Способ получения культуры клеток из перепелиных эмбрионов

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает получение яиц от перепелов, инкубацию яиц, получение эмбрионов и расщепление их раствором трипсина на магнитной мешалке на моноклетки. При этом получение яиц осуществляют от перепелов, в суточный рацион которых начиная с пятисуточного возраста и до конца яйценоскости добавляют три процента цеолита Хотынецкого месторождения Орловской области. Перед употреблением цеолит стерилизуют при температуре 120°С в течение 1 часа. Способ способствует увеличению выхода моноклеток с одного эмбриона на 70-80%. 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения монослоя клеток, используемых в технологии производства противовирусных вакцин в медицинской и ветеринарной промышленности.

Известен способ получения культуры клеток из перепелиных эмбрионов (Инструкция по изготовлению и контролю вакцин против болезни Марека, 1984 г.) (прототип). Однако данный способ экономически нецелесообразен, так как выход клеток с одного эмбриона низкий.

Технический результат заявляемого изобретения состоит в повышении выхода клеток на 70-80% с одного эмбриона без снижения их адгезивных свойств и репродукции вирусов.

Уникальный технический результат предлагаемого способа достигается тем, что в суточный рацион кормления перепелов начиная с пятисуточного возраста и до конца яйценоскости добавляют 3% цеолита Хотынецкого месторождения Орловской области, который является дополнительным источником макро- и микроэлементов, их более 40, стимулирует неспецифическую резистентность организма перепелов, обладает антиоксидантными свойствами, улучшает усвояемость корма.

Все эти положительные свойства цеолита повышают развитие эмбрионов перепелов на клеточном уровне, что подтверждается более устойчивыми свойствами цитоплазмы к воздействию раствора трипсина на ее разрушение во время трипсинизации эмбрионов, и тем самым увеличивается на 70-80% выход полноценных моноклеток с одного эмбриона по сравнению с обычной технологией.

Перед употреблением цеолит измельчают, сортируют по величине частиц: для молодняка от 5-суточного возраста до 2 недель диаметром 1 мм, а для взрослой птицы - до 2-3 мм, и стерилизуют при температуре +120°С в течение 1 часа для убивки посторонней микрофлоры.

Пример 1. В опытах использовали 9-дневные перепелиные эмбрионы при режиме инкубации +37,4°С и влажности 28,2-28,6% и поворотом лотков под углом 45° каждый час. У эмбрионов удаляли головы, взвешивали и на магнитной мешалке проводили расщепление их на моноклетки 0,25%-ным раствором трипсина в течение 20 минут. Затем фильтровали, центрифугировали и делали подсчет клеток с 1 эмбриона. В контрольных (прототипах) партиях эмбрионов выход клеток условно считали за 100% и сравнивали выход клеток в опытных партиях.

Таблица 1
Наименование партии эмбрионов	Кол-во эмбр-в (в шт.)	% отбраковки эмбр-в	Средний вес 1 эмбр (в г)	Выход клеток с 1 эмбр (в млн кл.)	% выхода оп./контр. групп
Опытная №1	100	-	0,47	86	191
Опытная №2	100	-	0,46	72	164
Опытная №3	100	-	0,47	79	184
Контр. №1 (прот.)	100	3%	0,47	45	100
Контр. №2 (прот.)	100	2%	0,46	44	100
Контр. №3 (прот.)	100	2,5%	0,45	43	100

Таблица 2
Наименование партии эмбрионов	Кол-во эмбрионов	Усредненные величины
% отхода эмбрионов	Средний вес 1 эмбриона (в г)	Выход клеток с 1 эмбриона (в млн кл.)	% выхода с 1 эмбриона
Опытные	100	-	0,47	79	180
Контрольные	100	2,3	0,46	44	100

Как видно из приведенных данных в таблицах 1 и 2, выход клеток в опытных партиях на 80% в среднем выше, чем в контрольных (прототипах).

Пример 2. Потребность опытных и контрольных перепелиных эмбрионов для получения монослоя культуры клеток в одной пятилитровой бутыли при выращивании вируса герпеса индейки ФС-126 для вакцины против болезни Марека. По технологии в 5-литровую бутыль заливают 800 мл ростовой среды и вносят культуру клеток эмбрионов перепелов из расчета 1,2 млн клеток на 1 мл ростовой среды, что составляет 960 млн клеток.

Для получения этого количества клеток потребуется с учетом, что с одного эмбриона получено в опытных партиях 79 млн клеток, 960:79=12 эмбрионов. По обычной технологии (прототип) получают в среднем с 1 эмбриона 44 млн клеток, и на одну бутыль потребуется 960:44=22 эмбриона.

Клеточный монослой в опытной партии был сплошной, не имел мертвых клеток, фибробласты веретенообразной формы, без зернистости, в контрольной же партии наблюдались незначительные скопления мертвых клеток, фибробласты частично овальной формы с зернистыми вкраплениями, что указывает на их неполноценность. Поэтому и титр вакцинного вируса герпеса индейки ФС-126 против болезни Марека выше в опытных партиях (4,7·10⁶) по сравнению с контрольными (4,0·10⁶).

Предложенный способ апробирован с положительными результатами в лабораторных и производственных условиях и в отличие от известного обладает следующими преимуществами:

- на 2-3% уменьшен отход эмбрионов (таблица 1);

- на 80% увеличен выход клеток с 1 эмбриона (таблица 2);

- на 80% уменьшается расход используемых материалов и трудовых затрат при трипсинизации эмбрионов;

- качество вируса герпеса индейки ФС-126 выше в опытной партии, чем в контрольной.

Источники информации

Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против болезни Марека. 1984 г. (прототип).

Способ получения культуры клеток из перепелиных эмбрионов, включающий получение яиц от перепелов, инкубацию яиц и получение эмбрионов, расщепление их раствором трипсина на магнитной мешалке на моноклетки, отличающийся тем, что получение яиц осуществляют от перепелов, в суточный рацион которых, начиная с пятисуточного возраста и до конца яйценоскости, добавляют три процента цеолита Хотынецкого месторождения Орловской области, причем перед употреблением цеолит стерилизуют при температуре 120°С в течение 1 ч.