Способ получения гепарина с низкой молекулярной массой и антикоагулянтной активностью

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ получения низкомолекулярных гепаринов с помощью ферментативного расщепления. Для ферментной деполимеризации используют лизоцим и в иммобилизованном виде. Полученный низкомолекулярный гепарин обладает увеличенной ингибиторной активностью по отношению к фактору свертывания крови Ха и уменьшенной ингибиторной активностью по отношению к тромбину, в сравнении с исходным гепарином. 2 табл.

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективного средства профилактики и лечения тромботических состояний (инфаркты, инсульты, тромбозы различной локализации).

В последнее десятилетие низкомолекулярные гепарины (НМГ) с более узким молекулярно-массовым распределением 4-6 кДа начали вытеснять нефракционированный гепарин как лекарственный препарат. Главное преимущество НМГ следует из их фармакокинетических свойств: в 2-4 раза большее время полувыведения из организма, заметно лучшая биодоступность при подкожном введении и более стабильная дозовая реакция (доза может быть рассчитана только исходя из веса пациента, без дополнительного лабораторного исследования). Меньший токсический эффект связан с вызываемой нефракционированным гепарином тромбоцитопенией, что, в свою очередь, обусловлено меньшим взаимодействием НМГ с тромбоцитами.

Ранее была показана возможность получения НМГ под действием гидролитических ферментов, никогда с этой целью не использованных. Таких как папани, химотрипсин, «протеаза С» или целловиридин [1].

Цель изобретения - получение НМГ с помощью фермента лизоцима яичного белка. Данная цель достигается тем, что для гидролиза используется фермент лизоцим. Он легко доступен, дешев. Ранее НМГ с помощью лизоцима никто не получал.

Лизоцим - мураминидаза, фермент класса гидролаз способен разрушать стенку бактериальной клетки, в результате чего происходит ее растворение (лизис). Он действует на один из основных компонентов бактериальной клетки - сложный полисахарид, состоящий из двух типов аминосахаров [2]. Известно применение лизоцима для гидролиза хитозана [3].

Наиболее близким по технической сущности является способ получения НМГ путем частичной деполимеризации под действием иммобилизованных гидролаз [1].

Сущность предложенного способа заключается в том, что раствор гепарина в 0,1 М NaCl перемешивали с иммобилизованным лизоцимом при температуре 50°С в течение 3 ч. Иммобилизованный фермент отделяли либо на стеклянном пористом фильтре, либо с помощью центрифуги, промывали 0,1 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10. Высушивали лиофильно. С выходом около 70-80% получали гепарин с молекулярной массой на 25-30% ниже, чем у исходного гепарина.

Лизоцим в иммобилизованном виде с целью деполимеризации гепарина использованы впервые. При этом установлено, что анти Ха-активность целевого продукта составляет 159±16 ЕД/мг, что соответствует удельной активности такого препарата НМГ как фраксипарин 120-160 ЕД/мг.

Иммобилизацию лизоцима осуществляли на органическом сорбенте поливиниловом спирте, содержащем альдегидные группы (150-200 мкмолей/г сырого сорбента) осуществляли по следующей методике: к 3 г «сырого» (отжатого на стеклянном пористом фильтре) сорбента добавляли 17 мл раствора фермента в 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,1 с концентрацией белка 1,8 мг/мл перемешивали в течение 3 ч при комнатной температуре и оставляли при охлаждении 4°С еще на 16 ч. Промывали на стеклянном пористом фильтре водой (200 мл), 1М NaCl (200 мл) и вновь водой. Количество иммобилизованного белка определяли по разности его содержания в исходном растворе фермента и в промывных растворах. Блокирование непрореагировавших альдегидных групп на сорбенте после ковалентного связывания ферментом осуществляли обработкой 0,1 М Трис-HCl буфером с рН 7,5 при перемешивании в течение 2 ч. Иммобилизованные ферменты хранили в холодильнике в воде.

Исследовали влияние низкомолекулярного гепарина (молекулярная масса 9,3 кДа, НМГи), полученного с помощью гидролиза нефракционированного гепарина (НФГ "Белмедпрепараты" ОАО, молекулярная масса 13,8 кДа) иммобилизованным лизоцимом, на изменение времени свертывания плазмы крови человека в тесте активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, влияние на внутренний путь свертывания крови) и РеаКлот НПО "Ренам"(влияние на активность фактора Ха) [4]. Лиофильно высушенную плазму человека приобретали в НПО «Ренам». Для расчета специфических антитромбиновой (анти-фактор IIa, aIIa) и анти-фактор Ха (аХа) активностей использовали калибровочную кривую 1-го Международного стандарта низкомолекулярного гепарина (NIBSC).

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. К 6 мл 1% раствора гепарина (из крупного рогатого скота, молекулярная масса 13,8 кДа) в 0,1 М NaCl добавляли 0,5 г иммобилизованного лизоцима а (содержание белка 6 мг/г). Весовое соотношение фермента к навеске гепарина 1:100. Суспензию перемешивали при 50°С в течение 3 ч. Иммобилизованный препарат отделяли центрифугированием, промывали 0,5 М NaCl и водой. Промывки присоединяли к супернатанту и обессоливали на колонке с сефадексом G-10 (2,5×42 см), элюент вода, скорость элюции 80 мл/ч, высушивали лиофильно. Получали 48 мг (80% от исходного) с молекулярной массой 9,3 кДа (НМГи).

Пример 2. К смеси 0,099 мл плазмы и 0,06 мл аЧТВ-реагента (НПО "Ренам") добавляли 0,05 мл растворов НФГ и НМГи в конечных концентрациях 0,14-2,20 мкг/мл. Через 3 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,025 М раствора CaCl₂ и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов (Таблица 1). Антитромбиновые активности (aIIa) НФГ и НМГи при сравнении со стандартом составили 128±3 ЕД/мг и 109±10 ЕД/мг соответственно.

Таблица 1
Время появления сгустка плазмы (сек) в тесте активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ)
шифр	Конечная концентрация, мкг/мл
0	0,22	0,27	0,3	0,36	0,43	0,54	0,72	1,1	2,2
НФГ	30,0±1,8	32,3±2,7	33,9±2,5	36,1±3,0*	37,2±3,3*	38±4,0*	43,4±3,8**	51,4±4,4**	69,5±6,7***	114,7±12,3***
НМГи	30,5±3,2	31,9±1,3	33±2,5	35,2±3,1	36,4±3,3*	37,8±3,0*	38,8±2,8*	48±3,7**	88,6±7,4***
* - р<0.05
** - р<0.01 и
*** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл

Пример 3. К смеси 0,085 мл плазмы и 0,015 мл раствора фактора Ха (НПО "Ренам") добавляли 0,01 мл растворов НФГ, НМГр и НМГи в конечных концентрациях 0,07-0,47 мкг/мл. Через 2 мин инкубации при 37°С добавляли 0,06 мл 0,035 М раствора CaCl₂ и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с ростом концентрации образцов (Таблица 2). Активности против фактора Ха (аХа) для НФГ и НМГи при сравнении со стандартом составили 117±10 ЕД/мг и 159±16 ЕД/мг.

Таким образом, при деполимеризации нефракционированного гепарина (отношение активностей aXa/aIIa=0,9) иммобилизованным лизоцимом мы получаем гепарин с молекулярной массой меньшей, в сравнении с исходным НФГ. При этом отношение активностей аХа /aIIa увеличивается в 1,5 раза.

Таблица 2
Время появления сгустка плазмы (сек) в тесте РеаКлот
шифр	Конечная концентрация, мкг/мл
0	0,07	0,14	0,18	0,23	0.28	0,35	0,47
НФГ	19,4±1,3	20,0±2,3	20,2±2,1	20,8±1,7	22,1±1,9	22,5±2,0	28,8±2,4**	37,9±2,8***
НМГи	21,5±1,8	25,4±2,2*	27,3±2,3**	29,4±3,0**	34,6±2,9**	40,1±3,8***	49±4,3***
* - р<0.05
** - р<0.01 и
*** - р<0.001 достоверность различий с показаниями при конечной концентрации гепаринов 0 мкг/мл

Список литературы

1. Г.Е.Банникова, В.П.Варламов, Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров, В.Е.Тихонов, К.Г.Скрябин, патент РФ №2295538 от 20 марта 2007 г., Бюл. Открыт., №5 (2007).

2. Бернхард С. Структура и функция ферментов. М., 1971.

3. Ильина А.В., Варламов В.П. Ферментативная деполимеризация N-сукцинилхитозана. Биоорг. Хим. 2007; 33(1):156-9.

4. Bates SM, Weitz JI // Circulation. 2005. V 112. N 4. P 53-60.

Способ получения низкомолекулярного гепарина, обладающего антитромбиновой активностью (aIIa) 109±10 ЕД/мг и активностью против фактора Ха (аХа) 159±16 ЕД/мг, с помощью ферментативной деполимеризации, характеризующийся тем, что иммобилизованный лизоцим добавляют в раствор гепарина в 0,1 М NaCl в весовом отношении 1:100 и перемешивают при 50°С в течение 3 ч, иммобилизованный фермент отделяют центрифугированием, супернатант обессоливают на колонке с сефадексом и лиофильно высушивают.