Способ получения посттестового лейкоконцентрата периферической крови

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, точнее к диагностике крови. Предложен способ получения посттестового лейкоконцентрата, который включает функциональный тест: в пробирку типа Эпендорф на 1.5 мл вносят 0.05 мл свежей гепаринизированной крови, в ту же пробирку вносят 0.05 мл 0.2% раствора нитросинего тетразолия (НСТ) на фосфатносолевом буфере или 0.05 мл взвеси частиц для фагоцитоза, при этом по завершении функционального теста выполняют следующие действия: в пробирку добавляют 1 мл 3.5% раствора уксусной кислоты, тщательно перемешивают, центрифугируют 5 минут при 1500 оборотах в минуту, удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в оставшейся жидкости, и, равномерно распределяя, наносят на предметное стекло, затем сушат и окрашивают любым подходящим способом. Изобретение обеспечивает улучшение функциональных свойств посттестового лейкоконцентрата.

 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам диагностирования физиологического состояния организма с помощью исследований, включающих исследование биологического материала, например крови.

Известны способы функциональной диагностики лейкоцитов периферической крови млекопитающих, в которых наиболее часто оценивают фагоцитарную реакцию и HCT-тест. Оба теста могут проводиться в двух вариантах: с цельной (нефракционированной) кровью или с лейкоцитарным концентратом, выделенным из крови. Первый вариант более физиологичен и объективней отражает функциональную активность лейкоцитов периферической крови млекопитающих. Результаты теста определяются микроскопией окрашенных мазков, но так как в мазке доминируют эритроциты (их более чем в 1000 раз больше, чем лейкоцитов) и для нахождения и подсчета нужного количества лейкоцитов (обычно не менее 100) нужно просмотреть большое количество полей зрения, то для этого требуется много времени. Другой вариант теста позволяет быстро визуализировать и подсчитывать нужное количество лейкоцитов, так как работа производиться с лейкоцитарным концентратом, максимально освобожденным от эритроцитов. Но получение самого лейкоконцентрата сопровождается нефизиологичным воздействием на клетки (гипотонический шок дистилированной водой, лизис эритроцитов хлоридом аммония, разделение клеток в градиенте плотности и т.д.), что в свою очередь может изменить базовые функциональные свойства лейкоцитов крови и создает невозможность сравнения результатов клинических или исследовательских работ, выполненных разными авторами. Кроме того, сокращение времени при микроскопии не ускоряет процесса функциональной диагностики лейкоцитов периферической крови млекопитающих, так как много времени тратится на выделение и отмывание лейкоконцентрата (1. Берестов В.А. Узенбаева Л.Б. Фагоцитарная реакция крови у песцов и норок. Ленинград. «Наука». Ленинградское отделение. 1983 год. 2. Меншиков И.В., Бедулаева Л.В. Основы иммунологии. Лабораторный практикум. Издательский дом «Удмурдский университет». Ижевск. 2001 год. 3. Штельцнер А. Фагоцитоз. Иммунологические методы. Под редакцией Фримеля Г. Стр.378-390. Москва. «Мир». 1987 год).

Задача изобретения - улучшение функциональных свойств посттестового лейкоконцентрата.

Технический результат поставленной задачи в способе получения посттестового лейкоконцентрата периферической крови млекопитающих, включающем функциональный тест: в пробирку типа Эпендорф на 1.5 мл вносим 0.05 мл свежей гепаринизированной крови, в ту же пробирку, например, вносим 0.05 мл 0.2% раствора нитросинего тетразолия (HCT) на фосфатносолевом буфере или 0.05 мл взвеси частиц для фагоцитоза, предлагается по завершении функционального теста выполнить следующие действия: в пробирку добавить 1 мл 3.5% раствор уксусной кислоты, тщательно перемешать, центрифугировать 5 минут при 1500 оборотах в минуту, удалить надосадочную жидкость, осадок ресуспендировать в оставшейся жидкости и, равномерно распределяя, нанести на предметное стекло, затем сушить и окрашивать любым подходящим способом.

Способ получения посттестового лейкоконцентрата периферической крови млекопитающих осуществляется следующим образом.

Вначале выполняем функциональный тест свежей гепаринизированной крови для оценки фагоцитоза для чего: в пробирку типа Эпендорф на 1.5 мл вносим 0.05 мл свежей гепаринизированной крови; в зависимости от цели исследования в ту же пробирку вносим 0.05 мл 0.2% раствора НСТ на фосфатносолевом буфере или 0.05 мл взвеси частиц для фагоцитоза, и проводим процедуру; по завершении функционального теста в пробирку добавляем 1 мл 3.5% раствора уксусной кислоты; пробирку тщательно перемешиваем, после чего центрифугируем 5 минут при 1500 оборотах в минуту; после центрифугирования надосадочную жидкость удаляем, а осадок ресуспендируем в оставшейся неудаленной жидкости (желательно, чтобы общий объем осадка был не более 0.005 мл наносим на предметное стекло и слегка размазываем; после этого мазки сушим, фиксируем и окрашиваем любым подходящим способом.

Положительный эффект от использования предлагаемого способа получения посттестового лейкоконцентрата периферической крови млекопитающих заключается в том, что данный способ приготовления лейкоцитарного концентрата позволяет получить цитологические препараты с такой плотностью тестируемых клеток, при которой в одном поле зрения (при увеличении более 1000) можно одновременно видеть и соответственно просчитывать сразу несколько (до 20) тестируемых клеток. Приготовление лейкоцитарного концентрата производится уже после проведения функционального теста и поэтому не влияет на исходные свойства лейкоцитов крови. Приготовление лейкоцитарного концентрата производится в один этап и не требует дополнительной обработки клеток. Приготовление лейкоцитарного концентрата при помощи 3.5% раствора уксусной кислоты позволяет: а - остановить тестируемую реакцию, б - зафиксировать тестируемые клетки, в - отмыть тестируемые клетки от субстрата. Приготовление лейкоцитарного концентрата при помощи 3.5% раствора уксусной кислоты не изменяет морфологии лейкоцитов, не влияет на вид фагоцитированных частиц, не изменяет цвет и не растворяет частицы формазана.

Способ получения посттестового лейкоконцентрата периферической крови млекопитающих, включающий функциональный тест: в пробирку типа Эпендорф на 1,5 мл вносят 0,05 мл свежей гепаринизированной крови, в ту же пробирку вносят 0,05 мл 0,2%-ного раствора нитросинего тетразолия (НСТ) на фосфатносолевом буфере или 0,05 мл взвеси частиц для фагоцитоза, отличающийся тем, что по завершении функционального теста выполняют следующие действия: в пробирку добавляют 1 мл 3,5%-ного раствора уксусной кислоты, тщательно перемешивают, центрифугируют 5 мин при 1500 оборотах в минуту, удаляют надосадочную жидкость, осадок ресуспендируют в оставшейся жидкости, и, равномерно распределяя, наносят на предметное стекло, затем сушат и окрашивают любым подходящим способом.