Средство, обладающее москитоцидными свойствами

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в качестве средства борьбы с кровососущими комарами. Способ предусматривает выращивание штамма гриба Calcarisporium arbuscula F-80, депонированного в коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ) на плотной питательной среде Чапека+ при температуре 23°С в течение 12 дней до образования сплошного воздушного мицелия со взрослыми колониями с последующим культивированием при той же температуре на среде, содержащей соевую муку, дрожжевой экстракт, глюкозу, KH₂PO₄, Mg₂SO₄ в течение 4 дней до образования бластоспор. Полученную культуральную жидкость центрифугируют с получением фугата. Полученный фугат экстрагируют хлористым метиленом на жидкость-жидкостном экстракторе непрерывного действия в течение 36 часов. Полученный экстракт очищают растворителями различной полярности (гексаном, хлороформом, этилацетатом, метанолом) с последующим хроматографированием на флеш-хроматографии и последующим хроматографированием на жидкостном хроматографе высокого давления с получением Ауровертина «В», обладающего москитоцидными свойствами. Изобретение позволяет расширить ассортимент средств для создания москитоцидных препаратов. 4 табл.

 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии.

Кровососущие комары являются переносчиками более 150 возбудителей болезней человека и теплокровных животных. Они являются единственными переносчиками таких болезней, как малярия, желтая лихорадка, лихорадка Денге, и главными переносчиками в передаче некоторых филярий и вирусных энцефалитов. Одним из путей снижения риска заболевания человека и животных трансмиссивными болезнями является контроль численности кровососущих комаров. Основным профилактическим средством борьбы с комарами является применение инсектицидных препаратов.

Известны химические средства борьбы с кровососущими комарами: карбаматы (пропоксур), фосфорорганические (малатион, темефос, фенитротион, фенатион), пиретроиды [1].

Интенсивное применение химических инсектицидов приводит к загрязнению окружающей среды и к возникновению резистентности к действующему веществу инсектицидов у большинства видов кровососущих комаров.

Известны биологические москитоцидные препараты на основе бактерий Bacillus thuringiensis israelensis и Bacillus sphaericus. Преимущество биопрепаратов перед химическими инсектицидами заключается в их селективности действия, безопасности для людей и теплокровных животных, нецелевых насекомых, гидробионтов.

Однако бактериальные москитоцидные препараты на основе Bacillus sphaericus не активны против многих видов комаров, включая переносчиков малярии. Повсеместное применение бактериальных инсектицидов привело к появлению резистентных популяций комаров [2].

Известны примеры использования грибов родов Lagenidium, Coelomomyces и Culicinomyces для борьбы с личинками кровососущих комаров [3]. Грибы родов Coelomomyces и Culicinomyces имеют существенный недостаток, заключающийся в необходимости их культивирования на живых организмах. В связи с этим они не могут быть наработаны в больших количествах для широкого применения. Другим недостатком этих грибов является заметные колебания эффективности из-за сложного цикла развития гриба в природе.

Известен москитоцидный препарат Лагинекс, выпускаемый в США с 1999 года на основе штамм гриба Lagenidium giganteum [4].

Недостатками этого препарата является то, что он неактивен против многих видов комаров, в частности против комаров рода Anopheles - переносчиков малярии. Активное начало препарата (зооспоры) токсичны для многих видов водной фауны.

Известны ауровертины А, В, С, Д. Е [5], продуцируемые штаммами гриба Calcarisporium arbuscula. Известно, что ауровертин "В" специфически связывается с Mg-зависимой митохондриальной АТФ-азой и является нейротоксином общего действия [6]. Поэтому ауровертин "В" нашел широкое применение в биохимических исследованиях как эффективный инструмент для изучения процессов окислительного фосфорилирования [6]. Недавно предложено использовать ауровертин "В" в качестве антимитотического средства для локализации злокачественных опухолей [7], в качестве антибиотика для лечения туберкулеза [8], в качестве ингибитора АТФ для лечения диабета [9], в качестве гербицида для уничтожения сорных растений [10]. Инсектицидные свойства ауровертина "В" не изучены.

Задачей изобретения является получение грибного метаболита ауровертина «В», активного против различных видов кровососущих комаров.

Поставленная задача решается тем, что предлагаемый метаболит ауровертин "В", продуцируемый штаммом гриба Calcarisporium arbuscula F-80, обладает москитоцидными свойствами.

Предлагаемый метаболит активен против различных видов кровососущих комаров, в том числе против комаров рода Anopheles - переносчиков малярии.

Сущность изобретения заключается в том, что ауровертин «В» выделяют из биомассы гриба Calcarisporium arbuscula F-80.

Штамм гриба Calcarisporium arbuscula выделен в 2004 году из образцов почвы Тверской области и отобран для исследования его москитоцидных свойств путем скрининга 180 штаммов 48 родов микромицетов из рабочей коллекции ГНЦ ПМБ.

Штамм гриба Calcarisporium arbuscula депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ), Оболенск, Московской области, коллекционный номер F-80.

Штамм характеризуется следующими признаками

Культурально-морфологические признаки.

Штамм гриба Calcarisporium arbuscula F-80 адаптирован к типовым средам для культивирования грибов (среды Чапека, Сабуро). На плотной агаризованной среде колонии умеренно быстро растущие, от белых до желтоватых. Колонии достигают диаметра 30 мм на седьмой день при 24°С; оптимум роста 18-24°С. Воздушный мицелий обильный. Обратная сторона колонии от желтоватой до темно-коричневой. Вегетативные гифы бесцветные, гладко- и тонкостенные, рыхлые. Конидиофоры вертикально поднятые, бесцветные, гладкостенные, часто слегка шероховатые у основания, несущие в верхней части несколько мутовок конидиогенных клеток. Конидиогенные клетки вытянутые, наиболее широкие в основании (2,5-3,1 µм) и постепенно суживающиеся к вершине, имеющей скопление длинных, несущих конидии зубчиков (общей длиной 10-25 µм). Конидии продолговатые, бесцветные, гладко- и тонкостенные, от яйцевидной формы с уменьшением к основанию до веретенообразных (1,8-3,2×5-9 µм). На среде, состоящей из овсяного агара, конидиофоры такого типа обычно исчезают после нескольких лет культивирования. Конидиогенные клетки, а часто также и конидии становятся более вытянутыми и узкими. Штамм гриба Calcarisporium arbuscula F-80 хорошо развивается в глубинной культуре на жидкой питательной среде, состоящей из соевой муки, дрожжевого экстракта, глюкозы и набора солей (таблица 1).

Таблица 1
Характеристика глубинной культуры штамма гриба Calcarisporium arbuscula F-80
Возраст культуры, сутки	Параметры культуральной жидкости
	pH	Сухой вес, г/л	Морфология культуры
1	6,81	20,4	Молодой растущий мицелий
2	6,92	22,6	Единичные конидии, образование фиалид, мицелий септирован, средней толщины, слабо ветвящийся
3	7,56	24,8	Конидии разной формы и размеров, в основном овальной формы, 70% конидий имеют заострения с одной стороны, гифы средней толщины, слабо ветвящиеся, густо переплетенные, образуют небольшие скопления. Размер конидий: ширина 2-2,5 мкм, длина - от 2,5 до 5,0 мкм. Толщина гифов 1,5-2,5 мкм.
4	7,86	26,7	Конидии разной формы с включениями, в гифах образуются жировые включения
5	8,22	25,4	Конидии разной формы с включениями, в гифах много жировых включений
6	8,27	25,1	То же
7	7,30	24,9	Начало лизиса мицелия
8	8,15	23,6	Продолжение лизиса мицелия
9	8,12	22,7	То же
10	8,10	22,3	То же

Данные динамики развития культуры показывают, что максимальный вес сухой биомассы гриба наблюдается на 4-е сутки роста и составляет 26,7 г/л. На седьмые сутки роста наблюдают начало лизиса мицелия и снижение веса биомассы. Резких изменений pH культуральной жидкости не наблюдается, что говорит о сбалансированности компонентов питательной среды. Морфологически культура состоит из свободных конидий овальной формы и разветвленного мицелия, который начинает лизировать с седьмых суток культивирования.

Биохимические признаки гриба Calcarisporium arbuscula F-80

Штамм F-80 утилизирует глюкозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, целлобиозу; не утилизирует арабинозу, ксилозу, лактозу, маннит, маннозу, сорбит. Не разлагает эскулин и салицин. Продуцирует ферменты: амилазу, протеазу, лецитиназу. Из источников азота лучше всего усваивает пептон и дрожжевой экстракт. В глубинной культуре на третьи сутки образуется пигмент желтого цвета.

Антибиотические свойства гриба Calcarisporium arbuscula F-80

Антибиотическую (фунгицидную) активность гриба Calcarisporium arbuscula F-80 определяли на односуточной культуре гриба Candida albicans в чашках Петри на агаризованной среде Сабуро. Опытным путем была подобрана концентрация тест-культуры для получения на чашках Петри сплошного, но не густого газона. Стандартизацию проводили по величине оптической плотности (OD) водной суспензии тест-культуры на фотоколориметре при длине волны 590 нм. Результаты тестирования глубинной культуры гриба Calcarisporium arbuscula F-80 представлены в таблице 2.

Таблица 2
Фунгицидная активность глубинной культуры штамма гриба Calcarisporium arbuscula F-80 в отношении Candida albicans
Возраст культуры, сутки	Зоны подавления роста Candida albicans, мм
0	0
1	0
2	0
3	20
4	17
5	19
6	18
7	16
8	20
9	20
10	20

Анализ данных антибиотической активности свидетельствует о том, что на третьи сутки роста гриб Calcarisporium arbuscula F-80 имеет максимальную антибиотическую активность метаболитов. Культура к этому времени выходит на стационарную фазу роста. Второй пик активности, по-видимому, связан с лизисом культуры и выходом метаболитов из клеток.

Москитоцидная активность гриба Calcarisporium arbuscula F-80.

Москитоцидную активность штамма проводили на личинках 2-го и 4-го возраста и куколках комаров различных видов. LC₅₀. Активность (LC₅₀) гриба Calcarisporium arbuscula штамма F-80 составляет для фугата 5-6% культуральной жидкости на личинках комаров Aedes aegypti.

Пример 1. Культивирование штамма гриба Calcarisporium arbuscula F-80 в колбах на жидкой питательной среде.

Культуру гриба выращивают на плотной питательной среде Чапека⁺ в чашках Петри при температуре 23°С и относительной влажности 90% в течение 12 дней до образования сплошного воздушного мицелия со зрелыми конидиями. Наработку биомассы проводят в качалочных колбах на среде следующего состава (г/л):

соевая мука	20.0
дрожжевой экстракт	8.0
глюкоза	30.0
KH2PO4	3.0
Mg2SO4	0.7

Для засева питательной среды используют трехсуточный инокулят. Инокулят готовят на жидкой питательной среде, куда помещают агаровый блок с газоном гриба, выращенного на среде Чапека⁺. Культивирование проводят при температуре 23°С и pH среды 6.0 на микробиологической качалке (260 об/мин) в течение 4 дней до выхода культуры на стационарную фазу роста и образования бластоспор. Для тестирования фугат получают центрифугированием культуральной жидкости при 4000 об/мин в течение 40 мин. Для определения LC₅₀ используют ряд последовательных двукратных разведений фугата водой. Для определения LT₅₀ используют смыв мицелиальной биомассы с чашек Петри. Для тестирования смывов суспензию в объеме 1 мл разбавляют водой до концентрации конидий 1×10⁶.

Москитоцидную активность штамма определяют на личинках второго возраста комаров вида Aedes aegypti. Активность смывов определяют по смертности личинок на 1, 2, 4 и 8 день с определением среднелетального времени - LT₅₀. Активность фугата определяют по величине среднелетальной концентрации - LC₅₀. Учет смертности личинок от фугата проводят через 24 часа. Штамм гриба Calcarisporium arbuscula F-80 характеризуется следующими показателями москитоцидной активности: LT₅₀ смывов равна 0,5 суток; LC₅₀ фугата культуральной жидкости равна 5,5%.

Пример 2. Выделение ауровертина "В" из штамма Calcarisporium arbuscula F-80.

Ауровертин "В" получают путем экстрагирования грибной биомассы. Высушенный мицелий экстрагируют хлористым метиленом на аппарате Сокслета в течение 24 часов при 30°С. Экстракцию веществ из фугата проводят хлористым метиленом на жидкость-жидкостном экстракторе непрерывного действия в течение 36 часов. Очистку (фракционирование) сырых экстрактов проводят последовательной обработкой растворителями различной полярности (гексаном, хлороформом, этилацетатом, метанолом).

Активность сырого и очищенного экстрактов из мицелия штамма гриба Calcarisporium arbuscula F-80 характеризуется следующими показателями москитоцидной активности: сырой экстракт - 16,7 миллионных долей (м.д.), очищенный экстракт - 10,2 м.д.

Окончательную очистку производят в несколько стадий с использованием флеш-хроматографии и жидкостного хроматографа высокого давления. Для разделения фракций используют полупрепаративные колонки (250×12 мм) с носителями "Diol", "C-18" и силикагель фирмы "Phenomenex". Структуру и класс этих соединений определяют методами ИК-спектроскопии, масс-спектроскопии (с электронной ионизацией (EI), электроспрей (ESI), МАЛДИ (MALDI), а также масс-спектроскопии высокого разрешения (HRESI)) и ЯМР-спектроскопии (¹Н-ЯМР, ¹³С-ЯМР) на приборах с рабочими частотами для протонов 400 и 600 МГц с использованием протоколов COSY, DEPT, НМВС.

Выделенный продукт из штамма гриба Calcarisporium arbuscula F-80 имеет молекулярную массу 460,517, брутто формулу C₂₅H₃₂O₈. Его название по номенклатуре UIPAC - 1S,3S,4S,5S,7R,8S)-7-этил-4-гидрокси-3-[(1Е,3Е,5Е)-6-(4-метокси-3-метил-6-оксо-пиран-2-ил)гекса-1,3,5-триэнил]-1,5-диметил-2,6-диоксабицикло[3.2.1]окт-8-ил] этаноат. По своей природе это вещество поликетидной природы (нанокетид). Ранее это вещество было названо "ауровертин "В"" [5].

Пример 3. Лабораторные испытания ауровертина "В" на различных видах комаров.

Москитоцидную активность ауровертина "В" проводят на личинках 2-го и 4-го возраста и куколках комаров различных видов. В емкостях по 1 мл заливают культуру штамма по 1 мл и далее разводят в 2 раза, получают ряд разведений от 100% до 12,5%. В каждую емкость помещают по 10 личинок комаров. Содержат при 25°С в термостате. В качестве контроля берут воду. Учет результатов проводят через 24 часа. Для тестируемого метаболита определяют среднелетальную концентрацию (LC₅₀), выраженную в миллионных долях (м.д.). Для определения среднелетального времени LT₅₀ учет смертности проводят каждый час. В таблицах 3-4 приведены данные о москитоцидной активности метаболита ауровертина "В".

Таблица 3
Активность (LC50) ауровертина "В" против личинок различных видов комаров.
Вид комаров	Время экспозиции (часов)	LC50 (м.д.) в отношении
		Личинок	Куколок
II возраст	IV возраст
Aedes aegypti	24	8,7	35,0	*
96	6,2	6,2	62,0
Culex pipiens molestus	24	6,0	18,0	58,0
96	2,5	2,5	15,0
Culex pipiens	24	7,0	10,0	*
96	2,5	7,5	11,0
Anopheles messeae	24	12,5	41,0	*
96	10,3	18,0	73,7
*- активность отсутствует

Таблица 4
Активность (LT50) ауровертина "В" против личинок различных видов комаров
Вид комаров	LT50 (часы) в отношении
	Личинок	Куколок
II возраст	IV возраст
Aedes aegypti	1	4	90
Culex pipiens molestus	2	6	40
Culex pipiens	5	12	90
Anopheles messeae	4	15	90

Полученные результаты свидетельствуют о высокой активности ауровертина "В" в отношении различных видов комаров, включая переносчиков малярии и других опасных возбудителей болезней человека и теплокровных животных.

По значениям удельной активности метаболита было определено его среднее содержание в культуральной жидкости - 160 мг/л. Впервые установлено, что ауровертин "В" обладает высокой москитоцидной активностью.

Полученные результаты позволяют рассматривать продукт штамма гриба Calcarisporium arbuscula F-80 (ауровертин "В") в качестве перспективного агента для создания москитоцидного препарата.

Источники информации

1. Малярийные комары и борьба с ними на территории Российской Федерации: Методические указания под ред. Аванесова Л.И., Максаковой Е.И. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 56 стр., 2000.

2. Кербабаев Э.Б. Кровососущие комары - паразиты животных и человека. Методы и средства борьбы с комарами, М., стр.375, 2003.

3. Scholte Е.-J, Knols В.G.J., Samson R.A., Takken W. Entomopathogenic fungi for mosquito control: A review, J. Insect Sci., Vol.4, pp.19-54, 2004.

4. Cuda J.P., et al, Evaluation of Lagenidium Giganteum for Biocontrol of Florida Mansonia Mosquitoes FIPR Publication №05, pp. 37-113, 1995.

5. Judith E.F., Pattenden G., Total synthesis of preaurovertin, putative biogenetic precursor of aurovertin. Biosynthetic interrelationships between the aurovertins, citreoviridinols and asteltoxin, J. Chem. Soc., Perkin Trans., Vol.1, р.1959-1966, 1991.

6. Nishiyama S., Toshima H., Kanai H., Yamamura S., Total synthesis and the absolute configuration of aurovertin B, an acute neurotoxic metabolite, Tetrahedron, vol.44, No 20, pp.6315-6324, 1988.

7. Papathanassiu A.E. (Silver Spring, MD, US), Mycotoxin derivatives as antimitotic agents, US Patent 6528489, 2003.

8. Ruiz A. (Gaithersburg, MD, US), Papathanassiu A. (Silver Spring, MD, US) Compositions and methods for the treatment of mycobacterial infections, US Patent 20040087489, 2004.

9. Anderson C.M. (Encinitas, CA, US), Clevenger W. (Oceanside, CA, US) Compositions and methods for regulating endogenous inhibitor of ATP synthase, including theatment for diabetes, US Patent 20040072739, 2004.

10. Slabas A.R. (Durham, GB), Chivasa S. (Durham, GB), Ndimba B.K. (Durham, GB), Lindsey K. (Durham, GB), Viability, US Patent 20060265776, 2006.

Средство, обладающее москитоцидными свойствами и представляющее собой Ауровертин «В» из штамма гриба Calcarisporium arbuscula ГНЦ ПМБ F-80.