Способ оценки эффективности внутристеночной аутоплазмохимиотерапии рака мочевого пузыря

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологическим исследованиям в онкологии. Для оценки эффективности внутристеночной аутоплазмохимиотерапии рака мочевого пузыря проводят реакции с маркерами факторов пролиферации и апоптоза. При снижении пролиферативной активности Ki-67 14,3±3,41%, снижении экспрессии р53 10%, апоптотического индекса 0,53±0,13, при отсутствии экспрессии цитокератинов АЕ1/АЕ3 в сосудах микроциркуляторного русла, при сохранении выраженной экспрессии цитокератинов АЕ1/АЕ3 в уротелиальном эпителии прогнозируют снижение рецидивов и метастазов. Способ повышает оценку эффективности лечения, химиопрофилактики местных рецидивов и прогрессирования поверхностного рака мочевого пузыря в мышечный слой. 2 табл., 3 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологическим исследованиям в онкологии, и может быть использовано для определения эффективности внутристеночной химиотерапии на аутоплазме поверхностного уротелиального рака мочевого пузыря.

Известно, что основной причиной неудач хирургического лечения рака мочевого пузыря является развитие рецидивов, частота рецидивов составляет 30,4-75,0%. Рецидивы после операции возникают преимущественно на новом месте, реже - в области послеоперационного рубца. Известны показатели эффективности лечения рака мочевого пузыря, сроки возникновения рецидивов. Факторами рецидивов инвазивной формы рака мочевого пузыря являются степень дифференцировки, фактор пролиферации Ki-67, индекс апоптоза.

Известен «Способ определения эффективности аутогемохимиотерапии рака ректосигмоидного отдела прямой кишки и сигмовидной кишки в сочетании с СВЧ-гипертермией рака прямой кишки» (см. патент №2219553, бюл. №35, опубл. 20.12.2003 г.), включающий проведение реакции с маркерами факторов пролиферации Ki-67, PCNA и ЭМА, при этом наблюдают положительную реакцию в виде отчетливого окрашивания, выявляют их экспрессию и маркеры соединительной ткани и делают вывод о блокаде маркеров эндотелия, базальных мембран, коллагена IV типа, подавление ангиогенеза, наличие сосудов капиллярного типа, гиперпластических изменениях в эндотелии, а также о пролиферативных процессах в сосудистом русле, и эти вышеперечисленные морфологические признаки считают прогностическими факторами эффективности лечения.

Однако в раковых опухолях и некоторой части аденом толстой кишки индекс метки был значительно выше, чем в нормальном эпителии, но одинаков с гиперпластическим эпителием вблизи края опухоли. Последнее обстоятельство ограничивает диагностическое применение PCNA в оценке озлокачествления эпителия толстой кишки.

Известен «Способ оценки эффективности неоадъювантного лечения меланомы кожи» (см. патент №2322194, бюл. №11, опубл. 20.04.2008 г.), выбранный нами в качестве прототипа, отличающийся тем, что при иммуногистохимическом исследовании результатов лечения выявляют экспрессию маркера меланомы Melan PNL2, отмечают реакцию с антителами фактора апоптоза р53, реакцию с антителами bcl-2, реакцию с антителами маркера фактора пролиферации Ki-67 и реакцию с антителами CD95 (АПО-1) и в случае отсутствия реакции с антителами фактора апоптоза р53, реакции с антителами bcl-2 либо наличии слабоположительного окрашивания антигена, наличии низкой пролиферативной активности меланоцитов, блокады пролиферации - повреждение локализации белка Ki-67 и активации апоптоза при реакции с антителами CD95 (АПО-1) лечение оценивают как эффективное, свидетельствующее о терапевтическом патоморфозе опухоли.

Однако показатели данного иммуногистохимического исследования эффективности неоадъювантного лечения специфичны только для меланомы кожи.

Целью изобретения является выявление факторов прогнозирования эффективности внутристеночной аутоплазмохимиотерапии рака мочевого пузыря.

Поставленная цель достигается тем, что проводят реакции с маркерами факторов пролиферации и апоптоза. Выявляют снижение пролиферативной активности Ki-67 14,3±3,41%, снижение экспрессии р53 10%, апоптотического индекса 0,53±0,13, отсутствие экспрессии цитокератинов АЕ1/АЕ3 в сосудах микроциркуляторного русла при сохранении выраженной экспрессии в уротелиальном эпителии, на основании выявленных показателей терапевтического патоморфоза опухоли прогнозируют снижение рецидивов и метастазов.

Изобретение «Способ оценки эффективности внутристеночной аутоплазмохимиотерапии рака мочевого пузыря» является новым, так как оно неизвестно в медицине, при морфологических исследованиях в онкологии для определения эффективности внутристеночной химиотерапии на аутоплазме поверхностного уротелиального рака мочевого пузыря.

Новизна заключается в том, что наш способ основан на целевой доставке и локальном депонировании химиопрепарата, инкубированного с аутоплазмой и проведения иммуногистохимического исследования, выявившего тенденцию к снижению экспрессии фактора Ki-67 и фактора р53. Данные, полученные в результате проведенного исследования, свидетельствуют о преимуществе предлагаемого способа оценки эффективности лечения, химиопрофилактики местных рецидивов и прогрессирования поверхностного рака мочевого пузыря в мышечный слой, по сравнению со стандартным алгоритмом ведения пациентов.

Изобретение «Способ оценки эффективности внутристеночной аутоплазмохимиотерапии рака мочевого пузыря» является промышленно применимым, так как может быть использовано в медицинских учреждениях онкологического профиля, онкодиспансерах, научно-исследовательских онкологических институтах.

«Способ оценки эффективности внутристеночной аутоплазмохимиотерапии рака мочевого пузыря» выполняется следующим образом.

Обоснованность подслизистых инъекций и отношение их локализации к основанию опухоли находятся в зависимости от тенденции распространения опухолевых элементов по подслизистому слою. Выполняя морфологические исследования опухолей мочевого пузыря, а также стенки пузыря вокруг опухоли, мы определяли наличие интрамурального внутрисосудистого метастазирования опухоли. Кроме того, нами была исследована корреляция внутристеночной диссеминации с размером и степенью гистологической дифференцировки основного очага.

Материалом для морфологического исследования послужили ткани, полученные в процессе выполнения оперативного пособия - трансуретральной резекции мочевого пузыря. Исследованию подвергалась как сама опухоль (экзофитная часть, основание), так и окружающая опухолевый очаг стенка мочевого пузыря.

Всего из 81 больного, вошедшего в исследование, полифокальная интраоперационая биопсия стенки мочевого пузыря выполнялась 64 больным, что составило 79%. В основной группе 33 пациентам (84,5%) и 30 больным в контрольной (71,5%). Вокруг большинства поверхностных опухолей как первичных, так и рецидивных, при визуальной оценке, уротелий не был изменен. Однако при морфологическом исследовании биоптатов окружающей опухоль стенки, взятых во время трансуретральных резекций, обнаруживались различные изменения (табл.1).

Как следует из представленных данных, частота выявления изменений уротелия и стенки мочевого пузыря прямо пропорциональна степени злокачественности опухоли. Частота сопутствующей дисплазии уротелия повышалась от 23% при G₁ до 80% при G₃. Такая же закономерность наблюдалась и в отношении диссеминации опухоли по капиллярам подслизистого слоя. При высокодифференцированных опухолях она обнаруживалась у 15% больных, а при низкодифференцированных опухолях - в 100%. В таблице также представлены сопутствующие изменения у больных, которым проводилась интраоперационная полифокальная биопсия. Сопутствующие основному опухолевому очагу раковые изменения уротелия (Tis, Ta, Т₁) не были обнаружены только у пациентов с высокодифференцированными опухолями.

Диссеминация опухоли определялась как в лимфатических капиллярах, так и в венозных.

Особенностью, отмечаемой во всех исследованных случаях, являлась тождественность опухолевых клеток в сосудах подслизистого слоя и клеток основного опухолевого очага.

Все опухоли, вокруг которых обнаруживалась внутристеночная сосудистая инвазия, были диаметром более 1,5 см. Среди указанных опухолей мы не обнаружили стадии Та, только Т₁.

Проводимая нами повторная полифокальная щипковая биопсия стенки мочевого пузыря была направлена на выявление изменений в состоянии именно сопутствующих основному, удаленному хирургическим путем опухолевому очагу, патологических процессов в уротелии.

Результаты, полученные при исследовании уротелия через 10-14 дней после перифокального воздействия химиопрепарата, инкубированного с аутоплазмой, показали, что на месте введения цитостатика обнаруживались разрушенные опухолевые клетки в просвете капилляров, незначительная лимфоцитарная инфильтрация тканей. В контрольной группе, пациентам из которой не проводилась указанная выше терапия, обнаруживались изменения уротелия в том же соотношении, что и определяемые ранее при интраоперационной перифокальной биопсии. В последующем у 4 пациентов из 10, подвергнутых повторной биопсии с положительным результатом в отношении сосудистой инвазии, развились местные рецидивы в сроки от 3 до 9 месяцев, причем у одного пациента развился мышечно-инвазивный рецидив на расстоянии 1,8 см от послеоперационного рубца на месте предыдущей ТУР. Данное обстоятельство свидетельствует о недостаточной эффективности, проводимой с профилактической (противорецидивной) целью адъювантной внутрипузырной химиотерапии, и свидетельствует о необходимости применения предлагаемой нами внутристеночной аутоплазмохимиотерапии.

Иммуногистохимическое исследование поверхностного уротелиального рака мочевого пузыря

Проведено иммуногистохимическое исследование уротелиального рака без лечения и под действием внутристеночной аутоплазмохимиотерапии. На уровне световой микроскопии различия между группами обнаружены не были.

Иммуногистохимическое исследование осуществляли с маркерами фактора пролиферации: Ki-67, р53, цитокератинами АЕ1/АЕ3.

Выбор панели маркеров определялся следующими обстоятельствами. Наличие фактора пролиферации во всех активных фазах митотического цикла позволяет использовать данный белок в качестве универсального маркера пролиферации при оценке активности роста злокачественных новообразований. Антиген Ki-67 определяется во всех фазах митотического цикла. Уровень экспрессии антигена Ki-67 тесно связан с биологически активным поведением опухоли (Шацева Т.А., Мухина М.С., 2004).

Протеин р53 является распространенным маркером опухолевой прогрессии. Опухоль-супрессирующий ген р53 локализуется на коротком плече хромосомы 17 (17р13.1). Прямая корреляция определена между экспрессией протеина р53 и ростом клинической агрессивности опухоли, стадией и клеточной градации (Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004).

В работе определены иммуногистохимические показатели (фактор пролиферации Ki-67, р53), апоптотический индекс, цитокератины АЕ1/АЕ3, выявившие изменения, наступавшие под воздействием внутристеночной аутоплазмохимиотерапии (табл.2).

Таблица 2
Факторы пролиферации и апоптоза при уротелиальном раке мочевого пузыря без лечения и под действием внутристеночной аутоплазмохимиотерапии
Иммуногистохимический показатель	Уротелиальный рак мочевого пузыря
без лечения	после внутристеночной АПХТ
Ki-67	16,85±3,5%	14,3±3,41%
р53	15%	10%
апоптотический индекс	0,67±0,12	0,53±0,13

Было обнаружено, что маркер пролиферации выявляется в виде отчетливого окрашивания в ядрах раковых клеток уротелия мочевого пузыря, составляя 16,85%.

После внутристеночной аутоплазмохимиотерапии экспрессия Ki-67 практически не изменялась, имелось лишь незначительное ее уменьшение на 2,55%, что связано с ее подавлением под действием аутоплазмохимиотерапии, составляя 14,3% (p≥0,001).

Маркер р53 отчетливо выявлялся в ядрах опухолевых клеток (++) или (+++), что вероятно свидетельствовало об освобождении его из блокады механизмов индукции апоптоза.

В нелеченых (контрольной группе) уротелиальных раках мочевого пузыря экспрессия р53 составила 15%. В уротелиальном раке после внутристеночной аутоплазмохимиотерапии - 10%.

Отмечено незначительное снижение апоптотического индекса, но различия статистически недостоверны (p≥0,001). В раковых опухолях как основной, так и контрольной группы в клетках уротелия определялась отчетливая экспрессия цитокератинов АЕ1/АЕ3. Однако отсутствие экспрессии цитокератинов АЕ1/АЕ3 в сосудах микроциркуляторного русла в группе внутристеночной аутоплазмохимиотерапии свидетельствовало об их блокаде под действием проводимой терапии.

Таким образом, проведенное иммуногистохимическое исследование выявило тенденцию к снижению экспрессии фактора Ki-67 и фактора апоптоза р53.

Результаты проведенного исследования коррелировали с клиническими данными, проявлявшиеся в снижении рецидивов и метастазов, уротелиального рака под действием внутристеночной аутоплазмохимиотерапии.

Пример клинического применения «Способа оценки эффективности внутристеночной аутоплазмохимиотерапии рака мочевого пузыря».

Больной М., 1939 года рождения (история болезни №10688/ф), находится под наблюдением РНИОИ с 09.12.2005 г.

Поступил в отделение онкоурологии РНИОИ 12.12.05 г. с жалобами на учащенное мочеиспускание, периодическую примесь крови в моче, рези в мочеиспускательном канале в конце акта мочеиспускания. Впервые кровь в моче появилась 2 месяца назад.

Диагноз - рак мочевого пузыря T1N0M0, ст.I, кл. гр.2.

Данные лабораторно-инструментального обследования.

1. Цистоскопия от 12.12.05 г.

Цистоскоп введен в полость мочевого пузыря свободно. Устья мочеточников расположены типично, не изменены. Во втором сегменте выше устья правого мочеточника визуализируется опухоль папиллярного строения до 2,0 см в диаметре. Произведена щипковая биопсия опухоли и ее основания. Кровотечения не отмечено. При дальнейшем осмотре по всем сегментам слизистая выглядит неизмененной, опухолевых очагов не обнаружено. Для цитологического подтверждения взят смыв из мочевого пузыря на атипичные клетки.

2. УЗИ мочевого пузыря от 09.12.05 г. (фиг.1).

На правой боковой стенке мочевого пузыря лоцируется объемное образование диаметром до 2,0 см.

3. УЗИ органов брюшной полости, почек от 09.12.05 г.

Заключение: хронический холеписто-панкреатит, умеренный двусторонний гидрокаликоз.

4. Общий анализ крови от 11.12.05 г.

Гемоглобин - 118 г/л, эритроциты - 3,9×10¹²/л, СОЭ 21 мм/ч; лейкоциты - 7,2×10⁹/л, П./яд. - 8%, С./яд. - 64%, эозинофилы - 2%, моноциты - 8%, лимфоциты - 18%.

5. Биохимические показатели крови от 11.12.05 г.

Мочевина - 6,3 ммоль/л; креатинин - 94,3 мкмоль/л.

6. Цитологическое исследование смыва из мочевого пузыря на АК:

Клетки умеренно-дифференцированного уротелиального рака.

7. Внутривенная урография от 11.12.05 г.

Заключение: расширения верхних мочевых путей на 10 минуте после внутривенного введения контрастного вещества не наблюдается. На 40-й минуте определяются четкие контуры мочевого пузыря, на правой боковой стенке дефект наполнения.

Проведенное лечение.

Операция: ТУР 2с/д мочевого пузыря с внутристеночной аутоплазмохимиотерапией. 12.12.05 г. с диагнозом рак мочевого пузыря T1N0M0 кл. гр.2, после предварительной подготовки и забора крови для получения плазмы больной взят в операционную для выполнения трансуретральной резекции мочевого пузыря. При видеоцистоскопии подтвердилась картина увиденного ранее опухолевого поражения мочевого пузыря. Удаление опухоли начато с экзофитной ее части, постепенно подходя к основанию. После полного удаления опухоли, включая основание до мышечного слоя и эвакуации опухолевых фрагментов из мочевого пузыря, произведена смена инструмента на катетеризационный цистоскоп. Взята биопсия из четырех точек вокруг основания удаленной опухоли, после чего биопсийные щипцы заменены на заранее сделанную стерильную, гибкую иглу. Подсоединив к канюле иглы шприц с раствором 200 мг циклофосфана, инкубированного в течение 40 минут с 20 мл аутоплазмы пациента при температуре 37°С, произведены заполнение иглы и четыре равных по объему подслизистые инъекции. Последние выполнялись в те зоны стенки пузыря, из которых бралась биопсия. После выполнения этих манипуляций произведена вапоризация основания и точечная коагуляция с гемостатической целью. Операция завершена установкой в мочевой пузырь ехходового уретрального катетера.

Адъювантная внутрипузырная химиотерапия

На третьи сутки после операции непосредственно перед удалением уретрального катетера внутрипузырно на 1,5 часа введен раствор 30 мг доксорубицина.

Лабораторно-инструментальные данные.

1. Общий анализ крови от 13.12.05 г.

Гемоглобин - 112 г/л, эритроциты - 3,9×10¹²/л, СОЭ 26 мм/ч; лейкоциты - 7,9×10⁹/л, П./яд. - 7%, С./яд. - 65%, эозинофилы - 1%, моноциты - 4%, лимфоциты - 23%.

2. Г/а №79532-38 от 13.12.05 г.

Умеренно-дифференцированный уротелиальный рак с инвазией субэпителиального слоя. В двух биоптатах из четырех, взятых вокруг основания удаленной опухоли, обнаружена внутрисосудистая лимфатическая диссеминация опухоли.

Проведено иммуногистохимическое исследование с определением Ki-67, Р53, апоптический индекс Ki-67 составляет 14,0%, апоптический индекс Р53 составляет 0,5.

3. Биохимические показатели крови от 13.12.05 г.

Мочевина - 5,8 ммоль/л; креатинин - 101 мкмоль/л.

4. Общий анализ крови от 17.12.05 г.

Гемоглобин - 116 г/л, эритроциты - 4,0х10¹²/л, СОЭ 16 мм/ч; лейкоциты - 8,4×10⁹/л, П./яд. - 5%, С./яд. - 53%, базофилы - 1%; эозинофилы - 3%, моноциты - 11%, лимфоциты - 27%.

18.12.05 г. в удовлетворительном состоянии больной М. выписан из стационара с диагнозом: рак мочевого пузыря pT1N0M0 кл. гр.2.

Рекомендовано:

1. Наблюдение онколога по м.ж.

2. Внутрипузырные инстилляции доксорубицина по схеме.

3. Явка в РНИОИ через 3 месяца для контрольного обследования. В период с 15.12.05 г. по 20.01.06 г. пациенту проведен полный курс адъювантной внутрипузырной химиотерапии доксорубицином по 30 мг один раз в неделю №5.

Контрольное обследование

Лабораторно-инструментальные данные.

Жалоб со стороны органов мочевыделительной системы пациент не предъявляет.

1. УЗИ органов малого таза от 10.03.06 г. (фиг.2).

На месте опухоли лоцируется рубцовая деформация.

2.Общий анализ крови от 10.03.06 г.

Гемоглобин - 118 г/л, эритроциты - 4,2×10¹²/л, СОЭ 11 мм/ч; лейкоциты - 6,0×10⁹/л, П./яд. - 5%, С./яд. - 58%, эозинофилы - 2%, моноциты - 4%, лимфоциты - 31%.

УЗИ органов малого таза от 05.09.08 г. (фиг.3).

Больной наблюдается регулярно, последний проведенный осмотр состоялся в декабре 2008 г., таким образом, с момента операции прошло 36 месяцев. Признаков рецидива или прогрессирования заболевания при последнем контрольном обследовании выявлено не было.

Технико-экономическая эффективность «Способа оценки эффективности внутристеночной аутоплазмохимиотерапии рака мочевого пузыря» заключается в том, что проведенное иммуногистохимическое исследование выявило тенденцию к снижению пролиферативной активности (Ki-67) Р≥0,01 по сравнению к контрольной группой; экспрессия р53 и апоптотический индекс по сравнению с контрольной группой имели тенденцию к снижению (Р≥0,01). В группе больных с уротелиальными раковыми опухолями, подвергавшихся внутристеночной аутоплазмохимиотерапии, экспрессия цитокератинов АЕ1/АЕ3 в сосудах микроциркуляторного русла отсутствовала при сохранении в уротелиальном эпителии. Результаты проведенного исследования коррелировали с клиническими данными, проявившиеся в снижении рецидивов и метастазов уротелиального рака под действием внутристеночной аутоплазмохимиотерапии.

Способ оценки эффективности внутристеночной аутоплазмохимиотерапии рака мочевого пузыря, проводят реакции с маркерами факторов пролиферации и апоптоза, выявляют снижение пролиферативной активности Ki-67 14,3±3,41%, снижение экспрессии р53 10%, апоптотического индекса 0,53±0,13, отсутствие экспрессии цитокератинов АЕ1/АЕ3 в сосудах микроциркуляторного русла, при сохранении выраженной экспрессии в уротелиальном эпителии прогнозируют снижение рецидивов и метастазов.