По патенту №2286324	«Стим»
Огурец	11	19
Томат	12	18
Капуста	15	19
Укроп	10	19

Данные таблицы свидетельствуют о том, что семена разных видов растений положительно реагируют на воздействие «Стим».

Развитие проростков огурца под влиянием препарата проходит намного активнее. Интенсивность роста повышается.

Опыты по влиянию препарата на рост и развитие растений огурца на песке также подтвердили стимулирующее действие препарата (фиг.1-4). Без внесения в песок суспензии растения огурца развивались плохо, не цвели и не плодоносили (фиг.3). Двукратное внесение в почву суспензии дало возможность, требовательной к азоту культуре, активно расти и даже плодоносить (фиг.2).

Способ приготовления бактериального удобрения на основе бактерии рода Azotobacter, включающий культивирование бактерий на плотной среде Эшби, отличающийся тем, что предварительно из жидких элективных культур выделяют свободные аэробные азотофиксаторы с последующим их культивированием в чистые культуры на плотной питательной среде, из чистых культур отбирают наиболее активно развивающиеся штаммы и переносят их в жидкую питательную среду, не содержащую азот, в полученную устойчивую бактериальную суспензию, стимулирующую рост сельскохозяйственных растений, добавляют микробиологический препарат на основе бактерий рода Псеводомонад и почвенный фильтрат представляющий собой жидкость, полученную после фильтрации надосадочной части раствора черноземной почвы в воде, через бумажный фильтр и фильтр Беркефельда, все тщательно перемешивают, затем добавляют профильтрованную среду Эшби для азотобактера и олигонитрофилов с раствором микроэлементов по Федорову и осуществляют культивирование в ферментере при температуре 22-28°С при скорости вращения мешалки 180 об/мин в течение 10 сут - 4 раза в сутки по 2 ч.