Патент ссср 248695

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 15.IX.1967 (№ 1183615/23-4) с присоединением заявки №

Приоритет 15.IX,1966, РУ 5996/66, ЧССР

Опубликовано 18Х11.1969. Бюллетень № 24

Дата опубликования описания 19.XII.1969

Кл. 12q, 6/01

МПК С 07с

УДК 547.964.07 (088.8) Комитет па делам иасбретеиий и открытий пр» Совете Мииистров

СССР

Авторы изобретения

Иностранцы

Милан Заораль, Иван Вавра, Алена Махова и Франтишек Шорм (Чехословацкая Социалистическая Республика) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1-ДЕЗАМИНО-D-АРГHHHJls

ВАЗОПРЕССИНА

Предлагается способ получения нового активного противодиуретического полипептида

1-дезамино-D-аргинил8-вазопрессина (1), который содержит в положении 1 р-меркаптопропионовую кислоту (Мер) и в положении 8-—

D-аргинин. Способ заключается в том, что р-бензилмеркаптопропионилтирозин, получечный хлорангидридным методом, ступенчато конденсируют гидразидным методом с соответствующими защищенными аминокислотами или пептидами с последующим отщеплением защитных трупп, например воздействием щелочных металлов в жидком аммиаке, и окислением полученного продукта, например феррицианидом калия в водном растворе при рН

6,5 — 7,0.

Для временной защиты сульфгидрильной группы, аминогруппы и гуанидиновой группы можно применять защитные группы, используемые в синтетической химии полипептида.

Защитная группа может быть также устранена методом, обычно применяемым при синтезе полипептидов, Окисляют полипептид в циклический полипептид известным способом как в водном растворе, так и в смеси растворителей с водой.

Например, конденсацией хлорида Р-бензилмеркаптопропионовой кислоты с метиловым эфиром тирозина можно приготовить еще е описанный метиловый эфир Р-бензилмерка Iтопропионилтирозин, который воздействием гидрата гидразина может быть превращен в еще не описанный гидразид и азид и соединен с метиловым эфиром — фенилаланина. Полученное производное эфира дипептида вновь конденсируют в форме азида с метиловым эфиром глутаминил-аспарагинил-S-бензилцистеина в еще не известный метиловый эфир

10 р-бензилмеркаптопропионилтирозил -фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-S - бензил - цистеин, который затем снова соединяют с защищенным производным октапептида синтезом его азида с амидом пролил-М -тозил-D-ap15 гинилглицина.

Защитные группы устраняют путем восстановления с натрием в жидком аммиаке, вследствие чего восстановленный продукт превра20 щается в результате окисления с феррицианидом калия в новый циклический, биологически активный дисульфид. Циклический дисульфид отличается более высокой и более специфической антидиуретической активностью (см.

25 таблицу), чем натуральный аргининвазопрезин.

Полипептид является, в отношении его биологического действия, превосходным препаратом для регулирования полиурии и ослабле30 ния полидипсии при диабете-инсипидус.

248695

Активность

Специфическая эффективность антидиуре- презоритическая ческая, интерн. интерн. ед./мг ед./мг

Соединение

1-Дезамино-D-Арг3вазопрезин

1-Дезамнно-фал - Apr3-вазопрезин

16000 200 11

800 170 29+7

1454

27,5

Пр им ер. Метиловый эфир (3-бензилмвркаптопропионилтирозина.

9,2 ч. р-бензилмеркаптопропиониловой кислоты превращают воздействием избытка тионилхлорида в хлорид, который растворяют в

20 мл этилацетата. Этот раствор добавляюг при интенсивном пвремешивании и охлаждении до 0 С к смеси из 10,9 ч. 1 -тирозинметилэфиргидрохлорида, 50 мл воды, оО мл этилацетата. Затем к реакционной смеси добавляют дикарбонат натрия. рН остается слабощелочным. Слой ацетата удаляют, сушат, выпаривают .при слабом давлении и перекристаллизовывают,из этилацетата — петролейного эфира. Из маточного раствора получают выпариванием и перекристаллизацией вторую фрак цию. Общий выход 16,5 ч. (93% от теории); т. пл. 89 — 90"С. 1а) „а — 3,4 + 0,5"С (О,о, диметилформамид) .

Найдено, %: С 54,31; Н 6,21; N 3,75.

CgPH33N 048 (375,5) .

Вычислено, %: С 64,38; Н 6,25; N 3,71.

1 èäðàçèä р-бензилмеркаптопропионилтирозин.

15,3 г сложного эфира метила р-бензилмеркаптопропионил-тирозина растворяют в 60 мл этанола. Затем добавляют б мл Ь0%-ного гидрата гидразина и полученную смесь кипятят

2 час с обратным холодильником. К реакционной смеси в избытке добавляют воду. Осаждвнный продукт отсасывают, промывают и перекристаллизовывают из водного этанола, Выход 11,95 г (78%), т. кип. 195 — 194"С. (а)„ "

6,00,5 С, (0,5, диметилформамид).

Найдено, %: С 61,10; Н 6,21; Х 11,25.

С13НязЬЬО3$ (375,5) .

Вычислено, %: С 61,10; Н 6,11; N 11,15.

Сложный эфир метила р-бензилмеркаптопропионилтирозил-фенилаланина.

5,6 г гидразида р-бензилмеркаптопропионилтирозила растворяют в смеси из 50 мл диметилформамида и 4 мл концентрированной хлористоводородной кислоты. К раствору добавляют при перемешивании и охлаждении до — 10 С 1,03 г нитрита натрия,и 2 мл воды. рН реакционной смеси, равное б — 7, устанавливают добавлением N-этилпиперидина. К смеси прибавляют 2,7 г метилового эфира фенилаланина в 3 мл диметилформамида. После выдерживания в течение 12 час при 0 С и 2 час при комнатной температуре реакционную массу выпаривают при слабом давлении. К масло65

Найдено, %: С 57,24; Н 6,02; N 13,95.

Сз,Н34И (40r4$3 (1405,65) .

Вычислено, %: С 57,33; Н 6,01; N 13,99.

Дезами1го-8-D-аргинин-вазопрезин, 4 образному остатку добавляют воду в нзбытке, а затем осажденный продукт отсасывают и перекристаллизовывают из водного этанола.

Выход 7,6 г (97%); т. кип. 151 — 152 С, (pp)3 3 +-17,5 — 0,5 С (0,5, диметилформамид).

Гидразид-() - бвнзилмеркаптопропионил - тирозил-фенилаланина.

14,0 г метилового эфира Р-бензилмеркаптопропионил-тирозил-фенилаланина кипятят 2 час с обратным холодильником с 100 мл метанола и б мл 80%-ного гидразингидрата. Осажденный продукт отсасывают, промывают с фильтром вместе метанолом и простым эфиром и перекристаллизовывают из смеси диметилформамида с водой.

Выход 10,1 г (72%); т. кип. 248 — 250 С; (а). 21,9 0,5 C (— 0,55, диметилформамид), Метиловый эфир р-бензилмвркаптопропионил-тирозил-фенилаланил - глутаминил - аспа20 рагинил-S-бензил-цистеина.

8,0 г р-бензилмеркаптопропионил-тирозилфенилаланил-гидрацида конденсируют обычным способом с 7,2 г метилового эфира глутаминил-аспарагинил-S-бвнзил-цистеина. После переКристаллизации из диметилформамида и воды получают 113 г (76%) продукта с т. кип. 253 — 255 С; (а)о 29,6+ 0,5 С (0,5, диметилформамид).

Найдено, %: С 59,73; Н 6,20; N 10,17.

С4вН37Х70 о$3 (965,1) .

Вычислено, %: С 59,61; Н 6,23; N 10,23.

Гидразид Р-бензилмеркаптопропионил-тирозил-фенилаланил-глутаминил - аспарагинил-Sбензил-цистеина.

Раствор 10,8 г метилового эфира р-бвнзилмеркаптопропионил-тирозил -фенилаланил-глутаминил-аспарагинил-$ - бензил-цистеина в

160 мл диметилформамида добавляют к 12 мл

40 80% -ного гидразингидрата. Реакционную смесь отстаивают 12 час при комнатной температуре.

Осажденный продукт отфильтровывают, промывают с фильтром вместе метанолом и простым эфиром и затем высушивают. Выход 6,7г

45 (62%), т. кип. 266 — 268 С без изменения после перекристаллизации .из диметилформамида и воды; (а) — 33,4+.0,5 С (0,5, диметилформамид).

Найдено, %: С 59,04; Н 6,01; N 13,19.

50 С47Н37М909$2 (956)1) .

Вычислено, %: С 59,04; Н 6,16; N 13,25.

Амид р-бензилмеркаптопропионил-тирозилфенилаланил-глутаминил - аспарагинил-S-бензил-цистеинил-пролил - Иа-тозил - D - -аргинилглицина готовят обычным способом (см. выше) из гидразида р-бензилмеркаптопропионилтирозил-1 -фенилаланил-1 - глутаминил аспарагинил-S-бензил-цистеина и амида-пролилХ6-тозил-D-аргинил-глицина. Выход 68%, 60 т. кип. 223 — 235 С.

2486М

Составитель А. Акимова

Текред A. А. Камышникова

Редактор С. Лазарева

Корр ктор А. С. Колабин

Заказ 3425/8 Тираж 480 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография; пр. Сапунова, 2

0,5 г амида р-бензилмеркаптопропионил-тирозил-фенилал-анил — глутаминил - аспарагинил-S-бензил-цистеинил-пролил-Р - тозил - Dаргинил-глицина восстанавливают натрием в жидком аммиаке обычным способом. Получен ную после выпа ривания аммиака фракцию растворяют в 800 мл 5 /о-ной уксусной кислогы.

Раствор фильтруют, р Н фильтр ата гидр оокисью натрия устанавливают в пределах 6,5—

7 и раствор окисляют обычным способом.

AH реакционной смеси в пределах 4,0 — 4,5 устанавливают путем добавления уксусной кислоты. Пептид улавливают на столбе карбоксиобменника, вымывают 50 /о -ной уксусной кислотой и изолируют лиофилизацией. Сырой продукт очищают высоковольтным электрофорезом обычным способом.

Выход лиофилизата составляет 100 — 200 мг; (а) р — 65+ 2 С (0,2, М СНзСООН).

Найдено, %: С 50,49; Н 6,10; N 16,48.

С4вНв4КдО Яа ° 2СНзСООН (1189,3).

Вычислено, /о. С 50,39; Н 6,32; N 16,45.

Анализ состава аминокислоты следующий:

Цис (SH) 0,40; Тир 0,98; Фал 1,03; Глу 1,05;

Асп 1,00; Про 1,03; Арг 0,98; Гли 0,95.

Предмет изобретения

Способ получения 1-дезам ино-D-аргинилввазопрессина, отличающийся тем, что р-бензил меркаптопропионилтирозин ступенчато конденсируют гидразидным методом с соответствующими защищенными аминокислотами или пептидами с последующим отщеплением защитных групп известным способом, например воздействием щелочных металлов в жидком амм иаке и окислением полученного продукта, например, феррицианидом калия в водном растворе при рН 5,5 — 7,0.