Покрытия из наноматериалов для остеоинтегрируемых биомедицинских протезов

Изобретение относится к медицине. Описаны новые материалы и способы для получения покрытий на основе диоксида титана для остеоинтегрируемых биомедицинских протезов. Покрытия создают с помощью наноматериалов, обладающих антибактериальными свойствами, и они обеспечивают остеоинтеграцию имплантатов и, в то же время, снижают отторжение, свойственное воспалительным процессам, которые возникают вследствие инфекций, которые могут развиваться рядом с имплантатами. Изобретение относится также к внутрикостному имплантату, содержащему биологически совместимые металлические материалы; отличающемуся тем, что указанный имплантат содержит покрытие, содержащее нанокристаллический материал, содержащий наночастицы формулы (I) АО_х-(L-Meⁿ⁺)_i; (I) где АО_х представляет собой TiO₂ или ZrO₂; Meⁿ⁺ представляет собой ион металла, обладающий антибактериальной активностью, с n=1 или 2; L представляет собой бифункциональную органическую молекулу, которая может одновременно связываться с оксидом металла и с ионом металла Meⁿ⁺; и i представляет собой количество групп L-Meⁿ⁺, связанных с одной наночастицей АО_х. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл.

 

Задача изобретения

Настоящее изобретение относится к материалам и способам для получения покрытий на основе диоксида титана для остеоинтегрируемых биомедицинских протезов. Такие покрытия получают с помощью наноматериалов, имеющих антибактериальные свойства, и их назначение состоит в обеспечении остеоинтеграции имплантатов и, в то же время, снижении отторжения, свойственного воспалительным процессам, которые возникают вследствие инфекций, которые могут развиваться рядом с имплантатами.

Введение

Протез представляет собой аппарат, которым заменяют орган, который утрачен или был удален. Орган представляет собой совокупность различных тканей, которые выполняют конкретную функцию. Зуб представляет собой орган. Зубной имплантат представляет собой пример протеза. Другим примером является аппарат, используемый в ортопедии для замены тазобедренного сустава.

Такие протезы состоят из материалов (обычно, металлов и сплавов металлов), имеющих конкретные механические свойства, позволяющие им выдерживать имеющиеся высокие нагрузки. Фундаментальным свойством, которым должен обладать такой протез, встроенный в костную ткань, является повышенная "остеоинтеграция".

Остеоинтеграция представляет собой процесс, посредством которого имплантированный или пересаженный материал активирует костную ткань, в которую он был имплантирован или в/на которую он был пересажен, так что это приводит к сращению костной ткани с указанным материалом.

Процесс остеоинтеграции является очень сложным и не полностью понятным. Он вовлекает механизмы:

- иммуногенного надзора (так называемого "распознавания своего"), который представляет собой типичные процессы, которые обеспечивают применение имплантатов;

- остеокондукции (процесса, посредством которого имплантированный или пересаженный материал обеспечивает основу для роста новой костной ткани); и

- остеоиндукции (процесса, посредством которого имплантированный или пересаженный материал дает начало одному или нескольким молекулярным сигналам, которые индуцируют остеогенез).

Процесс остеоинтеграции можно считать завершенным приблизительно через 60 суток, что соответствует времени консодилации переломов.

В успехе имплантата играют основные роли как эффекты материала, из которого состоит материал внутрикостного имплантата, так и конструкция самого имплантата. Оба фактора влияют на процесс остеоинтеграции в различной степени.

В настоящее время титан представляет собой предпочтительный для выбора материал для зубных протезов и для ортопедических протезов, поскольку он сочетает превосходные механические свойства и очень хорошую остеоинтеграцию.

В отношении конструирования имплантатов исходно рассматривают следующие аспекты: (1) макротехника; (2) минитехника; (3) микротехника; и (4) нанотехника. Макротехника представляет собой макроскопическое конструирование имплантата. В отношении зубных имплантатов, например, существуют имплантаты различных форм, таких как цилиндрическая и коническая. Минитехника относится, например, к характеристикам винтовой резьбы и к форме выступов на резьбе, причем эти выступы могут иметь тупые края (закругленные края) или заостренные края и составляют порядка миллиметров. Микротехника относится к характеристикам поверхности, которая может быть, например, гладкой или шероховатой. В связи с этим существуют различные способы определения различий в микропорах, которые образуются на поверхности имплантата. Наконец, нанотехника является объектом рассмотрения. Нанотехника относится к молекулярной организации поверхности имплантата. В настоящее время имплантаты состоят из титана, который окисляется на воздухе до диоксида титана, со стохастическим распределением между двумя кристаллическими формами, рутил и анатаз. Предварительные исследования, доступные в литературе, показывают, что является возможным получение поверхностей, полностью покрытых анатазом, который усиливает остеоинтегративные характеристики титана (Sul, Y.T., Johansson, CB., Jeong, Y., Roser, K., Wennerberg, A., and Albrektsson, T., 2001, "Oxidized implants and their influence on the bone response", J.Mater.Sci.Mater.Med., 12, 10-12:1025-31; и Giaveresi, G., Ambrosio, I., Battiston, G.A., Casellato, U., Gerbasi, R., Finia, M., Aldini, N.N., Martini, L., Rimondini, L., and Giardino, R., 2004, "Histomorphometric, ultrastructural and microhardness evaluation of the osteointagration of a nanostructured titanium oxide coating by metal-organic chemical vapour deposition: an in vivo study", Biomaterials, 25, (Nov) 25:5583-91).

Диоксид циркония также имеет остеоиндуктивные свойства (Cabrini, R.L., Guglielmotti, M. B., Almagro, J. C, 1993, "Histomorphometry of initial bone healing around zirconium implants in rats", Implant.Dent., 2:264-7; и Sennerby, L., Dasmah, A., Larsson, B., and Iverhed, M., 2005, "Bone tissue responses to surface-modified zirconia implants: A histomorphometric and removal torque study in the rabbit", Clin.Implant.Dent.Relat.Res., 7, Suppl. 1, S13-20).

Несмотря на достижения, описанные в области материалов и конструирования остеоинтегрируемых имплантатов, проблема, которая все еще остается нерешенной и которая проявляется, в частности, в области рядом с имплантатом, состоит в воспалительных процессах инфекционной этиологии, которые развиваются вокруг имплантата и которые во многих случаях приводят к потере имплантата, приводящей к увеличенной биологической нагрузке, а также к повышенным экономическим затратам. Очевидно, что материал, который поддерживает или действительно улучшает остеоинтегративные свойства титана и, кроме того, имеет высокое потенциальное противоинфекционное действие, может представлять собой значительное улучшение относительно доступных в настоящее время остеоинтегрируемых биомедицинских протезов.

Недавно было показано, что в условиях облучения фотонами в ультрафиолетовой области спектра анатаз обладает антибактериальными свойствами (Del Curto, B. Brunella, M.F. Giordano, C. Pedeferri, M.P. Valtulina, V. Visai L. and Cigada A., 2005, "Decreased bacterial adhesion to surface-treated titanium", Int.J.Artif.Organs, 23, (7, Jul): 718-30; и Suketa N., Sawase T., Kitaura H., Naito M. Baba, K. Nakayama, K. Wennerberg, A. and Atsuta, M., 2005, "An antibacterial surface on dental implants, based on the photocatalytic bactericidal effect," Clin.Implant.Dent.Relat. Res., 1, 2:105-11). Однако необходимость в световом излучении делает такой феномен непригодным для применения в протезах, в частности во внутрикостных имплантатах, где, очевидно, невозможно достигнуть требуемого освещения протеза.

Сущность изобретения

Это изобретение состоит в изготовлении покрытий на внутрикостные имплантаты, которые содержат титан или другой металлический материал, причем покрытия в основном содержат функционализированные наноматериалы, которые основаны на диоксиде титана в аллотропной форме анатаза, или основаны на диоксиде циркония и которые содержат ионы серебра (I), ионы цинка (II), и/или ионы меди (II). Такие покрытия проявляют бактерицидную и вироцидную активность даже в отсутствии светового облучения, и их можно использовать для усиления остеоинтеграции имплантатов, уменьшая, в то же время, отторжение, свойственное воспалительным процессам инфекционной этиологии.

В соответствии с одним признаком настоящего изобретения на внутрикостные имплантаты наносят прозрачные нанокристаллические субстраты, причем основой этих нанокристаллических субстратов является диоксид титана или диоксид циркония, функционализированный с помощью производных серебра (I), цинка (II) и/или меди (II), и их получают в соответствии со способами, описанными в настоящем документе ниже.

Нанокристаллические субстраты по этому изобретению на основе диоксида титана или диоксида циркония по существу являются наноматериалами, которые функционализированы лигандами L, содержащими органические молекулы, способные одновременно связываться с нанокристаллическим субстратом и с ионами металлов, которые проявляют бактерицидную и вироцидную активность (например, ионы одновалентного серебра, Ag⁺, ионы двухвалентного цинка, Zn⁺⁺ или ионы двухвалентной меди, Cu⁺⁺). Такие лиганды L могут быть названы "бифункциональными лигандами", поскольку они содержат группы, которые могут связываться с поверхностью наноматериала, и другие группы, которые могут связывать ионы металлов с бактерицидной активностью.

В соответствии с другим признаком настоящего изобретения можно получать праймеры, которые усиливают адгезию функционализированных нанокристаллических пленок на основе диоксида титана или диоксида циркония к внутрикостным имплантатам, содержащим титан или другой пригодный металлический материал. Материалы и способы получения этих покрытий описаны в настоящем документе ниже.

В соответствии с другим признаком настоящего изобретения, функционализированные нанокристаллические материалы, используемые для целей настоящего изобретения, можно смешивать с катионными поверхностно-активными веществами, имеющими антибактериальную активность, причем эти поверхностно-активные вещества способны адсорбироваться на поверхности наночастиц формулы AO_x или указанные поверхностно-активные вещества способны приводить к суспензиям наноматериалов, с помощью чего смеси являются стабильными с течением времени.

На чертеже представлена схематическая иллюстрация структуры наночастицы по этому изобретению.

Подробное описание изобретения

Нанокристаллические материалы, функционализированные посредством органических лигандов, которые используют для достижения целей настоящего изобретения, представляют собой материалы, описанные в международной патентной заявке PCT/IT2006/000280, 24 апреля 2006 года. Указанные материалы соответствуют формуле (I):

AO_x-(L-Meⁿ⁺)_i, (I)

где

AO_x представляет собой TiO₂ или ZrO₂;

Meⁿ⁺ представляет собой ион металла, обладающий антибактериальной активностью,

с n = 1 или 2 (предпочтительно Meⁿ⁺ представляет собой Ag⁺ или Cu⁺⁺);

L представляет собой бифункциональную органическую молекулу, которая может одновременно связываться с оксидом металла и с ионом металла Meⁿ⁺; и

i представляет собой количество групп L-Meⁿ⁺, связанных с одной наночастицей AO_x.

Значение индекса i зависит от различных факторов, таких как размер(ы) наночастицы(наночастиц) AO_x, структура лиганда L и способ, используемый для получения лиганда L. В контексте настоящего изобретения i соответствует количеству лигандов L, с которыми наночастица AO_x может связываться, когда указанную наночастицу подвергают контактированию с раствором лиганды L в течение периода между 10 минутами и 72 часами, предпочтительно между 3 и 24 часами.

Наномателиалы по этому изобретению имеют размер частиц менее 40 нм (нанометров), предпочтительно менее 30 нм, особенно предпочтительно менее 15 нм. Наночастицы с размером частиц менее 15 нм, как правило, приводят к прозрачным суспензиями, позволяя, таким образом, более широкий диапазон применений.

Бифункциональные лиганды L на основе соединений органического происхождения:

Бифункциональные лиганды L органического типа, которые используют в соответствии с настоящим изобретением, включают типы молекул, содержащие группы, которые могут обеспечивать взаимодействие с наночастицами AO_x, и указанные типы молекул далее содержат другие функциональные группы, которые могут связываться с ионами, обладающими антибактериальной активностью. Примеры таких типов молекул включают органические молекулы, содержащие следующие функциональные группы:

- группу карбоновой кислоты (карбоксигруппу) (-COOH), группу фосфоновой кислоты (фосфонильную группу) (-PO₃H₂) и группу бороновой кислоты (боронильную группу) (-B(OH)₂), причем эти группы способны обеспечивать адсорбцию (приводить к ней) на поверхности оксида AO_x;

- и группы >N, -NH₂, -CN, -NCS и -SH, причем эти группы способны связываться с ионами металла, обладающими антибактериальной активностью (такими как ионы Ag⁺, Zn²⁺ и Cu²⁺).

Эти органические лиганды [L] предпочтительно выбирают из:

- азот-содержащих гетероциклических колец, имеющих 6-18 членов (предпочтительно, выбранных из пиридина, дипиридила и терпиридила), замещенных одним или несколькими заместителями, выбранными из группы карбоновой кислоты (карбоксигруппы) (-COOH), группы бороновой кислоты (боронильной группы) (-B(OH)₂), группы фосфоновой кислоты (фосфонильной группы) (-PO₃H₂), меркаптогруппы (-SH) и гидроксильной группы (-OH);

- C6-C18 арильных соединений (предпочтительно выбранных из фенила, нафтила и бифенила), замещенных одним или несколькими заместителями, выбранными из: группы карбоновой кислоты (карбоксигруппы) (-COOH), группы бороновой кислоты (боронильной группы) (-B(OH)₂), группы фосфоновой кислоты (фосфонильной группы) (-PO₃H₂), меркаптогруппы (-SH) и гидроксильной группы (-OH);

- C2-C18 монокарбоновых кислот и дикарбоновых кислот, замещенных одной или несколькими меркаптогруппами (-SH) и/или гидроксильными группами (-OH).

Более предпочтительные примеры таких бифункциональных лигандов [L] органического типа включают:

- пиридин, дипиридил и терпиридил, функционализированные посредством группы(групп) карбоновой кислоты, группы(групп) бороновой кислоты), или группы(групп) фосфоновой кислоты; меркаптоянтарную кислоту, меркаптоундекановую кислоту, меркаптофенол, меркаптоникотиновую кислоту, 5-карбоксипентантиол, меркаптомасляную кислоту и 4-меркаптофенилбороновую кислоту.

Характерный признак этих субстратов связан с однородным распределением ионов серебра(I), цинка(II) и/или меди(II) на наночастицах диоксида титана или диоксида циркония, как схематично проиллюстрировано на фиг. 1.

Получение таких нанокристаллических материалов и покрытие внутрикостных имплантатов такими материалами описаны в настоящем документе ниже.

(A) Получение прозрачных суспензий на основе TiO ₂ ;

В стакан помещали 300 мл дистиллированной H₂O и 2,1 мл сильной кислоты, например концентрированной HNO₃ (65 мас. %). Через 10 мин, при встряхивании, с помощью делительной воронки добавляли 50 мл изопропоксида титана (поставленного Fluka). Сразу после этого образовывался молочно-белый осадок, содержащий TiO₂. Затем смесь нагревали до 80°С в течение 8-12 часов, уделяя внимание продолжению встряхивания и постоянной температуре. В процессе нагревания осадок повторно растворялся и смесь приобретала опалесцирующий внешний вид. В процессе нагревания коллоидной суспензии позволяли концентрироваться до конечного объема от 100 до 200 мл, соответствующего концентрации TiO₂ от 150 г/л до 75 г/л. Наночастицы диоксида титана, полученные в конце процесса, имели диаметр, который варьировал в диапазоне 6-15 нм. Затем суспензию, концентрированную до 100 мл, разбавляли добавлением 400 мл дистиллированной воды и 500 мл абсолютного этанола, получая конечный раствор, который был прозрачным, имел pH приблизительно 2 и содержал TiO₂ в концентрации 1,5% в объеме 1 л.

(B) Получение прозрачных суспензий на основе ZrO ₂:

В стакан помещали 300 мл дистиллированной H₂O и 2,1 мл сильной кислоты, например концентрированной HNO₃ (65 мас. %). Через примерно 10 мин, при встряхивании, с помощью делительной воронки добавляли 76 мл 70% раствора тетраизопропоксида циркония в изопропаноле.

Было отмечено, что сразу после этого образовывался молочно-белый осадок, содержащий из ZrO₂. Затем смесь нагревали до 90°С в течение 8-12 часов, уделяя внимание продолжению встряхивания и постоянной температуре. В процессе нагревания осадок повторно растворялся и смесь приобретала молочно-белый внешний вид, при этом коллоидной суспензии позволяли концентрироваться до конечного объема от 140 до 280 мл, соответствующего концентрации ZrO₂ от 150 г/л до 75 г/л. Затем суспензию, концентрированную до 140 мл, разбавляли добавлением 560 мл дистиллированной воды и 700 мл абсолютного этанола с получением 1,4 л опалесцирующей суспензии, которая имела pH приблизительно 2 и которая содержала ZrO₂ в концентрации 1,5%.

(C) Получение нейтральных прозрачных суспензий диоксида титана;

Нейтральные водные суспензии на основе диоксида титана, имеющие опалесцирующий внешний вид, можно получать из пероксититановой кислоты в качестве исходного материала.

Такой типичный способ получения является следующим: 150 мл TiCl₄ в 20% HCl помещают в стакан объемом 1 л, и к этому раствору добавляют 826 мл NH₄OH, разбавленного 1:9 дистиллированной водой. Значение pH полученного раствора является нейтральным (pH 7), и получают осадок титановой кислоты Ti(OH)₄ белого цвета гелеобразной консистенции. Осадок собирают на фильтре с пористостью G3 и промывают 750-1000 мл дистиллированной воды до полного удаления хлорида (показываемого обработкой жидкости фильтрата посредством AgNO₃). (Если хлорид присутствует, будет отмечен белый творожистый осадок AgCl). Осадок, содержащий титановую кислоту, Ti(OH)₄, собирают и суспендируют в 200 мл дистиллированной воды, имеющей проводимость менее 1,5 мкС (микросименс) и pH в диапазоне 5-7, и медленно добавляют 92 мл 30% H₂O₂ в течение 20-30 мин. Наблюдают растворение осадка, совместно с образованием раствора желтого цвета, содержащего пероксититановую кислоту общей формулы:

[Ti₂(O)₅(OH)_x]^(x-2)-,

где x может варьировать в диапазоне от 3 до 6.

Затем раствор нагревают в течение 1 ч при 70°С, чтобы произошло разложение избытка H₂O₂, а затем помещают в автоклав на 8 ч при 120°С. В ходе этого периода пероксититановая кислота разлагается до диоксида титана, который находится в преобладающей аллотропной форме анатаза. Полученная суспензия наночастиц имеет значение pH, близкое к нейтральному, обладает опалесцирующим внешним видом и является стабильной с течением времени.

Получение суспензий наноматериалов, имеющих антибактериальную и противовирусную активность:

В целях получения пленок, обладающих бактерицидной и противовирусной активностью, суспензии наноматериалов, описанные в разделах (A), (B) и (C), можно функционализировать посредством ионов серебра. В способе получения используются:

- первая стадия адсорбции на наночастицы, содержащие диоксид титана или диоксид циркония с бифункциональным лигандом L; с последующим

- смешиванием с водным или органическим раствором, содержащим ионы Ag⁺.

Также является возможным осуществление адсорбции на наночастицы соли алкиламмония, которая представляет собой катионное поверхностно-активное вещество, имеющее бактерицидную активность, смешиванием с суспензией наноматериалов, функционализированных посредством ионов Ag⁺.

Как правило, адсорбция бифункционального лиганда L на описанных наноматериалах по настоящему изобретению требует приблизительно 12-24 часов, в то время как связывание ионов Ag⁺ с лигандом L сразу стабилизируется, когда растворы, содержащие эти ионы, добавляют к суспензиям наноматериалов, функционализированных посредством лиганда L. Способы получения, описанные в настоящем документе, подробно описывают препаративные способы функционализации суспензий наноматериалов посредством:

- бифункциональных лигандов L;

- ионов Ag⁺; и

- катионных поверхностно-активных веществ.

Можно использовать аналогичные способы получения, в которых суспензии функционализируют ионами Cu²⁺.

(D) Адсорбция 4-меркаптофенилбороновой кислоты и ионов Ag ⁺ на прозрачные суспензии TiO ₂ , полученные в соответствии со способом (A), и на продукты, предоставленные фирмой Eco Coating Photocatalyst S.r.l.:

100 мл прозрачной суспензии диоксида титана, полученной способом (A) и содержащей 15% TiO₂, разбавляли 600 мл дистиллированной воды и 300 мл этанола. К полученной суспензии добавляли 0,052 г 4-меркаптофенилбороновой кислоты. Суспензию поддерживали при встряхивании 24 ч, в конце которого спектрофотометрически выявляли, что бороновая кислота полностью адсорбировалась на наночастицах полупроводника. К прозрачной и не имеющей запаха суспензии при встряхивании добавляли стехиометрическое количество (в отношении лиганда L) соли серебра, например такой как лактат серебра или ацетат серебра (0,06 г в случае лактата серебра).

К конечной суспензии добавляли хлорид бензалкония в таком количестве, чтобы получить 0,6 мас.%. Прозрачная суспензия была неограниченно стабильной; далее в настоящем документе ее будут называть "Bactercline". Тот же процесс можно использовать для модификации прозрачных суспензий наноматериалов, поставленных коммерчески под буквенным обозначением "PSO 419" фирмой Eco Coating S.r.l.; количество бифункционального лиганда и ионов серебра, используемое в этих случаях, будет основано на содержании диоксида титана в продукте. Например, продукт "PSO 419 D2", который аналогичен продукту, полученному способом (A), содержит 2% TiO₂ и имеет pH приблизительно 2, можно превращать в антибактериальный и противовирусный продукт следующим способом:

50 мл раствора PSO 419 D2, содержащего 2% TiO₂, разбавляют 50 мл этанола. К полученной суспензии добавляют 2,2 мг 4-меркаптофенилбороновой кислоты (2,05·10^-5 M), и суспензию встряхивают в течение 24 ч. В конце этого периода, полученный раствор является бесцветным; добавляют 2,8 мг лактата серебра. Полученная прозрачная суспензия является стабильной в течение неограниченного периода времени.

(E) Применение и получение праймеров:

В соответствии с другим признаком настоящего изобретения внутрикостные имплантаты по этому изобретению покрывают праймерами, способными обеспечивать адгезию указанных наночастиц, обладающих бактерицидной, вироцидной и фунгицидной активностью (в соответствии с формулой (I), выше, на титановый имплантат. Такие праймеры могут быть различных типов, например они могут содержать неорганические нанокристаллические продукты на основе диоксида титана, предоставленные коммерчески фирмой Eco Coating Photocatalyst S.r.l. под названиями продуктов "AT-01", "ATLS-01G" и "PSO 419", или они могут содержать органические продукты, например такие как сополимеры стирол-малеиновый ангидрид или сополимеры стирол-акрилат. Предпочтительно, праймеры основаны на пероксититановой кислоте.

Способ получения раствора такого праймера описан в настоящем документе ниже.

Типичный способ получения является следующим: 150 мл TiCl₄ в 20% HCl помещают в стакан объемом 1 л, и к этому раствору добавляют 826 мл NH₄OH, разбавленного 1:9 дистиллированной водой. Значение pH полученного раствора является нейтральным (pH 7), и получают осадок титановой кислоты Ti(OH)₄ белого цвета и гелеобразной консистенции. Осадок собирают на фильтре с пористостью G3 и промывают 750-1000 мл дистиллированной воды до полного удаления хлорида (показываемого обработкой жидкости фильтрата посредством AgNO₃). (Если хлорид присутствует, будет отмечен белый творожистый осадок AgCl). Осадок, содержащий титановую кислоту, Ti(OH)₄, собирают и суспендируют в 200 мл дистиллированной воды, имеющей проводимость менее 1,5 мкС и pH в диапазоне 5-7, и медленно добавляют 92 мл 30% H₂O₂ в течение 20-30 мин. Наблюдают растворение осадка, совместно с образованием раствора желтого цвета, содержащего пероксититановую кислоту общей формулы:

[Ti₂(O)₅(OH)_x]^(x-2)-,

где x может варьировать в диапазоне от 3 до 6 (в связи с этим нельзя указать координационное число гидроксильной группы (OH)).

Затем раствор нагревают 1 ч при 70°С, чтобы произошло разложение избытка H₂O₂.

Получение покрытий, содержащих наноматериалы, имеющие бактерицидную и вироцидную активность, нанесенные на внутрикостные имплантаты:

Cуспензии наноматериалов, описанные в разделах (A), (B), и (C), можно наносить на внутрикостные имплантаты, содержащие титан или другие материалы, при этом нанесение представляет собой нанесение покрытия погружением или нанесение покрытия распылением, с последующим высушиванием при температуре окружающей среды и последующим нагреванием до температуры в диапазоне 50-600°С, предпочтительно 200-500°С, в присутствии кислорода. Превентивное нанесение праймера, описанного в разделе (E), облегчает адгезию пленок, содержащих продукты (A), (B) и (C). Имплантаты, обработанные таким образом, обладают антибактериальными свойствами в присутствии светового облучения в ближнем ультрафиолетовом диапазоне c. 360-400 нм. Последующая обработка суспензиями, описанными в разделе (D), причем суспензии также можно наносить на имплантаты погружением или распылением и стабилизировать нагреванием при температуре в диапазоне 80-160°С, придает имплантату бактерицидные и вироцидные свойства в отсутствии светового облучения.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления этого изобретения нанокристаллические материалы формулы (I), используемые для целей этого изобретения, содержат катионные поверхностно-активные вещества с антибактериальной активностью, способные обеспечивать адсорбцию на поверхностях наночастиц AO_x или способные приводить в смесях с суспензиями наноматериалов к смесям, которые являются стабильными с течением времени.

Адсорбцию нанокристаллических материалов, полученных таким образом, на поверхности имплантатов можно обеспечивать, с предшествующим нанесением праймера или без него, в соответствии со способами, описанными в настоящем документе выше.

Получение нанокристаллических материалов формулы (I) с адсорбированными катионными поверхностно-активными веществами будет описано в настоящем документе ниже.

(F) Адсорбция катионных поверхностно-активных веществ на диоксиде титана:

Катионные поверхностно-активные вещества с антибактериальной активностью можно, в принципе, адсорбировать на наноматериалах на основе TiO₂, ZrO₂, SnO₂, ZnO и SiO₂. Адсорбция практически мгновенно приводит к отрицательно заряженным или нейтральным частицам. В случае суспензий наноматериалов с щелочным значением pH добавление солей бензалкония, например хлорида бензилдодецилдиметиламмония или хлорида бензилгексадецилдиметиламмония, или хлорида бензалкония, приводит к осаждению суспензии, в то время как в случае суспензий наноматериалов с нейтральным или кислым значением pH суспензия является стабильной.

Адсорбцию хлорида бензалкония на наноматериалах на основе TiO₂ в условиях нейтральных значений pH демонстрируют косвенно из кондуктометрических измерений. В теории, адсорбция катионов диалкиламмония на TiO₂ должна приводить к сниженной проводимости; это проверяли с помощью следующего эксперимента: 50% (мас./об.) раствор хлорида бензалкония, разбавленный 1:10 (об./об.), обладает проводимостью 4,7 мС. Если 10 мл этого раствора доводят до объема 15 мл добавлением дистиллированной воды, проводимость снижается до 3,90 мС; соответственно, если 10 мл доводят до 15 мл (разбавляют до 15 мл) добавлением 5 мл нейтральной суспензии диоксида титана, полученной способом (C) (указанное получение начинается с пероксититановой кислоты), или с использованием эквивалентного продукта с нейтральным значением pH, обозначаемого "AT-03", полученная измеренная проводимость составляет 3,60 мС. Снижение проводимости на 300 мкС может быть отнесено к адсорбции катионного поверхностно-активного вещества на поверхности диоксида титана.

Бактерицидная и вироцидная активность суспензий диоксида титана, описанных в разделе (D):

Суспензии, описанные в разделе (D), которые основаны на диоксиде титана, функционализированном посредством лиганда 4-меркаптофенилбороновой кислоты и ионов серебра, проявляют бактерицидную и вироцидную активность даже в отсутствии светового облучения. Эксперименты, описанные в настоящем документе ниже, относящиеся к материалу "Bactercline", свидетельствуют об активности продукта; вследствие чего указанный продукт при нанесении в качестве конечного покрытия на внутрикостные имплантаты придает им их бактерицидные и вироцидные свойства.

Оценка бактерицидной активности в суспензиях:

Способ с разбавлением и нейтрализацией

(стандартный способ UNI-EN 1276, апрель 2000 года);

Микроорганизмы:

Использовали следующие тестируемые штаммы:

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

Enterococcus faecalis

Escherichia Coli

Salmonella Listeria.

Источник микроорганизмов:

Все бактериальные штаммы, используемые в тестах, получали из Department of Experimental Medicine and Diagnostics, Microbiology Section, University of Ferrara. Тестируемый продукт разбавляли до 80%.

Тестируемое вещество считали бактерицидным, если для каждого из бактериальных штаммов при 20°С после контакта в течение 5 мин вещество вызывало снижение жизнеспособности на коэффициент по меньшей мере 10⁵. Полученные результаты указывают на то, что во всех случаях наблюдалось снижение жизнеспособности на коэффициент, превышающий 10⁵.

Заключение:

Исходя из полученных результатов, с учетом критериев надежности, используемых для теста, было выявлено, что тестируемое вещество является бактерицидным против Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Salmonella и Listeria в концентрации 80% (которая оказалась максимальной поддающейся тестированию концентрацией), после контакта в течение 5 мин, в присутствии бычьего альбумина в конечной концентрации 0,3%, в соответствии с UNI-EN 1276, апрель 2000 года.

Оценка бактерицидной активности в тесте поверхности (UNI-EN 13697, декабрь 2001 года):

Микроорганизмы:

В дополнение к штаммам, используемым ранее для тестирования в суспензии, в этом случае экспериментирование было расширено с помощью: Legionella pneumophila.

Полный перечень тестируемых штаммов в тесте поверхности является следующим:

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis

Enterococcus faecalis

Escherichia Coli

Salmonella

Listeria

Legionella pneumophila.

Тестируемое вещество считали бактерицидным против микробных штаммов согласно European Standard, если для каждого из бактериальных штаммов при 20°С, после контакта в течение 5 мин вещество вызывало снижение жизнеспособности на коэффициент по меньшей мере 10⁴.

Полученные результаты, указанные в следующей таблице, указывают на то, что во всех случаях десятичный логарифм противомикробной активности превышает 4.

Заключения:

Исходя из полученных результатов, учитывая критерии надежности, используемые для теста, было выявлено, что вещество, тестируемое в выбранных экспериментальных условиях, является бактерицидным против: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Salmonella Listeria и Legionella pneumophila в концентрации 100%, после контакта в течение 5 мин, в присутствии бычьего альбумина в конечной концентрации 0,3%, в соответствии с UNI-EN 13697, декабрь 2001 года.

Оценка фунгицидной активности в суспензиях;

Способ с разбавлением и нейтрализацией (UNI-EN 1650, October 2000);

Микроорганизмы:

Использовали следующие тестируемые штаммы:

Candida albicans

Aspergillus niger.

Штаммы получали из Department of Experimental Medicine and Diagnostics, Microbiology Section, University of Ferrara.

Тестируемое вещество считали фунгицидным, если для каждого из грибковых штаммов при 20°C после контакта в течение 15 мин вещество вызывало снижение жизнеспособности на коэффициент по меньшей мере 10⁴.

Результаты:

Значения снижения жизнеспособности для различных концентраций тестируемого вещества указаны в следующей таблице:

Заключения:

Исходя из полученных результатов, с учетом критериев надежности, используемых для теста, было выявлено, что тестируемое вещество является фунгицидным против Candida albicans в концентрациях 25%, 50% и 80% и против Aspergillus niger в концентрациях 50% и 80% (80% оказалась максимальной поддающейся тестированию концентрацией), после контакта в течение 15 мин, в присутствии бычьего альбумина в конечной концентрации 0,3%, в соответствии с UNI-EN 1650, октябрь 2000 года.

Оценка фунгицидной активности в тесте поверхности (TJNI-EN 13697, декабрь 2001 года):

Микроорганизмы:

Использовали следующие тестируемые штаммы:

Candida albicans

Aspergillus niger.

Штаммы получали из Department of Experimental Medicine and Diagnostics, Microbiology Section, University of Ferrara.

Тестируемое вещество считали фунгицидным если при 20°С после контакта в течение 15 мин, логарифм противомикробной активности против штаммов микроорганизмов составлял по меньшей мере 3 согласно упомянутому выше European Standard.

Результаты:

Логарифмы снижения жизнеспособности указаны в следующей таблице:

Заключения:

Исходя из полученных результатов, с учетом критериев надежности, используемых для теста, было выявлено, что вещество является фунгицидным против Candida albicans и Aspergillus niger в концентрации 100%, после контакта в течение 15 мин, в присутствии бычьего альбумина в конечной концентрации 0,3%, в соответствии с DNI-EN 13697, декабрь 2001 года.

Оценка вироцидной активности:

Эксперименты, описанные в настоящем документе ниже, демонстрируют, что тестируемый продукт способен проявлять очень высокую вироцидную активность против вируса HSV-1 (вирус простого герпеса 1) при очень низких концентрациях.

Экспериментальный способ:

Получали вирусные препараты, которые содержали различные количества суспензии вируса в модифицированной среде Дульбекко (D-MEM), содержащей эмбриональную телячью сыворотку (FBS) в количестве 1%. Используемое количество вируса (вирусный титр) составляло 1·10⁶ цитолитических бляшкообразующих единиц (бое). Добавляли различные количества тестируемого продукта со временем перед обработкой 1 ч и 5 ч. Контроли состояли из необработанных суспензий вирусов. После периода инкубации при комнатной температуре все образцы разбавляли до известных объемов для титрования вируса. Вирусные титры контролей и тестируемых образцов, обработанных веществом, подлежащим тестированию, определяли способом, описанным в настоящем документе ниже.

Вирусный титр определяют вычислением количества инфекционных вирусов, присутствующих в 1 мл раствора. Один способ, используемый для этого, состоит в определении количества цитолитических бляшек, продуцируемых достаточно разбавленной вирусной суспензией, контактирующей с монослоем клеток. В серии экспериментов, проведенных по этому поводу, используемые клетки представляли собой клетки почки Simia africana (Vero). Клетки культивировали при 37°С в D-MEM в присутствии 5% CO₂ с добавлением FBS в количестве 10%, L-глутамина в количестве 1% и пенициллин-стрептомицина в количестве 1%. Определение титра проводили на планшетах с лунками, имеющих по 12 лунок каждый. Когда культуры практически достигли смыкания монослоя, вирусный смыв разбавляли до указанных концентраций в среде, содержащей 2% FBS.

Для каждого разбавления инокулировали 2 лунки планшета с лунками. После инкубации в течение 1 ч при 37°С инокулят аспирировали и инфицирование останавливали добавлением среды, содержащей 1% FBS и 2% гамма-глобулин человека, который обладал функцией ингибирования образования вторичных бляшек.

Инфицированные (инокулированные) культуры инкубировали при 37°С в течение 2 суток и подвергали мониторингу, пока лизис бляшек не становился заметным. В этот момент клетки фиксировали и окрашивали генциановым фиолетовым. Количество бляшек, присутствующих в лунках, подсчитывали под оптическим микроскопом, и количество бляшек умножали на коэффициент разведения с получением титра вируса в единицах бое/мл.

Результаты и обсуждение результатов;

Вироцидная активность тестируемого продукта;

Тестируемый продукт, в количестве 10 или 50 микролитров, подвергали контактированию с HSV-1, имеющим вирусный титр 1·10⁶ бое. Инкубацию проводили в 1 мл среды D-MEM, содержащей 1% FBS; используемое время инкубации составляло (альтернативно) 1 ч и 5 ч. После данного периода инкубации вирус разбавляли до (альтернативно) 1·10³ бое и 1·10² бое, и инокулировали культуры с практически полным смыканием монослоя. Как проиллюстрировано в таблице 1, в клетках, инокулированных вирусом, предварительно обработанных тестируемым продуктом, не развивались лизисные бляшки для обоих периодов времени предварительной обработки и для обоих разведений вируса.

Таблица:

Количество бляшкообразующих единиц (бое) и процентное ингибирование цитолитического образования бляшек, относительно контроля, после предварительной обработки HSV-1 (титр 1·10⁶) продуктом (в количестве 1 микролитр/мл). Значения вычисляли для разведений HSV-1 1·10³ и 1·10² бое.

Титры вируса контролей HSV-1, которые указаны в таблице, вычисляли посредством умножения среднего количества цитолитических бляшек на коэффициент разведения (10³). Как видно из таблицы, после обработки было выявлено 100% снижение образования цитолитических бляшек по сравнению с контролями. Для обоих периодов предварительной обработки и для обоих разведений вируса происходило практически полное снижение присутствующих вирусных частиц. Тестируемый продукт снижал вирусный титр от c. 300000 вирусных частиц, присутствующих в контролях, до вирусного титра менее 1000. Это означает, что при контакте в течение 1 ч, при разведении 10 микролитров на мл (1%), происходила практически полная гибель вирусных частиц.

Заключения

Исследование противовирусной активности продукта демонстрирует, что продукт имеет противовирусную активность при прямом контакте с вирусом HSV-1, даже в условиях крайней степени разведения, в течение времени контакта 1 ч.

Проведенные эксперименты показали, что продукт способен обеспечивать практически полную гибель вирусных частиц в разведении продукта приблизительно 1:100.

1. Внутрикостный имплантат, содержащий биологически совместимые металлические материалы, отличающийся тем, что указанный имплантат содержит покрытие, содержащее нанокристаллический материал, содержащий наночастицы формулы (I):

где АО_х представляет собой TiO₂ или ZrO₂;
Meⁿ⁺ представляет собой ион металла, обладающий антибактериальной активностью,
с n=1 или 2;
L представляет собой бифункциональную органическую молекулу, которая может одновременно связываться с оксидом металла и с ионом металла Meⁿ⁺ и
i представляет собой количество групп L-Meⁿ⁺, связанных с одной наночастицей АО_х.

2. Внутрикостный имплантат по п.1, где указанный ион металла, обладающий антибактериальной активностью, выбран из Ag⁺, Zn⁺⁺ и Cu⁺⁺.

3. Внутрикостный имплантат по п.1 или 2, где TiO₂ находится в форме анатаза.

4. Внутрикостный имплантат по п.1 или 2, где покрытие, содержащее нанокристаллический материал, является прозрачным.

5. Внутрикостный имплантат по п.1 или 2, где i представляет собой количество молекул лиганда L, с которыми может связываться наночастица АО_х, когда указанную наночастицу подвергают контактированию с раствором лиганда L в течение периода между 10 мин и 72 ч.

6. Внутрикостный имплантат по п.1 или 2, где описанные наночастицы имеют размеры частиц менее 40 нм (нанометров).

7. Внутрикостный имплантат по п.1 или 2, где описанные наночастицы имеют размеры частиц менее 30 нм, предпочтительно менее 15 нм.

8. Внутрикостный имплантат по п.1 или 2, где бифункциональная органическая молекула L выбрана из органических молекул, содержащих следующие функциональные группы:
- группа карбоновой кислоты (карбоксигруппа) (-СООН), группа фосфоновой кислоты (фосфонильная группа) (-РО₃Н₂) и группа бороновой кислоты (боронильная группа) (-В(ОН)₂), которые способны обеспечивать адсорбцию (или приводить к ней) на поверхности оксида АО_х; и
- группы >N, -NH₂, -CN, -NCS и -SH, которые способны связываться с ионами металлов, обладающими антибактериальной активностью.

9. Внутрикостный имплантат по п.1 или 2, где бифункциональная органическая молекула L выбрана из:
- азотсодержащих гетероциклических колец, имеющих 6-18 членов (предпочтительно, выбранных из пиридина, дипиридила и терпиридила), замещенных одним или несколькими заместителями, выбранными из:
группы карбоновой кислоты (карбоксигруппы) (-СООН), группы бороновой кислоты (боронильной группы) (-В(ОН)₂), группы фосфоновой кислоты (фосфонильной группы) (-РО₃Н₂), меркаптогруппы (-SH) и гидроксильной группы (-ОН);
- С₆-С₁₈ арильных соединений (предпочтительно выбранных из фенила, нафтила и бифенила), замещенных одним или несколькими заместителями, выбранными из: группы карбоновой кислоты (карбоксигруппы) (-СООН), группы бороновой кислоты (боронильной группы) (-B(OH)₂), группы фосфоновой кислоты (фосфонильной группы) (-РО₃Н₂), меркаптогруппы (-SH) и гидроксильной группы (-ОН);
- С₂-С₁₈ монокарбоновых кислот и дикарбоновых кислот, замещенных одной или несколькими меркаптогруппами (-SH) и/или гидроксильными группами (-ОН).

10. Внутрикостный имплантат по п.9, где бифункциональная органическая молекула L выбрана из:
- пиридина, дипиридила и терпиридила, функционализированных посредством: группы(групп) карбоновой кислоты, группы(групп) бороновой кислоты, или группы(групп) фосфоновой кислоты;
- меркаптоянтарной кислоты, меркаптоундекановой кислоты, меркаптофенола, меркаптоникотиновой кислоты, 5-карбоксипентантиола, меркаптомасляной кислоты и 4-меркаптофенилбороновой кислоты.

11. Внутрикостный имплантат по п.1 или 2, где указанный нанокристаллический материал адсорбирован на поверхности указанного внутрикостного имплантата.

12. Внутрикостный имплантат по п.1 или 2, где между поверхностью внутрикостного имплантата и наночастицами формулы (I) помещен праймер, причем этот праймер предназначен для обеспечения фиксации указанных наночастиц к поверхности имплантата.

13. Внутрикостный имплантат по п.12, где основой указанного праймера является пероксититановая кислота, или его основой являются продукты на основе нанокристаллического титана, причем эти продукты предоставлены коммерческой фирмой Eco Coating Photocatalyst S.r.l. под названиями продуктов "АТ-01", "ATLS-01G" и "PSO 419";
или его основой являются органические продукты, например, такие как сополимер стирол-малеиновый ангидрид или сополимер стирол-акрилат.

14. Внутрикостный имплантат по п.1 или 2, где покрытие, содержащее нанокристаллический материал, содержит катионные поверхностно-активные вещества, обладающие антибактериальной активностью.

15. Внутрикостный имплантат по п.14, где катионные поверхностно-активные вещества способны адсорбироваться на поверхности наночастиц формулы АО_х.

16. Внутрикостный имплантат по п.15, где катионные поверхностно-активные вещества выбраны из: хлорида бензилдодецилдиметиламмония, хлорида бензилгексадецилдиметиламмония и хлорида бензалкония.

17. Внутрикостный имплантат по п.1 или 2, где покрытие, содержащее нанокристаллический материал получают посредством нанесения покрытия погружением или нанесения покрытия распылением, с последующим высушиванием при температуре окружающей среды, и последующим нагреванием до температуры в диапазоне 50-600°С, предпочтительно 200-500°С, в присутствии кислорода.

18. Применение наночастиц формулы (I):

где АО_х представляет собой TiO₂ или ZrO₂;
Meⁿ⁺ представляет собой ион металла, обладающий антибактериальной активностью,
с n=1 или 2;
L представляет собой бифункциональную органическую молекулу, которая может одновременно связываться с оксидом металла и с ионом металла Meⁿ⁺; и
i представляет собой количество групп L-Meⁿ⁺, связанных с одной наночастицей АО_х;
как указано в предшествующих пунктах,
для создания покрытия, имеющего антибактериальные и/или противовирусные свойства, на медицинском устройстве.

19. Применение по п.18, где антибактериальные и/или противовирусные свойства проявляются в отсутствии светового облучения.