Штамм streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini вкпм s-1084 - продуцент апрамицина и способ получения апрамицина
Владельцы патента RU 2392311:
Государственное учреждение научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве апрамицина, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами. Способ предусматривает культивирование штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084 продуцента апрамицина. Выделение ампрамицина из культуральной жидкости сорбцией на карбоксильных катионитах с последующей хроматографической очисткой двухколоночным методом путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22)н аммиака. Полученный элюат концентрируют в вакууме и осаждают избытком ацетона апрамицин в форме сульфата. Изобретение позволяет повысить выход апрамицина. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.
Изобретение касается нового штамма-продуцента антибактериального антибиотика апрамицина из группы аминогликозидов и способа получения апрамицина сульфата.
Особое значение аминогликозидов в современной антибиотикотерапии бактериальных инфекций обусловлено их высокой активностью в отношении грамотрицательных микроорганизмов, удельный вес которых в этиологии гнойно-септических процессов постоянно возрастает
Известен штамм Streptoalloteichus cremeus var. tobramycini var. nov. 2242 - продуцент аминогликозидных антибиотиков небрамицинового комплекса [1]. Недостатком данного штамма является низкий уровень содержания апрамицина в культуральной жидкости (не более 0,8 г апрамицина в 1 л культуральной жидкости), где он образуется наряду с другими антибиотиками аминогликозидного комплекса - карбамоилтобрамицином, карбамоилканамицином В в соотношении 2:1:1, соответственно.
Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент апрамицина в результате многоступенчатого мутагенного воздействия ультрафиолетовых лучей и нитрозометилбиурета на исходный штамм с последующим отбором мутантов на средах, содержащих стрептомицин и апрамицин в качестве селективных агентов.
Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером ВКМП S-1084.
Штамм 1084 обладает повышенной продуктивностью - (4 г в 1 л культуральной жидкости) апрамицина, синтезирует антибиотик в виде монокомпонента и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.
Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма 1084. Температура (20-37)°С; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал с десятидневной культурой штамма, выращенной на глицерин-нитратной агаровой среде Линденбайна. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (см.таблицу).
| Культурально-морфологические признаки штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084 | ||||
| Агаровая среда | Рост воздушного мицелия* | Цвет мицелия | Растворимый пигмент | |
| воздушного | субстратного | |||
| №1 Гаузе | + | Беловато-кремовый (К-2; К-3, Соо 6а) | Бесцветный | Нет |
| Овсяная | + | Беловатый (К-2, Coo 7а) | Бесцветный | Нет |
| Чапека | + | Беловатый (Д-1; Coo 7а) | Бесцветный | Нет |
| Глюкозо-аспарагиновая | - | Желтоватый (Г-5; Coo 4а) | Желтоватый (Ж-6) | |
| Линденбайна (глицерин-нитратная) | +++ | Беловато-кремовый (Д-1; Coo 7а) | Буроватый (б-4; Coo 4а) | Буроватый (б-4; Coo 4а) |
| Глюкозо-нитратная №2 Гаузе | +++ | Белый (Д-1; СОО 7а) до светло-кремового (б-б; Coo 5а) | Буроватый (б-4; Coo 4а) | Буроватый (б-4; Coo 4а) |
| Треснера (с пептоном и лимонно-кислым железом) | Меланоидные пигменты не образует | |||
| */ (+++) - хороший; (++) - умеренный; (+) - слабый. |
Морфологические признаки. Цепочки спор спиральные, спирали растянутые, с 2-6 оборотами, поверхность спор гладкая.
Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°С; оптимум роста 28°С и в диапазонах значений pH (5,0-10,0) с оптимумом роста при pH 7,0; желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимонно-кислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует фруктозу и инозитол, умеренно рамнозу и глюкозу, слабо использует сахарозу и лактозу, не использует раффинозу, арабинозу, манит, ксилозу и целлюлозу.
Хранение. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена.
Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре №2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов. Штамм фагоустойчив. Фаг в культуре отсутствует.
Штамм 1084 поясняется следующим примером.
Пример. Для получения спорового материала культуру Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini 1084 выращивают в течение 7 дней при 37°С на глицерин-нитратной агаровой Линденбайна следующего состава, %:
| Глицерин | 3,0 |
| K2HPO4 | 0,1 |
| MgSO4 | 0,05 |
| KCl | 0,05 |
| FeSO4 | 0.001 |
| NaNO3 | 0,2 |
| Агар | 2,0 |
| Вода | Водопроводная |
| pH до стерилизации | 7,0-7,2 |
Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении 1,0 атм и 120°С.
Для получения посевного мицелия споры культуры засевают на среду следующего состава, %:
| Соевая мука | 3,0 |
| Глюкоза | 3,0 |
| NaCl | 0,5 |
| CaCO3 | 0,5 |
| Вода | Водопроводная |
| pH до стерилизации | 7,0-7,2 |
Посевной материал выращивают при 37°С в течение 48 час в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, количество среды в колбах 150 мл. Скорость вращения качалки 200-240 об/мин. Количество посевного материала для инокуляции 5-7%.
Ферментация проводится на качалке при 37°С на среде (100 мл в колбах Эрленмейера объемом 750 мл) следующего состава, %:
| Соевая мука | 1,0 |
| Глюкоза | 0,4 |
| Крахмал | 1,5 |
| (NH4)2SO4 | 0,3 |
| CaCO3 | 0,3 |
| Вода | Водопроводная |
| pH до стерилизации | 6,6 |
Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом диффузии в агар с использованием тест-микроорганизма Bacillus subtilis 6633.
Содержание апрамицина в культуральной жидкости продуцента к концу ферментации (через 144 часа) составляет 4000 мкг/мл.
Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является способность к биосинтезу апрамицина в виде монокомпонента и в 5 раз повышенная продуктивность антибиотика, а именно содержание апрамицина в культуральной жидкости штамма-прототипа 800 мкг/мл в составе комплекса аминогликозидов, а в заявленном штамме - 4000 мкг/мл.
С целью выделения апрамицина проводят его сорбцию из нативного раствора (обработанной щавелевой кислотой и отфильтрованной от мицелия культуральной жидкости) с pH 6,7-6,9 на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме с последующей хроматографической очисткой двухколоночным методом. Десорбцию апрамицина проводят путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22)н аммиака. Элюат концентрируют в вакууме, добавляют (24,0-25,2)%-ный раствор серной кислоты до pH 6,0 и апрамицина сульфат осаждают добавлением избытка ацетона.
Апрамицина сульфат, полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini 1084, представляет собой белый порошок (допускается коричневатый оттенок), хорошо растворим в воде и нерастворим в органических растворителях. По своим физико-химическим свойствам (данные 13С-ЯМР, значения Rf при тонкослойной хроматографии и электрофоретическая подвижность при электрофорезе на бумаге в электролитах в области pH (1,7-2,5), антибактериальной активности (650 мкг/мг) и токсичности (LD50 составляет 220 мг/кг при внутривенном введении мышам) полученный апрамицина сульфат полностью соответствует апрамицину, описанному в литературе. Брутто-формула: C21H41N5O11. H2SO4. Мол. масса = 637,6 а.е.м. Мол. масса основания (метод MALDI-TOF-MS)=540 (МН)+. [α]20 D+174 (с 1,0, H2O); 13C-ЯМР (ppm): 101.59, 96.43, 95.32, 87.74, 78.40, 76.80, 74.17, 73.42, 71.70, 70.99, 67.99, 66.18, 62.31, 61.63, 53.06, 51.08, 50.23, 49.74, 36,51, 32.82, 32.76.
Выход целевого продукта 73,0% от его содержания в культуральной жидкости.
Таким образом, создан новый мутантный штамм Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084, отличающийся от известного по способности антибиотикообразования монокомпонентного апрамицина, которая в 4 раза превосходит активность штамма-прототипа 2242-ЛБ.
Антибиотическая активность нового штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084 составляет 4000 мкг/мл. Использование нового штамма Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084 как продуцента для биосинтеза апрамицина позволяет увеличить выход целевого продукта при выделении апрамицина из культуральной жидкости сорбцией на карбоксильных катионитах с последующей хроматографической очисткой двухкомпонентным методом путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22)н аммиака, концентрацией в вакууме и осаждением в форме сульфата.
ЛИТЕРАТУРА
1. Синягина О.П., Лапчинская О.А., Лаврова-Балашова М.Ф., Нестерова Т.П., Пономаренко В.И. Получение мутантов, образующих тобрамицин, в культуре продуцента комплекса аминогликозидных антибиотиков Streptomyces cremeus var. tobramycini var. nov. 2242. // Антибиотики, №12, С.891-894 (1980).
1. Штамм Streptomyces cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084 - продуцент апрамицина.
2. Способ получения ампрамицина, предусматривающий культивирование штамма Streptomyces cremeus subsp. tobramycini ВКПМ S-1084, выделение ампрамицина из культуральной жидкости сорбцией на карбоксильных катионитах с последующей хроматографической очисткой двухколоночным методом путем ступенчатой элюции растворами (0,19-0,22)н. аммиака, концентрацию в вакууме и осаждение в форме сульфата.
