Способ приготовления плотной питательной среды
Владельцы патента RU 2396335:
Федеральное государственное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации" (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в практике микробиологических лабораторий. Способ предусматривает внесение в жидкий питательный субстрат уплотнителя, добавление ингредиентов согласно стандартной прописи среды и стерилизацию в автоклаве. В охлажденную до температуры 65°С расплавленную среду вносят 0,2-0,3 мас.% предварительно приготовленной эмульсии смеси перфторорганических соединений в соотношении 3:1 перфтор-1,3-диметилциклогексана и перфтордекалина со средними размерами эмульгированных частиц 90-270 нм. Это приводит к количественному увеличению прорастания засеваемой популяции микроорганизмов, увеличению интенсивности роста и увеличению урожая растущей микробной культуры. 8 табл.
Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к способам приготовления плотных питательных сред для культивирования микроорганизмов, и может быть использовано в практике микробиологических лабораторий.
Известен способ приготовления плотных питательных сред для выращивания микроорганизмов, заключающийся в добавлении к жидкой питательной основе специальных добавок по предназначению (микро- и макроэлементов в составе разных химических соединений, индикаторов, стимуляторов и ингибиторов роста, красителей и др.) и уплотнителей (отвердителей), способных к гелеобразованию и придающих плотность этим средам (Методы общей бактериологии / Под ред. Ф.Герхардта // Пер. с англ., под ред. Е.Кондратьевой и Л.Калакуцкого в 3 т. - М.: Мир, 1983. - Т.1 - 536 с).
К недостаткам данного способа следует отнести то, что застывшие агаровые гели обеспечивают относительно слабый уровень диффузии питательных веществ, индикаторных и биологически активных добавок в плотных средах в направлении растущей на поверхности плотной среды микробной культуры, что, в конечном итоге, приводит к замедлению роста микробных культур и снижению урожая микробных клеток.
Наиболее близким к заявляемому является способ приготовления плотной среды, где в качестве уплотнителя используется агар в количестве 2,5% (в зависимости от вида среды и качества самого агара) (Семенов С. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. - М.: Агропромиздат, 1990. - С.86-94.). Питательный субстрат растворяют в воде, добавляют необходимое количество агар-агара и нагревают до полного растворения в автоклаве текучим паром в течение 40-90 мин. По окончании кипячения объем среды доводят до первоначального значения горячей дистиллированной водой и кипятят еще 2-3 мин. Расплавленную среду помещают в теплое место, чтобы она отстоялась, и фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр. Осадок не используют. Проверяют и если нужно корректируют рН, затем разливают в соответствующую посуду, не замачивая края горлышек, куда вставляют ватные пробки. Стерилизуют среду 15-30 мин автоклавированием при температуре в автоклаве 120°С. После стерилизации плотную питательную среду асептически разливают в чашки Петри, пробирки и другую микробиологическую посуду, в которой агаровый гель застывает при охлаждении.
Общим с заявляемым способом является использование при приготовлении плотных питательных сред уплотнителей, источников углерода, азота, фосфора, минеральных солей, микроэлементов, других питательных и дополнительных ингредиентов и технологии, обычно применяемой при приготовлении плотных питательных сред.
К недостаткам данного способа следует отнести то, что плотные питательные среды, получаемые принятым способом, из-за относительно низкого уровня диффузии в застывшем геле питательных веществ (химических микро- и макроэлементов, воды, углеводов и т.д.) индикаторных и биологически активных добавок в направлении растущей на поверхности плотной среды микробной культуры, не обеспечивают должный интенсивный рост и прорастание всей засеваемой популяции микроорганизмов.
Задачей предполагаемого изобретения является разработка способа приготовления плотной питательной среды, позволяющего увеличить интенсивность роста и получаемый урожай культур микроорганизмов, засеваемых на эти среды.
Поставленная задача решается путем внесения предварительно приготовленной эмульсии смеси перфторорганических соединений (ПФОС) - перфтор-1,3-диметилциклогексана (карбогала) и перфтордекалина в соотношении 3:1 со средними размерами эмульгированных частиц 90-270 нм до конечной общей концентрации 0,2-0,3 мас.% в расплавленную после стерилизации в автоклаве плотную питательную среду, имеющую жидкую консистенцию при охлаждении до температуры (60±5)°С.
Карбогал (КГ, химическая формула - C8F16), ТУ 95-1693 - бесцветная прозрачная негорючая жидкость без запаха, с вязкостью 1,04 мм2 × сСт-1 при 25°С, плотностью 1,85 г/см3 и температурой кипения 102°С. КГ не растворим в воде и в органических растворителях, смешивается без ограничений с фторуглеродными жидкостями, обладает исключительно высокими физической и химической устойчивостью, взаимодействует с кислотами и щелочами при температуре выше 450°С.
Перфтордекалин (ПФД, химическая формула - C10F18), ТУ 95-1233 - бесцветная прозрачная негорючая жидкость без запаха, с вязкостью 2,74 мм2 × сСт при 25°С, плотностью 1,945 г/см3 и температурой кипения 155°С. ПФД не растворим в воде и в органических растворителях, смешивается с фторуглеродными жидкостями без ограничений, обладает исключительно высокими физической (термически устойчив до 400°С) и химической устойчивостью, взаимодействует с кислотами и щелочами при температуре выше 400°С, является основным компонентом голубой крови (Перфторорганические соединения в биологии и медицине/ Под ред. Г.Р.Иваницкого и В.В.Мороза. - Пущино, 1999. - 286 с). КГ и ПФД не являются питательными веществами и не утилизируются микроорганизмами.
Наличие в агаровом геле 0,2-0,3 мас.% эмульгированных частиц смеси КГ и ПФД в указанном соотношении в застывшей при ее охлаждении плотной питательной среде эффективно поддерживает диффузию питательных веществ к растущей культуре микроорганизмов и высокий уровень обмена между средой и микробными клетками. При этом в среде формируется двухфазная система, где, на границе раздела фаз, частицы ПФОС, имеющие суммарную площадь поверхности около 12-18 м2, обеспечивают существенное повышение уровней диффузии и оптимальные условия для направленного перемещения потоков питательных веществ, клеточных метаболитов, индикаторных и биологически активных добавок в плотных средах в направлении растущей на поверхности плотной среды микробной культуры, что в конечном итоге приводит к улучшению условий прорастания всей засеваемой популяции микроорганизмов, увеличению интенсивности роста и увеличению урожая растущей микробной культуры.
КГ, ПФД и 0,01 мас.% агар в дистиллированной воде стерилизуются отдельно текучим паром в течение 50 мин, затем КГ и ПФД смешиваются асептически в соотношении 3:1 при температуре 60-70°С и при данной температуре к данной смеси добавляется равное количество по массе стерилизованного жидкого 0,01 мас.% водного агара. Полученная неоднородная смесь подвергается в течение 20 мин перемешиванию на высокоскоростной мешалке без доступа воздуха и газов при скорости вращения ротора не менее 6 тысяч об/мин с погружением вращающейся лопасти или турбины мешалки в смесь ПФОС при температуре 55-65°С. Полученная данным методом эмульсия содержит взвесь ПФОС со средним размером частиц в диапазоне от 90-270 нм, не подвергающихся коалесценции в течение не менее 20 сут при температуре 10-22°С. Полученную эмульсию с содержанием 50 мас.% по массе ПФОС используют в дальнейшем в качестве добавки в расплавленные плотные питательные агаровые среды после их охлаждения до (60±5)°С. Для получения конечной концентрации смеси ПФД и КГ 0,2-0,3 мас.%, в среду добавляют 0,4-0,6 мас.% приготовленной эмульсии ПФОС.
Сущность предложенного способа заключается в следующем. Питательный субстрат растворяют в воде, добавляют ингредиенты согласно стандартной прописи среды и необходимое количество агар-агара, нагревают до полного растворения в автоклаве текучим паром в течение 20-90 мин. По окончании кипячения объем среды доводят до первоначального значения горячей дистиллированной водой и кипятят еще 2-3 мин. Расплавленную среду помещают в теплое место, чтобы она отстоялась, и фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр. Осадок не используют. Проверяют и если нужно корректируют рН, затем разливают в соответствующую посуду, не замачивая края горлышек, куда вставляют ватные пробки. Стерилизуют среду 15-40 мин автоклавированием при давлении насыщенного пара 0,2-0,3 МПа, обеспечивающего температуру в автоклаве 121-134°С. Затем в плотную питательную среду, имеющую жидкую консистенцию после стерилизации в автоклаве и охлаждении до температуры (60±5)°С, вносят 0,2-0,3 мас.% предварительно приготовленной эмульсии смеси перфторорганических соединений в соотношении 3:1 перфтор-1,3-диметилциклогексана и перфтор декалина со средними размерами эмульгированных частиц 90-270 нм. После этого плотную питательную среду асептически разливают в чашки Петри, пробирки и другую микробиологическую посуду, в которой среда застывает при охлаждении. Полученные плотные питательные среды выдерживают 1 сут и засевают известным способом (шпателем, иглой, пипеткой и т.п.), после чего инкубируют требуемое время в условиях, необходимых для культивирования конкретных микроорганизмов.
Изобретение позволяет улучшить условия прорастания популяции микроорганизмов, повысить интенсивность роста микробной культуры и увеличить урожай культур, засеваемых на разные плотные питательные среды, приготовленные разработанным способом.
Возможность осуществления изобретения показана следующими примерами. В качестве тест-микробов использовали лабораторные штаммы микроорганизмов различных таксономических групп Escherichia coli М 17, Saccharomyces cerevisiae 5, Pseudomonas putida 15, Azotobacter chroococcum 17, Fusarium nivale 1727 и Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 (таблицы 1-8).
Для выращивания культур микроорганизмов использовали плотные питательные среды, имеющие стандартные прописи ингредиентов, приготовленные обычным и предлагаемым способами.
Количество живых клеток в 1 см3 исследуемой суспензии (М) определяли чашечным методом Коха - путем высева соответствующих десятикратных разведений исследуемой суспензии микроорганизмов на плотные питательные среды и расчетом по формуле
,
где а - среднее число колоний при высеве из данного разведения;
10 - коэффициент разведения;
n - порядковый номер разведения, из которого сделан высев;
V - объем суспензии, взятый для посева (см3).
В качестве посевных в экспериментах использовали культуры микроорганизмов, выращенные на плотной питательной среде в течение 24-72 ч, разведенные физиологическим раствором до заданной концентрации по оптическому стандарту мутности (ОСМ) ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
Под урожаем понимали конечное количество микроорганизмов, выросших на средах в заданных условиях при высеве 106 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри.
В качестве контроля использовали высевы тех же разведений приготовленных суспензий микроорганизмов на плотные питательные среды того же состава, но приготовленные без использования ПФОС.
По результатам, представленным в таблицах 1-8, видно, что разные по составу плотные питательные среды, специфичные для микроорганизмов разных таксономических групп, при использовании предлагаемого способа их приготовления с внесением в застывающий после стерилизации агаровый гель 0,2-0,3 мас.% эмульгированных частиц смеси КГ и ПФД соотношении 3:1 обеспечивает улучшение условий прорастания засеваемой популяции микроорганизмов на 10,5-44,4% и увеличение урожая растущей микробной культуры на 16,3-41,6% без внесения в состав сред дополнительных количеств питательных веществ.
| Таблица 1 | |||
Количество клонов бактерий родов Escherichia и Pseudomonas, вырастающих на мясопептонном агаре и среде Эйкмана, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 102 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри 
|
|||
| Среда | Способ приготовления среды | Количество клонов бактерий штамма выросших на плотной среде, абсолютное число (в процентах к контролю) | |
| Е. coli M 17 | P. putida 15 | ||
| Мясопептонный агар | принятый (контроль) | 84±6 (100,0) | 57±5 (100,0) |
| предлагаемый | 97±6 (115,4) | 63±4 (110,5) | |
| Эйкмана | принятый (контроль) | 86±8 (100,0) | 61±5 (100,0) |
| предлагаемый | 106±7 (123,3) | 69±6 (113,1) |
| Таблица 2 | |||
Урожай культур бактерий родов Escherichia и Pseudomonas за 24 ч роста на мясопептонном агаре и среде Эйкмана, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 106 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри 
|
|||
| Среда | Способ приготовления среды | Урожай культуры бактерий штамма…, полученный на плотной среде, абсолютное число ×109 (в процентах к контролю) | |
| Е. coli M 17 | P. putida 15 | ||
| Мясопеп- тонный агар |
принятый (контроль) | 27±3 (100,0) | 21±3 (100,0) |
| Эйкмана | предлагаемый | 34±3 (125,9) | 26±4 (123,8) |
| принятый (контроль) | 31±4(100,0) | 40±4(100,0) | |
| предлагаемый | 38±3 (122,6) | 49±5 (122,5) |
| Таблица 3 | |||
| Количество клонов микромицетов родов Fusarium и Saccharomyces на средах Сабуро и Чапека, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 102 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри
|
|||
| Среда | Способ приготовления среды | Количество клонов микромицетов штамма выросших на плотной среде, абсолютное число (в процентах к контролю) | |
| S. cerevisiae 5 | F. nivale - 1727 | ||
| Сабуро | принятый (контроль) | 27±3 (100,0) | 57±5 (100,0) |
| предлагаемый | 39±3 (144,4) | 63±4 (110,5) | |
| Чапека | принятый (контроль) | 21±4(100,0) | 61±5 (100,0) |
| предлагаемый | 29±3 (138,1) | 69±6 (113,1) |
| Таблица 4 | |||
| Урожай культур микромицетов родов Fusarium и Saccharomyces за 72 ч роста на средах Сабуро и Чапека, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 106 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри
|
|||
| Среда | Способ приготовления среды | Урожай культуры микромицетов штамма полученный на плотной среде, абсолютное число ×107 (в процентах к контролю) | |
| S. cerevisiae 5 | F. nivale - 1727 | ||
| Сабуро | принятый (контроль) | 42±4 (100,0) | 21±3 (100,0) |
| предлагаемый | 58±5 (138,1) | 28±3 (133,3) | |
| Чапека | принятый (контроль) | 36±4 (100,0) | 18±4 (100,0) |
| предлагаемый | 51±5 (141,6) | 25±3 (138,8) |
| Таблица 5 | ||
| Количество клонов актиномицета Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 на овсяном агаре и среде Ваксмана, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 102 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри
|
||
| Среда | Способ приготовления среды | Количество клонов актиномицета, выросших на плотной среде, абсолютное число (в процентах к контролю) |
| Овсяный агар | принятый (контроль) | 41±3 (100,0) |
| предлагаемый | 55±4 (134,1) | |
| Ваксмана | принятый (контроль) | 34±3 (100,0) |
| предлагаемый | 48±4 (141,2) |
| Таблица 6 | ||
Урожай культуры актиномицета Streptomyces purpurogeniscleroticus ВБМ 158 за 72 ч роста на овсяном и картофельный агарах, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 106 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри 
|
||
| Среда | Способ приготовления среды | Урожай культуры актиномицета, полученный на плотной среде, абсолютное число ×107 (в процентах к контролю) |
| Овсяный | принятый (контроль) | 26±3 (100,0) |
| агар | предлагаемый | 33±4 (126,9) |
| Картофельный агар | принятый (контроль) | 19±3 (100,0) |
| предлагаемый | 25±3 (131,6) |
| Таблица 7 | ||
Количество клонов A. chroococcum 17 на агаровых средах Эшби и Федорова, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 102 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри 
|
||
| Среда | Способ приготовления среды | Количество клонов азотобактера, выросших на плотной среде, абсолютное число (в процентах к контролю) |
| Эшби | принятый (контроль) | 61±3 (100,0) |
| предлагаемый | 71±4(116,4) | |
| Федорова | принятый (контроль) | 58±3 (100,0) |
| предлагаемый | 70±4 (120,7) |
| Таблица 8 | ||
Урожай культуры A. chroococcum 17 за 48 ч роста на агаровых средах Эшби и Федорова, приготовленных принятым и предлагаемым способами, при высеве 106 микробных клеток по ОСМ на чашку Петри 
|
||
| Среда | Способ приготовления среды | Урожай культуры азотобактера, полученный на плотной среде, абсолютное число ×108 (в процентах к контролю) |
| Эшби | принятый (контроль) | 49±5 (100,0) |
| предлагаемый | 57±4 (116,3) | |
| Федорова | принятый (контроль) | 41±4(100,0) |
| предлагаемый | 52±3 (126,8) |
Способ приготовления плотной питательной среды для выращивания микроорганизмов, предусматривающий внесение в жидкий питательный субстрат уплотнителя, добавление ингредиентов согласно стандартной прописи среды, последующую стерилизацию в автоклаве и охлаждение расплавленной среды, отличающийся тем, что в охлажденную до температуры (60±5)°С расплавленную среду дополнительно вносят 0,2-0,3 мас.% предварительно приготовленной эмульсии смеси перфторорганических соединений в соотношении 3:1 перфтор-1,3-диметилциклогексана и перфтордекалина со средними размерами эмульгированных частиц 90-270 нм.
