Средство, обладающее москитоцидными свойствами
Владельцы патента RU 2391390:
Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ) (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в качестве средства борьбы с кровососущими комарами. Способ предусматривает выращивание штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114, депонированного в коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ) на плотной питательной среде Чапека+ при температуре 23°С в течение 12 дней до образования сплошного воздушного мицелия со взрослыми колониями с последующим культивированием при той же температуре на среде Сабуро с добавлением дрожжевого экстракта в течение 6 дней до образования бластоспор. Полученную культуральную жидкость центрифугируют с получением фугата. Полученный фугат экстрагируют хлористым метиленом на жидкость-жидкостном экстракторе непрерывного действия в течение 30 часов. Полученный экстракт очищают растворителями различной полярности (гексаном, хлороформом, этилацетатом, метанолом) с последующим хроматографированием на флеш-хроматографии и последующем хроматографировании на жидкостном хроматографе высокого давления с получением 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона, обладающего москитоцидными свойствами. Изобретение позволяет расширить ассортимент средств для создания москитоцидных препаратов. 4 табл.
Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии.
Кровососущие комары являются переносчиками более 150 возбудителей болезней человека и теплокровных животных. Они являются единственными переносчиками таких болезней как малярия, желтая лихорадка, лихорадка Денге и главными переносчиками в передаче некоторых филярий и вирусных энцефалитов. Одним из путей снижения риска заболевания человека и животных трансмиссивными болезнями является контроль численности кровососущих комаров. Основным профилактическим средством борьбы с комарами является применение инсектицидных препаратов.
Известны химические средства борьбы с кровососущими комарами: карбаматы (пропоксур), фосфорорганические (малатион, темефос, фенитротион, фенатион), пиретроиды (1).
Интенсивное применение химических инсектицидов приводит к загрязнению окружающей среды и к возникновению резистентности к действующему веществу инсектицидов у большинства видов кровососущих комаров.
Известны биологические москитоцидные препараты на основе бактерий Bacillus thuringiensis israelensis и Bacillus sphaericus. Преимущество биопрепаратов перед химическими инсектицидами заключается в их селективности действия, безопасности для людей и теплокровных животных, нецелевых насекомых, гидробионтов.
Однако бактериальные москитоцидные препараты на основе Bacillus sphaericus не активны против многих видов комаров, включая переносчиков малярии. Повсеместное применение бактериальных инсектицидов привело к появлению резистентных популяций комаров (2).
Известны примеры использования грибов родов Lagenidium, Coelomomyces и Culicinomyces для борьбы с личинками кровососущих комаров (3). Грибы родов Coelomomyces и Culicinomyces имеют существенный недостаток, заключающийся в необходимости их культивирования на живых организмах. В связи с этим они не могут быть наработаны в больших количествах для широкого применения. Другим недостатком этих грибов являются заметные колебания эффективности из-за сложного цикла развития гриба в природе.
Известен москитоцидный препарат Лагинекс, выпускаемый в США с 1999 года на основе штамма гриба Lagenidium giganteum (4).
Недостатком этого препарата является то, что он неактивен против комаров рода Anopheles - переносчиков малярии. Активное начало препарата (зооспоры) токсичны для многих видов водной фауны.
Известны синтезируемые штаммом гриба Sesquicillium candelabrum метаболиты - дитерпеноидные пироны - канделалиды А-С, обладающие иммунодепрессантными свойствами /5/, а также производное изокумарина - сесканделин В, используемое для лечения заболеваний, возникающих при патологии ангиогенеза (рак, ревматический артрит, диабетическая ретинопатия) /6/.
Известно вещество 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон, продуцируемое грибом Gliocladium roseum и названное "аурантиоглиокладином" /7/. Известно, что аурантиоглиокладин применяется в качестве красителя в шампунях для окраски волос /8/. Данных об москитоцидной активности аурантиоглиокладина в литературе не найдено. Нет также данных о том, что гриб Sesquicillium candelabrum продуцирует 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон.
Задачей изобретения является получение грибного метаболита 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона, активного против различных видов кровососущих комаров.
Поставленная задача решается тем, что предлагаемый метаболит 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон продуцируется штаммом гриба Sesquicillium candelabrum F-114.
Предлагаемый метаболит активен против различных видов кровососущих комаров, в том числе против комаров рода Anopheles - переносчиков малярии.
Сущность изобретения заключается в том, что 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон выделяют из биомассы гриба Sesquicillium candelabrum F-114.
Штамм гриба Sesquicillium candelabrum выделен в 2004 году из образцов почвы Московской области и отобран для исследования его москитоцидных свойств путем скрининга 180 штаммов 48 родов микромицетов из рабочей коллекции ГНЦ ПМБ.
Штамм гриба Sesquicillium candelabrum депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ), Оболенск, Московской области, коллекционный номер F-114.
Штамм характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
Колонии достигают 30 мм в диаметре через 7 дней при 24°С. Оптимальная температура для роста 18-24°С, максимум 27-30°С. Обратная сторона колонии на овсяном агаре от бледно-желтоватой до бледно-оранжевой. Поверхность колонии белая, порошистая до гранулированной из-за конидиофоров и конидиальных масс, воздушный мицелий скудный или отсутствует. Конидиофоры мономорфные, кисточковидные или мутовчатые, по 3-4 в мутовке. Ножка до 100 µм высотой, до 4 µм шириной в основании, кисточки до 130 µм высотой и шириной. Первичные веточки расходящиеся, формирующие свободные боковые веточки; конечные веточки и фиалиды расходящиеся или прижатые, промежуточные фиалиды под одиночными конечными фиалидами в мутовках, иногда в мутовках вместе с конечными фиалидами, почти цилиндрические, по размеру близки к конечным фиалидам. Фиалиды бутылевидные или цилиндрические, сужающиеся в верхней части, 5-8-12 µм длиной, 3-4 µм в самой широкой части и около 1 µм шириной в верхней точке, иногда деградирующие в относительно молодых колониях. Конидии в белых колонках внахлест, гладкостенные, одноклеточные от эллипсоидных до субшаровидных, 3-5,5×1,8-3,4 µм. Штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 хорошо развивается в глубинной культуре на жидкой питательной среде. Динамика накопления биомассы и изменения pH культуральной жидкости (КЖ) штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 приведена в таблице 1.
| Таблица 1 | |||
| Характеристика глубинной культуры штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 | |||
| Возраст культуры, сутки | Параметры КЖ | ||
| pH | Сухой вес, г/л | Морфология культуры | |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 0 | 5,8 | 14,2 | Посевной материал |
| 1 | 6,0 | 20,7 | Молодой растущий мицелий |
| 2 | 6,07 | 25,5 | Длинные гифы мицелия, густо переплетенные. Мицелий слабоветвящийся, однородный |
| 3 | 7,5 | 30,2 | В гифах мицелия появились жировые включения |
| 4 | 7,78 | 26,6 | Мицелий, длинные септированные гифы с жировыми включениями; конидии отсутствуют |
| 5 | 8,1 | 25,9 | То же |
| 6 | 8,35 | 24,8 | Начало лизиса |
| 7 | 8,32 | 22,7 | Мицелий септирован, гифы с жировыми включениями. Отдельные участки гиф пустые; продолжение лизиса |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 8 | 8.3 | 21,9 | Продолжение лизиса |
| 9 | 8,27 | 20,1 | То же |
| 10 | 8,24 | 19,4 | То же |
Размер гифов - толщина от 1,5 до 2,5 мкм
Биохимические признаки
Штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 утилизирует глюкозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, не утилизирует арабинозу, ксилозу, лактозу, маннит, маннозу, сорбит. Не разлагает эскулин и салицин. Продуцирует фермент протеазу. Из источников азота лучше всего усваивает дрожжевой экстракт. В глубинной культуре на третьи сутки образуется пигмент желтого цвета.
Антибиотические свойства
Антибиотическую (бактерицидную) активность гриба Sesquicillium candelabrum F-114 определяли на односуточной культуре бактерии Staphylococcus aureus MRSA в чашках Петри на агаризованной среде из рыбокостной муки. Опытным путем подбирают концентрацию микроорганизмов для получения на чашках Петри сплошного газона. Стандартизацию проводят по величине оптической плотности (OD) водной суспензии тест-культуры на фотоколориметре при длине волны 590 нм. Результаты тестирования глубинной культуры штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-l14 представлены в таблице 2.
| Таблица 2 | |
| Бактерицидная активность глубинной культуры штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 в отношении Staphylococcus aureus | |
| Возраст культуры, сутки | Зоны подавления роста Staphylococcus aureus, мм |
| 0 | 0 |
| 1 | 0 |
| 2 | 18,0 |
| 3 | 22,0 |
| 4 | 14,0 |
| 5 | 10,0 |
| 6 | 10,0 |
| 7 | 8,0 |
| 8 | 8,0 |
| 9 | 0 |
| 10 | 0 |
Анализ данных антибиотической активности свидетельствует о том, что к 3 суткам роста штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 имеет максимальную антибиотическую активность.
Москитоцидная активность
Активность штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 и его метаболита определяли на личинках 2-го возраста комаров Aedes aegypti. Москитоцидная активность (LC50) составила: для фугата культуральной жидкости штамма гриба 5-13%; для активного метаболита гриба от 15 до 48 м.д.
Пример 1. Культивирование штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 в колбах на жидкой питательной среде
Культуру гриба выращивают на плотной питательной среде Чапека+ в чашках Петри при температуре 23°С и относительной влажности 90% в течение 12 дней до образования сплошного воздушного мицелия со зрелыми конидиями. Наработку биомассы проводят в качалочных колбах на среде Сабуро с добавлением дрожжевого экстракта. Культивирование проводят при 23°С на микробиологической качалке (260 об/мин) в течение 6 дней до выхода культуры на стационарную фазу роста и образования бластоспор. Для тестирования фугат получают центрифугированием культуральной жидкости при 4000 об/мин в течение 40 мин. Для определения LC50 используют ряд последовательных двукратных разведений фугата водой. Для определения LT50 используют смыв мицелиальной биомассы с чашек Петри. Для тестирования смывов суспензию в объеме 1 мл разбавляют водой до концентрации конидий 1×106.
Максимальный вес сухой биомассы гриба на 3-и сутки роста составляет 30,2 г/л. Морфология культуры представляет собой длинные гифы мицелия, густо переплетенные, слабоветвящиеся с жировыми включениями. Толщина гифов от 1,5 до 2,5 µм.
Москитоцидную активность штамма определяют на личинках комаров Aedes aegypti. Активность смывов определяют по смертности личинок комаров на 1, 2, 4 и 8 день с определением среднелетального времени - LT50. Активность фугата определяют по величине среднелетальной концентрации - LC50. Учет смертности личинок от фугата проводят через 24 часа. Штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 характеризуется следующими значениями москитоцидной активности: LT50 смывов равна 0,5 суток; LC50 фугата культуральной жидкости равна 8,5%.
Анализ данных по динамике роста свидетельствует о том, что к 3-4 суткам штамм гриба Sesquicillium candelabrum F-114 имеет максимальную активность и отмечается выход культуры на стационарную фазу роста.
Пример 2. Выделение 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона из биомассы гриба Sesquicillium candelabrum F-114
2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон получают путем экстрагирования биомассы гриба Sesquicillium candelabrum F-114. Высушенный мицелий экстрагируют хлористым метиленом на аппарате Сокслета в течение 24 часов при 30°С. Экстракцию веществ из фугата проводят хлористым метиленом на жидкость-жидкостном экстракторе непрерывного действия в течение 30 часов. Очистку (фракционирование) сырых экстрактов проводят последовательной обработкой неполярными и полярными растворителями (гексаном, хлороформом, этилацетатом, метанолом).
Активность сырого и очищенного экстрактов из мицелия штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 характеризуется следующими показателями москитоцидной активности: сырой экстракт - 26,5 миллионных долей (м.д.); очищенный экстракт - 21,0 м.д.
Окончательную очистку производят в несколько стадий с использованием флеш-хроматографии и жидкостного хроматографа высокого давления. Для разделения фракций используют полупрепаративные колонки (250×12 мм) с носителями "Diol", "C-18" и силикагель фирмы "Phenomenex". Структуру и класс этих соединений определяют методами ИК-спектроскопии, масс-спектроскопии (с электронной ионизацией (EI), электроспрей (ESI), МАЛДИ (MALDI), а также масс-спектроскопии высокого разрешения (HRESI)) и ЯМР-спектроскопии (1Н-ЯМР, 13С-ЯМР) на приборах с рабочими частотами для протонов 400 и 600 МГц с использованием протоколов COSY, DEPT, НМВС.
Из активного экстракта штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 получают чистый продукт и определяют его структуру. Это вещество имеет молекулярную массу 164 и брутто-формулу C10H12O4. Его название по номенклатуре UIPAC - 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон.
Пример 3. Лабораторные испытания 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона на различных видах комаров
Москитоцидную активность 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона определяют на личинках 2-го и 4-го возраста и куколках комаров четырех видов. В емкостях по 1 мл заливают культуру штамма по 1 мл и далее разводят в 2 раза, получают ряд разведений от 100% до 12,5%. В каждую емкость помещают по 10 личинок комаров и куколок. Их содержат при 25°С в термостате. В качестве контроля берут воду. Учет результатов проводят через 24 часа. Для тестируемого метаболита определяют среднелетальную концентрацию (LC50), выраженную в миллионных долях (м.д.). Для определения среднелетального времени (LT50) учет смертности проводят каждый час. В таблицах 3-4 приведены данные о москитоцидных свойствах метаболита 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона.
| Таблица 3 | ||||
| Активность (LC50) 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона против личинок и куколок различных видов комаров | ||||
| Вид комаров | Время экспозиции, часов | LC50 (м.д.) в отношении | ||
| Личинок | Куколок | |||
| II возраст | IV возраст | |||
| Aedes aegypti | 24 | 23,0 | 99,0 | 397,0 |
| 96 | 20,0 | 65,0 | 90,0 | |
| Culex pipiens molestus | 24 | 48,0 | 88,0 | 172,0 |
| 96 | 15,0 | 28,0 | 28,0 | |
| Culex pipiens | 24 | 41,0 | 80,0 | 301,0 |
| 96 | 15,0 | 30,0 | 30,0 | |
| Anopheles messeae | 24 | 26,0 | 110,0 | 405,0 |
| 96 | 20,0 | 75,0 | 60,0 |
Из данных таблицы 3 следует, что москитоцидная активность 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона составляет: 15-110 м.д. - для личинок комаров; 28-405 м.д. - для куколок комаров.
| Таблица 4 | |||
| Активность (LT50) 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона против личинок и куколок различных видов комаров | |||
| Вид комаров | LT50 (часы) в отношении | ||
| Личинок | Куколок | ||
| II возраст | IV возраст | ||
| Aedes aegypti | 2 | 10 | 90 |
| Culex pipiens molestus | 5 | 10 | 15 |
| Culex pipiens | 10 | 20 | 48 |
| Anopheles messeae | 6 | 10 | 52 |
Представленные в таблице 4 данные указывают, что москитоцидная активность тестируемого метаболита по показателю LT50 составляет: 2-20 часов - для личинок комаров; 15-90 часов - для куколок комаров.
Данные таблиц 3-4 свидетельствуют о высокой активности метаболита 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона в отношении различных видов комаров, включая переносчиков малярии и других опасных возбудителей болезней человека и теплокровных животных.
По значениям удельной активности 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона было определено его среднее содержание в культуральной жидкости - 280 мг/л.
Таким образом, впервые установлена высокая москитоцидная активность 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинона (аурантиоглиокладина). Полученные результаты позволяют рассматривать метаболит штамма гриба Sesquicillium candelabrum F-114 (2,3 диметокси 5,6-диметил бензохинон) в качестве перспективного агента для создания москитоцидного препарата.
Источники информации
1. Малярийные комары и борьба с ними на территории Российской Федерации: Методические указания под ред. Аванесова Л.И., Максаковой Е.И. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 56 стр. 2000.
2. Кербабаев Э.Б. Кровососущие комары - паразиты животных и человека. Методы и средства борьбы с комарами. М., стр.375, 2003.
3. Scholte E-J, Knols B.G.J., Samson R.A., Takken W., Entomopathogenic fungi for mosquito control: A review, J. Insect Sci., Vol.4, pp.19-54, 2004.
4. Cuda J. P., et al. Evaluation of Lagenidium Giganteum for Biocontrol of Florida Mansonia Mosquitoes FIPR Publication №05, pp 37-113, 1995.
5. Singh S.B., Zink D.L., Dombrowski A.W., Dezeny G., Bills G.F., Felix J.P., Slaughter R.S., Goetz M.A., Candelalides A-C: novel diterpenoid pyrones from fermentations of Sesquicillium candelabrum as blockers of the voltage-gated potassium channel Kv1.3., Org Lett., Vol.25, 3(2), p.247-250. 2001.
6. Kimura, et al. Biosyntheses of Sescandelin B: New Isocoumarin Compounds Produced by the Fungus, Sesquicilium candelabrum, Biosci. Biotech. Biochem., Vol.58 (8), p.1525-1526, 1994.
7. Bentley R., Lawate W.V., Studies on coenzyme Q. The biosynthesis of aurantiogliocladin and coenzyme Q in molds, J. Biol. Cheem., vol.240, N1, P/532-540, 1965.
8. Lang G., (Saint-Gratien), Malaval A., (Aulnay-sois-Bois), Grollier J.F., (Paris), Rosenbaum G., (Asniers) Use of benzoquinines for the direct dyeing of keratin fibres, US Patent 4867751, 1989.
Средство, обладающее москитоцидными свойствами, представляющее собой 2,3-диметокси 5,6-диметил бензохинон из штамма гриба Sesquicillium candelabrum ГНЦ ПМБ F-114.
