Прослеживаемость семян трансгенных растений при предварительной и последующей обработке
Получают растение, обладающее характерной пигментацией семенной оболочки или других частей семени, за которыми можно следить, а затем это растение трансформируют с целью продуцирования представляющего интерес гетерологичного белка. Способ получения такого растения позволяет легко отличить семена данного трансгенного растения в поле во время и/или после уборки от нетрансгенных семян растения того же вида, которые не имеют этого визуального характеристического признака. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 3 ил.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к области биотехнологии растений и конкретно к способам улучшения сдерживания распространения и различимости трансгенных семян как до уборки, так и после уборки посредством целевого разведения желаемых культиваров, используемых для трансформации.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Наследственная биологическая способность к накоплению белка в развивающихся семенах сельскохозяйственных культур означает, что многие сельскохозяйственные культурные растения, особенно однодольные, обладают потенциальной способностью быть практичным и эффективным носителем для широкомасштабного производства гетерологичных рекомбинантных белков, например высокоценных полипептидов для фармацевтической промышленности; этот метод получения часто называют «сельскохозяйственным производством молекул» (от английского названия «molecular farming»). Кроме того, хранение гетерологичных полипептидов в семенах уменьшает стоимость процесса последующей обработки, поскольку семена могут храниться годами без влияния на качество гетерологичного полипептида. Экспрессия таких белков предпочтительно находится под контролем промоторов, специфичных для семени или специфичных для эндосперма.
По мере того как биотехнологическая промышленность продолжает идти по пути производства фармацевтических препаратов и промышленных белков в пищевых и/или кормовых культурах, таких как злаки, растет озабоченность, что семена, происходящие от трансгенных растений, могут случайно попасть в пищевые продукты для людей в результате смешивания этих семян с нетрансгенными семенами во время уборки, хранения или последующей обработки. Это, например, подчеркивается тем фактом, что семена от трансгенных злаков, полученные для «сельскохозяйственного производства молекул», неотличимы от нетрансгенных семян с помощью простого визуального осмотра. Следовательно, в «сельскохозяйственном производстве молекул» существует крайняя необходимость в простой технологии, чтобы отличать трансгенные семена в поле или во время уборки и последующей обработки от нетрансгенных семян для обеспечения безопасности пищевых продуктов и окружающей среды. Кроме того, существует также крайняя необходимость в осуществлении этого визуального отслеживания без добавления дополнительных генов в линейные экспрессионные кассеты, которые можно использовать в «сельскохозяйственном производстве молекул» для высокого уровня экспрессии особо ценного гетерологичного белка. Такая технология должна быть важным фактором при адаптации строгих требований к улучшенному сдерживанию распространения трансгенного семенного материала, предназначенного в качестве сырья для фармацевтической промышленности. Даже еще важнее, когда общие требования к Добросовестной Сельскохозяйственной Практике (GAP, Good Agricultural Practices) изложены в качестве необходимых условий для всего «сельскохозяйственного производства молекул» фармацевтических препаратов и промышленных ферментов.
Отслеживание трансгенного материала, такого как семена, неотличимого от нетрансгенного материала с помощью простого визуального осмотра, может быть затруднительно, требует больших затрат времени и основано на утомительных протоколах экстракции и дорогостоящей диагностической технологии, такой как количественная ПЦР и ПЦР в реальном времени или твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).
Генетические маркеры, такие как подлежащие скринингу маркеры, можно использовать в экспрессионных векторах для скрининга организмов-хозяев на эффективную трансформацию, где такие маркеры включают ген R-локуса, который кодирует продукт, регулирующий продуцирование антоцианиновых пигментов (красного цвета) в тканях растений (Dellaporta et al., 1988), ген люциферазы (lux), который дает возможность обнаружения биолюминесценции, или ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Хотя они могут быть полезны в тканевой культуре после переноса генов, ни один из них, однако, не пригоден для широкомасштабного мечения и отслеживания при биопроизводстве генетически модифицированных (ГМ) сельскохозяйственных культур в связи, например, с трудностями в применении in situ или в связи с потребностями в биохимическом пути нативного биохимического предшественника для активации маркера, который может отсутствовать у интересующего растения.
Также следует отметить, что общепринятые методики трансформации, используемые в биотехнологии растений, часто производят «химерные» или «мозаичные» гибридные линии, которые происходят более чем от одной клетки, и могут в результате давать растения, экспрессирующие интересующий гетерологичный ген, введенный в растение, но не экспрессирующие маркер, подлежащий скринингу. Экспрессия маркеров, подлежащих скринингу, введенных с помощью экспрессионных векторов при трансформации, часто исчезает между поколениями, и такие маркеры могут, поэтому, быть ненадежными признаками для визуальной проверки.
При возрастающей заботе об общей безопасности, связанной с генетически модифицированными сельскохозяйственными культурами и биопроизводством, существует крайняя необходимость в безопасных и эффективных способах получения генетически модифицированных растений, которые безопасны в смысле их распространения и надежно отличаются от немодифицированных дикорастущих или сельскохозяйственных растений.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ И ОБЪЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Технология прослеживаемости, основанной на простом визуальном осмотре или механической визуализации пигментированных семян, должна принести немедленную пользу сельскохозяйственному производству молекул и биотехнологии растений. Было бы также весьма желательно иметь простой технологичный подход, который может способствовать обеспечению совершенно необходимых предосторожностей для сдерживания генетического распространения при сельскохозяйственном производстве молекул.
Первая цель настоящего изобретения сформулирована как разработка способов повышения уровней биологического сдерживания распространения и различимости семенного материала при «сельскохозяйственном производстве молекул». В предпочтительном воплощении вышеизложенного первоочередным подходом является введение в желаемое растение-хозяина, пригодное для сельскохозяйственного производства молекул, визуального характеристического наследуемого признака, такого как характеристическая пигментация семенной оболочки или других частей семени, и использование этого нового культивара в качестве носителя или растения-хозяина для получения трансгенных растений, экспрессирующих интересующий гетерологичный белок, с семенами, которые можно отслеживать и легко отличать в поле, либо во время уборки, либо после уборки, от нетрансгенных семян того же вида, которые не обладают визуальной характеристикой, например, характеристической пигментацией семян.
Типично растение и культивар растения, используемые и получаемые в соответствии с настоящим изобретением, выбраны из группы двудольных растений и однодольных растений, и в предпочтительных воплощениях указанное растение выбрано из группы капусты посевной, сои культурной, ячменя, кукурузы, пшеницы, овса и риса. Изобретение, в частности, полезно для получения и использования трансгенных растений, таких как хлебные злаки, которые используют для экспрессии и накопления гетерологичного белка в семенах этого растения. В таких воплощениях должно быть понятно, что не только трансгенные растения по изобретению легко распознаются от нетрансгенных растений, но также семена от трансгенных растений при их отделении от стеблей, листьев растений и т.д. легко распознаются от нетрансгенных семян, как проиллюстрировано конкретным воплощением, показанным на фигурах 1 и 2.
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что ячмень, и в частности ячмень Hordeum vulgaris, является особенно полезным в качестве растения-хозяина для продуцирования представляющих интерес гетерологичных белков в трансгенных растениях с визуально мечеными семенами, поскольку проблемы случайного перекрестного опыления практически не существует.
Авторами изобретения обнаружены редкие культивары ячменя, которые сами по себе не пригодны для генетического манипулирования, но обладают очень отчетливыми визуальными признаками, так что растения указанных культиваров и семена от них легко и просто отличаются от обычных сельскохозяйственных культиваров или от растений дикого типа.
Более конкретно объектом настоящего изобретения является применение обратного скрещивания для получения новых пригодных растений-хозяев/культиваров для сельскохозяйственного производства молекул с визуальными характеристиками, такими как, в частности, пигментированная семенная оболочка, или семенами, которые можно легко отслеживать посредством простой визуализации, что, следовательно, дает возможность повысить уровни сдерживания распространения.
Другой объект настоящего изобретения проиллюстрирован воплощением, где растение ячмень-хозяин, отобранное как желательное для сельскохозяйственного производства молекул, опыляют пыльцой от растения ячменя-донора, которое имеет генетический локус или локусы для пигментированной семенной оболочки или семени, и посредством повторных обратных скрещиваний получают растение-хозяина, которое обладает всеми необходимыми характеристиками исходного культивара растения, пригодного для сельскохозяйственного производства молекул, включая то, что они легко поддаются культивированию ткани и генетической трансформации, в дополнение к обладанию визуальными характеристиками от растения-донора, такими как, в частности, пигментированное семя или семенная оболочка, которые легко распознаются визуально или оборудованием автоматического обнаружения.
Более конкретно объектом настоящего изобретения является разработка способов получения новых изогенных растений ячменя-хозяина, пригодных для сельскохозяйственного производства молекул, включая легко поддающиеся культивированию ткани и генетической трансформации, с черными семенами, которые можно легко распознать и отслеживать визуально в поле во время уборки или после уборки. Такие изогенные растения-хозяева будут обеспечивать воспроизведение и безопасность при продуцировании гетерологичных белков, поскольку все индивидуальные растения имеют двойную гаплоидную организацию генома по существу без варьирования по окраске семян.
В предпочтительном воплощении вышеизложенного способ получения растения-хозяина, такого как, в частности, растение-хозяин, представляющее собой изогенный ячмень, пригодного для сельскохозяйственного производства молекул, с черными семенами, и легко поддающегося культивированию ткани и генетической трансформации, включает: (1) селекцию первого растения ячменя из культивара, который легко поддается культивированию ткани и генетической трансформации; (2) селекцию второго растения ячменя из культивара, который имеет окрашенную семенную оболочку и не является распространенно используемым в коммерческом сельском хозяйстве; (3) скрещивание второго растения с указанным первым растением, то есть опыление первого растения пыльцой от растения с окрашенной семенной оболочкой (например черной, темно-серой, либо темно-синей, либо красной) с получением гибридных растений F1; (4) обратное скрещивание гибридных растений F1 с культиваром, который легко поддается культивированию ткани и генетической трансформации; (5) повторение этого обратного скрещивания от одного до нескольких раз для создания гибридной линии культивара, которая имеет окрашенную семенную оболочку, как указанное второе растение, и по существу сохраняет организацию генома указанного первого растения, которое легко поддается культивированию ткани и генетической трансформации, в зависимости от числа обратных скрещиваний; (6) использование методик культивирования пыльников-микроспор для получения изогенных линий культивара с черной семенной оболочкой; (7) трансформацию множества таких изогенных линий нуклеиново-кислотной конструкцией, содержащей экспрессионную кассету, и скрининг на наиболее пригодную изогенную линию для «сельскохозяйственного производства молекул», которая имеет окрашенные семена и поддается культивированию ткани и генетической трансформации. Воплощения этого способа включают дополнительные стадии трансформации таких пригодных изогенных линий для «сельскохозяйственного производства молекул» нуклеиново-кислотной конструкцией, содержащей активный в растениях промотор, оперативно сцепленный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интересующий гетерологичный белок, с получением трансгенной линии ячменя с окрашенными семенами, экспрессирующей с высокими уровнями экспрессии высоко ценный гетерологичный белок.
Согласно изобретению в качестве воплощения нового растения ячменя предложен изогенный культивар ячменя для сельскохозяйственного производства молекул, обозначенный как "Dimma".
Настоящее изобретение успешно преодолевает недостатки доступных в настоящее время методик обеспечения адекватного отслеживания трансгенных семян при сельскохозяйственном производстве молекул в поле во время уборки или после уборки. В частности, в изобретении предложено простое решение проблемы контаминации семян, где семена, происходящие от трансгенных растений, могут случайно попасть в пищевые или кормовые продукты для человека или животного в результате смешивания трансгенных семян с нетрансгенными семенами во время уборки или при хранении. Настоящее изобретение представляет собой экономичный и надежный способ уменьшения риска такой семенной контаминации.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГ.1. Полностью развитое семя от культивара ячменя "Golden Promise" (a), "Svarthovdi" (б) и изогенной гибридной линии ячменя "Dimma" (в).
ФИГ.2 иллюстрирует визуальное отличие семян "Dimma" в смеси семян "Dimma" и культивара "Golden Promise".
ФИГ.3 иллюстрирует схематическое представление экспрессионной кассеты pbGF20lif, используемой для трансформации и селекции "Dimma" в соответствии с настоящим изобретением.
Сокращения: Dhor, эндосперм-специфичный промотор D-гордеина; pb, сигнальный пептид; lif, последовательность кДНК ингибиторного фактора лейкемии; р, линкер; СВМ, кДНК модуля связывания углеводов; pinll, сигнал терминации гена ингибитора протеиназы II картофеля; 35S, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты; hph, гигромицинфосфотрансфераза из Е.coli (номер по каталогу Gemebank #K01193); nos, сигнал терминации нопалинсинтазы; R, правая граница; L, левая граница.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Здесь далее будут подробно описаны предпочтительные воплощения настоящего изобретения.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, как обычно понимают и используют специалисты в области техники, к которой принадлежит данное изобретение.
Термин ««сельскохозяйственное производство молекул»», как его используют здесь, относится к процессу использования растений любого вида в открытых полях или в закрытом помещении для производства ценных биологических соединений, таких как белки, для дальнейшей обработки.
Термин «белок» используют здесь взаимозаменяемо с терминами «полипептид» и «пептид».
Термин «семенная контаминация» относится к ситуации, когда семена от растений, таких как злаки, используемых для сельскохозяйственного производства молекул, случайно смешиваются с семенами растений, используемых для пищевого или кормового производства.
Термин «сдерживание распространения» или «сдерживание распространения трансгенных семян» относится к ситуации, когда семена от трансгенных культиваров растений успешно поддерживаются отдельно от нетрансгенных семян и не смешиваются с нетрансгенными семенами в поле ни во время уборки, ни после уборки.
Термин «растительный культивар» относится к растению вида, имеющего происхождение и поддерживаемого в условиях культивирования, который может быть получен путем селективной гибридизации, либо может быть найден в дикорастущих популяциях, и поддерживается путем вегетативного размножения или с помощью инбредного посева.
Термин «желаемый родительский культивар» или «желаемый культивар», используемый здесь, относится к растительному культивару, отобранному для модификации посредством скрещивания, чтобы стать подходящим культиваром-хозяином для сельскохозяйственного производства молекул. Термин «культивар-хозяин» относится к культивару, который является генетически трансформированным для использования в качестве растительного культивара для продуцирования рекомбинантных белков при «сельскохозяйственном производстве молекул».
Термины «поколение F1», либо «растение F1», либо «гибрид F1» используют здесь относительно первого поколения, полученного при скрещивании между желаемым культиваром и культиваром с желаемым признаком, таким как характеристические паттерны пигментации в семени или семенной оболочке.
Термин «обратное скрещивание» относится к процессу, при котором селекционер повторно скрещивает гибридное потомство (F1 или F1+n, где n равно 1 или больше 1) обратно на исходный желаемый родительский культивар. Неограничивающим примером является такой, когда гибридное потомство между Hordeum vulgaris cv. "Golden Promise" (желаемый родительский культивар) и Hordeum vulgaris cv. "Svarthovdi" (культивар с желаемым признаком) повторно скрещивают обратно с исходным желаемым родительским культиваром "Golden Promise".
Термин «изогенная линия» или «изогенный ячмень», используемый здесь, относится к диплоидному культивару или линии ячменя, который представляет собой двойную гаплоидную линию или линию, гомозиготную более или менее по каждому аллелю.
Термин «пигментация семени» относится к накоплению пигментных соединений, продуцируемых растительными клетками в семени или семенной оболочке. Термин «характеристическая пигментация» относится к паттернам пигментации семени или семенной оболочки, которые являются легко отличимыми от паттернов пигментации, которыми могут обладать коммерческие или обычные культивары. Неограничивающим примером паттернов пигментации у коммерческого культивара является паттерн пигментации, наблюдаемый у культивара Hordeum vulgaris cv. "Golden Promise" (фиг.1а). Не ограничивающим примером характеристического паттерна пигментации является паттерн пигментации, наблюдаемый у Hordeum vulgaris cv. "Svarthovdi" (фиг.1б). «Семенная оболочка» или «теста» относится к наружному и внутреннему интегументу семени, включая пигментный слой или защитный наружный слой семени. В качестве неограничивающего примера накопление черного меланиноподобного пигмента в семенах культивара ячменя "Svarthovdi" соответствует настоящему изобретению.
Термин «оборудование механизированного обнаружения» или «оборудование автоматического обнаружения» представляет собой любой прибор или инструмент, способный к различению между семенами, которые являются пигментированными, и семенами, которые не являются пигментированными. Термин «визуальное отслеживание» относится к любым средствам отслеживания и идентификации семян на основании их пигментации или паттернов пигментации семенной оболочки или других частей семени. Такое оборудование обнаружения может быть основано на спектрофотометрических методиках измерения поглощения и/или отражения образцов семян, пропускаемых через путь луча света между источником света и детектором. Машинные видеокамеры с детектором CCD или CMOS, соединенным с компьютерным оборудованием, программированным пригодным программным обеспечением распознавания паттерна, также применимы для автоматического обнаружения визуально меченых семян в соответствии с изобретением.
Термин «кодирующая последовательность» относится к нуклеотидной последовательности, которая кодирует специфичную аминокислотную последовательность.
"Промотор" определяют как порядок одной или более чем одной нуклеиново-кислотной регулирующей последовательности или сайтов связывания регуляторов транскрипции, который направляет транскрипцию оперативно сцепленной нуклеиновой кислоты.
Термин "трансформация" или "генетическая трансформация" относится к переносу молекулы нуклеиновой кислоты в геном организма-хозяина, приводящему в результате к генетически стабильному наследованию. Организмы-хозяева, содержащие трансформированные фрагменты нуклеиновой кислоты, называют "трансгенными" организмами. "Клетка-хозяин трансгенного растения" по изобретению содержит по меньшей мере одну чужеродную, предпочтительно две чужеродные молекулы нуклеиновой кислоты, стабильно интегрированные в геном. Примеры способов трансформации растений включают опосредованную Agrobacterium трансформацию (De Blaere et al. 1987) и метод трансформации с помощью бомбардировки частицами или "генного ружья" (Klein et al. (1987); патент США №4945050).
Термин "селективный маркер" или "селективный маркерный ген" относится к гену, который придает клетке или организму, экспрессирующим этот ген, четкий фенотипический признак, характеризующийся тем, что эта клетка или организм становятся более толерантными к токсичности конкретного химического агента, такого как гербицид или антибиотик или тому подобное.
Термин "маркер скрининга" относится к фенотипическому признаку клетки или организма, который может быть обнаружен посредством наблюдения или тестирования, типично посредством визуального осмотра.
После отбора желаемого культивара растения для сельскохозяйственного производства молекул, который легко поддается культивированию ткани и генетической трансформации, отбирают другой культивар, который имеет семена, легко отличимые визуально от семян от желаемого культивара. Эти семена могут иметь другой цвет или пигментацию, как, например, черные семена некоторых местных культиваров ячменя Эфиопии, либо цветовые паттерны синего, красного или серого цвета, либо обладать другими морфологическими признаками, которые легко отличаются визуально от семян из культиваров, используемых в пищу или корм. Предпочтительно, чтобы генетический локус или локусы, ответственные за этот характеристический признак, такой как черная семенная оболочка некоторых местных культиваров ячменя Эфиопии, являлся доминантным, высоко наследуемым признаком с сильной пенетрантностью. Ряд различных культиваров ячменя с высоко наследуемыми признаками, вызывающими пигментацию семян, описан в литературе. Желаемый культивар для «сельскохозяйственного производства молекул» скрещивают вручную с культиваром с желаемым признаком пигментированного семени или семенной оболочки, и гибридное потомство повторно подвергают обратному скрещиванию с желаемым культиваром. После нескольких обратных скрещиваний (например, 2, 3, 4 или более) гибрид тестируют на его способность к культивированию ткани и генетической трансформации и сравнивают с исходным желаемым культиваром. Как только способность к культивированию ткани и генетической трансформации гибридной линии считают достаточной и сравнимой с желаемым культиваром, эту гибридную линию используют для получения двойной гаплоидной линии или изогенной линии, как, например, предпочтительно путем использования методик культивирования пыльников-микроспор, как описано в Примере 2 и было подробно описано Kasha et al. (1992; 2001), с получением от этой линии гибридного культивара линии, которая является гомозиготной по желаемому признаку пигментированных семян. Затем эту изогенную гибридную линию можно использовать в качестве культивара-хозяина для сельскохозяйственного производства молекул.
В предпочтительных воплощениях множество изогенных растений получают от гибридной линии, полученной после обратного скрещивания; различная изогенная организация генома индивидуальных изогенных линий предоставляет большое число возможных результирующих скрещиваний потомков F3; семена указанных изогенных растений сеют и выращивают, после чего тестируют на способность к трансформации и культивированию ткани путем трансформации экспрессионным вектором, таким как описан здесь, и скрининга на эффективную трансформацию и экспрессию; и на основании указанного тестирования отбирают изогенную линию из указанного множества изогенных растений в качестве трансформируемого растения для продуцирования интересующего гетерологичного белка.
Однодольные и двудольные растения, с которыми можно проводить генетические манипуляции, можно использовать в качестве желаемого культивара в настоящем изобретении. Предпочтительно растение является однодольным, более предпочтительно представляет собой ячмень, и наиболее предпочтительно ячмень Hordeum vulgaris. Растение, которое может быть генетически трансформировано, представляет собой растение, в котором гетерологичная последовательность ДНК, включая последовательность ДНК кодирующей области, может быть введена, экспрессируется, стабильно поддерживается и передается последующим поколениям потомства. Для получения растений ячменя использованы способы генетической манипуляции и трансформации, при которых используют гербицидную устойчивость, включая, например, биалафос или баста, или устойчивость к антибиотикам, такую как устойчивость к гигромицину, в качестве селективного маркера.
Предпочтительно, чтобы промоторы, используемые в конструкции ДНК по настоящему изобретению, обладали сильной активностью в визуально различимой части растения, такой как ткань семени, где желательно накопление интересующего гетерологичного полипептида. Такие промоторы могут быть получены из разнообразного растительного генетического материала или из растительных вирусов. Предпочтительно, чтобы конкретный выбранный промотор был пригоден для экспрессии гетерологичного белка в однодольных семенах, более предпочтительно у ячменя, и наиболее предпочтительно в ткани эндосперма семени.
Рекомбинантная плазмида по изобретению может быть получена путем лигирования (вставки) интересующих последовательностей ДНК в подходящую плазмиду, которая может реплицироваться в бактериальном хозяине. Последовательности ДНК, такие как ген, кодирующий интересующий гетерологичный белок, или промоторные последовательности ДНК, предназначенные для тканеспецифичной экспрессии в семени, должны быть оперативно вшиты в плазмиду, которая может содержать в дополнение к промотору и для данной цели, если желательно, дополнительные энхансерные последовательности ДНК, области присоединения каркаса, интроны, дополнительный сигнал поли(А), последовательность связывания рибосомы и интересующий селективный маркерный ген, такой как ген устойчивости к гигромицину, ген устойчивости к ампициллину, ген устойчивости к биалафосу или тому подобный. Такой селективный маркер является предпочтительным при трансформации растений ячменя, поскольку эффективность трансформации является относительно низкой и, следовательно, желательно иметь возможность селекции положительных трансформированных клеток от нетрансформированных клеток.
ПРИМЕРЫ
Приведенные ниже примеры представлены для лучшего объяснения настоящего изобретения и чтобы служить руководством обычным специалистам в данной области техники в осуществлении настоящего изобретения. Если не указано иное, термины следует понимать в соответствии с их общепринятым употреблением специалистами в соответствующей области техники.
МЕТОДЫ
Искусственное опыление линий ячменя при скрещивании и обратном скрещивании
Hordeum vulgaris, или ячмень, является самоопыляющимся растением, что означает, что пыльца от одного цветка обычно опыляет яйцеклетку в том же цветке. При культивировании самоопыление, в конечном счете, приводит к изогенным или почти изогенным линиям, что означает, что большинство или все аллели являются гомозиготными. Чтобы ввести новый признак или фенотип в такие самоопыляющиеся виды, необходимо искусственное опыление или скрещивание. Искусственное опыление или скрещивание ячменя проводят в теплицах. Сначала два культивара с некоторыми желаемыми признаками отбирают, и их семена высевают в горшки. Посев повторяют в течение нескольких суток, чтобы гарантировать, что стадия развития родителей, отобранных для скрещивания, является совместимой. Искусственное опыление проводят в две стадии. Первой стадией является стадия, когда только цветки на культиваре-хозяине являются полностью развитыми, или сразу после того, как побеги под колосьями начинают выступать из листового влагалища. Затем каждый цветок или вторичный колосок на колосе раскрывают, и три тычинки внутри цветка удаляют ножницами. Затем каждый обработанный колос помещают в пакет, чтобы препятствовать распространению пыльцы по вторичным колоскам, и чтобы препятствовать высыханию цветка. Второй стадией является действительное искусственное опыление или скрещивание, и оно имеет место спустя три-пять суток после удаления тычинок, или когда плодолистик у культивара-хозяина полностью развит и готов к опылению. Тычинки у культивара-донора, которые еще не распространили свою пыльцу на их собственный плодолистик, и являются полностью развитыми, отбирают и используют для опыления вторичных колосков хозяина с удаленными тычинками. Успешная частота искусственного опыления обычно составляет между 50% и 70%.
Получение двойных гаплоидных изогенных гибридных линий ячменя
Эта методика основана на протоколе, разработанном Kasha et al. (2001). Семена высевают на смесь 75% легкого торфа из сфангума и 25% пемзы (средний размер зерен) и выращивают растения при 16°С в дневное время (16 часов) и 12°С в ночное время (8 часов) и относительной влажности 70% при 250 мкмоль м-2 с-1 непрерывного освещения в дневное время при холодно-белой флуоресценции и поливают по необходимости под корень водой. В этих условиях растения выращивают вегетативно в течение примерно 55-95 суток до тех пор, когда незрелые колосья можно собрать на подходящей стадии. Идеальной стадией для культивирования микроспор является стадия от средней до поздней одноядерной. После сбора колосья кладут на марлю и хорошо опрыскивают 80% EtOH, покрывают марлей и сушат в течение 5 минут. Колосья извлекают из листового влагалища и помещают в стерильные чашки Петри, примерно 10 колосьев на каждую чашку. В каждую чашку добавляют 15 мл охлажденного во льду 0,3 М маннита, а затем чашки запаивают прозрачной пластиковой пленкой, закрывают алюминиевой фольгой и хранят при 4°С в течение 3-4 суток. Затем концы предварительно обработанных колосьев отрезают и выбрасывают, и колосья режут на кусочки 1-2 см в охлажденную чашку смесителя с охлажденным во льду маннитом. Ингредиенты смешивают в смесителе Уоринга при низкой скорости в течение 5 сек, и суспензию фильтруют через нейлоновые мембраны 500 мкм + 200 мкм. Фильтрат собирают, фильтруют через мембрану 100 мкм и собирают в 50 мл пробирки BD Falcon. Пробирки центрифугируют в течение 5 мин, жидкость осторожно выливают и промывают 0,3 М маннитом, объединяют в одну или две 50 мл пробирки и центрифугируют в течение 5 мин, жидкость выливают из 50 мл пробирки, осадок ресуспендируют в 2 мл маннита и переносят пипеткой примерно на 12 мл 20% мальтозы в 15 мл пробирки Falcon. Пробирки центрифугируют в течение 5 мин, живые микроспоры собирают пипеткой со слоя выше середины пробирки, ресуспендируют в манните и центрифугируют в течение 5 мин, и осадок микроспор ресуспендируют в 2 мл среды FHG. Затем суспензию микроспор осторожно переносят пипеткой на предварительно увлажненную фильтровальную бумагу в фарфоровую воронку под вакуумом. Самую верхнюю фильтровальную бумагу переносят на центр затвердевшей среды FHG в чашку Петри, и чашки запаивают пластиковой пленкой и инкубируют в темноте при 25°С в течение 3-4 недель. Через 7-10 суток в чашки добавляют свежую жидкую FHG. Эмбрионоподобные структуры переносят в среду MS для дифференциации, когда они достигают размера 1-2 мм, инкубируют в темноте в течение 3 суток, а затем переносят на 8-часовой свет при 22°С на несколько недель. Маленькие проростки (3-4 см) переносят в среду MS для регенерации в ящики, и растения пересаживают вскоре после того, как корни хорошо разовьются.
Оценка способности к культивированию ткани и генетической трансформации у гибридных линий ячменя
а) Растительный материал для генетической трансформации
Семена Hordeum vulgaris cv Golden Promise и семена из различных гибридных линий сеют на смесь 75% легкого торфа из сфангума и 25% пемзы (средний размер зерен), и растения выращивают при 16°С в дневное время (16 часов) и 12°С в ночное время (8 часов) и относительной влажности 70% при 250 мкмоль м-2 с-1 непрерывного освещения в дневное время при холодно-белой флуоресценции и поливают по необходимости под корень водой. В этих условиях растения выращивают вегетативно в течение примерно 55-95 суток или до тех пор, пока незрелые семена не готовы в качестве материала для трансформации, что составляет примерно от 8 до 14 суток после опыления. Семена стерилизуют в 3% гипохлорите натрия в течение 40 мин в роторной качалке и промывают пятью сменами стерильной воды.
б) Бактериальные штаммы и подготовка к трансформации растений
Agrobacterium tumefaciens, несущие бинарный вектор в транс-положении с Ti-плазмидой, обладающий участком vir, используют для введения в ячмень участка Т-ДНК с конструкцией ДНК, регулирующей экспрессию интересующего гетерологичного белка. Трансформацию обеих бактерий, E.coii XL-Blue и Agrobacterium tumefaciens, проводят путем электропорации, как описано Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982). Для подготовки к трансформации растения отдельную колонию культуры Agrobacterium инокулируют в 5 мл среды Agro (триптон 5 г/л, дрожжевой экстракт 2,5 г/л, маннит 5 г/л, глутаминовая кислота 1 г/л, KH2PO4 250 мг/л, MgSO4·7H2O 100 мг/л, биотин 1 мкг/л, рН 7,0, 25 мкг/мл рифампицина, 50 мкг/мл стрептомицина) и выращивают в течение 24-40 часов при 27°С. В стерильных пробирках Эппендорф 200 мкл культуры добавляют к 200 мкл 30% водного глицерина (предварительно стерилизованного), и культуру хорошо перемешивают на вортексе и оставляют на столе на 2 часа, после чего хранят при -80°С. Для каждой трансформации одну пробирку извлекают из морозильника на -80°С, оттаивают, и примерно 200 мкл концентрированной суспензии Agrobacterium добавляют к 5 мл среды Agro без антибиотика. Затем культуру выращивают в течение 17-20 часов при 27°С, после чего используют для инокуляции растительного материала (см. ниже).
в) Получение эксплантатов ячменя для индуцированной Agrobacterium трансформации
На первые сутки примерно 10 головок ячменя собирают примерно через 8-14 суток после опыления, ости и семена удаляют и извлекают зародыши размером между 1,5 мм и 2 мм. Исходный растительный материал должен быть здоровым и зрелым, а также не насыщенным водой, и семена должны быть зелеными без признаков заболевания или грибков. Семена помещают в 50 мл пробирку Falcon (не более чем на половину объема) и промывают 70% этанолом, а затем этанол выливают. Затем добавляют 20% осветляющий раствор (White King) и перемешивают в течение 20 минут. В вытяжном ламинарном шкафу осветляющий раствор выливают, семена промывают стерильной водой (примерно 5-8 промывок), и пробирки помещают на ночь при 4°С. На вторые сутки семена помещают в стерильную чашку Петри на платформу препаровальной лупы. Положение зародыша локализуют, от семени отрезают кончик и делают надрез вниз по боку семени. Затем семя прочно удерживают ножницами и надавливают на середину семени так, чтобы зародыш выскочил. Зародыш удерживают на месте ножницами, и лезвие скальпеля вставляют в канавку между щитком и осью, и ось медленно вырезают. Зародыш без оси помещают на регенерационную среду, стороной надреза вверх, в центр чашки Петри, примерно 25 зародышей на чашку. На каждую трансформацию используют всего 200 зародышей.
г) Обращение с бинарным вектором
Бинарный вектор размножают в Е.coii XI-Blue в культуральной среде LB, содержащей 100 мкг/мл спектиномицина, при 37°С, и вектор последовательно очищают из 100 мл культуры, выращенной в течение ночи, используя набор QIAGEN® Plasmid Midi Kit. Плазмидный бинарный вектор вводят в Agrobacterium tumefaciens с помощью электропорации путем помещения 1 мкл (1 мкг) вектора в стерильную кювету с прорезью 0,1 см (BioRad), смывая вектор 40 мкл электрокомпетентных клеток и устанавливая напряжение при 2,5 кВ и емкость 21 пФ для электропорации. Клетки рассевают на селективные чашки YEP, содержащей 100 мкг/мл спектиномицина и 20 мкг/мл рифампицина, и выращивают при 28°С в течение 2 суток. Анализ рестрикционного расщепления плазмиды из трансформантов A. tumefaciens проводят для проверки интактности бинарного вектора.
д) Инфекция эксплантатов ячменя Agrobacterium
Примерно 10 мкл культуры Agrobacterium переносят пипеткой на каждый зародыш, обеспечивая приведение в контакт всех зародышей с раствором. Зародыши переворачивают (стороной надреза вниз) и протягивают через регенерационную среду до наружного края чашки, удаляя избыток Agrobacterium. Затем зародыши переносят на чашки со свежей регенерационной средой (стороной надреза вверх) через равные промежутки (25 на чашку) и помещают в темный кабинет при 24°С.
е) Регенерация и органогенез в культуре ткани ячменя после инфекции Agrobacterium
Через трое суток зародыши переносят на свежую регенерационную среду с селективным маркером, таким как биалафос или гигромицин, и оставляют там от четырех до шести недель, пересевая каждые две недели. Для регенерации побегов каллусы переносят на среду для индукции побегов (SIM), и выживший каллус и регенерирующие побеги переносят на свежую SIM каждые две недели до образования маленьких проростков. Затем побеги переносят на среду для индукции корней (RIM), выжившие растения считают, а затем высевают в горшки в почву. После одного месяца в почве эксплантат листа собирают от каждого растения для ПЦР скрининга на трансген и считают число трансгенных растений на 100 зародышей, зараженных Agrobacterium.
Выделение ДНК и ПЦР анализ трансгенных линий
Геномную ДНК для ПЦР амплификации выделяют примерно из 200 мг ткани молодого листа, используя набор NucleoSpin Plant Kit® от Clonetech, и в соответствии с инструкциями изготовителя. ПЦР амплификации на ген гигромицинфосфотрансферазы (hph) проводят в 25 мкл реакционной смеси (50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl (рН 8,4), 1,5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого dNTP, примерно 0,25 мкМ праймера, 2,5 Ед Taq полимеразы (Fermentas) и от 50 нг до 100 нг ДНК-матрицы. Реакцию ПЦР проводят, начиная с 3 минут при 94°С, а затем 31 цикл со следующими стадиями: 30 секунд при 66°С, 45 секунд при 72°С, 30 секунд при 94°С. Реакция амплификации заканчивается 4-мин стадией элонгации при 72°С. Для амплификации используют два специфичных праймера hph (hph129 и hph130). Последовательность этих праймеров приведена ниже: hph 129, 5'-CGGGCGCCATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACG-3' (SEQ ID NO:1); hph130, 5'-CGGGCGCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGC-3' (SEQ ID NO:2).
ПРИМЕР 1
Разведение трансформируемой гибридной линии ячменя с черными семенами
Семена от Hordeum vulgaris cv Golden Promise, который поддается трансформации растений и регенерации растения через тканевую культуру, высаживали в горшки. Засев повторяли в течение нескольких суток, и растения выращивали в теплице при естественном освещении. В то же время семена от культивара Hordeum vulgaris, называемого "Svarthovdi", который имеет черные семена, но не поддается трансформации растений и регенерации растений через тканевую культуру, высаживали в горшки и выращивали в тех же условиях. Черное семя является доминантным признаком "Svarthovdi", и этот фенотип проявляется в семенной оболочке или в алейроновом слое семени. Когда семя является полностью зрелым, по меньшей мере 50% семенной оболочки имеет черную пигментацию. Как только цветы на культиваре Golden Promise полностью развились, или сразу после того как побеги под колосьями начали выступать из листового влагалища, десять цветков или вторичный колосок на колосе раскрывали, и три тычинки внутри цветков удаляли ножницами. Затем каждый обработанный колос помещали в пакет, чтобы препятствовать распространению пыльцы по вторичным колоскам и высыханию цветка. Спустя четверо суток полностью развитые тычинки от культивара "Svarthovdi" собирали и использовали для опыления плодолистиков десяти цветков культивара Golden Promise с удаленными тычинками. После опыления колосья держали в пакете, и семена не собирали до их полного развития. Зародыши F1 в этих семенах все являются гетерозиготными по аллелю black. Генетический фон составляет 50% Golden Promise и 50% "Svarthovdi" с черной пигментированной семенной оболочкой, поскольку аллель black является доминантным. Все обработанные семена F1 высевали в горшки, и растения F1 выращивали до тех пор, пока вторичные колоски не были готовы к обратному скрещиванию с пыльцой от культивара Golden Promise. Обратное скрещивание Golden Promise проводили, как описано выше, и семена F2 высевали в горшки и выращивали растения F2 в условиях теплицы до тех пор, пока вторичные колоски не были готовы к повторению обратного скрещивания с пыльцой от культивара Golden Promise. Генетический фон в растениях F2 вычислен как 75% cv Golden Promise и 25% cv "Svarthovdi". Растения F2 выращивали в теплице до тех пор, пока вторичные колоски не были готовы к обратному скрещиванию с пыльцой от культивара Golden Promise, как описано выше. Генетический фон в растениях F3 должен составлять 87,5% cv Golden Promise и 12,5% cv "Svarthovdi". Вторичным колоскам F3 давали возможность самоопыления и развития полностью зрелых семян F3. 75% семян F3 имели черный фенотип и 25% имели традиционный желтый фенотип семени. Черные семена F3 собирали и высевали в горшки, и растения F3 выращивали в условиях теплицы до тех пор, пока микроспоры не были готовы к сбору для культивирования микроспор для получения двойных гаплоидных изогенных гибридных линий, гомозиготных либо по фенотипу черного семени, либо по фенотипу желтого семени, где все имеют генетический фон, который преимущественно (вычислено 87,5%) составляет культивар Golden Promise, который поддается трансформации растений и регенерации растений. Изогенные гибридные линии выращивали до состояния зрелости, и линии с фенотипом черных семян собирали для тестирования на способность к трансформации растений и регенерации растений.
ПРИМЕР 2
Селекция гибридной линии ячменя с черными семенами, поддающейся трансформации растений и регенерации растений через тканевую культуру, с использованием генетической трансформации
Незрелые семена 50 гибридных двойных гаплоидных изогенных линий, примерно через 8-14 суток после опыления, собирали и хранили в течение ночи при 4°С в темноте. Инкубированное на холоде незрелое семя обрабатывали в 70% EtOH в течение 1 мин, а затем в течение 10 мин в 0,6% гипохлорите натрия с последующей тщательной отмывкой (5-8 раз) в стерильной дистиллированной воде и помещали на стерильную чашку Петри под препаровальную лупу в ламинарном вытяжном шкафу в стерильных условиях. Положение зародыша локализовали, кончик семени отрезали и делали надрез вниз по боку семени. Семя удерживали ножницами и надавливали на середину семени так, чтобы выдавить зародыш. Зародыш удерживали на месте ножницами, лезвие скальпеля вставляли в канавку между щитком и осью, и ось медленно вырезали. Щиток помещали на среду для индукции каллуса, стороной надреза вверх, и инокулировали 25 мкл-40 мкл Agrobacterium tumefaciens, несущей вектор для трансформации растений pbGF201if (SEQ ID NO:3, см. фиг.3 и приведенное выше описание к ней) в течение 1-5 минут. После инокуляции щиток вытаскивали на наружный край чашки, чтобы снизить бактериальную нагрузку и уменьшить перерастание во время фазы совместной культивации. Инфицированный щиток переносили на чашку со свежей средой для индукции каллуса, и чашку инкубировали при 24°С в темноте в течение 3 суток. После 3 суток щиток переносили на новую среду для индукции каллуса, но со 100 мкг/мл тиментина для уничтожения Agrobacterium и 50 мкг/мл гигромицина для селекции трансформированных клеток и инкубировали в течение 4 недель в темноте при 24°С, пересевая каждые 2 недели. Затем каллус переносили на среду для индукции побегов, содержащую 2,5 мг/л ВАР, 50 мкг/мл тиментина и 25 мкг/мл гигромицина и инкубировали при высоком свете от 4 до 10 недель. Индивидуальные регенерирующие ростки переносили на среду для образования корней (50 мкг/мл тиментина и 25 мкг/мл гигромицина и без гормонов). После развития побегов с корнями примерно до 5-7 см трансгенные растения переносили в почву и выращивали там при полном освещении. Семена от трансгенных линий подвергали скринингу на экспрессию гетерологичного слитого белка lif-cbm, используя ELISA с поликлональным антителом, образованным против cbm (модулятор связывания целлюлозы) у кролика. Гибридную двойную гаплоидную изогенную линию, которая давала самый высокий процент трансгенных растений, отобрали как наиболее пригодную линию для сельскохозяйственного производства молекул и назвали "Dimma".
ПРИМЕР 3
Продуцирование интересующего гетерологичного белка
Семена от линии растений, отобранной в Примере 2 и названной Dimma, трансформируют по существу, как описано выше за исключением того, что ген, кодирующий интересующий гетерологичный белок, вводят в экспрессионный вектор вместо кодирующей последовательности lif-cbm. Успешные трансформанты сеют и выращивают; семена собирают, и интересующий белок экстрагируют из них, особенно предпочтительно экспрессировать интересующий гетерологичный белок в виде слитого белка cbm, поскольку такие слитые белки можно легко экстрагировать и очистить в широком масштабе, и участок cbm этого слитого белка можно, возможно, легко отщепить или отделить от интересующего гетерологичного белка путем введения сайта расщепления, распознаваемого подходящей протеазой, между кодирующей последовательностью cbm и последовательностью, кодирующей интересующий гетерологичный белок. Такие способы подробно описаны в совместно поданных заявках WO 2005/021762 и WO 2005/021764, которые полностью включены сюда путем ссылки.
Хотя только предпочтительные воплощения изобретения конкретно проиллюстрированы, предполагается, что специалистами в данной области техники могут быть сделаны различные модификации и варианты в изобретении, как описано в приведенных выше примерах, без отклонения от сущности и заявленного объема изобретения.
Источники информации
Davis et al., 1994: In: Basic Methods in Molecular Biology. Norwalk. Connecticut: Appelton and Lenge: 350-355.
De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:277.
Kasha et al. (1992): In: Barley Genetics VI, vol. 2 Proc. 6th Int. Barley Genet. Symp. pp793-806. Munksgaard Int. Publ. Copenhagen.
Kasha et al. (2001) Euphytica 120:379-385.
Klein et al. (1987) Nature 327:70-73.
Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
Sanford et al. U.S. Patent No. 4,945,050.
Sorensen et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 250: 750-760.
Waterhouse et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95:13959-13964.
1. Способ получения трансформированного растения с семенами, обладающими визуальным характеристическим признаком, при котором:
(а) обеспечивают желаемый первый культивар для экспрессии и накопления гетерологичного белка в его семенах или любой его части, где указанный культивар поддается трансформации растений и регенерации растений через тканевую культуру; и
(б) обеспечивают второй культивар с семенами, которые обладают визуальным характеристическим признаком, так что семена указанного культивара визуально существенно отличаются от семян обычных сельскохозяйственных культиваров или растений дикого типа того же вида, которые растут в географическом районе, предназначенном для выращивания указанного трансформированного растения;
(в) скрещивают указанный второй культивар с указанным первым культиваром с получением гибридной линии;
(г) проводят обратное скрещивание указанной гибридной линии с указанным первым культиваром с получением гибридных растений, геном которых, по существу, состоит из генома указанного первого культивара и имеет семена с таким же визуальным характеристическим признаком, как и семена в указанном втором культиваре;
(д) отбирают из указанных гибридных растений гибридную линию-хозяина, которая сохраняет характеристики указанного первого культивара, что делает ее способной к трансформации растений и регенерации растений, и
(е) обеспечивают нуклеиново-кислотную конструкцию, которая содержит нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую промотор, активный в растениях, оперативно сцепленный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей интересующий гетерологичный белок;
(ж) трансформируют одну или более чем одну клетку из указанной гибридной линии-хозяина указанной нуклеиново-кислотной конструкцией;
(з) регенерируют растение из указанной трансформированной одной или более чем одной клетки растения-хозяина из указанной гибридной линии-хозяина и выращивают указанное растение с получением генетически трансформированного растения с визуально мечеными семенами, экспрессирующими указанный гетерологичный белок.
2. Способ по п.1, где указанный визуальный характеристический признак представляет собой окраску семени, существенно отличающуюся от окраски семени указанных обычных сельскохозяйственных культиваров или растений дикого типа того же вида, которые растут в географическом районе, предназначенном для выращивания указанного трансформированного растения.
3. Способ по п.1, где указанное генетически трансформированное растение представляет собой однодольное растение.
4. Способ по п.3, где указанное генетически трансформированное растение представляет собой ячмень.
5. Способ по п.1, где стадию обратного скрещивания (г) повторяют по меньшей мере один раз для получения указанных гибридных растений.
6. Способ по п.1, где микроспоры от указанных гибридных растений используют для тканевой культуры с получением изогенных гибридных линий, поддающихся трансформации растений и регенерации растений, с семенами, имеющими указанную иную окраску.
7. Способ по п.6, где множество указанных изогенных гибридных растений трансформируют нуклеиново-кислотной конструкцией, содержащей селективный маркерный ген, оперативно сцепленный с промотором, и где указанную гибридную линию-хозяина отбирают на основании оценки эффективности трансформации и экспрессии генного продукта указанной нуклеиново-кислотной конструкции.
8. Способ по любому из пп.2-8, где по меньшей мере 50% поверхности указанных визуально меченых семян указанного генетически трансформированного растения имеет окраску, существенно отличающуюся от окраски семени обычных сельскохозяйственных культиваров или растений дикого типа того же вида, которые растут в географическом районе, предназначенном для выращивания указанного трансформированного растения.
9. Способ по п.1, где указанный промотор, активный в растениях, представляет собой промотор, специфичный для семени.
10. Способ по п.1, где указанный интересующий гетерологичный белок выбран из группы, состоящей из коллагенов, коллагеназы, полипептидов гомеобокса, моноклональных антител, секретируемых антител, отдельных цепей антител, включая легкие цепи и тяжелые цепи, лектина, связывающего маннозу, пепсина, химотрипсина, трипсина, казеина, человеческого гормона роста, человеческого сывороточного альбумина, человеческого инсулина, целлюлаз, пектиназ, гемицеллюлаз, фитаз, гидролаз, пероксидаз, фибриногена, фактора IX, фактора XIII, тромбина, белка С, ксиланазы, изоамилазы, глюкоамилазы, амилаз, лизоцима, бета-глюканазы, глюкоцереброзидазы, казеинов, лактазы, уреазы, глюкозоизомеразы, инвертазы, стрептавидина, эстеразы, щелочной фосфатазы, ингибиторов протеаз, папаина, киназ, фосфатаз, дезоксирибонуклеаз, рибонуклеаз, фосфолипаз, липаз, лакказы, белков паутины, белков-антифризов, противомикробных пептидов или дефензинов, факторов роста и цитокинов.
11. Способ по п.1, где указанный интересующий гетерологичный белок представляет собой ингибиторный фактор лейкемии.
12. Способ по п.1, где указанная нуклеиново-кислотная конструкция содержит нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую модуль связывания целлюлозы (cbm), прилежащий к нуклеиново-кислотной последовательности, кодирующей указанный интересующий гетерологичный белок, возможно отделенной нуклеиново-кислотной последовательностью, кодирующей сайт протеолитического расщепления.
13. Способ по п.1, где указанное генетически трансформированное растение с указанными визуально мечеными семенами выращивают в условиях, где указанная нуклеиново-кислотная последовательность, кодирующая указанный интересующий гетерологичный белок, экспрессируется таким образом, что указанный белок накапливается в семенах указанного растения.
14. Трансгенное растение ячменя, полученное способом по п.1, экспрессирующее в его семенах интересующий гетерологичный белок, продуцирующее в его семенах или в семенной оболочке пигмент, который, по существу, является визуально отличным от природной желтой окраски семени обычного ячменя, такого как вид ячменя Hordeum vulgaris.
15. Трансгенное растение ячменя по п.14, продуцирующее черный, красный или синий пигмент, достаточный для придания семенам этого растения заметной синей, красной, серой или черной окраски.
16. Трансгенное растение ячменя по п.14, экспрессирующее, по существу, весь указанный гетерологичный белок в его семенах.
17. Трансгенное растение ячменя по п.14, имеющее в его геноме промотор, специфичный для семени, оперативно сцепленный с нуклеиново-кислотной последовательностью, кодирующей указанный гетерологичный белок.
18. Трансгенное растение ячменя по п.17, где указанный промотор, специфичный для семени, выбран из группы, состоящей из промоторов из однодольного растения, которые являются первично специфичными для семени.
19. Трансгенное растение ячменя по п.14, которое является изогенным.
20. Трансгенное растение ячменя по п.14, поддающееся культивированию ткани и генетической трансформации.
21. Трансгенное растение ячменя по п.14, где указанный гетерологичный белок экспрессируется в виде слитого белка, содержащего модуль связывания углеводов.
22. Способ продуцирования интересующего гетерологичного белка, при котором:
(а) выращивают трансгенное растение ячменя по любому из пп.14-21, которое имеет семена, визуально отличные от обычных сельскохозяйственных культиваров или растений дикого типа того же вида, которые растут в этом географическом районе, где указанное трансгенное растение ячменя экспрессирует в его семенах указанный интересующий гетерологичный белок;
(б) собирают указанное растение и
(в) экстрагируют из его семян указанный гетерологичный белок.
23. Способ по п.22, где множество указанных трансгенных растений ячменя выращивают в открытом поле, отделенном от каких-либо нетрансгенных растений ячменя.
