Способ получения тимосапонина вii
Владельцы патента RU 2395518:
ДЗЕ ИНСТИТЬЮТ ОФ РАДИЭЙШН МЕДСИН, ЭКЕДЕМИ ОФ МИЛИТАРИ МЕДИКАЛ САЙЕНСИЗ, ПиЭлЭй (CN)
Описывается способ получения Тимосапонина BII, который использует Китайское традиционное лекарственное средство Корневище Anemarrhenae или мочковатый корень Anemarrhena asphodeloides Bge. в качестве сырья и включает выделение Тимосапонина BII с помощью одного или нескольких процессов, выбранных из экстракции растворителем, адсорбции полимерной смолой, полиамидной хроматографии, колоночной хроматографии с обращенной фазой, колоночной хроматографии с Sephadex LH-20 и т.п., комбинированное с соответствующим способом сушки, таким как сушка при пониженном давлении, сушка вымораживанием и распылительная сушка и т.д. Тимосапонин BII, полученный с помощью настоящего способа, имеет свыше 90% чистоты, и способ является простым, практичным и пригодным для промышленного применения. 9 з.п.ф-лы, 1 табл.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к способу получения Тимосапонина BII.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Китайское традиционное лекарственное средство Корневище Anemarrhenae является корневищем Anemarrhena asphodeloides Bge.(Liliaceae), широко распространенного в Hebei, Neimenggu, провинция Шанхай, северо-восточный Китай, и в некоторых других областях. Вследствие функции очистки путем повышения температуры и очищения в результате лихорадки, и действия, стимулирующего продуцирование жидкости тела и питание легкого, оно часто применяется в клинике традиционной китайской медицины. Главными компонентами Anemarrhena asphodeloides Bge. являются стероидные сапонины, наряду с флавонами, олигосахаридами, полисахаридами и жирными кислотами, и т.п. Фармакологические исследования показали, что оно имеет антибиозный, антивирусный, пиретолитический, антидиабетический, седативный по отношению к сознанию, ингибирующий агрегацию тромбоцитов, противораковый и противолучевой эффекты, и т.п.
Тимосапонин BII, также названный как Прототимосапонин AIII, является главным компонентом корневища Anemarrhena asphodeloides Bge. Он имеет структуру (25S)-26-O-β-D-глюкопиранозил-22-гидрокси-5β-фуростан-3β, 26-диол-3-O-β-D-глюкопиранозил-(1→2)-β-D-галактопиранозид. Он имеет следующую формулу:
Тимосапонин BII был впервые выделен Toshio KAWAZAKI в 1963, но он не представил его структуру. В 1991 Seiji NAGUMO первый определил структуру Тимосапонина BII (Seiji NAGUMO с сотр., YAKUGAKI ZASSHI, 1991; 111 (1): 306-310). После этого Noboru Nakashima (NOBORU NAKASHIMA с сотр., Journal of Natural Products, 1993; 56(3): 345-350), Bai-ping Ma (Bai-ping Ma с сотр., Acta. Pharm. Sin. 1996; 31 (4): 271-277), Masayasu Kimura (Masayasu KIMURA с сотр., Biol. Pharm. Bull, 1996; 19 (7): 926-931) и Jian-ying Zhang (Jian-ying ZHANG с сотр., Clinica Chimica Acta, 1999; 289: 79-88) сообщили о выделении и активности Тимосапонина BII. Исследователи указали, что Тимосапонин BII имеет активности антидиабетическую, ингибирующую агрегацию тромбоцитов, захвата свободных радикалов и противодействия деменции. В почти всех предшествующих ссылках в данной области Тимосапонин BII получали посредством экстракции н-бутанолом, колоночной хроматографии с силикагелем с нормальной фазой, колоночной хроматографии с макропористой полимерной смолой и высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Но он легко эмульгируется при экстракции н-бутанолом, количество образца ограничено для колоночной хроматографии с силикагелем, имеются трудности в регенерации силикагеля, существуют трудности в выделении элюента хлороформ-метанол-вода. Поэтому описанные способы обычно имеют трудный технологический процесс, низкий выход, низкую чистоту и не поддаются промышленному получению. Даже с использованием макропористой полимерной смолы и жидкостной хроматографии с обращенной фазой элюент метанол-вода будет приводить к метоксилированию по С-22 гидроксила Тимосапонина BII с формированием определенной фракции Тимосапонина BI (Seiji NAGUMO с сотр., YAKUGAKU ZASSHI, 1991; 111 (I): 306-310). Так эти способы приводят к непроизводительной трате некоторого количества образцов и могут только генерировать смесь Тимосапонина BII и Тимосапонина BI, а также являются трудными до получения чистого Тимосапонина BII.
По этим причинам существует необходимость улучшения способа получения Тимосапонина BII.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является улучшенный способ получения Тимосапонина BII. В способе избегают применения н-бутанола и колоночной хроматографии с силикагелем при экстракции и очистке, избегают применения метанола для элюирования и, поэтому, обеспечивают высокую чистоту и выход Тимосапонина BII.
Таким образом, данное изобретение относится к улучшенному способу получения Тимосапонина BII, включающему:
а) обеспечение в качестве сырья отваренных кусочков Китайского традиционного лекарственного средства корневища Anemarrhenae или свежевыкопанного корневища или корня Anemarrhena asphodeloides Bge. и экстракцию растворителем, выбранным из группы, состоящей из воды, ацетона, этанола, пропанола и смеси по меньшей мере двух из них;
б) выделение экстракта из а) посредством одного или нескольких способов, выбранных из группы, состоящей из адсорбции полимерной смолой, полиамидной хроматографии, колоночной хроматографии с обращенной фазой и колоночной хроматографии с Sephadex LH-20, и элюирование элюентом, выбранным из группы, содержащей воду, ацетон, ацетонитрил, этанол, пропанол и смесь по меньшей мере двух из них;
в) объединение элюентов б), сушку и получение Тимосапонина BII.
В соответствии с настоящим изобретением на этапе а) использованным растворителем может быть любой один из воды, ацетона, этанола и пропанола или смесь, содержащая два или несколько из них в любой пропорции. Экстракт может быть получен путем иммерсионной экстракции или ультразвуковой экстракции в ультразвуковом экстракторе при комнатной температуре, или иммерсионной экстракции или экстракцией при кипячении в условиях нагревания, и экстракция может быть проведена один или несколько раз. На этапе а) предпочтительными способами экстракции являются следующие:
отваривание в воде; или кипячение, диафильтрация или ультразвуковая экстракция 10-90% раствором этанола в воде; или кипячение, диафильтрация или ультразвуковая экстракция 10-80% раствором ацетона в воде.
В соответствии с настоящим изобретением на этапе б) в отношении адсорбции полимерной смолой использованными полимерными смолами могут быть тип D-101 адсорбирующих полимерных смол, тип AB-8 адсорбирующих полимерных смол, тип XAD-2 адсорбирующих полимерных смол, тип HP20 адсорбирующих полимерных смол, тип SP825 адсорбирующих полимерных смол, тип SP700 адсорбирующих полимерных смол, тип CHP-20P адсорбирующих полимерных смол или тип SP70 адсорбирующих полимерных смол, или другие типы полистиреновых (PS) макропористых адсорбирующих полимерных смол. Используемым элюентом может быть один или несколько, выбранных из воды, ацетона, этанола и пропанола. Элюирующим способом может быть изократическое элюирование или градиентное элюирование.
В конкретном варианте осуществления супернатант после центрифугирования или фильтрат экстракта адсорбировали на макропористой полимерной смоле и примеси могли быть удалены путем элюирования водой или низкой концентрацией ацетона, или низшим спиртом (например, этанолом или пропанолом) в воде, где концентрация может быть 5-30% и объем может быть 2-7-кратным объему колонки (2-7 BV). Затем колонку элюировали наивысшей концентрацией ацетона или низшего спирта (например, этанолом или пропанолом) в воде, где концентрация может быть 20-70% и объем может быть 2-7-кратным объему колонки (2-7 BV). В зависимости от результатов детекции весь или часть элюата собирали, растворитель регенерировали и остаток концентрировали до получения неочищенного Тимосапонина BII.
В соответствии с настоящим изобретением в качестве альтернативного способа, который может быть использован на этапе б), полиамидной хроматографией может быть колоночная хроматография или статический способ адсорбирующей фильтрации и элюентом может быть один или несколько, выбранных из воды, ацетона, ацетонитрила, этанола и пропанола. Элюирующим способом может быть изократическое элюирование или градиентное элюирование.
В конкретном варианте осуществления водный раствор Тимосапонина BII загружали в полиамидную колонку и элюировали водой или низкой концентрацией ацетона, или низшим спиртом (например, этанолом или пропанолом) в воде, где концентрация может быть 0-15% и объем может быть 2-5-кратным объему колонки (2-5 BV). В зависимости от результатов детекции весь или часть элюата собирали, растворитель регенерировали и остаток концентрировали до получения Тимосапонина BII. В качестве альтернативы полиамид добавляли в водный раствор, содержащий Тимосапонин BII, перемешивали достаточно, отстаивали, фильтровали через фильтр Бюхнера и элюировали водой или низкой концентрацией ацетона, или низшим спиртом в воде. В зависимости от результатов детекции весь или часть элюата объединяли, растворитель регенерировали и остаток концентрировали до получения Тимосапонина BII. Полиамид можно было регенерировать высокой концентрацией ацетона, этанола или пропанола в воде или кислотой, или щелочью.
В качестве альтернативного способа, который может быть использован на этапе б) способа в соответствии с настоящим изобретением, колоночная хроматография с обращенной фазой может быть колоночной хроматографией с обращенной фазой при нормальном давлении или при повышенном давлении. Наполнителем колонки может быть Силикагель с обращенной фазой 18 (Силикагель RP-18) или Силикагель с обращенной фазой 8 (Силикагель RP-8). Элюентом может быть один или несколько, выбранных из ацетонитрила-воды, ацетона-воды, этанола-воды и пропанола-воды. Элюирующим способом может быть изократическое элюирование или градиентное элюирование.
В конкретном варианте осуществления образец, который содержит Тимосапонин BII, растворяли в элюенте, раствор хроматографировали на колонке с обращенной фазой и элюировали одним или несколькими, выбранными из ацетонитрила-воды, ацетона-воды, этанола-воды и пропанола-воды, где концентрация органического растворителя может быть 15-60% и элюат собирали фракционно. В зависимости от результатов детекции часть элюата объединяли, растворитель регенерировали и остаток концентрировали до получения Тимосапонина BII.
В качестве альтернативного способа, который может быть использован на этапе б) способа в соответствии с настоящим изобретением, колоночной хроматографией с Sephadex LH-20 может быть колоночная хроматография при нормальном давлении или при повышенном давлении. Элюентом может быть один или несколько, выбранных из ацетонитрила-воды, ацетона-воды, этанола-воды и пропанола-воды, и элюирующим способом может быть изократическое элюирование или градиентное элюирование.
В конкретном варианте осуществления образец, который содержит Тимосапонин BII, растворяли в элюенте, хроматографировали на Sephadex LH-20 и элюировали одним или несколькими, выбранными из ацетонитрила-воды, ацетона-воды, C2-C5 спирта (например, этанола и пропанола)-воды, где концентрация органического растворителя может быть 5-60% и элюат собирали фракционно. В зависимости от результатов детекции часть элюата объединяли, растворитель регенерировали и остаток концентрировали до получения Тимосапонина BII.
В соответствии с настоящим изобретением на этапе в) способом сушки, известным в данной области, могла быть использована, например, сушка при пониженном давлении, сушка вымораживанием и распылительная сушка.
Изобретение решило проблемы трудностей предшествующих способов из данной области техники, особенно в отношении низкой чистоты и низкого выхода Тимосапонина BII вследствие применения н-бутанола, метанола и колоночной хроматографии с силикагелем. В соответствии со способом по настоящему изобретению чистота полученного Тимосапонина была выше 90%; и этот способ является простым, практичным и выполнимым для промышленности.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры детально иллюстрируют изобретение, но не ограничивают изобретение любыми средствами.
Пример 1
Получение Тимосапонина BII
Отваренные кусочки Китайского традиционного лекарственного средства Корневища Anemarrhenae (8 кг) измельчали, к ним добавляли 48 л 50% этанола. Лекарство погружали на один час и затем при кипячении экстрагировали один час до фильтрования. Остаток также при кипячении экстрагировали более двух раз. Этанольный экстракт объединяли, этанол регенерировали и остаток концентрировали при пониженном давлении до 40 л. Предварительно обработанную макропористую адсорбирующую полимерную смолу SP825 (Mitsubishi Co., Japan) загружали в колонку (18 л), которую уравновешивали водой. Концентрированный экстракт фильтровали и фильтрат хроматографировали на колонке и промывали водой для удаления примеси. Затем колонку элюировали последовательно 3-кратным объемом колонки (3BV) 35% этанолом, 3BV 50% этанолом и 3BV 95% этанолом. Результаты детекции показали, что Тимосапонин BII был, в основном, собран во фракции 50% этанола. Эту фракцию концентрировали для удаления этанола до небольшого объема и затем этанол добавляли до 35% конечной концентрации для дальнейшего применения. Колонку с регенерированной макропористой полимерной смолой SP825 (18 л) уравновешивали 35% этанолом. Вышеупомянутый образец хроматографировали на колонке и элюировали 6BV 45% этанолом. Элюат собирали во фракции по 2000 мл на фракцию и чистоту каждой фракции детектировали с помощью HPLC. Фракции 18-30 объединяли и концентрировали для удаления этанола до небольшого объема. Полученный раствор хроматографировали на предварительно обработанной полиамидной колонке (6 л, 30-60 меш, Linjiang Reagent Chemical Plant) и элюировали 5BV воды. Вначале фракцию, содержащую окрашенный материал, отбрасывали и элюат собирали во фракции по 600 мл на фракцию и детектировали с помощью HPLC. Фракции 6-23 объединяли, концентрировали и сушили распылительной сушкой до получения Тимосапонина BII (56,5 г). Выход продукта составлял 0,71% сырого медицинского материала, и чистота, детектированная с помощью HPLC, была 90,8%.
Пример 2
Получение Тимосапонина BII
Отваренные кусочки Китайского традиционного лекарственного средства Корневища Anemarrhenae (5 кг) измельчали, к ним добавляли 30 л 30% ацетона. Лекарство погружали на два часа и затем экстрагировали 0,5 часа генератором ультразвуковых волн до фильтрования. Остаток также экстрагировали ультразвуком более двух раз. Ацетоновый экстракт объединяли, ацетон регенерировали и остаток концентрировали при пониженном давлении до 30 л. Предварительно обработанную макропористую полимерную смолу AB-8 (Tianjin Nankai Chemical Plant) загружали в колонку (18 л), которую уравновешивали водой. Концентрированный экстракт фильтровали и фильтрат хроматографировали на колонке и элюировали водой для удаления примеси. Затем колонку элюировали последовательно 3-кратным объемом колонки (3BV) 20% этанолом, 3BV 50% этанолом и 3BV 95% этанолом. Результаты детекции показали, что Тимосапонин BII был, в основном, собран во фракции 50% этанола. Эту фракцию концентрировали для удаления этанола до небольшого объема и затем сушили в вакууме до получения неочищенного образца Тимосапонина BII (286 г). 80 г неочищенного образца растворяли в 1000 мл 25% ацетона и загружали в колонку с СИЛИКАГЕЛЕМ RP-18 (6,5 л), которую предварительно уравновешивали 25% ацетоном. Колонку элюировали последовательно 28% ацетоном (20000 мл) и 30% ацетоном (20000 мл) и затем регенерировали 80% ацетоном (13000 мл). Элюаты 28% ацетона и 30% ацетона собирали во фракции по 600 мл на фракцию и чистоту каждой фракции детектировали с помощью HPLC. Фракции 6-21 объединяли и концентрировали для удаления ацетона до небольшого объема и затем лиофилизировали до получения Тимосапонина BII (12,9 г). Выход продукта составлял 0,92% неочищенного медицинского материала, и чистота, детектированная с помощью HPLC, была 94,3%.
Пример 3
Получение Тимосапонина BII
Отваренные кусочки Китайского традиционного лекарственного средства Корневища Anemarrhenae (5 кг) измельчали, к ним добавляли 30 л 30% ацетона. Лекарство погружали на два часа и затем экстрагировали 0,5 часа генератором ультразвуковых волн до фильтрования. Остаток также экстрагировали ультразвуком более двух раз. Ацетоновый экстракт объединяли, ацетон регенерировали и остаток концентрировали при пониженном давлении до 30 л. Предварительно обработанную макропористую полимерную смолу AB-8 (Tianjin Nankai Chemical Plant) загружали в колонку (18 л), которую уравновешивали водой. Концентрированный экстракт фильтровали и фильтрат хроматографировали на колонке и элюировали водой для удаления примеси. Затем колонку элюировали последовательно 3BV 20% этанолом, 3BV 50% этанолом и 3BV 95% этанолом. Результаты детекции показали, что Тимосапонин BII был, в основном, собран во фракции 50% этанола. Эту фракцию концентрировали для удаления этанола до небольшого объема и затем сушили в вакууме до получения неочищенного образца Тимосапонина BII (290 г). 80 г неочищенного образца растворяли в 1000 мл 25% раствора ацетона и хроматографировали на колонке с СИЛИКАГЕЛЕМ RP-18 (6,5 л), которую предварительно уравновешивали 32% метанолом. Колонку элюировали последовательно 32% метанолом (20000 мл) и 34% метанолом (20000 мл) и затем регенерировали 90% метанолом (15000 мл). Элюаты 32% метанола и 34% метанола собирали во фракции по 600 мл на фракцию и чистоту каждой фракции детектировали с помощью HPLC. Фракции 8-19 объединяли и концентрировали для удаления метанола до небольшого объема и затем лиофилизировали до получения Тимосапонина BII (9,79 г). Чистота, детектированная с помощью HPLC, была 73,1%. Образец растворяли в 30% ацетоне, кипятили при 95°C в течение 5 часов и концентрировали для удаления ацетона до получения небольшого объема и затем лиофилизировали до получения Тимосапонина BII (9,7 г). Выход продукта составлял 0,70% неочищенного медицинского материала, и чистота, детектированная с помощью HPLC, была 93,9%.
Пример 4
Получение Тимосапонина BII
Свежевыкопанные корневища Anemarrhena asphodeloides Bunge (4 кг) соединяли и отваривали с 10 л воды 1 час до фильтрования. 8 л воды добавляли к остатку и отваривали 1 час до фильтрования. Фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении до 10 л, к ним добавляли этанол до 25% конечной концентрации до получения экстракта для дальнейшего применения. Предварительно обработанную макропористую полимерную смолу D101 (Tianjin Agrochemical Plant) загружали в колонку (6 л), которую уравновешивали 25% этанолом. Экстрагированный раствор фильтровали и фильтрат хроматографировали на колонке. Затем колонку элюировали последовательно 3BV 25% этанолом, 3BV 35% этанолом и 3BV 90% этанолом. Результаты детекции показали, что Тимосапонин BII был, в основном, собран во фракции 35% этанола. Эту фракцию концентрировали для удаления этанола до небольшого объема. Концентрированный элюат хроматографировали на предварительно обработанной полиамидной колонке (6 л, 30-60 меш, Linjiang Reagent Chemical Plant) и элюировали 5BV воды. Вначале фракцию, содержащую окрашенный материал, отбрасывали и элюат собирали во фракции по 600 мл на фракцию и детектировали с помощью HPLC. Фракции 8-24 объединяли, концентрировали и сушили с помощью распыляющей сушки до получения неочищенного образца Тимосапонина BII (51 г). Около 40 г неочищенного образца растворяли в 200 мл 35% этанола и хроматографировали на колонке с Sephadex LH-20 (8,5 л), которую предварительно уравновешивали 35% этанолом. Колонку элюировали 35% этанолом (50000 мл) и затем регенерировали 95% этанолом (20000 мл). Элюат 35% этанола собирали во фракции по 800 мл на фракцию и чистоту каждой фракции детектировали с помощью HPLC. Фракции 16-35 объединяли и концентрировали для удаления этанола до небольшого объема и затем лиофилизировали до получения Тимосапонина BII (11,2 г). Выход продукта составлял 0,36% свежевыделенных корневищ (соответствует выходу 1,07% сухого медицинского материала), и чистота, детектированная с помощью HPLC, была 92,3%.
Пример 5
Получение Тимосапонина BII
Мочковатые корни Anemarrhena asphodeloides Bunge (2 кг) нарезали и отваривали с 16 л воды 1 час до фильтрования. 12 л воды добавляли к остатку и отваривали 1 час до фильтрования. Фильтраты объединяли и концентрировали при пониженном давлении до 12 л, к ним добавляли ацетон до получения 15% конечной концентрации для дальнейшего применения. Предварительно обработанную макропористую полимерную смолу SP700 (Mitsubishi Co., Japan) загружали в колонку (6 л), которую уравновешивали 15% ацетоном. Экстракт фильтровали и фильтрат хроматографировали на колонке. Затем колонку элюировали последовательно 3BV 25% ацетоном, 3BV 35% ацетоном и 3BV 80% ацетоном. Результаты детекции показали, что Тимосапонин BII был, в основном, собран во фракции 35% ацетона. Эту фракцию концентрировали для удаления ацетона и сушили распылительной сушкой до получения неочищенного образца Тимосапонина BII (45,0 г). Около 40 г неочищенного образца растворяли в 200 мл 10% ацетона и хроматографировали на колонке с Sephadex LH-20 (8,5 л), которую предварительно уравновешивали 10% ацетоном. Колонку элюировали 10% ацетоном (40000 мл) и затем регенерировали 80% ацетоном (20000 мл). Элюат 10% ацетона собирали во фракции по 800 мл на фракцию и чистоту каждой фракции детектировали с помощью HPLC. Фракции 20-36 объединяли и концентрировали для удаления ацетона до небольшого объема и затем лиофилизировали до получения Тимосапонина BII (9,2 г). Выход продукта составлял 0,52% корневого материала, и чистота, детектированная с помощью HPLC, была 91,7%.
Пример 6
Получение Тимосапонина BII
Свежевыкопанные корневища Anemarrhena asphodeloides Bunge (4 кг) соединяли, к ним добавляли 8 л 50% этанола. Лекарство погружали на 2 часа и затем экстрагировали 0,5 часа генератором ультразвуковых волн до фильтрования. Остаток также экстрагировали ультразвуком более двух раз. Этанольные экстракты объединяли и концентрировали при пониженном давлении для удаления этанола до 10 л. Предварительно обработанную макропористую полимерную смолу AB-8 (Tianjin Nankai Chemical Plant) загружали в колонку (6 л), которую уравновешивали водой. Концентрированный экстракт фильтровали и фильтрат хроматографировали на колонке и элюировали водой для удаления примеси. Затем колонку элюировали последовательно 3BV 20% этанолом, 3BV 50% этанолом и 3BV 95% этанолом. Результаты детекции показали, что Тимосапонин BII был, в основном, собран во фракции 50% этанола. Эту фракцию концентрировали для удаления этанола до небольшого объема и затем сушили в вакууме до получения неочищенного образца Тимосапонина BII (59,3 г). 50 г неочищенного образца растворяли в 200 мл 35% ацетона и хроматографировали на колонке с силикагелем RP-18 (6,5 л), которую предварительно уравновешивали 25% этанолом. Колонку элюировали последовательно 28% ацетоном (20000 мл) и 30% ацетоном (20000 мл) и затем регенерировали 80% ацетоном (15000 мл). Элюаты 28% ацетона и 30% ацетона собирали во фракции по 600 мл на фракцию и чистоту каждой фракции детектировали с помощью HPLC. Фракции 6-25 объединяли и концентрировали для удаления ацетона до небольшого объема и затем лиофилизировали до получения Тимосапонина BII (15,6 г). 14,1 г образца растворяли в 70 мл 25% раствора ацетона и хроматографировали на колонке с силикагелем RP-18 (6,5 л), которую предварительно уравновешивали 25% ацетоном. Колонку элюировали 28% ацетоном (40000 мл) и затем регенерировали 80% ацетоном (1200 мл). Элюат собирали во фракции по 600 мл на фракцию и чистоту каждой фракции детектировали с помощью HPLC. Фракции 8-19 объединяли и концентрировали для удаления ацетона до небольшого объема и затем лиофилизировали до получения Тимосапонина BII (4,5 г). Выход продукта составлял 0,15% свежевыкопанных корневищ (соответствует выходу 0,44% в пересчете на сухой медицинский материал), и чистота, детектированная с помощью HPLC, была 98,6%.
Продукт был в виде белого аморфного порошка с т.пл. 243°C (разл.) и был позитивен как в реакции Либермана-Бурхарда, так и в реакции Молиша, а также позитивен с реагентом Эрлиха.
Структуру полученного Тимосапонина BII идентифицировали с помощью инфракрасной спектроскопии (ИК), масс-спектрометрии (МС) и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) следующим образом:
ИК (диффузное отражение)см-1: 3348(OH), 2930, 2850, 1075, 1044 (гликозидная связь C-O).
FAB-МС (m/z): 943(M+Na)+, 903(M+H-H2O)+, 741(M+H-H2O-Glc)+, 579(M+H-H2O-Glcx2)+, 417(M+H-H2O-Glcx2-Gal)+, 399(агликон+H-H2Ox2)+, 255, 185, 145.
EI-МС (m/z): 740(M-H2O-Glc)+, 578(M-H2O-Glcx2)+, 416(агликон-H2O)+, 415(агликон-H-H2O)+, 357, 273, 217, 181, 139.
1Н-ЯМР(C5D5N)δ : 0,85(3Н, с, 18-СН3), 0,96(3Н, с, 19-СН3), 1,00(3Н, д, J=6,4 Гц, 27-СН3), 1,30(3Н, д, J=6,8 Гц, 21-СН3), 4,79(1Н, д, J=7,8 Гц, Glc 1-H), 4,901(1Н, д, J=7,8 Гц, Glc 1-Н), 5,27(1Н, д, J=7,8 Гц, Glc 1-H).
Данные 13C-ЯМР представлены в Таблице. Соединением являлся (25S)-26-O-β-D-глюкопиранозил-22-гидрокси-5β-фуростан-3β, 26-диол-3-O-β-D-глюкопиранозил-(1→2)-β-D-галактопиранозид.
| 13C-ЯМР химические сдвиги Тимосапонина BII (δ в пиридине-d3) | |||
| Положение (агликон) | δс | Положение (гликозил) | δс |
| 1 | 30,9 | gal-1 | 102,5 |
| 2 | 27,0 | 2 | 81,8 |
| 3 | 75,0 | 3 | 76,9 |
| 4 | 30,9 | 4 | 69,8 |
| 5 | 36,9 | 5 | 76,5 |
| 6 | 26,7 | 6 | 62,1 |
| 7 | 26,7 | glc-1 | 106,1 |
| 8 | 35,4 | 2 | 75,5 |
| 9 | 40,2 | 3 | 78,0 |
| 10 | 35,2 | 4 | 71,4 |
| 11 | 21,1 | 5 | 78,4 |
| 12 | 40,4 | 6 | 62,7 |
| 13 | 41,2 | 26glc-1 | 105,1 |
| 14 | 56,4 | 2 | 75,2 |
| 15 | 32,4 | 3 | 78,5 |
| 16 | 81,2 | 4 | 71,6 |
| 17 | 64,0 | 5 | 78,4 |
| 18 | 16,7 | 6 | 62,7 |
| 19 | 24,0 | ||
| 20 | 40,6 | ||
| 21 | 16,4 | ||
| 22 | 110,6 | ||
| 23 | 37,1 | ||
| 24 | 28,3 | ||
| 25 | 34,4 | ||
| 26 | 75,3 | ||
| 27 | 17,4 |
Сравнительный пример 1
Получение Тимосапонина BII
Отваренные кусочки Китайского традиционного лекарственного средства Корневища Anemarrhenae (1 кг) измельчали, к ним добавляли 6 л 60% этанола. Лекарство погружали на один час и затем при кипячении экстрагировали нагреванием один час до фильтрования. Остаток также при кипячении экстрагировали более двух раз. Этанольные экстракты объединяли и концентрировали для удаления этанола при пониженном давлении до 4 л. 4 л н-бутанола, насыщенного водой, добавляли в концентрированный раствор. Полученный раствор перемешивали до однородности путем встряхивания. Затем слой н-бутанола собирали и водный слой также экстрагировали более 4 раз путем добавления н-бутанола, насыщенного водой. Пятикратные н-бутанольные экстракты объединяли и концентрировали досуха с получением сапонинов (33,1 г). Сапонины растворяли в метаноле и смешивали с силикагелем (60 г), и затем нагревали до испарения растворителя досуха. Смешанный образец хроматографировали на колонке с силикагелем (3 л), которая была заполнена сухим способом, и элюировали градиентной смесью хлороформ-метанол-вода. Элюат хлороформ-метанол-вода (60:40:10, нижняя фаза), содержащий Тимосапонин BII, собирали и концентрировали досуха с получением неочищенного продукта (2,3 г). Неочищенный продукт далее хроматографировали на колонке с силикагелем (500 мл) и элюировали хлороформом-метанолом-водой. Элюат хлороформ-метанол-вода (65:35:10, нижняя фаза) собирали во фракции по 50 мл на фракцию. Фракции 15-23 концентрировали досуха с получением продукта (0,67 г). Продукт растворяли в 32% метаноле и хроматографировали на колонке с силикагелем RP-18 (600 мл). Колонку элюировали последовательно 32% метанолом (1800 мл) и 34% метанолом (1800 мл) и затем регенерировали 90% метанолом (1200 мл). Элюаты 32% метанола и 34% метанола собирали во фракции по 50 мл на фракцию и чистоту каждой фракции детектировали с помощью HPLC. Фракции 13-21 объединяли и концентрировали для удаления метанола до небольшого объема и затем лиофилизировали до получения Тимосапонина BII (0,34 г). Чистота, детектированная с помощью HPLC, была 75,5%. Продукт растворяли в 30% ацетоне, кипятили на водяной бане при 95°C в течение 5 часов и концентрировали для удаления ацетона, и затем лиофилизировали до получения Тимосапонина BII (0,33 г). Выход продукта составлял 0,033% неочищенного медицинского материала и чистота была 93,4%.
1. Улучшенный способ получения Тимосапонина BII, включающий
а) получение отваренных кусочков Китайского традиционного лекарственного средства Корневища Anemarrhenae или свежевыкопанного корневища, или мочковатого корня Anemarrhena asphodeloides Bunge в качестве сырья и экстракцию растворителем, выбранным из группы, состоящей из воды, ацетона, этанола, и смеси по меньшей мере двух из них;
б) выделение экстракта, полученного из а) посредством одного или нескольких способов, выбранных из группы, состоящей из адсорбции полимерной смолой, полиамидной хроматографии, колоночной хроматографии с обращенной фазой и колоночной хроматографии с Sephadex LH-20, и элюирование с помощью элюента, выбранного из группы, состоящей из воды, ацетона, ацетонитрила, этанола, и смеси по меньшей мере двух из них;
в) объединение элюатов б), сушку и получение Тимосапонина BII.
2. Способ по п.1, в котором экстракция а) является экстракцией при комнатной температуре или нагревании, или ультразвуковой экстракцией, и экстракция может быть выполнена один или несколько раз.
3. Способ по п.1, в котором экстракция растворителем а) является экстракцией с помощью способа, выбранного из группы, состоящей из:
кипячения, диафильтрации или ультразвуковой экстракции 10-95% этанолом в воде; и
кипячения, диафильтрации или ультразвуковой экстракции 10-80% ацетоном в воде, после отваривания неочищенного материала в воде.
4. Способ по п.1, в котором в адсорбции полимерной смолой в б) применяемая полимерная смола является полистироловым типом макропористой полимерной смолы, применяемый элюент выбран из группы, состоящей из воды, ацетона, ацетонитрила и этанола, и элюирование может быть изократическим элюированием или градиентным элюированием.
5. Способ по п.4, в котором полимерной смолой в б) является тип D-101 адсорбирующей полимерной смолы, тип АВ-8 адсорбирующей полимерной смолы, тип XAD-2 адсорбирующей полимерной смолы, тип НР20 адсорбирующей полимерной смолы, тип SP825 адсорбирующей полимерной смолы, тип SP700 адсорбирующей полимерной смолы, тип СНР-20Р адсорбирующей полимерной смолы или тип SP70 адсорбирующей полимерной смолы.
6. Способ по п.5, в котором процесс адсорбции полимерной смолой включает адсорбцию супернатанта после центрифугирования или фильтрата растворенного экстракта на макропористой полимерной смоле, удаление примеси путем элюирования водой или 5-30% ацетоном или этанолом в воде в количестве 2-7-кратным объему колонки и затем элюирование 20-70% ацетоном, этанолом или пропанолом в воде в количестве 2-7-кратным объему колонки.
7. Способ получения Тимосапонина BII по п.1, в котором полиамидной хроматографией в б) является колоночная хроматография или статический способ адсорбирующего фильтрования и элюентом является растворитель, выбранный из группы, состоящей из воды, ацетона, ацетонитрила и этанола, и элюирование может быть изократическим элюированием или градиентным элюированием.
8. Способ по п.1, в котором полиамидная хроматография в б) включает загрузку водного раствора Тимосапонина BII в полиамидную колонку и затем элюирование водой или 0-15% раствором ацетона или этанола в воде в количестве 2-5-кратным объему колонки.
9. Способ по п.1, в котором колоночной хроматографией с обращенной фазой является колоночная хроматография с обращенной фазой при нормальном давлении или при повышенном давлении, наполнителем колонки является силикагель RP-18 (ODS) или RP-8, элюент выбран из группы, состоящей из ацетонитрила-воды, ацетона-воды и этанола-воды, и элюирование может быть изократическим элюированием или градиентным элюированием.
10. Способ получения Тимосапонина BII по п.1, в котором колоночной хроматографией с Sephadex-20 является колоночная хроматография при нормальном давлении или при повышенном давлении, элюент выбран из группы, состоящей из ацетонитрила-воды, ацетона-воды и этанола-воды, и элюирование может быть изократическим элюированием или градиентным элюированием.
