Способ получения гамма-схизандрина

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности. Проводят экстракцию лимонника китайского сжиженным диоксидом углерода. Полученный СO₂-экстракт подвергают хроматографическому разделению на оксиде алюминия и элюируют гексаном, после элюирования полученные гексановые фракции вымораживают и перекристаллизовывают из смеси хлороформ-гексан в соотношении 1:10-3:10. Изобретение позволяет повысить выход продукта.

 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к производству лекарственных средств в виде субстанций и индивидуальных биологически активных соединений.

Лимонник китайский - широко известное в традиционной и народной медицине лекарственное растение, тонизирующая активность которого обусловлена наличием лигнанов. Одним из основных представителей этих соединений является гамма-схизандрин [1].

В связи с отсутствием в нашей стране государственного стандартного образца гамма-схизандрина до сих пор остается открытым вопрос относительно стандартизации сырья и препаратов, в том числе биологически активных добавок лимонника китайского. Так, стандартизацию плодов и семян лимонника проводят лишь по

внешним признакам, микроскопии и числовым показателям [2, 3], а анализ препарата «Лимонника семян настойка» - по содержанию эфирного масла, сумме жирного и эфирного масел [4].

Наличие гамма-схизандрина позволит разработать государственный стандартный образец гамма-схизандрина, что, в свою очередь, даст возможность предложить методики анализа плодов и семян лимонника китайского, препаратов и биологически активных добавок на их основе, которые будут удовлетворять современным требованиям объективной стандартизации.

Известен способ получения гамма-схизандрина путем экстракции стеблей и листьев лимонника китайского сжиженным диоксидом углерода при сверхкритическом давлении 20-27 МПа и температуре 40-60°C [5]. После статичной экстракции (10-15 мин) следовала динамичная экстракция сжиженным диоксидом углерода. Полученные образцы растворяли в 2 мл ацетонитрила (для первой колонки) и метаноле (для второй колонки), отфильтровывали через картридж, наполненный силикагелем и стационарной фазой С₁₈, и проводили анализ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (обращенная фаза). Условия проведения первой аналитической колонки (ультрафиолетовый диодный детектор и рефрактометр HP 1090 (Hewlett-Packard), колонка ЕС 250×4 мм, стационарная фаза Nucleosil 100 5 µm С₁₈; и охранная колонка 8×4 мм I.D., Nucleosil 100 5 µm С₁₈) - температура 18-20°C, аналитическая длина волны 254 нм; градиент A: CH₃CN-H₂O: 5 мин 50:50 изократический, градиент 30 мин 60:40, градиент 20 мин 70:30, 15 мин 70:30 изократический; градиент В: МеОН-H₂O: 1 мин 70:30, градиент 34 мин 95:5, 5 мин 95:5 изократический. Вторую аналитическую колонку осуществляли, используя жидкостной хроматограф PV 4100 (Philips), детектор в ультрафиолетовой и видимой части спектра PV 4110 и мультиканальный детектор Pye Unicam PV 4021 и последовательно колонку Tessek-CGC SGX C₁₈, 10 µm, 30×3 мм I.D. и колонку Merck-Lichrospher 100 RP 18, 5 µm, 250×4 мм I.D. Условия хроматографирования: температура около 25°C, аналитическая длина волны 254 нм; подвижная фаза ацетонитрил-вода от 40:60 до 70:30, градиент 60 мин, последовательно 70:30, 30 мин, изократическое элюирование.

Однако недостатком данного способа является низкий выход гамма-схизандрина, который составляет 0,082% от воздушно-сухого сырья и 0,017% - из стеблей и из листьев соответственно, а также многостадийность технологического процесса.

Данный способ взят за прототип изобретения.

Целью изобретения является увеличение выхода гамма-схизандрина, обладающего антитоксической активностью, из плодов лимонника китайского.

Эта цель достигается тем, что после элюирования гексановые фракции вымораживают и перекристализовывают из смеси хлороформ-гексан в соотношении 1:10-3:10.

Заявляемый способ получения гамма-схизандрина реализуется следующим образом: первоначально сырье лимонника китайского экстрагируют сжиженным диоксидом углерода. Полученный CO₂-экстракт подвергают хроматографическому разделению на оксиде алюминия и элюируют гексаном.

Это приводит к получению блока фракций (12-21), обогащенных гамма-схизандрином. Выделение гамма-схизандрина осуществляют путем вымораживания упаренных гексановых фракций и последующей кристаллизацией осадка. Очистку целевого вещества осуществляют дальнейшей перекристаллизацией из смеси хлороформ-гексан.

В ходе эксперимента использованы физико-химические методы анализа, такие как адсорбционная жидкостная колоночная хроматография, тонкослойная хроматография (хроматографические пластинки «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ»), а также сочетание экстракционных методов и перекристаллизации.

Для изучения строения выделенного лигнана были использованы метод тонкослойной хроматографии и спектральные методы (УФ-спектроскопия, спектрофотометр «Specord-40»; ЯМР-спектроскопия), позволяющие идентифицировать целевое соединение как γ-схизандрин.

Было проведено фармакологическое исследование гамма-схизандрина на белых беспородных мышах, которым в течение 6 дней ежедневно внутримышечно вводили четыреххлористый углерод в дозе 2,0 г/кг. На фоне токсического гепатита в группе животных, получавших гамма-схизандрин в дозе 25 мг/кг внутрибрюшинно, на седьмой день при введении тиопентал-натрия внутрибрюшинно в виде суспензии, продолжительность тиопенталового сна составила 131,83 мин, что в 2,4 раза меньше такового в контрольной группе (313,50 мин).

Проведенный заявителем поиск по научно-техническим и патентным источникам информации [6-10] и выбранный из перечня аналогов прототип [5] позволяет выявить отличительные признаки в заявленном техническом решении. Следовательно, заявляемый способ получения удовлетворяет критерию изобретения "новизна".

Заявляемый способ иллюстрируется следующим примером.

Пример 1. 250 г высушенных плодов лимонника китайского экстрагируют сжиженным диоксидом углерода при сверхкритическом давлении 135-340 бар и температуре 40-80°C. Скорость подачи экстрагента около 250 мл/мин, получают масло плодов лимонника китайского. Полученное масло (50 г) смешивают с 224,4 г алюминия оксида (II нейтральный по Брокману), высушивают. Полученный сухой порошок (СО₂-экстракт+алюминия оксид) наносят на слой алюминия оксида, сформированного в гексане (высота колонки 20 см, диаметр 5,5 см), и элюируют гексаном. Отсутствие примесей в получаемом соединении контролируется методом тонкослойной хроматографии.

Из фракций (12-21), обогащенных гамма-схизандрином, выделение гамма-схизандрина осуществляли путем вымораживания (-8-10°C) упаренных гексановых фракций и последующей кристаллизацией осадка. Очистку целевого вещества осуществляли дальнейшей перекристаллизацией из смеси хлороформ-гексан в соотношении 1:10-3:10.

Для изучения строения выделенного лигнана были использованы метод тонкослойной хроматографии и спектральные методы, позволяющие идентифицировать целевое соединение как γ-схизандрин.

Выход целевого продукта - индивидуального гамма-схизандрина - составляет 1,0 г или 0,40% от массы воздушно-сухого сырья. Физико-химические и спектральные характеристики гамма-схизандрина следующие.

Гамма-схизандрин, призматические кристаллы белого цвета, С₂₃Н₂₈О₆, т.пл. 117-120°C, λ_max(лямбда) в EtOH: 220, 254 и 280 нм. Спектр Н'-ЯМР (CDCl₃) δ: 6,55 (с, 1Н, Н-4), 6,49 (с, 1Н, Н-5¹), 5,95 (с, 2Н, ОСН₂O), 3,90 (с, 3Н, ОСН3), 3,88 (с, 3Н, ОСН₃), 3,82 (с, 3Н, ОСН₃), 3,55 (с, 3Н, ОСН₃), 2,54 (м, 2Н, Н-7), 2,22 (дд, 9,1 т, 13,2 Гц, 2Н, Н-7¹), 0,97 (д, 7,0 Гц, СН₃-9), 0,73 (д, 7,0 Гц, СН₃-9¹).

Таким образом, использование заявляемого способа получения гамма-схизандрина дает следующие преимущества:

1) использование в заявляемом способе в качестве элюента гексана позволяет в 4 и 23 раза увеличить выход целевого продукта - гамма-схизандрина - из плодов лимонника китайского по сравнению с прототипом;

2) гамма-схизандрин, полученный заявляемым способом из семян лимонника китайского, обладает выраженной антитоксической активностью (продолжительность тиопенталового сна у животных сокращается в 2,4 раза по сравнению с контрольной группой).

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов / В.А.Куркин. - 2-е изд., перераб. и доп. - Самара: Офорт; СамГМУ, 2007. - 1239 с.

2. Государственная фармакопея СССР. - Десятое издание. - М: Медицина, 1986. - 1078 с.

3. Государственная фармакопея СССР. - Одиннадцатое издание (Выпуск 1). - М.: Медицина, 1989. - Т.2. - 399 с.

4. ФС 42-1822-90. Настойка семян лимонника Гос. инспекция по контролю за качеством лекарств, средств и изделий мед. техники. Фармакопейный комитет. - Взамен ФС 42-1822-82; Введ. 28.09.90 до 30.06.95. - М., - 5 с.

5. Bartlova, M. Liquid chromatographic analysis of supercritical carbon dioxide extracts of Schizandra chinensis / M. Bartlova, L. Opletal, V. Chobot, H. Sovova // J. of Chromatography B.2002. - No.770. - P.283-289.

6. Кочетков H.K. Химическое исследование китайского лимонника / Н.К.Кочетков, А.Я.Хорлин, О.С.Чижов // Ж. общей химии, 1961. - т.31. - с.3454-3460.

7. Ikeya, Y. The constituents of Schizandra chinensis Baill. I. Isolation and structure determination of five new lignans, gomisin А, В, C, F and G, and the absolute structure of schizandrin / Y.Ikeya, H.Taguchi, I.Yosioka, H.Kobayashi // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). - 1979. - Vol.27, No.6. - P.1383-1394.

8. Ikeya, Y. The constituents of Schizandra chinensis Baill. X. The structures of γ-Schizandrin and Four New Lignans, (-) Gomisins L₁ and L₂ (±)-Gomisin M₁ and (+) Gomisin M₂ / Y.Ikeya, H.Taguchi, I.Yosioka // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). - 1982. - Vol. 30, No.6. - P.132-139.

9. Slanina, L. Lignans in the seeds and fruits of Schizandra chinensis cultured in Europe / L.Slanina, E.Taborska, L.Lojkova // Planta Med. - 1997. - Vol.63, No.3. - P.277-280.

10. Kim, Y. Effect of plant matrix and fluid ethanol concentration on supercritical fluid extraction efficiency of schizandrin derivatives / Y.Kim, Y.H.Choi, Y.W.Chin, Y.P.Jang, Y.C.Kim, J.Y.Kim, S.N.Joung, M.J.Noh, K.P.Yoo // J.Chromatogr. Sci. 1999. - Vol.63, No.3. - P.277-280.

Способ получения гамма-схизандрина из сырья лимонника китайского, включающий экстракцию сжиженным диоксидом углерода и элюирование органическим растворителем, отличающийся тем, что полученный CO₂-экстракт подвергают хроматографическому разделению на оксиде алюминия и элюируют гексаном, после элюирования полученные гексановые фракции вымораживают и перекристаллизовывают из смеси хлороформ-гексан в соотношении 1:10-3:10.