Способ определения генетического родства штаммов холерных вибрионов методом секвенирования генов, фланкирующих кластер генов биосинтеза о-антигена

Способ по изобретению предусматривает выделение ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции (ПНР) с использованием олигонуклеотидных праймеров, представленных в формуле изобретения, с последующим определением нуклеотадной последовательности амплифицированных фрагментов генов rjg, gmhD и orf2 и сравнением их с аналогичными генами штаммов холерных вибрионов других серогрупп. Определение генетического родства штаммов холерных вибрионов различного происхождения проводят по количеству единичных нуклеотидных замен в генах rjg, gmhD и orf2, фланкирующих кластер генов биосинтеза O-антигена, в сравнении с аналогичными генами холерных вибрионов других серогрупп, представленных в базе данных GenBank. Использование изобретения позволяет быстро, эффективно и надежно устанавливать родственные связи штаммов холерных вибрионов различного происхождения с другими холерными вибрионами, в том числе и с вирулентными и эпидемически значимыми вибрионами O1 и O139 серогрупп. 2 табл.

 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности, к определению филогенетического родства холерных вибрионов, выделенных из различных источников, и молекулярному типированию штаммов Vibrio cholerae.

Холерные вибрионы, относящиеся к виду V.cholerae, являются многочисленной и разнообразной группой бактерий, существующих в пресноводных и морских биоценозах. Среди них встречаются как высоковирулентные эпидемические штаммы V.cholerae O1 и O139 серогрупп, так и штаммы других серогрупп, которые способны вызывать лишь локальные вспышки холероподобных заболеваний или отдельные случаи гастроэнтеритов. Важной задачей является установление происхождения штамма и определение его родства с другими вибрионами, особенно с теми из них, которые имеют высокую вирулентность и высокий эпидемический потенциал.

Микробиологические, биохимические и другие методы идентификации являются не вполне надежными, поскольку фенотипические свойства холерных вибрионов могут меняться в зависимости от внешних условий. Высокую эффективность и воспроизводимость имеют различные генетические методы (риботипирование, пульс-гель-электрофорез, анализ вариабельных тандемных повторов и другие), среди которых первое место занимает метод мультилокусного секвенирования, связанный с определением нуклеотидных последовательностей нескольких фрагментов генома бактерий. Этот метод позволяет в достаточно короткие сроки получать достоверную информацию о штамме бактерий и проводить его сравнение с другими изучаемыми или представленными в генетических базах данных штаммами.

В настоящее время для генотипирования холерных вибрионов методом мультилокусного секвенирования используют такие гены холерных вибрионов, как: asd, mdh, hlyA, recA, dnaE (Byun et al., 1999); asd, cadA, idh, lap, mdh, epd (Farfan et al., 2002); dnaE, lap, recA, pgm, gyrB, cat, chi, rstR, gmd (Garg et al., 2002); gyrB, recA, pgm, ctxA, ctxB, tcpA (Kotetishili et al., 2003); recA, rpo, 16S rRNA (Thompson, Gevers, 2005); atp, pyrH, recA, rpoA (Thompson, et al., 2007); recA, pyrH, rpoD, rtcB, gyrB, toxR и 16S rRNA (Pascual et al., 2007); pyrH, recA, rpoA, ftysZ, gapA, gyrB, mreB и topA (Sawabe, Kita-Tsukamoto, Thompson, 2007). Использование этих генов позволяет хорошо дифференцировать различные виды рода Vibrio, а также филогенетически удаленные группы внутри вида V.cholerae, но оно является мало эффективным для разделения близкородственных холерных вибрионов.

Известен способ определения генетического родства холерных вибрионов, включающий выделение ДНК холерных вибрионов, проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью олигонуклеотидных праймеров на гены gyrH, pgm, recA, tcpA, ctxA, ctxB, определение нуклеотидных последовательностей полученных в ПЦР генов, сравнение этих последовательностей с последовательностями аналогичных генов у других холерных вибрионов или с данными GenBank, дифференциацию вибрионов различных филогенетических групп (Kotetishvili M., Stine O.C., Chen Y. et al. Multilocus sequence typing has better discriminatory ability for typing Vibrio cholerae than does pulsed-field gel electrophoresis and provides a measure of phylogenrtic relatedness // J. Clinical Microbiology. - 2003. - Vol.41. - P.2191-2196). Использование генов gyrH, pgm, recA в описанном способе позволяет дифференцировать филогенетически удаленные между собой вибрионы, а также устанавливать родство изучаемых штаммов с эпидемически значимыми вибрионами O1 и O139 серогрупп. Однако этот способ является недостаточно эффективным для разделения близко родственных холерных вибрионов. Применение трех других генов tcpA, ctxA, ctxB, предложенных в этом способе, имеет еще меньшую разрешающую способность по сравнению с вышеуказанными генами gyrH, pgm, recA. Кроме того, способ в первую очередь предназначен для анализа вирулентных холерных вибрионов, у которых в геноме присутствуют гены вирулентности tcpA, ctxA, ctxB.

Задачей изобретения является поиск в геноме холерных вибрионов менее консервативных генов, отличающихся большей вариабельностью их нуклеотидных последовательностей, использование которых позволяет более эффективно оценивать родственные связи холерных вибрионов, выделяемых из различных источников.

Впервые авторами предложен способ определения генетического родства штаммов холерных вибрионов, основанный на использовании в качестве ДНК мишеней для мультилокусного секвенирования генов rjg, gmhD и orf2, фланкирующих кластер генов биосинтеза O-антигена. Кластер генов O-антигена имеет у всех холерных вибрионов одинаковую организацию и ограничен генами rjg справа и gmhD, orf2 слева. Гены rjg, gmhD и orf2 выявлены у всех исследованных к данному моменту вибрионов. Фланкирующие кластер O-антигена гены являются сайтами для рекомбинационных событий, по которым у холерных вибрионов проходит замена кластеров генов O-антигена одной серогруппы на другую. Эти данные позволяют предположить определенную вариабельность нуклеотидной последовательности генов rjg, gmhD и orf2 и указывают на возможность использования фланкирующих кластер O-антигена участков генома для определения филогенетических связей различных штаммов холерных вибрионов.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности определения генетического родства холерных вибрионов, выделенных из различных источников.

Технический результат достигается способом определения родства холерных вибрионов, основанном на методе секвенирования, который предусматривает выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции, амплификацию фрагментов генов rjg, gmhD, orf2, фланкирующих кластер генов биосинтеза O-антигена, при этом олигонуклеотидные праймеры на гены rjg, gmhD и orf2 имеют следующие последовательности:

RJG-1 5'- -3' CCCGTTGGCTGTGGAGTTT

RJG-2 5'- -3' TAATCTGCCCGCTCTGGC

GMHD-1 5'- -3' TGAAGAGGCATACAGGAAGG

GMHD-2 5'- -3' GGCAGCAACATTATCAAAGC

ORF2-1 5'- -3' GCTGCGCTGCGTTTAAAGA

ORF2-2 5'- -3' CCAAAGCTCACGATGGCCT,

определение нуклеотидной последовательности фрагментов генов rjg, gmhD, orf2, установление родства штаммов путем сравнения нуклеотидных последовательностей генов rjg, gmhD, orf2 по количеству единичных нуклеотидных замен с данными GenBank или с последовательностями аналогичных генов у других холерных вибрионов.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма холерного вибриона проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-11 групп патогенности».

Полимеразную цепную реакцию осуществляют по стандартной методике (МУ 1.3.1794-03) с применением вышеуказанных праймеров на гены rjg, gmhD и orf2.

Олигонуклеотидные праймеры, используемые для амплификации в ПЦР фрагментов генов rjg, gmhD, orf2, рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей этих генов у штамма холерного вибриона N16961, представленных в базе данных GenBank. С помощью рассчитанных праймеров проводят в ПЦР амплификацию фрагментов генов rjg, gmhD и orf2 и определяют нуклеотидные последовательности полученных фрагментов генов (таблица 1). Олигонуклеотидные праймеры на rjg, gmhD и orf2 имеют следующий состав:

RJG-1 5'- -3' CCCGTTGGCTGTGGAGTTT

RJG-2 5'- -3' TAATCTGCCCGCTCTGGC

GMHD-1 5'- -3' TGAAGAGGCATACAGGAAGG

GMHD-2 5'- -3' GGCAGCAACATTATCAAAGC

ORF2-1 5'- -3' GCTGCGCTGCGTTTAAAGA

ORF2-2 5'- -3' CCAAAGCTCACGATGGCCT

Полимеразную цепную реакцию с амплификацией фрагментов генов на rjg, gmhD и orf2 с применением праймеров RJG-1/RJG-2, GMHD-1/GMHD-2 и ORF2-1/ORF2-2 осуществляют по следующей программе: 1-й цикл - 95°С, 5 мин; 2-35-й циклы - 95°С, 30 сек; 61°С, 40 сек; 72°С, 30 сек.

Определение нуклеотидных последовательностей ПЦР - фрагментов генов rjg, gmhD и orf2 - проводят на автоматическом секвенаторе по методу F. Sanger et al. (1977) с использованием прямых и обратных праймеров. Амплифицированные в ПЦР фрагменты генов rjg, gmhD и orf2 имеют размеры 447 п.н., 315 п.н., и 373 п.н. соответственно.

Полученные в результате секвенирования нуклеотидные последовательности генов rjg, gmhD и orf2 у изучаемых штаммов сравнивают с последовательностью аналогичных генов штамма O1 серогруппы биовара эльтор V.cholerae N16961 (базы данных GenBank) с помощью программ BLAST и MEGA4, со штаммом O1 серогруппы классического биовара V.cholerae O395 (GenBank), референтным штаммом МO45 или между собой. Результаты сравнения нуклеотидных последовательностей фрагментов генов rjg, gmhD и orf2 у штаммов холерных вибрионов различных серогрупп со штаммом V.cholerae N16961 серогруппы O1 биовара эльтор (GenBank) представлены в таблице 1. Интерпретацию полученных результатов осуществляют в соответствии с таблицей 2.

Определение генетического родства штаммов холерных вибрионов проводят по количеству единичных замен нуклеотидов в генах rjg, gmhD и orf, выявленных относительно штамма Vibrio cholerae N16961 серогруппы O1 биовара эльтор, полная нуклеотидная последовательность которого представлена в базе данных NCBI GenBank. Совпадение нуклеотидной последовательности этих генов с аналогичными генами у штамма N16961 свидетельствует о принадлежности изучаемого штамма к генотипу 1, к которому относятся холерные вибрионы O1 серогруппы биовара эльтор, вирулентные (см. таблицу 2). Присутствие замен трех нуклеотидов в гене orf2 (на фрагменте гена размером 373 п.н) и наличие одной или ее отсутствие в генах rjg (447 п.н.) и gmhD (315 п.н.) свидетельствует о принадлежности штамма к генотипу 3 (3-1, 3-2, 3-3), к которому относятся вибрионы O1 серогруппы классического биовара (см. таблицу 2). Наоборот отсутствие различий в гене orf2, но наличие 7 или 8 замен в гене gmhD (315 п.н.) и 13 замен в гене rjg (447 п.н.) относительно аналогичных генов штамма N16961 является доказательством принадлежности изучаемого штамма к генотипу 4 (4-1, 4-2), к которому принадлежат холерные вибрионы O139 серогруппы, вирулентные. Большое количество различий во всех трех генах rjg, gmhD и orf2 по сравнению со штаммом N16961 свидетельствует о принадлежности изучаемого штамма к другим филогенетическим линиям и соответствующим им генотипам - 2, 5, 6, 7 и т.д. (см. табл.2). Если исследуемые штаммы холерных вибрионов имеют множественные замены нуклеотидов в генах rjg, gmhD и orf2 по сравнению со штаммом N16961, но их количество у них идентично или отличается несущественно (одна или две единичные замены в трех генах) между собой, то эти штаммы относятся к одной филогенетической группе вибрионов (см. таблицу 2).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Определение генетического родства штамма Vibrio cholerae T4 с другими холерными вибрионами (модельный эксперимент)

Выделение ДНК штамма V.cholerae T4 проводят стандартным методом (с помощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинизотиоцианата с предварительным обеззараживанием культуры вибриона путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при температуре 56°С в течение 30 мин (организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности (МУ 1.3.1794-03)).

Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме 25 мкл; реакционная смесь содержит: 1х буфер (10х ПЦР-буфер - 2,5 мкл), MgCl₂ - 2,0 мМ, смесь dNTP - 0,3 мМ, олигонуклеотидные праймеры - 2 пмол, Taq DNA полимераза - 0,1 ед., исследуемой ДНК - 10 мкл. Продукты амплификации анализируют в 1-2% агарозном геле с добавлением этидиум бромида и просматриваются в УФ-свете.

Нуклеотидные последовательности образованных в ПЦР фрагментов генов rjg, gmhD и orf2 определяют на автоматическом секвенаторе по методу F.Sanger et al. (1977) с использованием прямых и обратных праймеров. Амплифицированные в ПЦР фрагменты генов rjg, gmhD и orf2 имеют размеры 447 п.н., 315 п.н., и 373 п.н. соответственно.

Определенные с помощью вышеуказанных манипуляций нуклеотидные последовательности генов rjg, gmhD и orf2 штамма V.cholerae T4 сравнивают с последовательностями этих генов у штамма N16961 серогруппы O1 биовара эльтор (GenBank). Последовательности генов rjg, gmhD и orf2 у штаммов T4 и N16961 идентичны. Делают заключение о том, что штамм T4 относится к генотипу 1, к которому принадлежат вибрионы O1 серогруппы биовара эльтор, вирулентные (см. таблицы 1, 2).

Пример 2. Определение генетического родства штамма V.cholerae P17815 проводится аналогично примеру 1. Полученные нуклеотидные последовательности генов rjg, gmhD и orf2 сравнивают с последовательностью этих генов у штамма N16961 серогруппы O1 биовара эльтор (GenBank). Они имеют существенные различия. В гене rjg имеется 1 нуклеотидная замена, в гене gmhD - 12, в orf2 - 12 замен по сравнению с N16961. Делается вывод о том, что штамм Р 17815 не относится к генотипу 1, но принадлежит к генотипу 2 (2-1), к которому относятся холерные вибрионы O1 серогруппы биовара эльтор, авирулентные (см. таблицы 1, 2).

Пример 3. Определение родственных связей штамма V.cholerae В53-2 осуществляют аналогично примеру 1. Полученные нуклеотидные последовательности генов rjg, gmhD и orf2 сравнивают с последовательностью этих генов у штамма N16961 серогруппы O1 биовара эльтор (GenBank). Наличие трех замен нуклеотидов в гене orf2 и наличие одной в гене rjg, а также отсутствие замен в гене gmhD свидетельствует о принадлежности штамма к генотипу 3 (3-2), к которому также относятся вибрионы O1 серогруппы классического биовара (см. таблицы 1, 2).

Пример 4. Определение родственных связей штамма V.cholerae AP1 осуществляют аналогично примеру 1. На основании отсутствия нуклеотидных замен в последовательности гена orf2, наличия 7 замен в гене gmhD и 13 замен в гене rjg штамм АР-1 относят к генотипу 4 (4-1), к которому принадлежат холерные вибрионы O139 серогруппы, вирулентные.

Пример 5. Определение генетического родства штамма V.cholerae M420 осуществляют аналогично примеру 1. Наличие 16 замен в гене rjg, 11 - в gmhD и 22 - в orf2 относительно штамма N16961 свидетельствуют о том, что изучаемый штамм M420 относится к генотипу 5 (5-1), к которому относятся холерные вибрионы O139 серогруппы, авирулентные.

Пример 6. Определение генетического родства штаммов V.cholerae Р16134, Р16140, P16146 осуществляют аналогично примеру 1. В гене rjg присутствуют 14, gmhD - 12 и orf2 - 24 нуклеотидные замены относительно N16961. Штаммы относят к генотипу 6 (6-2), к которому принадлежат также холерные вибрионы не O1 /не O139 серогруппы, вирулентные. По последовательностям генов rjg, gmhD и orf2 штаммы идентичны. Делается вывод о том, что штаммы Р 16134, Р 16140, Р 16146 относятся к одной филогенетической линии.

Пример 7. Определение генетического родства штамма V.cholerae P4107 осуществляют аналогично примеру 1. Полученные нуклеотидные последовательности генов rjg, gmhD и orf2 сравнивают с последовательностями этих генов у штаммов V.cholerae N16961. В гене rjg содержится 17 замен нуклеотидов, в gmhD - 15 и в orf2 - 14. Делают вывод о принадлежности штамма к генотипу 7 (7-1), к которому относятся также холерные вибрионы не O1 / не O139 серогруппы, авирулентные.

Пример 8. Определение генетического родства штамма V.cholerae P-8845 осуществляют аналогично примеру 1. Полученные нуклеотидные последовательности генов rjg, gmhD и orf2 сравнивают с последовательностями этих генов у штаммов V.cholerae N16961 серогруппы O1 биовара эльтор (GenBank). В гене rjg присутствует 15 замен нуклеотидов, в гене gmhD - 15 и в гене orf2 - 10. Делают вывод о принадлежности штамма V.cholerae Р-8845 к генотипу 7 (7-2), к которому относятся холерные вибрионы не O1 / не O139 серогруппы, авирулентные.

Отличительной особенностью заявляемого способа является использование в качестве ДНК мишеней для мультилокусного секвенирования последовательностей - генов rjg, gmhD и orf2, ранее никогда не применявшихся для определения генетического родства холерных вибрионов. Преимущество использования этих генов заключается в том, что они позволяют разделять не только филогенетически удаленные группы холерных вибрионов, но и проводить дифференциацию между близкородственными вибрионами O1 серогруппы классического и эльтор биоваров и O139 серогруппы. Использование генов в заявляемом способе, имеющих большую вариабельность нуклеотидных последовательностей по сравнению с другими применяемыми в настоящее время генами холерных вибрионов, значительно повышает эффективность определения родственных связей холерных вибрионов различного происхождения. Применение рассчитанных нами праймеров на гены rjg, gmhD, orf2 позволяет проводить секвенирование небольших (соответственно 447, 315 и 373 п.н.), но наиболее вариабельных фрагментов этих генов. Заявленный способ успешно апробирован на шестидесяти двух штаммах холерных вибрионов. Сорок три штамма представлены в таблице 1.

Таким образом заявленный способ, основанный на определении нуклеотидной последовательности фрагментов генов rjg, gmhD и orf2, фланкирующих кластер генов биосинтеза O-антигена, позволяет эффективно и надежно устанавливать родственные связи штаммов холерных вибрионов различного происхождения и определять наличие возможного родства выделяемых изолятов с вирулентными и эпидемически значимыми вибрионами O1 и O139 серогрупп.

Способ определения генетического родства штаммов холерных вибрионов методом секвенирования генов, фланкирующих кластер генов биосинтеза O-антигена

Таблица 1
Штаммы V.cholerae	Фрагменты генов и количество единичных нуклеотидных замен в них относительно штамма N16961 серогруппы O1 биовара эльтор (GenBank)
rjg (447 п.н.)	gmhD (315 п.н.)	orf2 (373 п.н.)
Серогруппы O1 биовара эльтор
Вирулентные:
N16961 (GenBank)	0	0	0
Т23	0	0	0
Т4	0	0	0
579/67	0	0	0
	Авирулентные
Р17815	1	12	12
М1379	1	9	12
М1157	1	2	5
М1114	1	2	5
М1280	16	8	13
Серогруппы O1 классического биовара
0395 (GenBank)	0	0	3
В53-2	1	0	3
2А «Инаба»	1	0	3
4 Афг	1	0	3
Дакка 22	1	0	3
Дакка 35	1	0	3
ПАК 27	1	0	3
35 A3	1	0	3
569 В	1	1	3
МАК 154	1	1	3

Серогруппы O139
Вирулентные
МО45 референтный	13	7	0
SG24	13	7	0
API	13	7	0
Р07	13	7	0
SG25	13	8	0
	Авирулентные
М420	16	11	22
М457	17	33	4
М481	10	10	9
М419	17	53	4
М388	17	53	4
М399	17	53	4
М482	17	8	5
Серогруппы не O1 / не O139
Вирулентные
Р16132	14	12	24
Р16134	14	17	24
Р16136	14	17	24
Р16139	14	17	24
Р16140	14	17	24
Р16146	14	17	24
Авирулентные
Р-4107	17	15	14
Р-8845	15	15	10
М430	14	12	23
М3795	20	11	18
10332	12	22	35
110-68	10	9	19

Способ определения генетического родства штаммов холерных вибрионов методом секвенирования генов, фланкирующих кластер генов биосинтеза O-антигена

Таблица 2
Гены и количество нуклеотидных замен в них относительно штамма N16961 серогруппы O1 биовара эльтор	Генотип	Генетическое родство штамма V.cholerae:
rjg	gmhD	orf2
0	0	0	1	серогруппа O1 б/в эльтор, вирулент.
1	12	12	2-1	серогруппа O1 б/в эльтор, авирулент.
1	9	12	2-2	-«-
1	2	5	2-3	-«-
16	8	13	2-4	-«-
0	0	3	3-1	серогруппа O1 классич. вирулентн.
1	0	3	3-2	-«-
1	1	3	3-3	-«-
13	7	0	4-1	серогруппа O139, вирулент.
13	8	0	4-2	-«-
16	11	22	5-1	серогруппа O139, авирулент.
17	33	4	5-2	-«-
10	10	9	5-3	-«-
17	53	8	5-4	-«-
17	8	5	5-5	-«-
14	12	24	6-1	серогруппа не O1/ не O139, вирулент.
14	17	24	6-2	-«-
17	15	14	7-1	серогруппы не O1/ не O139, авирулент.
15	15	10	7-2	-«-
14	12	23	7-3	-«-
20	11	18	7-4	-«-
12	22	35	7-5	-«-
10	9	19	7-6	-«-

Способ определения генетического родства штаммов холерных вибрионов методом секвенирования, включающий выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции, амплификацию фрагментов генов, определение нуклеотидной последовательности фрагментов генов, анализ результатов, отличающийся тем, что при проведении ПЦР используют праймеры на гены rjg, gmhD, orf2, фланкирующие кластер генов биосинтеза O-антигена, при этом праймеры имеют следующие последовательности:
RJG-1 5'- -3' CCCGTTGGCTGTGGAGTTT;
RJG-2 5'- -3' TAATCTGCCCGCTCTGGC;
GMHD-1 5'- -3' TGAAGAGGCATACAGGAAGG;
GMHD-2 5'- -3' GGCAGCAACATTATCAAAGC;
ORF2-1 5'- -3' GCTGCGCTGCGTTTAAAGA;
ORF2-2 5'- -3' CCAAAGCTCACGATGGCCT,
определение родственных связей холерных вибрионов осуществляют путем сравнения нуклеотидных последовательностей генов rjg, gmhD, orf2 исследуемого штамма по количеству единичных нуклеотидных замен с данными, представленными в GenBank, или с последовательностями аналогичных генов у других холерных вибрионов.