Способ выделения клеток из секрета молочной железы

Изобретение относится к биологии и медицине. Предложен способ выделения из тела человека клеток-предшественников, в том числе всех клеток с характеристиками, подобными характеристикам стволовых клеток, в особенности всесторонне активных или множественно активных клеток-предшественников, причем такие клетки выделяют прямо или опосредованно из человеческого секрета молочной железы, полученного из указанного тела человека. Этот секрет может быть молозивом, созревшим молоком или выделением у мужчин или женщин в течение перерыва в лактации, в течение, по меньшей мере, одного из следующих периодов: период отсутствия беременности, период беременности, период лактации, период инволюции. Далее настоящее изобретение относится к предпочтительным применениям таких выделенных клеток. 3 н. и 21 з.п. ф-лы, 8 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способу выделения клеток из человеческого тела, а также к применениям таких клеток.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Стволовые клетки определяют как клоногенные (дающие начало клонам), самообновляющиеся клетки-предшественники, которые могут путем процесса дифференцировки давать начало разнообразным более специализированным типам клеток. Согласно классическому подходу считается, что существуют два различных типа стволовых клеток. Эмбрионные стволовые (ЭС) клетки происходят из внутренней массы бластоциста, являются плюрипотентными и поэтому способны давать начало всем типам дифференцированных клеток тела. Другие субпопуляции стволовых клеток происходят из клеток ЭС и являются орган- или тканеспецифичными. Считалось, что эти полипотентные клетки, известные также как взрослые стволовые клетки, способны дифференцироваться только в ткани того органа, из которого они получены. Примером таких полипотентных клеток являются кроветворные стволовые клетки, которые служат для непрерывной регенерации клеток крови и иммунной системы.

Стволовые клетки были выделены из многих тканей, от таких тканей, которые обладают высокой скоростью постоянного клеточного обновления, таких как кровь, пуповинная кровь, костный мозг, кожа, ткани кишечника и молочной железы, до тканей с низкой скоростью обновления, таких как головной мозг, скелетные мышцы и молочные зубы. Долгое время существовала теория о том, что независимо от ткани-источника взрослые стволовые клетки могут дифференцироваться только в те ткани, из которых они были получены. Однако недавние исследования показали, что при воздействии нового окружения органспецифичные стволовые клетки могут преодолеть эти внутренние ограничения для трансдифференцировки в другие ткани. Например, было показано, что нервные стволовые клетки могут трансдифференцироваться в клетки крови, полученные из костного мозга стволовые клетки могут трансдифференцироваться в клетки мышц, головного мозга, печени и сердца, а полученные из кожи стволовые клетки могут трансдифференцироваться в клетки головного мозга. Таким образом, теперь теория, связанная с ограничениями в развитии органспецифичных стволовых, клеток, выглядит некорректной, и возможно, что эти стволовые клетки при соответствующих внешних воздействиях могут трансдифференцироваться в другой тип клеток.

В человеческом молоке имеется смесь различных типов клеток. В молоке обнаруживаются секреторные клетки эпителия (лактоциты) из-за их отслаивания от базальной мембраны грудной железы вследствие давления, связанного с постоянным наполнением и опорожнением железы. Число лактоцитов достигает приблизительно 10-20% всей клеточной популяции. Большинство остальных клеток, содержащихся в человеческом молоке, составляют лейкоциты (иммунные клетки, такие как лимфоциты, макрофаги, моноциты, природные киллерные клетки, базофилы, эозинофилы и нейтрофилы). Существует мнение, что лейкоциты содержатся в молоке как для защиты грудной железы от инфекции, так и для обеспечения иммунной защиты ребенка. К настоящему времени считается, что в молоке содержатся только эти типы клеток.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить новый способ выделения клеток-предшественников из тела человека. В этом смысле термин «клетки-предшественники» включает все клетки с характеристиками, подобными характеристикам стволовых клеток, в том числе преимущественно, но не исключительно, плюрипотентные или полипотентные клетки-предшественники, подобные, например, стволовым клеткам.

Настоящее изобретение решает эту задачу путем получения таких клеток непосредственно или косвенно из человеческого секрета молочной железы, например из молозива, созревшего молока или секрета, выделяемого у мужчин или женщин в течение перерыва в лактации, в течение, по меньшей мере, одного из следующих периодов: период отсутствия беременности, период беременности, период лактации, период инволюции. Иными словами, авторы демонстрируют в настоящей работе, что клетки-предшественники неожиданно могут быть также обнаружены в человеческом лактационном молоке и что эти клетки могут быть использованы в создании тканей для матери и ребенка. Необходимо отметить, что для выделения соответствующих клеток-предшественников могут быть использованы не только секреты молочной железы человека, но и вообще секреты молочной железы видов млекопитающих. С помощью антител, специфичных к клеткам-предшественникам, можно однозначно доказать, что секрет молочной железы, то есть, например, человеческое молоко, действительно содержит клетки-предшественники.

В первом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки-предшественники извлекают из секрета молочной железы таким образом, что неклеточные составляющие секрета молочной железы отделяют от клеточных составляющих, и в особенности так, что из полученных таким образом клеточных составляющих удаляют клетки, не являющиеся плюрипотентными или полипотентными. Клеточные составляющие секрета молочной железы, помимо плюрипотентных клеток, могут дополнительно содержать секреторные клетки эпителия, лейкоциты и, в особенности, клетки не человеческого происхождения, такие как бактериальные клетки. Эти клетки, не являющиеся плюрипотентными, преимущественно удаляют из секрета молочной железы.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения для выделения клеток-предшественников используют секрет молочной железы, полученный в течение периодов лактации, причем используют секрет молочной железы на определенных стадиях выделения молока, таких как стадия после начала индивидуального кормления; стадия у конца индивидуального кормления; фаза лактации; предпочтительно фаза ранней лактации.

Возможно, осуществить особенно полезный и удобный для практического применения способ выделения таких клеток-предшественников из млечного выделения, если применить магнитные гранулы. С этой целью магнитные гранулы предпочтительно соединяют со специфичными к клеткам-предшественникам антителами, что обеспечивает присоединение гранул к клеткам-предшественникам.

Как правило, на первой стадии клеточные компоненты отмывают от секрета молочной железы, на второй стадии клеточные компоненты окрашивают антителами к маркерам клеток-предшественников, а на третьей стадии клетки-предшественники отделяют от других клеток прямым или непрямым способом (то есть непосредственно или опосредованно) с помощью связанных антител, предпочтительно, но не исключительно, используя магнитные гранулы. Для этой цели окрашенные антителами клетки-предшественники присоединяют к гранулам, предпочтительно к небольшим железным гранулам, и клетки-предшественники экстрагируют с помощью гранул, предпочтительно в случае небольших железных гранул, используя магнит, и при этом впоследствии гранулы, а также в случае необходимости и антитела, отделяют от клеток-предшественников. Это возможно осуществить, например, выбором гранул, которые были предоставлены со специфическими антителами, связанными с гранулами, причем эти антитела специфически связываются с клетками-предшественниками. Чтобы получить чистые клетки, гранулы затем отделяют от клеток-предшественников, что возможно, например, осуществить с помощью ферментов, расщепляющих связь между гранулами и антителами. Если связь между гранулами и антителами основана на ДНК, такое расщепление можно осуществить с помощью ДНК-азы, а если связь между гранулами и антителами содержит аминокислотные цепи, можно использовать протеазы.

Было неожиданно обнаружено, что в то время как обычные клетки-предшественники нужно культивировать, то есть выращивать, на очень специфических питающих слоях (фидерах), как, например, на питающих слоях из мышиных фибробластов, выделенные в соответствии с настоящим способом клетки-предшественники не нуждаются в таких специфических питающих слоях, и их, как правило, можно выращивать на других питающих слоях, например, на таких, какие раскрыты в пределах охвата конкретными примерами.

Более конкретно способ выделения содержит следующие стадии: (i) весь человеческий секрет молочной железы подвергают центрифугированию, которое обычно дает сверху слой жира, под ним слой, богатый белками и углеводами, и на дне осадок клеток; (ii) фракцию жира и надосадочную жидкость отбрасывают; (iii) добавляют, например, буфер, такой как (но не ограничиваясь ими) солевой раствор в фосфатном буфере (PBS) и/или солевой раствор в трис-буфере (TBS), или среду, такую как (но не ограничиваясь ими) среда Вильямса (Williams) или среда RPMI, и клетки (содержащие не только клетки-предшественники) ресуспендируют в буфере/среде и центрифугируют, как ранее, предпочтительно повторяя этот процесс 3 или 4 раза, получая по существу чистый осадок клеток; (iv) отделяют клетки-предшественники от осадка клеток.

Отделение клеток-предшественников от осадка клеток предпочтительно осуществляют посредством следующих стадий: (v) осадок клеток суспендируют в среде, предпочтительно в среде RPMI, содержащей, например, сыворотку коровьего плода; (vi) эту суспензию инкубируют с (магнитными) гранулами, которые перед этим предпочтительно были инкубированы со специфичными к клеткам-предшественникам антителами (предпочтительно специфичными к стволовым клеткам антителами, подобными мышиным антителам IgG), причем эти антитела присоединены к магнитным гранулам небольшим участком цепи, например, из ДНК или аминокислот, при том, что инкубацию клеточной суспензии с этими магнитными гранулами предпочтительно осуществляют в течение 15 мин при 4°С; (vii) как только клетки-предшественники оказываются связанными с магнитными гранулами, к содержащей клетки/гранулы пробирке прикладывают магнит, в результате чего связанные с гранулами клетки-предшественники притягиваются к магниту, тогда как несвязанные не притягиваются и остаются в надосадочной жидкости; (viii) надосадочную жидкость удаляют, оставляя только клетки-предшественники, связанные с гранулами посредством антител к клеткам-предшественникам.

Необходимо обратить внимание на то, что можно применить другие типы гранул или же вообще другие средства разделения, чтобы обеспечить селективное связывание гранул с клетками-предшественниками. Такие гранулы должны быть отделены от клеток-предшественников, и для этой цели предпочтительно могут быть применены следующие стадии обработки: (ix) клетки-предшественники, связанные с гранулами посредством антител к стволовым клеткам, удаляют с помощью подходящего средства расщепления, предпочтительно, в том случае, когда антитела связаны с гранулами короткой цепью ДНК, путем добавления ДНК-азы; (х) гранулы удаляют, прикладывая еще раз магнит, так что гранулы, более не связанные со стволовыми клетками, притягиваются к нему; (xi) удаляют надосадочную жидкость, теперь содержащую отделенные клетки-предшественники.

Альтернативный способ разделения, основанный на специфическом росте плюрипотентных клеток, включает следующие стадии:

(i) На первой стадии весь человеческий секрет молочной железы подвергают центрифугированию, которое дает сверху слой жира, под ним слой, богатый белками и углеводами, и на дне осадок клеток.

(ii) На факультативной второй стадии осадок промывают питательной средой. Предпочтительно промывают клетки только средой RPMI.

(iii) На третьей стадии клетки из клеточного осадка высевают в подготовленное устройство для культивирования клеток в ростовой среде и инкубируют. Предпочтительно эту инкубацию осуществляют в течение 10-30 дней, более предпочтительно, в течение 14-20 дней.

(iv) Клетки собирают, то есть их снимают с подложки, предпочтительно с помощью трипсинизации. После этого снятые клетки промывают, предпочтительно раствором ростовой среды.

(v) Собранные и промытые клетки высевают для роста на препарат преобразованной базальной мембраны, рост предпочтительно осуществляют до стадии слитого монослоя. На этой последней стадии предпочтительно используют препарат солюбилизированных базальных мембран, выделенных из мышиной саркомы EHS. Это может быть, например, препарат Matrigel™, поставляемый фирмой BD Biosciences.

Этот способ позволяет получить культуры клеток с морфологией, характерной для клеток-предшественников. Клетки не похожи на лактоциты, а поскольку ростовая среда обеспечивает рост клеток-предшественников/стволовых клеток/лактоцитов, они не могут быть бактериальными клетками.

Кроме этого, настоящее изобретение относится к клеткам-предшественникам, которые предпочтительно являются плюрипотентными или полипотентными клетками-предшественниками (стволовыми клетками), полученными с применением способа, описанного выше.

В дополнение к этому, настоящее изобретение относится к применениям таких клеток-предшественников, например, к применениям ex vivo, in vitro и/или in vivo. Без ограничения области охвата настоящего изобретения такое применение может распространяться на следующие конкретные примеры или их комбинации: создание тканей или клеток для матери и/или ребенка, и/или других индивидуумов; последующие воздействия методами генной терапии или внутриматочные воздействия на плод; создание клеток, тканей, желез или органов для лечения заболевания; последующее клонирование или научное исследование; на одну или несколько из группы следующих задач: клиника, диагностика, биоинженерия, лактоинженерия, регенерация ткани грудной железы, восстановительная хирургия грудной железы, косметическая или улучшающая хирургия грудной железы, регенерация и/или хирургия экзокринной железы.

Дальнейшие варианты осуществления настоящего изобретения обозначены в зависимых пунктах формулы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На прилагаемых чертежах представлены предпочтительные варианты осуществления изобретения.

Фиг.1 показывает общую смешанную популяцию клеток человеческого молока после удаления жира и снятого молока.

Фиг.2 показывает стволовые клетки (sc) после их отделения от общей популяции клеток молока. Эти клетки помещены мазком на предметные микроскопные стекла и окрашены гематоксилином и эозином. На фиг.2а и 2b показана одиночная стволовая клетка (sc). На фиг.2с показана стволовая клетка, связанная с гранулой Dynabeads® (Db). Гранулы Dynabeads® (Db) имеют размер 4,5 мкм, что позволяет приблизительно оценить размер стволовых клеток в 6-7 мкм.

Фиг.3 показывает одиночную стволовую клетку через 1 день после перевода в культуру; после очистки стволовых клеток от общей популяции клеток молока выделенные стволовые клетки можно культивировать, применяя различные условия культивирования.

Фиг.4: через 1-2 недели культивирования выделенные из общей популяции стволовые клетки начинают претерпевать процесс деления (митоз); на этой фотографии стрелка указывает клетку, претерпевающую митоз.

Фиг.5: после культивирования в течение нескольких месяцев эти клетки не обнаруживают дифференцировки в клетки других типов; на этой фигуре показана стволовая клетка после 2 месяцев культивирования, которая было помещена мазком на предметное микроскопное стекло и окрашена гематоксилином и эозином.

Фиг.6: после культивирования в течение 2 месяцев стволовые клетки не были дифференцированы; на этой фигуре показаны стволовые клетки, выделенные с помощью антител SSEA-4 (а) и Tra 1-60 (b), после 2-месячного культивирования;

клетки были отмыты от культуральной среды и помещены мазком на предметное микроскопное стекло, после чего были визуализованы в конфокальном микроскопе с помощью антител SSEA-4 (а) и Tra 1-60 (b), конъюгированных с флуоресцентно мечеными вторичными антителами (козий IgG к мышиным антителам, конъюгированный с AlexaFluor-488).

Фиг.7 показывает скорость роста выделенных стволовых клеток в культуре; видно, что клетки делятся и пролиферируют в течение 4 дней; было установлено, что число клеток, отделенных от Dynabeads® и антител SSEA-4, увеличивается за 4 дня культивирования от приблизительно 50 клеток на чашку до 150 клеток на чашку; была выделена центральная зона чашки и применена перекрестная модель подсчета; в каждой культуре число полей было N=10 и просто подсчитывали число клеток в индивидуальные дни; представленные на этой фигуре данные являются результатами опыта, проведенного в 3 повторах.

Фиг.8 показывает монослой плюрипотентных клеток, полученных из секрета млекопитающего с применением альтернативного способа согласно настоящему изобретению.

ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Исторически сложившийся метод проверки того, являются ли предполагаемые стволовые клетки действительно стволовыми клетками, заключался в том, что необходимо трансплантировать подозреваемые клетки облученным сублетально (на грани выживаемости) мышам. Если после этого трансплантированные клетки закреплялись и восстанавливали какие-либо органы у этих мышей, считалось, что рассматриваемые клетки являются плюрипотентными стволовыми клетками. Однако позднее идентификацию плюрипотентных (стволовых) клеток стало возможным осуществлять без длительного процесса трансплантации на основе идентификации внешних клеточных маркеров плюрипотентных стволовых клеток (например, с помощью антител Tra 1-60 и SSEA-4; Chemicon International, Temecula, California, US).

После отмывки всех клеток от человеческого молока путем повторения процесса мягкого центрифугирования, отсасывания надосадочной жидкости и повторного ресуспендирования клеток в буфере или питательной среде стволовые клетки отделяли от общей популяции клеток молока (фиг.1) с помощью гранул Dynabeads в соответствии с указаниями производителя. В качестве буфера можно использовать солевые растворы в трис-буфере (TBS) или солевые растворы в фосфатном буфере (PBS). В частности, можно использовать растворы TBS, содержащие 10 мМ трис, 150 мМ NaCl с рН вблизи 7,4. В случае растворов PBS, они могут содержать 1,1 мМ KH₂PO₄, 140 мМ NaCl, 4,5 мМ Na₂HPO₄×7H₂O и 2,7 мМ NaCl, рН может быть доведен до приблизительно 7,4. В качестве питательных сред можно использовать среду Вильямса или RPMI (Poswell Park Memorial Institute), поставляемые фирмой Sigma Aldrich, US под номерами продуктов R6504, R7755, R4130 или W4125, W4128, W1878. Можно использовать также среду RPMI фирмы Gibco (CA, US), № по каталогу 11875-093.

Специфичные к стволовым клеткам антитела, например, Tra 1-60, Тга 1-81 и/или SSEA-4, все из них моноклональные и все поставляются, например, фирмой CHEMICON International, 28820 Single Oak Drive, Temecula, CA 92590, для выделения клеток-предшественников присоединяли к Dynabeads®. Можно использовать также антитела к кроветворным клеткам CD133 (№ по каталогу МАВ1133) фирмы R&D Systems, Inc., CA, US).

Незрелые кроветворные стволовые и клетки-предшественники уже выделяли из периферической крови с помощью иммуномагнитных принципов разделения клеток. Исследовательские группы успешно выделяли и культивировали позитивные по CD133 клетки, используя магнитные частицы, конъюгированные с моноклональными антителами (система CliniMACS System и реагент АС133 от фирмы Miltenyi Biotec).

Любые специфичные к стволовым клеткам антитела (в том числе SSEA-3, SSEA-1 и Tra 1-81, Oct-4, CD133) инкубируют с Dynabeads®. Dynabeads® поставляются фирмой Dynal AS и представляют собой небольшие железные гранулы, с которыми посредством короткой цепи ДНК связаны антитела - мышиный IgG. Например, доступны Dynabeads® под названием Dynal CD34. Перед тем, как инкубировать Dynabeads® с выделенными из молока клетками в течение 15 мин при 4°С, осуществляют инкубацию Dynabeads® в течение 1 ч при комнатной температуре.

Как только стволовые клетки оказываются связанными с Dynabeads, на что обычно требуется приблизительно от 30 минут до 1 часа, к боковой стенке пробирки, содержащей клетки/Dynabeads®, подносят магнит. Dynabeads® - это однородные парамагнитные гранулы на основе полистирола диаметром 4,5 мкм. Dynabeads® (вместе с присоединенными стволовыми клетками) притягиваются к магниту, а несвязанные клетки не притягиваются и остаются в надосадочной жидкости. Затем надосадочную жидкость удаляют, оставляя только клетки, связанные с Dynabeads® посредством антител к стволовым клеткам. Клетки, связанные с Dynabeads® посредством антител к стволовым клеткам, удаляют добавлением ДНК-азы, разрушающей короткую цепь ДНК. Это называют освобождающим буфером, и он является частью набора Dynal kit, содержащей 62500 ед./мл ДНК-азы (от 15000 до 20000 ед. во флаконе, что указывается в инструкциях). Dynabeads® удаляют, еще раз прикладывая магнит, к которому притягиваются Dynabeads®, не связанные более со стволовыми клетками. Теперь надосадочная жидкость содержит отсоединенные стволовые клетки. Эти стволовые клетки теперь можно использовать для любого последующего применения, как указано выше и далее.

Извлеченные клетки-предшественники (стволовые клетки) можно культивировать на питающем клеточном слое - фибробластах мышиного зародыша в среде Игла в модификации Knockout-Dulbecco. Обычно культивацию можно осуществлять при температуре 37°С.

Примеры применения питающих клеток:

- Длительное воспроизведение стволовых клеток человеческого эмбриона в настоящее время осуществляют путем совместного культивирования с первичными фибробластами мышиного эмбриона, которые служат питающими клетками.

- Ускорение образования культивируемого эпителия путем использования в качестве слоя питающих клеток обработанных ультразвуком экспрессирующих клеток ежа.

- Клетки костного мозга взрослого человека поддерживают длительное проращивание в культуре стволовых клеток эмбриона человека.

- Для пролиферации эмбрионных стволовых клеток в клетки эндотелия и их созревания в модели in vitro необходимы питающие клетки ОР9.

- Селективное прорастание и постоянная культура макрофагов из крови взрослой свиньи. Макрофаги из крови взрослой свиньи селективно проращивались и непрерывно культивировались непосредственно в среде, покрывающей питающий слой мышиных фибробластов STO.

- При основании и получении характеристик новой линии человеческих незрелых клеток мегакариобластной лейкемии (М-МОК) для жизнеспособности клеток необходимы фибробласты. Была основана новая зависящая от фибробластов линия человеческих незрелых клеток мегакариобластной лейкемии (М-МОК) из костного мозга девочки с острой мегакариобластной лейкемией, и было установлено, что рост клеток полностью зависит от присутствия человеческих фибробластов HEL-O, полученных из легких эмбриона.

- Для культуры in vitro клеток зародышевых бластодисков из бластоцистов свиньи в качестве питающего слоя используют предварительно облученные фибробласты плода свиньи G30.

- Было установлено, что клетки острых лимфоцитарных лейкемий (ALL) новорожденных и детей преимущественно выживают в совместной культуре с клеточной линией клонированных жировых клеток эндотелия (14F1.1) из костного мозга мыши и проявляют экстенсивный рост в присутствии мышиных стромальных клеток. Эти клетки ALL строго зависели от наличия мышиного стромального клона 14F1.1 и утрачивали способность к пролиферации в отсутствие адипоцитов эндотелия или в присутствии различных питающих клеток.

Рост клеток

Было установлено, что число клеток, извлеченных с помощью Dynabeads® и антител SSEA-4, за 4 дня возрастает от приблизительно 50 клеток на чашку до 150 клеток на чашку (см. фиг.7).

Методы

Приготовление клеток

Цельное молоко (150 мл) центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, чтобы собрать клетки. Осадок клеток ресуспендируют приблизительно в 4 мл TBS с 1% BSA и снова центрифугируют в течение 10 мин. Окончательный осадок ресуспендируют в 200 мкл среды RPMI с 1% сыворотки плода коровы (FCS).

Приготовление гранул

Гранулы промывали 3 раза в среде RPMI с 1% сыворотки плода коровы.

Гранулы покрывали первичными антителами (1 мкл в 500 мкл TBS с 1% BSA) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с аккуратным помешиванием.

Покрытые гранулы отделяли, промывали 3 раза в 1 мл TBS с 1% BSA и переносили в чистую пробирку. Последнюю промывку производили в 1 мл среды RPMI с 1% FCS.

Выделение клеток

К гранулам добавляли 200 мкл препарата клеток и инкубировали в течение 30 мин при приблизительно 4°С. После инкубации несвязанную фракцию отбрасывают.

К комплексу клеток с гранулами добавляют 200 мкл среды RPMI с 1% FCS и после этого подвергают его мягкому пипетированию для удаления остатков несвязанного вещества.

К 200 мкл комплекса клеток с гранулами добавляют 5 мкл освобождающего буфера и инкубируют при аккуратном перемешивании в течение 15 мин при 37°С. Комплекс гранул с клетками подвергают интенсивному пипетированию для облегчения освобождения клеток.

Извлеченную суспензию клеток (200 мкл) переносят в чистую пробирку Eppendorf. Эту клеточную суспензию можно сразу вводить в систему для культивирования.

Метод культивирования

Клетки высевают на покрытые коллагеном чашки для культивирования. После периода оседания и связывания клеток надосадочную жидкость осторожно сливают, чтобы удалить примеси, и добавляют свежую среду. Затем культуры инкубируют в чашках при 37°С в термостате с 5% СО₂, сменяя среду каждые 2 дня.

Среды для культивирования

Среда Вильямса Е (Williams E), дополненная 10% сывороткой плода коровы; 10^-7 М дексаметазон (Sigma); 2 ммоль/л глутамин; предварительно сделанная смесь ITS⁺, содержащая инсулин (6,25 мкг/мл), трансферрин (6,25 мкг/мл), селеновую кислоту (6,25 нг/мл), бычий сывороточный альбумин (1,25 мг/мл) и линолевую кислоту (5,35 мкг/мл) от фирмы Becton-Dickinson, Bedford, MA. Антибиотики: пенициллин/стрептомицин 5000 мкг/мл, фунгизон (250 мкг/мл).

Антитела

Примерами некоторых из антител, потенциально пригодных для применения в данной системе, являются (все поставляются фирмой CHEMICON International, 28820 Single Oak Drive, Temecula, CA 92590):

SSEA-1 (№ по каталогу МАВ4301)

SSEA-3 (MAB4303)

SSEA-4 (MAD4304)

Tra 1-60(MAB4360)

Tra 1-81 (MAB4381)

антитела к кроветворным клеткам CD133 (№ по каталогу МАВ1133) от фирмы R&D Systems, Inc.

Буферы

TBS: 1% BSA, 10 мМ трис, 150 мМ NaCl

RPMI с 1% FCS

PBS: 1,1 мМ KH₂PO₄, 140 мМ NaCl, 4,5 мМ Na₂HPO₄×7H₂O

После очистки стволовых клеток от человеческого молока с использованием антител к внешним маркерам стволовых клеток (Tra 1-60 и SSEA-4), связанных с Dynabeads®, делали мазки стволовых клеток на микроскопных предметных стеклах и окрашивали стволовые клетки гематоксилином и эозином (фиг.2). Используя эти же очищенные стволовые клетки, авторы смогли культивировать клетки (фиг.3) и продемонстрировать, что эти клетки способны делиться (фиг.4). После продолжительного культивирования авторы смогли окрасить эти клетки гематоксилином и эозином и продемонстрировать, что эти клетки остались стволовыми клетками, поскольку они после нескольких месяцев культивирования продолжают связываться с антителами к стволовым клеткам (Tra 1-60 и SSEA-4), что видно при конфокальной микроскопии (фиг.6). Рост отдельных клеток также был подтвержден (см. фиг.7).

Альтернативный способ выделения/выращивания плюрипотентных клеток состоит в использовании специфичной комбинации ростовых сред, путем которой можно вырастить монослой плюрипотентных клеток, которые, несомненно, не выглядят похожими на лактоциты (см. фиг.8). Действительно, выращенные в культуре клетки физически идентичны, например, культурам стволовых клеток печени. Возможна дополнительная идентификация этих клеток с помощью клеточных маркеров, которые они экспрессируют, и по активности их генов.

Альтернативный способ выделения или селективного роста может быть осуществлен следующим образом.

Приготовление чашек, покрытых Matrigel™

Matrigel (коммерческий препарат преобразованной базальной мембраны, BD Matrigel™, фирма BD Biosciences, № по каталогу 354234) медленно размораживали в ледяной бане. Наконечники пипеток и планшеты для культивирования перед использованием охлаждали и держали на льду. Отбирали аликвоты Matrigel по 50 мкл, переносили их из наконечника пипетки в каждую из ячеек микропланшета на 24 ячейки с плоским дном и инкубировали на льду в течение 30 мин. После этого планшеты дополнительно инкубировали в течение 30 мин при 37°С для связывания геля. После связывания в каждую ячейку добавляли по 1 мл ростовой среды и возвращали планшет в термостат до использования (на срок не более 5 дней).

Выращивание и приготовление клеток

Приблизительно 50 мл свежеполученного остаточного молока (hind milk - женское грудное молоко с высоким содержанием жира, кремового цвета; оно дает ребенку основную часть калорий и наиболее способствует прибавлению массы) центрифугировали для перевода клеток в осадок (детали приведены выше). Осадок клеток промывали 2 раза только средой RPMI (RPMI Medium 1640, фирма Gibco, № по каталогу 108-36).

После этого клетки высевали на специально обработанные для культивирования клеток пластиковые культуральные чашки в ростовой среде (состав ростовой среды для культур клеток: RPMI 1640; сыворотка плода коровы 20%; инсулин 5 мкг/мл; холерный токсин 50 нг/мл; гидрокортизон 0,5 мкг/мл; 2-кратная концентрация пенициллина-стрептомицина-фунгизона) и инкубировали в течение приблизительно 14-20 дней.

После инкубации отбирали чашки с большими колониями и близким к слиянию монослоем и снимали клетки трипсинизацией (Trypsin-EDTA 1x, фирма JRH Bioscience, № по каталогу 59218).

Собранные клетки промывали 1 раз ростовой средой и высевали в покрытые Matrigel™ ячейки планшета в количестве приблизительно 1500 клеток/мл. Через приблизительно 14 дней можно было наблюдать зоны слитых клеток.

Описание

Морфология типична для клеток эпителия в том смысле, что развиваются слитые слои клеток, и клетки в колониях тесно ассоциированы. Тот факт, что полученные из грудного молока клетки, культивируемые таким способом, развиваются в первичную культуру и образуют обширные круглые колонии с хорошо очерченными границами, в сильной степени свидетельствует о том, что клетки обладают качествами, подобными качествам клеток-предшественников. То, что клетки оказываются недифференцированными и многие из них обнаруживают высокое соотношение объемов ядра и цитоплазмы, даже более доказательно, чтобы идентифицировать их как подобные клеткам-предшественникам.

Использованные специфические материалы

Холерный токсин (LIST BIOLOGICAL LABORATORIES, № по каталогу 101 В)

Сыворотка плода коровы (Fetal Bovine serum, Invitrogen, № по каталогу 10099141)

Гидрокортизон (Sigma, № по каталогу НО135)

Инсулин (Sigma, № по каталогу 19278)

Пенициллин/стрептомицин/фунгизон (Scott Scientific, № по каталогу 17.745Е)

Микропланшет MICROPLATE (IWAKI, № по каталогу 3820-024)

Чашка для клеточных культур (Corning, № по каталогу 430165)

Вследствие приспосабливаемости к внешней среде этих плюрипотентных стволовых клеток, эти выделенные клетки могут быть использованы для множества разнообразных применений. Например, эти клетки могут:

- применяться для создания тканей, преимущественно для матери и ребенка (и в принципе для других индивидуумов), в том числе для последующих воздействий методами генной терапии или внутриматочных воздействий на плод, и для создания клеток, тканей, желез или органов для лечения заболевания. Все вышеперечисленное включает их применение в научных исследованиях, в клинических, диагностических или коммерческих применениях. А также может включать также создание биологических соединений, в том числе клеток, клеточных фрагментов, клеточных выделений, клеточных фракций, нуклеотидов, дезоксирибонуклеиновых кислот, аминокислот, белков, гликопротеинов, углеводов, липидов, гормонов, факторов роста и цитокинов. Кроме того, вышеперечисленное применение клеток может включать создание клеток как этап, предшествующий созданию ткани, желез или органов, или как этап, последующий за созданием ткани, желез или органов, для лечения заболевания, регенерации тканей, совершенствования тела или косметических применений для следующих тканей: обонятельная, слуховая, глазная, лимфатическая, иммунная, кроветворная, эндокринная, экзокринная, кишечная, желудочно-кишечная, ткань пейеровых бляшек, островков Лангерганса, скелетная, мышечная, соединительная, сосудистая ткани, кровь, ткань кожи, волос, ногтей, молочной железы, головного мозга и центральной нервной системы, печени, сердца, легких, почек, костей, поджелудочной железы, репродуктивных органов;

- храниться для будущего использования. Последующее использование этих стволовых клеток, или же дифференцированных или дедифференцированных клеток, включает хранение этих стволовых клеток для будущего использования, как описано ниже. Это включает их хранение для последующего использования в научных исследованиях, в клинических, диагностических или коммерческих применениях;

- применяться для культур клеток, например, для воспроизводства тех же самых стволовых клеток или же для дифференцирования или дедиференцирования этих стволовых клеток в другие типы клеток. Это включает их применение в научных исследованиях, в клинических, диагностических или коммерческих применениях;

- применяться для клонирования. Последующее применение этих стволовых клеток, или же клеток, дифференцированных или дедифференцированных из этих стволовых клеток, может включать применение для создания клонов либо эмбрионов, либо целых животных. Это включает их применение в научных исследованиях, в клинических, диагностических или коммерческих применениях;

- примененяться для научных исследований. Последующее применение этих стволовых клеток, или же клеток, дифференцированных или дедифференцированных из этих стволовых клеток, может включать применение в научных исследованиях. Это может включать создание биологических соединений, в том числе клеток, клеточных фрагментов, клеточных выделений, клеточных фракций, нуклеотидов, дезоксирибонуклеиновых кислот, аминокислот, белков, гликопротеинов, углеводов, липидов, гормонов, факторов роста и цитокинов. Кроме того, вышеперечисленное применение клеток может включать создание клеток как этап, предшествующий созданию ткани, желез или органов, или как этап, последующий за созданием ткани, желез или органов, для лечения заболевания, регенерации тканей, совершенствования тела или косметических применений для следующих тканей: обонятельная, слуховая, глазная, лимфатическая, иммунная, кроветворная, эндокринная, экзокринная, кишечная, желудочно-кишечная, ткань пейеровых бляшек, островков Лангерганса, скелетная, мышечная, соединительная, сосудистая ткани, кровь, ткань кожи, волос, ногтей, молочной железы, головного мозга и центральной нервной системы, печени, сердца, легких, почек, костей, поджелудочной железы, репродуктивных органов;

- использоваться для клинических, диагностических или коммерческих применений. Последующее применение этих стволовых клеток, или же клеток, дифференцированных или дедифференцированных из этих стволовых клеток, может включать их использование для клинических, диагностических или коммерческих применений. Вышеперечисленное применение клеток может включать создание биологических соединений, в том числе клеток, клеточных фрагментов, клеточных выделений, клеточных фракций, нуклеотидов, дезоксирибонуклеиновых кислот, аминокислот, белков, гликопротеинов, углеводов, липидов, гормонов, факторов роста и цитокинов. Кроме того, вышеперечисленное применение клеток может включать создание клеток как этап, предшествующий созданию ткани, желез или органов, или как этап, последующий за созданием ткани, желез или органов, для лечения заболевания, регенерации тканей, совершенствования тела или косметических применений для следующих тканей: обонятельная, слуховая, глазная, лимфатическая, иммунная, кроветворная, эндокринная, экзокринная, кишечная, желудочно-кишечная, ткань пейеровых бляшек, островков Лангерганса, скелетная, мышечная, соединительная, сосудистая ткани, кровь, ткань кожи, волос, ногтей, молочной железы, головного мозга и центральной нервной системы, печени, сердца, легких, почек, костей, поджелудочной железы, репродуктивных органов;

- использоваться для биоинженерии. Последующее применение этих стволовых клеток, или же клеток, дифференцированных или дедифференцированных из этих стволовых клеток, может включать их использование для создания в теле человека любого другого типа клеток. Эти клетки, ткани или органы могут быть затем использованы в косметической/восстановительной хирургии, пересадке органов/тканей или создании клеток/тканей/органов для третьего партнера. Вышеперечисленное применение клеток может включать создание биологических соединений, в том числе клеток, клеточных фрагментов, клеточных выделений, клеточных фракций, нуклеотидов, дезоксирибонуклеиновых кислот, аминокислот, белков, гликопротеинов, углеводов, липидов, гормонов, факторов роста и цитокинов. Кроме того, вышеперечисленное применение клеток может включать создание клеток как этап, предшествующий созданию ткани, желез или органов, или как этап, последующий за созданием ткани, желез или органов, для лечения заболевания, регенерации тканей, совершенствования тела или косметических применений для следующих тканей: обонятельная, слуховая, глазная, лимфатическая, иммунная, кроветворная, эндокринная, экзокринная, кишечная, желудочно-кишечная, ткань пейеровых бляшек, островков Лангерганса, скелетная, мышечная, соединительная, сосудистая ткани, кровь, ткань кожи, волос, ногтей, молочной железы, головного мозга и центральной нервной системы, печени, сердца, легких, почек, костей, поджелудочной железы, репродуктивных органов;

- использоваться для лактоинженерии. Последующее применение этих стволовых клеток, или же клеток, дифференцированных или дедифференцированных из этих стволовых клеток, может включать их использование для создания биологических компонентов молока, в том числе клеток, клеточных фрагментов, клеточных выделений, клеточных фракций, нуклеотидов, дезоксирибонуклеиновых кислот, аминокислот, белков, гликопротеинов, углеводов, липидов, гормонов, факторов роста и цитокинов;

- использоваться для регенерации тканей молочной железы. Последующее применение этих стволовых клеток, или же клеток, дифференцированных или дедифференцированных из этих стволовых клеток, может включать их использование для создания ткани молочной железы;

- использоваться для восстановительной хирургии груди (бюста). Такая регенерированная ткань, как описанная выше, может быть затем использована для восстановительной хирургии груди;

- использоваться для косметической хирургии груди. Такая регенерированная ткань, как описанная выше, может быть затем использована для косметической хирургии груди;

- использоваться для регенерации и/или хирургии тканей экзокринных желез. Последующее применение этих стволовых клеток, или же клеток, дифференцированных или дедифференцированных из этих стволовых клеток, может включать их использование для создания тканей экзокринных желез, которые в свою очередь могут быть использованы для восстановления или замены экзокринных желез;

- использоваться для создания биологических соединений, в том числе клеток, клеточных фрагментов, клеточных выделений, клеточных фракций, нуклеотидов, дезоксирибонуклеиновых кислот, аминокислот, белков, гликопротеинов, углеводов, липидов, гормонов, факторов роста и цитокинов.

1. Способ выделения из тела человека клеток-предшественников, в том числе всех клеток с характеристиками, подобными характеристикам стволовых клеток, причем такие клетки получены непосредственно или опосредованно из человеческого секрета молочной железы, полученного из указанного тела человека, при этом секрет может быть молозивом, созревшим молоком или выделением у мужчин или женщин в течение перерыва в лактации, в течение по меньшей мере одного из следующих периодов: период отсутствия беременности, период беременности, период лактации, период инволюции.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки-предшественники являются плюрипотентными или полипотентными.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные клетки-предшественники выделены из секрета молочной железы таким образом, что неклеточные составляющие секрета молочной железы отделены от клеточных составляющих.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что из клеточных составляющих удалены клетки, не являющиеся плюрипотентными или полипотентными.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что из секрета молочной железы удалены секреторные клетки эпителия, лейкоциты и в особенности клетки не человеческого происхождения - такие, как бактериальные клетки.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения клеток-предшественников используют секрет молочной железы, полученный в течение периодов лактации, и при этом используют секрет молочной железы на определенных стадиях выделения молока: таких, как стадия после начала индивидуального кормления; стадия у конца индивидуального кормления; фаза лактации; предпочтительно фаза ранней лактации.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения клеток-предшественников используют магнитные гранулы.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что на первой стадии клеточные компоненты отмывают от секрета молочной железы, на второй стадии указанные клеточные компоненты окрашивают антителами к маркерам клеток-предшественников, а на третьей стадии клетки-предшественники отделяют от других клеток непосредственно или опосредованно с помощью связанных антител.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что окрашенные антителами клетки-предшественники связывают с гранулами, предпочтительно с небольшими железными гранулами, и при этом клетки-предшественники выделяют посредством гранул, предпочтительно в случае небольших железных гранул с помощью магнита, причем в дальнейшем гранулы, а также, в случае необходимости, и антитела отделяют от клеток-предшественников.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что удаление гранул осуществляется посредством ферментов, выбранных из следующей группы: ДНК-аза, протеаза, РНК-аза.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки-предшественники культивируют без использования питающего слоя фибробластов, в частности без использования питающего слоя мышиных фибробластов.

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что
(i) на первой стадии цельный человеческий секрет молочной железы подвергают центрифугированию, которое дает сверху слой жира, под ним слой, богатый белками и углеводами, и на дне осадок клеток;
(ii) на второй стадии фракцию жира и надосадочную жидкость отбрасывают;
(iii) на третьей стадии добавляют буфер - такой, как (но не ограничиваясь ими) солевой раствор в фосфатном буфере (PBS), и/или солевой раствор в трио-буфере (TBS), или среду - такую, как (но не ограничиваясь ими) среда Вильямса (Williams) или среда RPMI, и клетки ресуспендируют в буфере/среде и центрифугируют, как ранее, предпочтительно повторяя этот процесс 3 или 4 раза, получая, по существу, чистый осадок клеток;
(iv) на четвертой стадии отделяют клетки-предшественники от осадка клеток.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что из человеческого секрета молочной железы получают осадок клеток и затем применяют следующие стадии разделения:
(i) осадок клеток суспендируют в среде, предпочтительно в среде RPMI, содержащей сыворотку коровьего плода;
(vi) эту суспензию инкубируют с магнитными гранулами, которые перед этим были инкубированы со специфичными к клеткам-предшественникам антителами, предпочтительно со специфичными к стволовым клеткам антителами, подобными мышиным антителам IgG, причем эти антитела присоединены к магнитным гранулам небольшой цепью ДНК, при этом инкубацию клеточной суспензии с этими магнитными гранулами предпочтительно осуществляют в течение 15 мин при 4°С;
(vii) как только клетки-предшественники оказываются связанными с магнитными гранулами, к содержащей клетки/гранулы пробирке прикладывают магнит, в результате чего связанные с гранулами клетки-предшественники притягиваются к магниту, тогда как несвязанные клетки не притягиваются и остаются в надосадочной жидкости;
(viii) надосадочную жидкость удаляют, оставляя только клетки-предшественники, связанные с гранулами посредством антител к клеткам-предшественникам.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что следом за указанными стадиями используют следующие стадии:
(ix) клетки-предшественники, связанные с гранулами посредством антител к стволовым клеткам, удаляют с помощью подходящего средства расщепления - предпочтительно, в том случае, когда антитела связаны с гранулами посредством короткой цепи ДНК, путем добавления ДНК-азы;
(х) гранулы удаляют, прикладывая магнит еще раз, так что гранулы, более не связанные со стволовыми клетками, притягиваются к нему;
(xi) удаляют надосадочную жидкость, теперь содержащую отделенные клетки-предшественники.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки выделяют из человеческого секрета молочной железы центрифугированием, затем инкубируют в ростовой среде, которая обеспечивает рост клеток-предшественников/стволовых кпеток/лактоцитов.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что
(i) на первой стадии цельный человеческий секрет молочной железы подвергают центрифугированию, которое дает сверху слой жира, под ним слой, богатый белками и углеводами, и на дне осадок клеток.
(ii) на второй стадии осадок клеток промывают питательной средой, предпочтительно только средой RPMI.
(iii) на третьей стадии клетки из клеточного осадка высевают в подготовленное для культивирования клеток устройство в бактерицидной и/или фунгицидной ростовой среде и инкубируют, предпочтительно в течение 10-30 дней, наиболее предпочтительно - в течение 14-20 дней.
(iv) клетки собирают, предпочтительно с помощью трипсинизации, и промывают, предпочтительно используя ростовую среду.
(v) собранные клетки высевают для роста на препарат преобразованной базальной мембраны, предпочтительно для роста до стадии слитого монослоя.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что на стадии (v) используют препарат солюбилизированных базальных мембран, выделенный из мышиной саркомы EHS, как, например Matrigel™.

18. Клетки-предшественники, предпочтительно плюрипотентные или полипотентные клетки-предшественники, полученные с использованием способа по любому из пп.1-17, отличающиеся тем, что они
представляют собой клоногенные, самообновляющиеся клетки, способные путем процесса дифференцировки давать начало более разнообразным специализированным типам клеток;
представляют собой клоногенные, самообновляющиеся клетки, способные путем процесса дифференцировки давать начало разнообразным более специализированным типам клеток;
обладают способностью связываться со специфичными к клеткам-предшественникам антителами;
имеют морфологию, характерную для клеток - предшественников;
обладают способностью к росту в ростовой среде, обеспечивающей рост клеток-предшественников;
обладают способностью к длительному воспроизведению;
обладают способностью к пролиферации в первичную культуру и образованию обширных круглых колоний с хорошо очерченными границами;
проявляют недифференцированность;
имеют высокое соотношение объемов ядра и цитоплазмы; и
проявляют приспосабливаемость к внешней среде.

19. Применение плюрипотентных или полипотентных клеток-предшественников, полученных с использованием способа по любому из пп.1-17, для их применений ex vivo и/или in vivo.

20. Применение по п.19, отличающееся тем, что оно представляет собой применение для создания тканей или клеток для матери, и/или ребенка, и/или других индивидуумов.

21. Применение по п.19 или 20, отличающееся тем, что оно представляет собой применение для последующих воздействий методами генной терапии.

22. Применение по п.19, отличающееся тем, что оно представляет собой применение для создания клеток, тканей, желез или органов для лечения заболевания.

23. Применение по п.19, отличающееся тем, что оно представляет собой применение для последующего клонирования животных и/или эмбрионов животных.

24. Применение по п.19, отличающееся тем, что оно представляет собой применение для одной или нескольких задач из следующей группы: клиника, диагностика, биоинженерия, лактоинженерия, регенерация ткани грудной железы, восстановительная хирургия грудной железы, косметическая или улучшающая хирургия грудной железы, регенерация и/или хирургия экзокринной железы.