Среда обогащения для выделения холерного вибриона

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской микробиологии. Питательная среда содержит панкреатический перевар пекарских дрожжей, натрий хлористый, калий азотнокислый и дистиллированную воду при заданном содержании компонентов. Изобретение позволяет повысить ростовые качества питательной среды и повысить ее чувствительность. 2 табл.

 

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано как питательная среда обогащения для выделения холерного вибриона.

Все известные питательные среды в качестве основы содержат белки животного или растительного происхождения, в частности белки сои (см. RU пат. №2301256, кл. С12 №1/20, 2007, 06, 20).

Однако такие среды нестандартны в отношении используемого сырья, которое, кроме того, применяется для питания человека и животных, при этом в основном упомянутые среды имеют низкую чувствительность в виду присутствия дубильных веществ, плохо действующих на рост микроорганизмов.

В настоящее время перспективными являются среды, получаемые из дрожжевого сырья, в частности из хлебопекарных дрожжей, которые растут на дешевых субстратах (отходы пищевой и молочной промышленности).

Наиболее близкой по технической сущности является среда обогащения для выделения холерных вибрионов (см. RU №2152999, кл. C12Q 1/04, С12 №1/20, 2000.07.20), содержащая в г/л:

Пептон ферментативный сухой 3,0-4,0

Хлорид натрия 5,0-6,0

Натрия калия 0,1-0,12

Карбонат натрия 2,5-2,6

Дистиллированная вода 1 л

рН 8,4±0,2

Недостатком прототипа является то, что при высеве 6-часовых культур на агаровые пластинки в отношении 28 взятых в работу штаммов V.cholerae (см. табл.2), известная среда по показателю числа выросших колоний имеет значение втрое ниже, чем предложенное. Это обстоятельство подтверждает недостаточность ее ростовых показателей и соответственно невысокую чувствительность.

Кроме того, питательной основой известной среды является пептон ферментативный - препарат из нестандартного мясного сырья, что отражается на качестве и стоимости среды.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение ростовых качеств - повышение чувствительности среды обогащения для выделения холерного вибриона, а также снижение ее стоимости.

Поставленная задача достигается тем, что в известной среде обогащения для выделения холерного вибриона, содержащей питательную основу, натрий хлористый, калий азотнокислый и дистиллированную воду, питательной основой является панкреатический перевар пекарских дрожжей при следующем соотношении компонентов из расчета на 1 литр:

Панкреатический перевар пекарских дрожжей 0,01-0,1% (по аминному азоту)

Натрий хлористый 0,4-0,8 г

Калий азотнокислый -0,1-0,12 г

Дистиллированная вода до 1 литра

рН 8,2±0,4

Питательную среду готовят следующим образом.

Исходным материалом служит панкреатический перевар пекарских дрожжей (ПППД), представляющий собой белковый гидролизат, который является питательной основой сред для культивирования и выделения холерного вибриона (препарат разработан Ростовским противочумным институтом, подтвержден «Инструкцией по изготовлению и контролю», «Инструкцией по применению»), в настоящее время подготовлены материалы: «Производственный регламент», «Временная фармакопейная статья» для представления в ГИСК им. Тарасовича.

В емкость вносят 0,01-0,1% (по аминному азоту) панкреатического перевара пекарских дрожжей, натрия хлористого 0,4-0,8 г и доводят объем до 1 литра холодной дистиллированной водой. Смесь кипятят на плитке 5-10 мин или в паровом стерилизаторе (в режиме текучего пара) в течение 40-60 мин. Затем добавляют 0,1-0,12 г калия азотнокислого. Раствор фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Проверяют реакцию среды, если нужно, pH доводят до 8,2±0,4 с помощью 18% раствора соляной кислоты или 20% раствора гидроокиси натрия. Готовую среду разливают в градуированные флаконы по 100 мл и стерилизуют при 110°С 20 мин. Качество готовой предлагаемой питательной среды обогащения для выделения холерного вибриона проверяют в соответствии с требованиями Методических указаний МУ 3.3.2.2124-06 (5).

Пример 1. В питательную среду следующего состава (из расчета на 1 литр): панкреатический перевар пекарских дрожжей 0,005% (по аминному азоту), натрий хлористый 2 г, калий азотнокислый 0,05 г добавляли дистиллированную воду до 1 литра, а затем кипятят до полного растворения ингредиентов, фильтруют через вату, устанавливают pH 8,2±0,4 с помощью 18% раствора соляной кислоты или 20% раствора гидроокиси натрия. Готовую среду разливают в градуированные флаконы по 100 мл, стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 20 мин. После охлаждения среды до 37°С во флаконы вносят 100 м.к. штаммов холерного вибриона различных биоваров и серогрупп, подготовленных в соответствии с требованиями МУ 3.3.2.2124-06. После шести часов инкубации при 37°С производили высев бактериологической петлей №5 по Чаплевскому с поверхности испытуемой среды на пластинки щелочного агара. Количество выросших колоний каждого штамма холерного вибриона подсчитывают после 12-18 ч инкубации при 37°С. Результаты представлены в табл.1.

Таким образом среда данного состава не соответствует требованиям МУ 3.3.2.2124-06, кроме того, наблюдается даже отсутствие роста штаммов V. cholerae cholerae O1 P-1 (145), V.cholerae O139 16077.

Пример 2. В питательную среду следующего состава (из расчета на 1 литр): панкреатический перевар пекарских дрожжей 0,01% (по аминному азоту), натрий хлористый 0,4 г, калий азотнокислый 0,1 г добавляют дистиллированную воду до 1 литра, а затем кипятят до полного растворения ингредиентов, фильтруют через вату, устанавливают pH 8,2±0,4 с помощью 18% раствора соляной кислоты или 20% раствора гидроокиси натрия. Готовую среду разливали в градуированные флаконы по 100 мл, стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 20 мин. После охлаждения среды до 37°С во флаконы вносят 100 м.к. штаммов холерного вибриона различных биоваров и серогрупп, подготовленных в соответствии с требованиями МУ 3.3.2.2124-06. После шести часов инкубации при 37°С производят высев бактериологической петлей №5 по Чаплевскому с поверхности испытуемой среды на пластинки щелочного агара. Количество выросших колоний каждого штамма холерного вибриона подсчитывают после 12-18 ч инкубации при 37°С. Результаты представлены в табл.1.

Следовательно, среда данного состава соответствует требованиям МУ 3.3.2.2124-06, все штаммы дают рост более 10 м.к.

Пример 3. В питательную среду следующего состава (из расчета на 1 литр): панкреатический перевар пекарских дрожжей 0,05% (по аминному азоту), натрий хлористый 5 г, калий азотнокислый 0,1 г добавляют дистиллированную воду до 1 литра, а затем кипятят до полного растворения ингредиентов, фильтруют через вату, устанавливают pH 8,2±0,4 с помощью 18% раствора соляной кислоты или 20% раствора гидроокиси натрия. Готовую среду разливают в градуированные флаконы по 100 мл, стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 20 мин. После охлаждения среды до 37°С во флаконы вносят 100 м.к. штаммов холерного вибриона различных биоваров и серогрупп, подготовленных в соответствии с требованиями МУ 3.3.2.2124-06. После шести часов инкубации при 37°С производят высев бактериологической петлей №5 по Чаплевскому с поверхности испытуемой среды на пластинки щелочного агара. Количество выросших колоний каждого штамма холерного вибриона подсчитывают после 12-18 ч инкубации при 37°С. Вывод: среда соответствует требованиям МУ 3.3.2.2124-06, все штаммы дают хороший рост (см. табл.1).

Пример 4. Готовят среду следующего состава (из расчета на 1 литр):

Панкреатический перевар пекарских дрожжей 0,1% (по аминному азоту)

Натрий хлористый 8 г

Калий азотнокислый 0,12 г

Добавляют дистиллированную воду до 1 литра, а затем проводят кипячение, фильтрацию, установку pH. Все дальнейшие действия осуществляют по технологии примеров 1, 2, 3. (Результаты представлены в табл.1).

Исходя из результатов получили среду, соответствующую требованиям МУ 3.3.2.2124-06, однако количество выросших колоний имеют пограничные значения.

Пример 5. Готовят среду следующего состава (из расчета на 1 литр).

Панкреатический перевар пекарских дрожжей 0,2% (по аминному азоту)

Натрий хлористый 12 г

Калий азотнокислый 0,2 г

Добавляют дистиллированную воду до 1 литра. После осуществляют кипячение, фильтрацию, установку pH. Дальнейшая технология проводится аналогично примерам 1, 2, 3. Результаты указаны в табл.1, из которой видно, что идет плохой рост колоний, который не соответствует МУ 3.3.2.2124-06.

Провели сравнительную оценку биологических показателей предлагаемой среды и среды, приготовленной по прописи прототипа. Оценивали следующие биологические показатели: чувствительность сред; число колоний, выросших при высеве культур после 6 часов инкубации в исследуемых жидких средах на агаровые пластинки. Данные показатели оценивали в отношении 28 штаммов холерного вибриона различных биоваров и серогрупп, включая тест-штаммы V.cholerae cholerae O1 P-1 (145). V.cholerae eltor O1 M-878. V.cholerae non O1 P-9741. Результаты сравнительного изучения предлагаемой среды и среды, приготовленной по прописи прототипа, представлены в табл.2.

Анализ результатов, представленных в табл.2, свидетельствует о том, что предлагаемая среда по показателю чувствительности на порядок превосходит известную среду. Четыре из 28 взятых в работу штаммов при внесении посевной дозы 10 м.к. не растут на среде, приготовленной по прописи прототипа. Предлагаемая среда по показателю числа колоний, выросших при высеве 6-часовых культур на агаровые пластинки в отношении всех использованных штаммов V. cholerae в среднем, втрое превосходит прототип.

Кроме того, в результате сравнения стоимости материалов идущих на изготовление 1 л известной предлагаемой среды, последняя в три раза дешевле.

Таким образом, предлагаемая среда обогащения для выделения холерных вибрионов имеет преимущества по биологическим показателям и по себестоимости.

Таблица 1
Штаммы	Количество колоний (шт.)
	Примеры
1	2	3	4	5
V/ cholerae cholerae O1 P-1 (145)	нет роста	15,3±1,1	32,9±1,7	13,2±1,4	2,1±0,32
V/cholerae eiltor. O1 M-878	2,3±0,21	24,7±2,4	33,4±3,1	29,1±2,6	2,4±0,24
Vibrio cholerae non O1/0139P-9741	2,9±0,2	26,4±2,6	35,6±3,4	28,1±3,5	3,1±0,31
V/cholerae non O139 16077	нет роста	23,5±2,2	30,2±3,1	22,2±2,8	1,8±0,28

Таблица 2 (продолжение)
1	2	3	4	5	6	7
V.cholerae O139 16077	7,8±0,5	86,4±4,6	10	1,8±0,2	14,0±2,0	10
V.cholerae O139 16131	7,0±0,4	5б,2±4,4	10	1,3±0,4	18,8±2,2	10
V.cholerae O139 88	6,4±0,4	59,4±5,8	10	2,1±0,3	15,0±1,3	10
V.cholerae non O1 Р-9741	9,3±0,8	94,0±8,6	10	3,5±0,4	32,8±3,1	10
V.cholerae non O1 16005 (068)	9,8±0,6	73,6±1,6	10	2,8±0,2	24,8±4,1	10
V.cholerae non O1 16003 (065)	9,7±0,7	79,4±6,2	10	3,1±0,3	21,0±2,2	10
V.cholerae non O1 Р-12691 (064)	8,5±0,3	69,6±5,4	10	2,6±0,3	18,1±3,1	10
V.cholerae non O1 P-11972 (063)	8,8±0,6	86,0±6,9	10	2,6±0,4	23,5±3,4	10

Среда обогащения для выделения холерного вибриона, содержащая питательную основу, натрий хлористый, калий азотнокислый и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что в качестве питательной основы она содержит панкреатический перевар пекарских дрожжей при следующем количественном содержании компонентов из расчета на 1 л:

Панкреатический перевар
пекарских дрожжей	0,01-0,1% (по аминному азоту)
Натрий хлористый	4-8 г
Калий азотнокислый	0,1 -0,12 г
Дистиллированная вода	до 1 л
рН	8,2±0,4