Способ получения оптически активных

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимый от патента №

Заявлено 13ЛХ.1966 (№ 1101381/23-4) Кл. 12о, 25

Приоритет конвенционный по п. 2 14.IX.1965, приоритет по п. 1 13.IX.1966

МПК С 07с

УДК 547.389.6.07 (088,8) Комитет по делам изобретений н открытий при Совете Министров сссР

Опубликовано 25Лт/.1969. Бюллетень № 15

Дата опубликования описания 17.IX.1969

Авторы изобретения

Иностранцы

Хайнц Гибиан, Клаус Кизлих, Ханс-Йоахим Кох, Хорст Космоль, Клеменс Руфер, Эберхард Шредер и Роземари Фессинг (Федеративная Республика Германии) Иностранная фирма

«Шеринг АГ» (Федеративная Республика Германии) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ АНТИПОДОВ

РЯДА СТЕРОИДОВ о

1

„ 0

Изобретение относится к области получения оптически активных антиподов ряда стероидов.

Предлагаемый способ состоит в том, что стероидное оптическое неактивное соединение общей формулы: где С обозначает оптически неактивный углеродный атом, Q — группу СН.СНз — или †СНа вЂ, Х вЂ” водород, галоид, карбоксильную группу в свободной или этерифицированной форме или насыщенный или ненасыщенный алкильный радикал с 1 — 4 атомами углерода, который дополнительно может быть замещен галоидом или гидроксильной амино- или карбоксильной группой в свободной или функционально измененной форме, У вЂ” остальную часть секостероида, включая кольца А и В, а также его функциональные производные по кетогруппам, подвергают ферментативному превращению, например, с микроорганизмами или выделенными из них ферментами.

Пример 1. Получение 3-метокси-8(14)секо-l, 3, 5 (10), 9 (11)-экстратетраен-14а-ол17-она (13р-метил-14а-ОН-ЯМ1 или 13а-метил17р-ОН-ЯМт) ферментацией грибками. а) Восстановление 3-метокси-8 (14)-секо1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен-14, 17-диона (SM) посредством Aspergillus ochraceus (CBS—

Даме).

Ферментация идет с помощью грибковых тп штаммов в колбах для встряхивания, Колбу Эрленмейера емкостью 2 л, наполненную 500 смз питательного раствора из следующих веществ, %: 3 глюкозы; 1 жидкости для замочки кукурузы; 0,2 ИаИОз., 0,1 КНзРО4, 15 0,05 MgSO4, 0,05 КС1; 0,002 FeSOg, 0,2

К НР04 стерелизуют нагреванием в течение

30 мин до 120 С и после охлаждения раствор засевают суспензией Aspergillus ochraceus (CBS), которая получается промыванием

20 культуры косого агара физиологическим раствором поваренной соли.

Взбалтывают предварительно культуру в течение 2 дней при 30 С (число колебаний 145 об/мин), перезасевают затем по 50 смз культу25 ры в 10 колб для ферментации емкостью по

2 л с 450 смз такого же питательного раствора, взбалтывают их в течение 16 час при 30 С, добавляют в каждую колбу в стерильных условиях по 5 смз 2%-ного этанолового раствора

30 SM и проводят ферментацию в течение 24 час.

242777

Ход ферментации контролируют с помощью хроматографии в тонком слое. Для этого на пластинки из кизельгеля по Шталю наносят метилизобутилкетоновые экстракты проб из бродильного чана; пластины с рабочей поверхностью свыше 15 см проявляют в системе хлороформа — ацетона 9: 1, опрыскивают реактивом из 1 см концентрированной Н2$04 и 20 см

95%-ного этанола, сушат в течение 10 мин при

140 С и рассматривают в длинноволновом ультрафиолетовом свете.

SN

13р-метил-14а-ОН-SM и 17а-ОН-$М1

13р-метил-14р-ОН-$М1 и 17Р-ОН-$М

RF 0,92, окраска: красновато-желтая

RF 0,72, окраска: красновато-желтая

RF 0 63, окраска: темноватожелтая

Соединенные исходные смеси ферментации экстрагируют дважды 2500 смз метилизобутилкетона и экстракт при температуре ванны

45 С сгущают в вакууме приблизительно до

5 смз. Концентрат очищают хроматографией препарата в тонком слое с применением кизельгеля GF2;4 в качестве абсорбента и бензол-эфира уксусной кислоты 9: 1 в качестве рабочей среды.

Видимую в коротковолновом ультрафиолетовом свете (основную) зону с величиной R F около 0,4 отделяют, извлекают с помощью

100 смз хлористого метилена при комнатной температуре, элюат сгущают при температуре ванны 25 С и остаток перекристаллизовывают из 10 ч. диизопропилового эфира.

Получают 13Р-метил-14а-ОН-$М1, т. пл.

101/102 — 103,5 С, а ро + 47,8 (диокса н, с =

1); 13Р-метил-14а-ОН-$М1 может получаться при таких же экспериментальных условиях ферментацией с помощью Aspergillus niger (АТСС 9142). б) Восстановление SM посредством Rhizopus

nigricaus (АТСС 9142).

13 -метил-14а-ОН-SN> можно получить при экспериментальных условиях, описанных в примере 1 (а), ферментацией с помощью Rhisopus nigricaus (АТСС 6227Ь). в) Восстановление SM посредством Penicilliшп notatum (ИКК1 2284).

При экспериментальных условиях, описанных в примере 1(а) из SM ферментацией посредством Penicillium notatum (ИКК1 1982) можно получить 13Р-метил-14а-ОН-SN .

Пример 2. Получение 13Р-метил-14а-OHSM> ферментацией посредством дрожжей. а) Восстановление SN посредством Saccharomyces cerevisiac (ИКК1-Y-2250).

Ферментация идет с помощью дрожжей в колбах для встряхивания.

Колбу Эрленмейера емкостью 2 л, наполненную 500 смз питательного раствора из 5% глюкозы и 2% жидкости для замочки кукурузы, 4 стерилизуют и затем засевают суспензией Sacharomices cerevisiac (NRRL-Y-2250), которая получается промыванием культуры косого агара физиологическим раствором поваренной соли. Взбалтывают предварительную культуру в течение суток при 30 С (число колебаний 145 об/мин), перезасевают по 50 см культуры в 4 колбы для ферментации емкостью 2 л, наполненные каждая 450 см такого же питательного раствора, взбалтывают их в течение 6 час при

30 С, добавляют в каждую колбу 5 слР 2%-ного этанолового раствора $М и проводят ферментацию в течение 20 час.

Суспензии для ферментапии приготовляют, как описано в примере 1(а).

Получают 13р-метил-14а-ОН-SN, т. пл.

101/102 — 104 С; а,", + 46,2 (диоксан, с = 1) в 4 = 21000. б) Восстановление SN посредством Saccharomyces cerevisiac (ИСУС 1021).

При описанных в примере 2(а) условиях из

SM ферментацией посредством Saccharomyces

cerevisiac (ИСУС 1021) получают 13Р-метил14а- О Н-SM>. в) Восстановление $М посредством Sacchar omyces car 1sber gens is (C B S 1505) .

При описанных в примере 2(а) условиях из

SM ферментацией посредством Saccharomyces

carlsbergensis (CBS 1505) получают 13р-метил14а-ОН-SN>. г) Восстановление $М посредством Saccharomyces pastorianus (Институт ферментной промышленности, Берлин).

При условиях, описанных в примере 2(а), но со временем ферментации 40 час, из $М ферментацией посредством Saccharomyces pastorianus может быть получен 13Р-метил-14аОН-$М,.

Пример 3. Получение 13Р-метил-14а-OHSN< ферментацией посредством бактерий. а) Восстановление SM посредством Bacillus

esterificans (ВВА — Берлин).

Ферментация идет посредством бактерий в колбах для встряхивания. Колбу Эрленмейера емкостью 2 л с 500 см питательного раствора из следующих веществ, % 0,5 глюкозы, 0,2 жидкости для замочки кукурузы; 0,1 экстракта дрожжей; 0,1 пептона (Мерк) стерилизуют и затем засевают суспензией Bacillus esterificans, которую получают промыванием культуры косого агара физиологическим раствором поваренной соли. Взбалтывают предварительную культуру в течение суток при 30 С (число колебаний 145 об/мин), переносят по 50 смз культуры в 4 колбы для ферментации емкостью 2 л, каждая из которых наполнена

450 см такого же питательного раствора, взбалтывают эти колбы 4 час при 30 С, добавляют в каждую колбу 5 см 2%-ного этанолового раствора SM и проводят ферментацию еще 20 час.

Суспензию для ферментации приготовляют, как описано в примере 1(а).

242777

Ьо

Получают 13Р-метил-14а-ОН-$М1, т. пл.

101/102 — 104 С. б) Восстановление SM посредством Bacillus

latегоsporus (АТСС 4517) .

При описанных в примере 3(а) экспериментальных условиях, но со временем ферментации 44 час, из SM ферментацией посредством

Bacillus latегоsporus получают 13р-метил-14аОН-SM в) Восстановление SM посредством Brevibacterium vitarumeu (АТСС 10234) .

При описанных в примере 3 (а) условиях SM ферментацией посредством Brevibacterium vitarumeu восстанавливается в 13Р-метил-14аОН-SM,. г) Восстановление SM посредством Propionibacterium arabinosum (АТСС 4965).

Из SM при описанных в примере 3(а) условиях ферментацией посредством Propionibacterium arabinosum получают 13р-метил-14а-OHSM,. д) Восстановление SM посредством Prota minobacter alboflavus (АТСС 8458) .

При указанных в примере 3(б) условиях из

SM ферментацией посредством Protaminobacter

alboflavus получают 13р-метил-14а-ОН-SMi. е) Восстановление SM посредством Mesentericus spec (Институт Роберта Коха, Берлин).

Из SM при. указанных в примере 3(а) условиях ферментацией посредством Mesentericus

spec. получают 13р-метил-14а-ОН-SMь ж) Восстановление SM посредством Mycop1ana dimorpha (АТСС 4279) .

При указанных в примере 3(б) условиях из

SM ферментацией посредством Mycoplana dimorpha получают 13Р-метил-14а-OH-SM . в) Восстановление SM посредством Bacillus

thuringiensis (ВВА — Дармштадт) .

Ферментация идет посредством бактерий в бродильном чане.

Бродильный чан из нержавеющей стали емкостью 50 л наполняют 30 л питательной среды из следующих веществ, ОД„: 05 глюкозы;

0,2 жидкости для замочки кукурузы; 0,5 экстракта дрожжей; 0,1 пептона (Мерк), стерилизуют нагреванием в течение 1,5 час до 120 С и засевают 1 л выдержанной в течение суток взболтанной культуры Bacillus thuringiensis

5ВА — Дармштадт) .

Посевной материал получают при условиях, описаных для выращивания посевов в колбах по примеру 3 (а) .

После однодневного размножения при температуре 29 С, перемешивании (220 об!мин) и аэрации (1,65 м /час) 1,8 л культуры при стерильных условиях переносят в бродильныи чан такого же размера с 28 л того же питательного раствора. После выращивания в течение 6 час при перемешивании и аэрации, как указано выше, добавляют силиконовое масло

SH + 5О, олеомаргарина из свиного сала в качестве предотвращающего вспенивание средства и раствор 15,0 г SM в 800 смз этанола и проводят ферментацию еще в течение 16 час.

Затем суспензию бродильного чана экстрагируют дважды 15 л метилизобутилкетона, сгущают экстракт при температуре ванны 45 С в вакууме до сиропа и растворяют последний в 150 смз изопропилового эфира. После выдерживания в течение 20 час при 0 С осажденные кристаллы отсасывают, промывают небольшим количеством холодного изопропилового эфира и высушивают при 60 С в вакууме.

Выход: -13,1 г 13р-метил-14а-ОН-SM, т. е.

87 /, теоретического количества, т. пл. 98/99—

100 С.

Вещество может быть очищено перекристаллизацией из 4 ч. спирта. и) Восстановление $М посредством Protaminobacter alboflavus (АТСС 8458).

При описанных в примере 3 (з) условиях $М может быть в значительной степени восстановлен посредством Protaminobacter alboflavus только в том случае, если через 20 час после добавки субстрата подача воздуха полностью прекратится, и затем проводится ферментация еще в течение 20 час. Чтобы изолировать полученный 13р-метил-14а-OH-$М, требуется растворить концентрат сырого экстракта в хлористом метилене и отфильтровать через колонну с кизельгелем, дезактивированную 10О воды, и кристаллизовать элюат, как описано, из диизопропилового простого эфира.

П п и м е 4. Получение 3-метокси-8(14) -секо-l, 3, 5 (10), 9 (11) -эстратетраен-17 3-ол-14она (13р-метил-17р-ОН-$М ) ферментацией посредством дрожжей. а) Восстановление SM посредством Saccharomyces ellipsoides (штамм Токауера, 22, Берлин).

При описанных в примере 2(а) условиях SM восстанавливают посредством Saccharomyces

elIipsoides (штамм Токауера). Полученный хроматографией препарата в тонком слое сырой продукт перекристаллизовывают дважды из

10 ч. диизопропилового простого эфира.

Получают 138-метил-178-OH-$М1, т. пл.

110/112 — 114 С; а — 39.2 <диоксан, с = 1);

esca = 20,800. б) Восстановление SM посредством Saccha

romyces pastorianus (Институт ферментативной промышленности, Берлин).

При описанных в примере 2(а) условиях из

SM ферментацией посредством Saccharomvces

pastorianus получают 13й-метил-17()-ОН-$М.. в) Восстановление $М посредством Saccharomyces carlsbergensis (CBS 2354).

При описанных в примере 2(а) условиях из

$М ферментапией посредством Saccharomyces

carlsbergens!s (CBS) получают 13Р-метил-17рОН-SM,.

r) Восстановление SM посредством Saccharomvces uvarum (CBS 1508).

Ферментапия идет посредством дрожжей в бподильном чане. Бродильный чан из нержавеющей стали емкостью 50 л наполняют 30 л питательного раствора пз 504 виноградного сахара и 2О,, жидкости для замочки кукурузы.

242777 стерилизуют нагреванием в течение 30 мин до

120 С и засевают 1 л выдержанной в течение суток взболтанной культурой Saccharomyces

uvarum (CBS 1508). Посевной материал получают при условиях, описанных для выращива- 5 ния посевов в колбах по примеру 2(а).

После однодневного размножения при температуре 29 С, перемешивании (220 об/мин) и аэрации (1,65 м /час) 1,8 л культуры при стерильных условиях переносят в бродильный jo чан такого же размера с 28 л того же питательного раствора. После выращивания в течение 6 час при перемешивании и аэрации, как описано выше, добавляют силиконовое масло

SH + 5 Д олеомаргарина из свиного сала в ка- 15 честве средства, предотвращающего вспенивание, и раствор 45,0 г SM в 800 смз этанола и проводят ферментацию еще в течение 19 час.

Затем экстрагируют суспензию для фермен20

30 тации дважды 15 л метилизобутилкетона, сгущают экстракт при температуре ванны 45 С в вакууме до сиропа, разбавляют последний

400 см диизопропилового эфира и оставляют полученный раствор на 16 час при 0 С.

Образовавшиеся кристаллы отсасывают, промывают 25 смз ледяного диизопропилового эфира и сушат в вакууме при 60 С.

Выход: 31,8 г 13р-метил-17Р-ОН-$М, т. е, 71 Д теоретического количества; т. пл.

106/108 — 109 С; а О 34,5 (диоксан, с = 1); в 4 = 20,100.

Соединение может быть очищено перекристаллизацией из 4 ч. этанола.

Пример 5. Получение 13Р-метил-17р-ОН$М, восстановлением SM посредством Curvularia lunata (МЯКИН 2434).

Ферментация идет посредством грибков в бродильном чане. Бродильный чан из нержавеющей стали емкостью 50 л наполняют 30 л питательного раствора из следующих веществ, Д,: 3 глюкозы; 1 жидкости для замочки кукурузы; 0,2 ХаХО; 0,2 К НРО,1,. О,1 КН РО1;

0,005 Мд$0, 0,05 КС1; 0,002 Ре$0, стерилизуют нагреванием в течение 30 мин до 120 С и засевают 1 л выдержанной в течение 2 дней взболтанной культуры Curvularia iunata (NRRL

2434). Посевной материал получают при условиях, описанных в примере 1(а) для выращивания посевов в колбах.

После двухдневного размножения при температуре 29 С, перемешивании (220 об/мин) и аэрации (1,65 ло/час1 3 л культуры при стерильных условиях переносят в бродильный чан такого же размера с 27 л того же питательного раствора.

После выращивания в течение 16 час при перемешивании и аэрации, как описано выше, добавляют Pluronic L 81 в качестве средства, предотвращающего вспенигание, и раствор

6,0 г SM в 450 смз этанола и проводят д>епментацию еще в течение 20 час. Зятем экстрягируют суспензию ферментации дважды 15 л метилизобутилкетоня, сгущают экстракт ппи температуре ванны 45 С в вакууме до сиропа, 35

8 отделяют последний хроматографией в колонне на 200 г дезактивированного 10 /О воды кизельгеля в качестве абсорбента и смесях четыреххлористого углерода — хлористого метилена в качестве растворителя для элюирования.

Содержащие 13Р-метил-17Р-ОН-SM, фракции соединяют и после сгущения перекристаллизовывают из изопропилового эфира.

Пример 6. Получение 3-метокси-8 (14) -секо-1, 3, 5 (10), 9 (11) -эстратетраена-17п-ол14-она (13р-метил-17а-ОН-$М1) восстановлением SM посредством Arthrobacter simplex (ATCC 6946).

При описанных в примере 3(и) условиях SM подвергается ферментации посредством Arthrobacter simplex.

Получают кристаллизат с т. пл. 91/92 — 95 С.

z — 16 (диоксан, с = 1) . Последний многократной фракционированной кристаллизацией очищают из диизопропилового эфира и из этан ола.

Получают 13Р-метил-17а-ОН-$М; т. пл.

100/101 — 102 С; а D — 44,3 (дио ксан, с = 1); в д — — 20,600.

Пример 7. Получение З-метокси-l, 3, 5 (10) -8, 14-эстрапентаен-17Р-ола С 9Н О (282, 37) .

30,04 г (0,100 моль) 13g-метил-17р-ОН-SM< кипятят с флегмой 2,5 час в 42 мл метанола и

83 мл хлористого метилена с 0,81 мл концентрированной соляной кислочы. Затем раствор выливают в 85 мл воды, отделяют органическую фазу и водную фазу дважды экстрагируют хлористым метиленом. Соединенные органические фазы промывают до нейтрального состояния раствором бикарбоната и водой и сушат. После отгонки растворителя в вакууме и перекристаллизации из этанола получают

21,00 г (74,4 Ä/,) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14эстрапентаен-17р-ола, т. пл. 107 — 109 С; и ро—

141 (с = 1, СНС1).

Вещество идентично З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17Р-олу, который получают отщеплением рацемата из рацемического материала, по точке плавления, вращению, всем спектрам, а также по газовой хроматографии и хроматографии в тонком слое.

Пример 8. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10), 8-эстратетраен-17р-ола, С1 Н О (284, 38) .

58,00 г (0,205 моль) З-метокси-l, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17р-ола гидрируют при помощи 8,2 г предварительно гидрированного

5О, -ного палладия/карбонат кальция в 200 мл тетрагидрофурана. Поглощается в течение

50 мин 4820 мл водорода (95 Д теоретического количества). Раствор отфильтровывают от катализатора.

После выпаривания растворителя в вакууме и перекристаллизации из этанола получают

39,80 г (68,2 /о) З-метокси-l, 3, 5 (10), 8-эстратетраен-17Р-ола; т. пл. 123 — 126 С; ссD — 71 (с = 1, СНСlз).

242777

9

Пример 9. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10) -эстратриен-17Р-ола (эстрадиолметиловый эфир). С оНзоОз (286, 39).

11,35 г (0,040 моль) Ç-метокси-1, 3, 5 (10)—

8-эстратетраен-17Р-ола растворяют в 120 мл абсолютного тетрагидрофурана и при — 50 С, добавляют к раствору 100 мг лития в 120 мл жидкого аммиака и 9,9 мл анилина. При такой же температуре порциями добавляют 340 мг лития и перемешивают еще в течение 10 мин.

Затем добавляют 0,72 мл воды в 12 мл тетрагидрофурана, причем раствор становится прозрачным.

После добавления остальных 0,59 г лития раствор перемешивают еще 20 мин и обесцвечивают хлористым аммонием. После выпаривания аммиака добавляют воду, органические растворителя отгоняют в вакууме и остающуюся смесь экстрагируют хлористым метиленом.

Соединенные растворы хлористого метилена освобождают с помощью 1 н. соляной кислоты от анилина и промывают раствором бикарбоната и воддй до нейтрального состояния.

После сушки раствора, отгонки растворителя в вакууме и перекристаллизации из этанола получают 8,5 г (74,0оД) З-метокси-1, 3, 5 (10) -эстратриен-17Р-ола (эстрадиолметиловый эфир); т. пл. 114 — 116 С; а „о + 72 . Вещество идентично полученному из натурального материала эстрадиолметиловому эфиру по точке плавления, вращению и всем спектрам, а также по газовой хроматографии и по хроматограмме в тонком слое.

Пример 10. Получение Ç-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17Р-ола-ацетата

Сз,Н 40з (324, 40).

5,00 г (0,0167 моль) 13р-метил-17р-ОН-SMI обрабатывают в течение 15 час в пиридине при комнатной температуре 30 мл уксусного ангидрида. Затем раствор выливают в соляную кислоту, экстрагируют раствором хлористого метилена, промывают до нейтрального состояния

1 н. соляной кислотой, раствором бикарбоната и водой. Масло, остающееся после сушки и отгонки растворителя в вакууме, поглощается в

800 мл бензола и кипятится в течение 15 мин в водоотделителе с 2,8 г п-толуолсульфокислоты. После охлаждения раствор промывают до нейтрального состояния раствором бикарбоната и водой.

Сушка и отгонка растворителя дает 4,89 г (90Я) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17р-ол-ацетата; т. пл. 79 — 82 С; а о

180 .

На газовой хроматограмме вещество 98о4-ное и может применяться для гидрирования в 3метокси-1, 3, 5 (10), 8-эстратетраен-17Р-ол-ацетат.

Для сравнения с ацетатом З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17р-ола из отщепления рацемата в рацемическом материале оно перекристаллизовывается из этанола. Получают 3,60 г {бб,б II) Ç-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 145

65 эстрапентаен-17Р-ол-ацетата; т. пл. 86 — 87 С; ао 188 р

Этн данные, а также спектры и хроматограммы идентичны данным ацетата, полученного из отщепления рацемата.

П р и и е р 11. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10), 8-эстратетраен-17р-ол-ацетата Сл НгоОз (326,41) .

2,40 г (0,0074 моль) Ç-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17Р-ол-ацетатата сырого гидрируют с помощью 664 мг предварительно гидрированного 5о4-ного палладия на карбонате кальция в 8 мл бензола и 8 мл тетрагидрофурана. За 2 час поглощаются 180 мл водорода (97о, теоретического количества).

После отфнльтрования катализатора, отгонки растворителя в вакууме и перекристаллизации из этанола получают 1,61 г (66,6 "4) 3-метокси-1, 3, 5 (10), 8-эстратетраен-17Р-ол-ацетата; т. пл. 110 — 113 С; а — 49 . (с =- 1, СНС!з) .

П р и м ер 12. Получение 3-мет"..ксн-1,3, 5 (10), 8-эстратетраен-17Р-ола С,Нз40 .(284,38) .

2,70 г (0,0083 моль) Ç-метокси-1,3,5 (10), 8эстратетраен-17Р-ол-ацетата перемешивают при комнатной температуре в течение 3 час в

50 мл 1 н. метанолового калийного щелока.

Прн этом вещество полностью растворяется.

При охлаждении раствора осаждается продукт. Осаждение дополняется 100 мл ледяной воды.

Получают 2,14 г (95,1 о о) Ç-метокси-1,3,5(10), 8-эстратетраен-17р-ола, т. пл. 125 — 127 С; о" — 7,9 (с = 1, СНС1,).

Вещество идентично веществу, полученному гидрированием Ç-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17р-ола.

Пример 13. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17р-ола (282,37).

150 мг (0,00046 моль) Ç-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстр апентаен-17Р-ол-ацетата перемешивают в течение 3 час в потоке азота в 3 мл метанолового 1 н. калийного щелока. При этом вещество растворяется постепенно. При охлаждении льдом оно подкисляется 0,6 л л концентрированной кислоты и осаждается 2,4 л л воды.

После перекристаллизапии из этанола/воды получают 107,5 л г (82,5оД) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8,14-эстрапентаен-17р-ола; т. пл. 101—

102 С; а" — 135 С (c = 1, СНС4).

Пример 14. Получение Ç-метокси-13а-1, 3,5 (10) .8,14-эстрапентаен-17р-ол-ацетата.

С„Но,,Оз (324,40).

2,00 г (0,067 моль) 138-метил-14а-ОН-SMI (равноценно 13а-метил-17р-ОH-SM,) обрабатывают в течение 16 час при комнатной температуре 20 мл пиридина с 12 мл уксусного ангидрида. Затем раствор выливают в воду, экстрагируют хлористым метиленом и соединенные фазы хлористого метилена промывают до нейтрального состояния соляной кислотой, бикарбонатом и водой, 242777

5

После сушки и отгонки растворителя в вакууме маслянистый некристаллизующийся остаток поглощается в 50 мл бензола и кипятится в течение 10 мин на водоотделителе с

120 мг и-толуолсульфокислоты. После разбавления простым эфиром раствор промывают до нейтрального состояния водой и бикарбонатом, сушат и растворитель отгоняют в вакууме.

Перекристаллизация из этано7a дает 1,83 г (84,7 Ä/,) З-метокси-13я-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17Р-ол-ацетата; т. пл. 127 †1 C;

+ 183 (с = 1, CHCI ) ..

Пример 15. Получение З-метокси-13а-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17Р-ола С ОНззОз (282, 37).

800 л г (0,00246 моль) 3-метокси-13сс; 1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17Р-ол-ацетата перемешивают в течение 3 «ас в потоке азота с

16 мл 1 н. метанолового калийного щелока.

При этом вещество растворяется. При охлаждении льдом с помощью воды проводят осаждение и основательную промывку.

Получают 681 мг (97,6 )() ) З-метокси-13а-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17(-ола.

Разложение при температуре выше 32 С сРро + 199 (с = 1, СНСIз).

Вещество по всем спектрам и хроматограммам унифицированное, но очень легко разлагается.

Пример 16. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17а-ол-ацетата

Сз Нз40з (324,40) .

300 мл (0,001 моль) 13р-метил-17а-ОН-SM< обрабатывают в течение 16 «ас при комнатной температуре 3 мл пиридина и 2 мл уксусного ангидрида. Затем раствор выливают в воду, экстрагируют хлористым метиленом и соединенные растворы хлористого метилена промывают до нейтрального состояния соляной кислотой, бикарбонатом и водой. После сушки и отгонки растворителя остается масло, которое поглощается в 8 мл бензола и кипятится в течение 10 хин с 18 яг п-толуолсульфокислоты.

После разбавления простым эфиром раствор промывают до нейтрального состояния водой и бикароонатом, сушат и растворитель отгоняют.

Перекристаллизация из этанола дает 244 мг (70,5О, ) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17а-ол-ацетата; т. пл. 126 — 127,5 С; о + 197 (с = 2, СНСIз)

Пример 17. Получение З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17к-ола СОНззОз (282,37) .

200 мг (0,000618 моль) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17и-ол-ацетата перемешивают в течение 3 «ас в потоке азота с 4 мл 1 н. метанолового калийного щелока. При этом вещество полностью растворяется. При охлаждении льдом происходит осаждение водой, осадок отсасывается и основательно промывается.

Получают 128 мг (73,5ОД ) З-метокси-1, 3, 5 (10), 8, 14-эстрапентаен-17а-ола.

Разложение при температуре выше 30 С; а — 197 (с = 1, СНСIз).

Вещество должно храниться в холоде, так как оно быстро разлагается.

Пример 18. Получение 3-метокси 8 (14)секо-9, 14а-оксидо-1, 3, 5(10)-эстратриен-17она С зНз40з (300,38).

400 мг (0,00133 моль) 13а-метил-17Р-OHSMI кипятят в течение 30 мин, с флегмой в

20 мл метанола и 40 мл хлористого метилена с

0,4 мл концентрированной соляной кислоты.

После добавления воды отделяется органическая фаза и водная фаза экстрагируется хлористым метиленом. Соединенные органические фазы промывают до нейтрального состояния бикарбонатом и водой, и растворитель отгоняют в вакууме.

Получают 400 мг (100,) 3-метокси-8, 14-секо-95, 14а-оксидо-1., 3, 5 (10) -эстратриен-17она, который является унифицированным по хроматограмме в тонком слое.

Многократная перекристаллизация из этанола дает 45 мг вещества; т. пл. 59 — 90 С; а

41,7 (с = 1, СНСIз).

Структура была подтверждена инфракрасной частью спектра, ультрафиолетовой частью спектра, NMR масс-спектром.

Пример 19. Получение 13р-метил-14а-OHSMI ферментанцией посредством Saccharomyces uvarum (CBS 1508) по методу остаточной клетки.

30 л культуры Saccharomyces uvarum (CBS

1508) из предварительного бродильного чана, полученной, как описано в примере 4(г), подвергают центрифугированию. Промывают полученные дрожжи дистиллированной водой, центрифугируют еще раз и взвешивают в 30 л дистиллированной воды. По 500 смз суспензии наливают в 8 колб Эрленмейера емкостью 2л, закрывают их ватной пробкой и взбалтывают (число колебаний 145 об мин) при 30 С. Через

4 «ас добавляют в каждую колбу по 250 мг

SM, растворенных в 2,5 смз метилцеллозольва, и проводят ферментацию в течение 20 час.

Затем соединяют исходные смеси ферментации, экстрагируют их дважды с помощью 1 л метилизобутилкетона, сгущают экстракт в вакууме при температуре ванны 45 С до сухого состояния и перекристаллизовывают остаток

1 раз из смеси бензола — гексана и 1 раз из этанола.

Получают 13 3-метил-14а-ОН-$М, т. пл.

101/102 — 10 С; e + 45,4 (с =1, диоксан).

Пример 20, Получение 13р-метил-14а-OHSM< ферментацией посредством $ассЬаготусез пс.arum (СВ$1508) — сухого порошка.

Из 30 л культуры CBS 1508 предварительного бродильного чана получают, как описано в примере 19, центрифугированием дрожжи. Последние взвешивают в 3 л ацетона, перемешивают суспензию в течение 15 мин, отсасывают дрожжи, взвешивают снова в 3 з ацетона, перемешивают, отсасывают дрожжи и сушат ц

242777

65 гечейие 3 час в вакууме при комнатной температуре.

Полученный сухой порошок взвешивают в

30 л дистиллированной воды и пр именяют эту суспензию для ферментации.

Ферментация $М и переработка исходных смесей происходит, как описано в примере 19.

Получают 13Р-метил-14а-ОН-$М, т. пл.

100/102 — 103 С; а + 43 (с = 1, диоксан).

Пример 21. Получение 13р-метил-14аОН-$М посредством раствора 20Р-гидроксистероиддегидрогеназы.

К смеси 4,4 мл 0,022 М фосфатного буферного раствора (рН 5,5), 0,7 мл 0,4 Д,-ного

DPN н. раствора и 0,03 мл разбавленной в отношении 1: 5 суспензии 20р-гидроксистероиддегидрогеназы (фирма «Ц. Ф. Берингер унд

Зене», Общество с ограниченной ответственностью Мангейм) добавляют 1 мг SM в 0,05 мл этанола и взбалтывают в течение 15 мин при комнатной температуре В результате анализа хроматографией в тонком слое (см. пример 1,а) обнаруживают в качестве единственного продукта превращения 13Р-метил-14а-ОН-SM

Пример 22. Получение 13р-этил-3-метокси-8 (14)-секо-18-нор-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен-17I3-ол-14-îíà (13I3-этил-17Р-ОН-SM,) .

При условиях, описанных в примере 4(г), 15,0 г 13р-этил-3-метокси-8 (14)-секо-18-нор-1, 3, 5 (10), 9 (11) -эстратетраен-14, 17-диона (13р-этил-$М) подвергают ферментации посредством Saccharomyces uvarum (СВ$1508) в течение 20 час. Затем суспензию ферментации экстрагируют дважды 15 л метилизобутилкетона, сгущают экстракт при температуре ванны

45 С до сиропа и перекристаллизовывают полученный продукт из изопропилового эфира.

Получают 13р-этил-3-метокси-8 (14) секо-18нор-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен-17Р-ол-14он; т. пл. 85 — 86,5 С; а р + 15,2 (с = 1, диоксан) .

Согласно NMR-спектру гидроксильная группа P — постоянная относится к 13Р-этиловой группе.

Пример 23. Получение 3-метокси-8 (14)секо- D-гомо-1, 3, 5 (10), 9 (11) -эстратетраен17сф-ол-14-îíà (17ар-OH) - (D-гомо-SM) .

1,6 г 3-метокси-8 (14)-секо-D-гомо-1, 3,5 (10), 9 (11) -эстратетраен-14, 17а-диона (D-гомо-SM) подвергают ферментации, как описано в примере 20, посредством ацетонового сухого порошка Saccharomyces uvarum (CBS 1508). Полученный сухой продукт очищают, как описано в примере 1,а, хроматографией препарата в тонком слое и перекристаллизовывают из изопропилового эфира.

Получают 3-метокси-8 (14) -секо-D-гомо-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен-17пР-ол-14-он; т. пл.

115 — 116,5 С; ао + 28,5 (с = 1, диоксан).

Пример 24. Получение 2-метил-3-метокси8(14)-секо-1,3,5 (10), 9 (11) - эстратетраен14а-ол-17-она.

По 500 смз суспензии$ассБагогпусез uvarum (СВ$1508) — сухого порошка (пример 20) вво14 дят в 16 колб Эрленмейера емкостью 2 л, за. крывают их ватной пробкой и взбалтывают (числом колебаний 145 об/мин) при 30 С. Через 1 час добавляют в каждую колбу по 100 мг

2-метил-3-метокси-8 (14) -секо-1, 3, 5 (10), 9 (11) -эстратетраен-14, 17-диона, взбалтывают еще 48 час.

Этот не описанный до сих пор исходный продукт приготовляют известным способом следующим образом: б-метокси-7-метил-тетралин окисляют хромовой кислотой в б-метокси7-метилтетралоне-1 (т. пл. 102 — 104 С), из которого после реакции с Гриньяровским соединением, с винилом-бромидом магния и последующей конденсации полученного «висколя», посредством 2-метилциклопентандиона-1, 3 получают 2-метил-3-метокси-8 (14) -секо-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен-14, 17-дион (т. пл.

101 — 103 С) .

Затем соединяют исходные смеси ферментации, экстрагируют их дважды 2 л метилизобутилкетона, сгущают экстракт в вакууме при температуре ванны 45 С, очищают остаток хроматографией препарата в тонком слое (пример 1,а) и перекристаллизовывают продукт из изопропилового эфира.

Получают 2-метил-3-метокси-8 (14) -секо-1, 3, 5 (10), 9 (11) -эстратетраен-14а-ол-17-он; т..пл. 135 — 137 С; а, +47,8 (с = 1, диоксан).

Согласно NMR-спектру гидроксильная группа а-постоянная относится к 13р-метиловой группе.

Пример 25. Получение 4-метил-3-метокси8 (14) -секо-1, 3, 5 (10), 9 (11) -эстратетраен-17Рол-14-она, 30 л суспензии Saccharomyces uvarum (CBS

1508) — сухого порошка (пример 20) перемешивают в бродильном чане из нержавеющей стали при 30 С (число колебаний 200 об/мик) и аэрируют 300 л/час воздуха, Добавляют 3,0 г

4-метил-3-метокси-8 (14) -секо-1, 3, 5 (10);

9 (11) -эстратетраен-14, 17-диона, растворенного в 800 смз этанола.

Этот не описанный до сих пор исходный продукт получают следующим образом: 5-метил-б-метокситетралон-1 вводят в реакцию с

Гриньяровским соединением посредством винила-хлорида магния и полученный при этом соответствующий «винол» конденсируют посредством 2-метилциклопентадиона в 4-метил-3-метокси-8 (14)-секо-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен-14, 17-дион (т. пл. 154 — 155 С).

Затем перемешивают в течение 48 час с аэрацией и 60 час без аэрации. Экстрагируют, как обычно, метилизобутилкетоном, сгущают экстракт, отделяют остаток хроматографией препарата в тонком слое и перекристаллизовывают полученный сырой продукт из изопропилового эфира.

Получают 4-метил-3-метокси-8 (14) -секо-1, 3, 5 (10), 9 (11)-эстратетраен-17р-ол-14-он; т. пл, 242777

) — а

15

Составитель П. Йивницкая

Техред Л. Я. Левина Корректоры: М. В. Радзинская и В. И. Жолудева

Редактор А. Петрова

Заказ 3080/19 Тираж 480 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Центр, пр. Серова, д. 4

Типография, пр, Сапунова, 2

167 — 168 С; с — 43,6 (с = 1, диоксан). Согласно NNR-спектру гндроксильная группа Рпостоянная относится к 13)5-метиловой группе.

Предмет изобретения

1. Способ получения оптически активных антияодов ряда стероидов, отличающийся тем, что соединение общей формулы где С обозначает оптически неактивный атом углерода, а Q — группу — СН вЂ” СН вЂ” или — СН вЂ”, X — водород, галоид, карбоксильную 20 группу в свободной или этерифицированной форме или насыщенный или ненасыщенный алкильный радикал с 1 — 4 атомами углерода, который дополнительно может быть замещен галоидом или гидроксильной группой, амино- 25 группой или карбоксильной группой в свободной или функционально измененной форме, Y— остаточную часть секостерорда, включая кольца A и В, а также его функциональные производные по кетогруппам, подвергают ферментативному превращению, например, с микроорганизмами или выделенными из них ферментами.

2. Способ получения оптических активных антиподов ряда стероидов, отличающийся тем, что соединение общей формулы где С обозначает оптически неактивный атом углерода, Q — группу — СН.— СНв — или — СН вЂ”, Х вЂ” водород, галоид, карбоксильную группу в свободной или этерифицированной форме или насыщенный или ненасыщенный алкильный остаток с 1 — 4 атомами углерода, который дополнительно может быть замещен галоидом или гидроксильной группой, аминогруппой или карбоксильной группой в свободной или функционально измененной форме, Y — остаточную часть секостероида, включая кольца А и В, подвергают ферментативному восстановлению, например, с микроорганизмами, как грибы, дрожжи, бактерии или с выделенными из них ферментами.