Способ переработки кислого гудрона (варианты)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу переработки кислого гудрона. Способ заключается в смешивании гудрона с почвой, добавлении к смеси почвы с гудроном смешанной культуры микроорганизмов, состоящей из штамма Candida digboiensis MTCC 4371 и Candida digboiensis MTCC 4372 вместе с системой питательных веществ. Причем микроорганизмы могут находиться на носителе. Изобретение позволяет быстро дезактивировать кислый углеводородный осадок эффективным и приемлемым для окружающей среды образом. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к разделу биологии, относящемуся к экологии и охране окружающей среды, конкретно к способу удаления гудрона и более конкретно к способу удаления кислого гудрона с использованием микроорганизмов, способных к разложению углеводорода, т.е. к способу биоперереботки при кислом рН.

Уровень техники

В течение последних нескольких десятилетий получение, обработка, хранение, перевозка и утилизация синтетических и природных химических веществ во всем мире привела к внесению значительных количеств опасных материалов в окружающую среду. Случайная утечка продуктов перегонки нефти, промышленных растворителей и других химических субстанций была вызвана, например, разрушением под влиянием атмосферных воздействий, химической коррозией и случайным повреждением трубопроводов, резервуаров для хранения, обрабатывающего оборудования, транспортных средств и т.п. Умышленные действия и неосторожность также вносят вклад в выброс опасных веществ в окружающую среду. Утечка данных материалов привела, в результате, к появлению большого числа загрязненных мест и огромным объемным количествам почвы и почвенных вод, которые были загрязнены опасными веществами. Загрязнение почвы может вызывать обширное повреждение местной экосистемы, накапливаясь в ткани животных и растений и являясь причиной их гибели и/или мутаций у их потомства. Данное загрязнение может также представлять собой серьезную угрозу для здоровья человека и в чрезвычайных случаях может делать загрязненную территорию непригодной для проживания человека. Во многих случаях загрязненные места могут представлять опасность для расположенных рядом объектов собственности, например, в связи с уносом опасных веществ потоком местных почвенных вод, и местные законы часто предписывают восстановление перед продажей или сдачей в аренду объектов собственности, если почва загрязнена опасными веществами.

Для обработки, восстановления или удаления нефтяного осадка использовали различные способы. В основном, данные способы включают постоянное удаление загрязненной почвы в безопасное место для захоронения отходов, сжигание, непрямую термообработку, аэрацию, вентиляцию, барботаж воздухом и биопереработку. Удаление зараженной почвы в места захоронения отходов более не является привлекательной альтернативой в свете высоких затрат на экскавацию (выемку грунта), перевозку и удаление, а также вследствие возможной ответственности за отходы. Сжигание и непрямая термообработка могут осуществляться на месте или вне места нахождения отходов, но в любом случае включают экскавацию, сбор и обработку практически всей загрязненной почвы, а также значительных количеств почвы, находящейся вблизи от загрязненной почвы. Тогда почву нужно либо перевозить к обрабатывающему оборудованию, либо, иначе, обрабатывающее устройство должно быть установлено на месте использования. В любом случае данные способы, как правило, включают огромные транспортные расходы и расходы на обработку и требуют больших количеств энергии на сжигание или перевод загрязняющих веществ в летучую форму. Другие сложные и дорогостоящие технологии, которые были использованы, включают экскавацию и обработку загрязненной почвы с использованием многостадийных отдельных операций для отделения и восстановления почвы от загрязняющих веществ. Преимущество удаления, сжигания, непрямой термообработки и других способов обработки загрязненной почвы, которые включают полную экскавацию загрязненной почвы, состоит в том, что их можно осуществить за относительно короткий период времени. Данные способы особенно привлекательны в тех случаях, когда имеется значительный риск быстрого распространения загрязнения на находящиеся вблизи объекты собственности. Однако в большинстве случаев данные способы чрезмерно дороги.

Старые нефтеперерабатывающие заводы имеют давнюю проблему безопасного удаления отработанного кислого гудрона (остатка от сернокислой очистки нефтепродуктов), который накапливается в течение нескольких десятилетий в результате кислотной обработки парафина и масляной фракции сырой нефти. Однако кислотная обработка масляной фракции нефти и парафина была прекращена, но имеется огромный остаток данного кислого гудрона на нефтеперерабатывающих заводах. Например, на нефтеперерабатывающем заводе Digboi в Индии имеется остаток 20000-50000 КЛ, который хранится в открытых водоемах для отходов. В прошлом был предпринят ряд попыток удалить накопленный отработанный гудрон, но они имели только ограниченный успех. Принятые способы, как правило, не обеспечивают практическую доступную по стоимости технологию переработки кислого гудрона экологически благоприятным и интенсивным образом.

Известно использование микроорганизмов для обезвреживания или разложения углеводородных загрязняющих веществ. Данные способы обработки известны как биовосстановление. Биовосстановление может быть осуществлено в аэробных и анаэробных условиях. Основными требованиями к эффективному биовосстановлению являются: биоразлагаемый органический субстрат, соответствующее и активное микробное сообщество (консорция), биодоступность загрязняющего субстрата для микроорганизмов и создание оптимальных условий для микробного метаболизма. В некоторых случаях биовосстановление требует дополнительной биостимуляции питательными веществами или каким-либо специфическим субстратным аналогом; оно может также потребовать биологического усиления микробного сообщества, если участок не содержит соответствующую автохтонную биоразлагающую популяцию. Биовосстановление представляет собой эффективный по затратам, менее энергоемкий и экологически благоприятный способ удаления гудрона. Однако биоразложение кислого гудрона является трудной задачей, поскольку при низком рН нормальные разлагающие гудрон микроорганизмы неспособны к росту.

Патент США № 3152983 раскрывает микробное удаление нефтяных отходов. Данный способ разработан для крупного промышленного разделения и удаления отходов, начиная с сепаратора для отделения воды от нефти.

Патент США № 3462275 раскрывает способ обработки биоразлагаемого материала органических отходов с использованием культуры термофильного аэробного микроорганизма, способной разлагать целлюлозу и продуцировать клеточный белковый материал.

Патент США № 3769164 описывает способ микробного разложения разлитой нефти путем ее обработки несущими специфические мутации видами микроорганизмов Candida parapsilisis sp.(ATCC 20246), Aspergillus sp.(АТСС 20253), Nocardia corallina (ATCC 21504) и т.п.

Патент США № 3838198 направлен на кондиционирование загрузки необработанных отходов для разложения термофильными аэробными микроорганизмами. Способ предназначен для обработки отходов животной природы.

Патент США № 3871956 характеризует способ очищения случайных разливов нефти на воде или в почве. В способе, соответствующем данному патенту, не используют контроль температуры или кислорода, и он не является самоподдерживающимся способом.

Патент США № 3871957 описывает способы применения ряда микроорганизмов для быстрого рассредоточения разливов нефти. Используемые при этом микроорганизмы включают широкий ряд бактерий, дрожжей, актиномицетов и филаментозных грибов. В данной ссылке описано также применение ряда глин, таких как каолин и цеолиты, в качестве носителей для данных микроорганизмов.

Патент США № 4415662 раскрывает применение определенного гриба для разложения сырой нефти и нефтепродуктов. Способ заключается в обработке сырой нефти и нефтепродуктов в окружающей среде эффективным количеством гриба Actinomucor elegans (Ediam)Benj. and Hasselt., штамм № TC-405, соединением, являющимся его ферментативно активным началом, содержащим его бульоном или средой-носителем, содержащей гриб, либо соединение, являющееся его ферментативно активным началом.

Патент США № 4668388 раскрывает высокоскоростной реактор для обработки активного ила, в котором реакцию проводят в камере.

Патент США № 4913586 описывает способ и устройство для безопасной обработки и обеззараживания загрязненной почвы, сильно насыщенной загрязняющими веществами, такими как бензин и нефтяные углеводороды. Загрязненную почву обрабатывают добавкой, состоящей из низкосортной гуминовой кислоты и извести, которую смешивают с почвой в примерном соотношении девять частей почвы на одну часть добавки. Обработка включает разбивание частиц почвы до состояния тонкого ила или песка, смешивание добавки с почвой в опрокидывающем устройстве и, наконец, выгрузку полностью покрытых добавкой и инкапсулированных частиц токсичной почвы в предварительно вырытый котлован.

Патент США № 5035537 раскрывает способ обработки почвы, пористого камня и аналогичного материала, загрязненного бензином, углеводородом и летучими органическими соединениями, и включает стадии сбора загрязненной почвы, ее равномерного распределения на непроницаемой горизонтальной поверхности при толщине (10-15 см), ее обработки эмульгатором и создания возможности для эмульгатора просачиваться через почву и переводить в летучую форму углеводородные и органические соединения в почве.

Патент США № 5039415 относится к способу обработки почвы, загрязненной углеводородами, путем экскавации почвы, формирования из почвы потока сыпучих частиц, образования водной жидкой смеси воды и раствора, содержащего микроорганизмы, который реагирует с углеводородом с образованием CO₂ и воды, диспергирования жидкой смеси в потоке частиц почвы для увлажнения частиц и создания возможности для субстанции вступать в реакцию с увлажненными частицами почвы с образованием при этом CO₂ и воды.

Патент США № 5055196 раскрывает способ обработки почвы или ила для удаления загрязняющих веществ, контактирующих с почвой или илом. Более конкретно данный способ относится к процессу, в котором неорганические загрязняющие вещества, такие как металл или соли металла, либо органические загрязняющие вещества, такие как РСВ (полихлорбифенилы), удаляют из смоченной водой почвы или ила.

Патент Соединенных Штатов Америки № 5059252 раскрывает способ биовосстановления почв, загрязненных опасными бензиновыми отходами. Данный способ усиления биовосстановления включает стадию внесения катионной ионообменной смолы в загрязненную почву в количестве, достаточном для стимуляции роста организмов, способных разлагать опасные отходы.

Патент Соединенных Штатов Америки № 5415777 раскрывает способ обеззараживания почвы, загрязненной бензиновыми продуктами, в области загрязнения, который осуществляют путем химического разложения, ферментативного действия и биологического микробного разложения. Существенными продуктами данного разложения углеводородного материала являются вода, соли натрия, соли аммония, диоксид углерода, свободные аминокислоты и тепло.

Патент Соединенных Штатов Америки № 5427944 описывает способ биоразложения полициклических ароматических углеводородных загрязняющих веществ с использованием смешанной бактериальной культуры Achromobacter sp. и Mycobacterium sp. и питательных веществ. Смешанную бактериальную культуру используют для биовосстановления in situ или ex situ загрязненной почвы либо в любом из различных обычных биореакторов для обработки загрязненных жидкостей, таких как сточные воды из свалок, почвенные воды или промышленные сточные воды.

Патент США № 5453133 относится к способу удаления загрязняющих веществ, таких как углеводороды, из почвы. Способ заключается в контактировании загрязненной почвы с подходящим растворителем для загрязняющего вещества в присутствии поглощающей жидкости, которая не смешивается с растворителем при перемешивании. Количество поглощающей жидкости и степень перемешивания уравновешивают с целью контроля размера частиц образующихся при этом агломератов, в основном, загрязняющего вещества с растворителем и свободной почвы.

Патент США № 5494580 относится к способу обеззараживания окружающей среды, загрязненной углеводородом, с использованием ряда бактериальных композиций.

Патент США № 5609667 раскрывает способ обработки почв, загрязненных углеводородами. Порошковая целлюлоза, содержащая, в основном, 3-8% сульфата аммония, образует биологически активную среду, которая предпочтительно адсорбирует углеводороды в присутствии воды и поддерживает рост природных углеводород-восстанавливающих бактериальных форм, приводя, в результате, к быстрому разложению адсорбированных углеводородов с образованием воды, диоксида углерода и других безопасных отходов.

Патент США № 5624843 раскрывает способ усовершенствования биовосстановления воды, загрязненной углеводородами, с помощью автохтонных микроорганизмов, включающий добавление в воду, загрязненную углеводородами, раствора добавки, выбранной из группы, состоящей из (а) смеси эфира сорбита и С₇-С₂₂ монокарбоновой кислоты и полиоксиалкиленового аддукта моноэфира сорбита и С₇-С₂₂монокарбоновой кислоты, содержащего от 6 до 50 полиоксиалкиленовых звеньев, (b) алкилгликозида, в котором алкильная группа содержит от приблизительно 8 до 18 атомов углерода, и гликозид представляет собой моно- или дигликозид, и (с) смеси (а) и (b), причем раствор добавляют в количествах, достаточных для стимуляции роста автохтонных микроорганизмов.

Патент США № 5807724 описывает способ и средства, обеспечивающие возможность восстановления и удаления разлитых масел или жиров (липидов) из земли, движущихся или стоячих жидкостей, взвесей или полутвердых подвергшихся обработке изделий, из пищевых субстанций с использованием трех определенных видов дрожжей (Candida albicans, Candida guilliermondii и Candida yarrowia), которые обладают способностью продуцировать фермент липазу, который может расщеплять вещества на углеводородной основе, например сырую нефть и другие продукты перегонки нефти как на парафиновой основе, так и имеющие другие специфические химические основы.

Патент США № 5811290 описывает способ стимуляции биовосстановления загрязненных углеводородами почв, воды и/или гудрона при использовании клатрата мочевина-поверхностно-активное вещество.

Патент США № 5834540 относится к композиции и способу восстановления загрязненных материалов, в особенности к восстановлению почв. Ссылка касается композиций и способов, которые вызывают разложение нежелательных загрязняющих веществ, таких как углеводородные отходы. Ссылка относится к последующему применению излучения, предпочтительного микроволнового излучения, для того, чтобы вызвать разложение загрязняющих веществ. Ссылка в равной степени эффективна в плане обработки материалов, которые подверглись воздействию вредных или инфекционных биологических загрязняющих агентов.

Патент США № 6057147 раскрывает устройство и способ стимуляции биопереработки углеводородов, удаленных из загрязненного объекта. Устройство и способ способствуют непрерывной микробной биопереработке углеводородных загрязняющих веществ при саморазмножении в процессе очищения раствора и фильтрации осадка без образования опасных для окружающей среды следовых количеств отходов. Очищающий раствор содержит микроорганизмы родов Achromobacter, Actinobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Nocardia, Flavobacterium, Pseudomonas и их смеси.

Патент США № 6503746 относится к выделенным штаммам Paenibacillus validus, которые разлагают полиароматические углеводороды, способу выделения штаммов, соответствующих изобретению, и способу применения штаммов, соответствующих изобретению, для биовосстановления.

Патентная заявка США № 20020187545 раскрывает способ биовосстановления загрязненных углеводородами отходов с использованием материала, полученного из кукурузы. Осуществляют контактирование углеводородного загрязняющего вещества с материалом, полученным из кукурузы, в присутствии питательных веществ и бактерий, эффективных в плане биовосстановления.

Патентная заявка США 20030100098 раскрывает применение бактериальных штаммов для биовосстановления почв и почвенных вод, загрязненных полиароматическими углеводородами.

Раскрытие изобретения

Объектом настоящего изобретения является разработка способа, который будет быстро дезактивировать кислый углеводородный осадок эффективным и приемлемым для окружающей среды образом.

Соответственно объектом настоящего изобретения является представление способа биопереработки кислого гудрона с помощью кислотоустойчивых ассимилирующих углеводороды микробов.

Объект осуществляют посредством настоящего изобретения, которое описывает способ и средства, делающие возможными переработку и удаление кислого жирного осадка, разлитых масел и взвесей.

Способ, соответствующий настоящему изобретению, относится к выделению двух определенных видов дрожжей, которые обладают способностью разлагать углеводородные субстанции, например сырую нефть и другие продукты перегонки нефти как на основе парафинов, так и обладающие другими специфическими химическими основами при кислом, а также при нейтральном рН.

Данные изоляты были использованы для разработки способа переработки кислого гудрона.

Настоящее изобретение относится к способу переработки кислого гудрона, который заключается в смешивании гудрона с почвой, добавлении микробной консорции, способной к разложению углеводорода, к смеси гудрона с почвой, где микроорганизм поддерживают на носителе, и внесение питательных веществ для микроорганизма в смесь почвы с гудроном.

Осуществление изобретения

Ранее было предпринято несколько попыток удалить накопившийся отработанный гудрон, но они имели только ограниченный успех. В основном, данные способы включают безопасное захоронение отходов, сжигание, непрямую термообработку, аэрацию, вентиляцию, барботаж воздухом и биопереработку. Гудрон, находящийся в резервуарах для хранения, был источником загрязнения грунтовых вод. Принятые способы, как правило, не обеспечивают практическую доступную по стоимости технологию переработки кислого гудрона экологически благоприятным и интенсивным образом. Одним из способов была нейтрализация известью с последующей сушкой, а затем использование материала в печах для обжига кирпича в качестве топлива. Данный способ также не был удачным вследствие проблем, связанных с горением и выделяющимися продуктами.

Однако, как отмечено, биопереработка кислого гудрона является трудной задачей, поскольку нормальные гудрон-разлагающие микроорганизмы неспособны к росту при низком рН. Однако специализированные гудрон-разлагающие микроорганизмы, которые специально адаптированы для выживания в кислой среде, могут разлагать гудрон. Данные микробы получены из автохтонной микробной популяции кислого гудрона с помощью методики селективного обогащения.

Главными требованиями эффективной биопереработки являются биоразлагаемый органический субстрат, соответствующее и активное микробное сообщество (консорция), биодоступность загрязняющего субстрата для микроорганизмов и создание оптимальных условий для микробного роста. В ряде случаев для биопереработки требуется дополнительная биостимуляция питательными веществами, поверхностно-активными веществами или некоторыми специфическими субстратными аналогами, для нее может также потребоваться биоусиление микробного сообщества, если на месте отсутствует подходящая автохтонная биоразлагающая популяция. При биоусилении природные, но отселектированные специфические микробы культивируют в лабораторных условиях, а затем вносят в полевые условия.

Способ разработки технологий биопереработки включает стадии, а именно: выделения и характеризации природных микроорганизмов с биоперерабатывающей способностью с помощью методики селективного обогащения, оптимизации широкомасштабного культивирования данных микробов и их адсорбции на подходящем носителе. Следующей стадией является оценка их способности разлагать нефтяной осадок и раздельно его различные фракции в жидкой среде, а также в экспериментах с почвой в лабораторном масштабе и оптимизация условий, таких как питательные вещества, условия влажности, аэрация для усиления биоразложения в экспериментальных условиях. Затем способ тестируют и оптимизируют в полевых условиях.

Углеводород-разлагающий микроорганизм, соответствующий настоящему изобретению, выделен с помощью методики селективного обогащения культуры из автохтонной микробной популяции кислого гудрона при использовании кислого гудрона в качестве источника углерода и инокулюма.

Методика обогащения культуры базируется на основном принципе селекции и обеспечивает рост организма, представляющего интерес, и является, насколько это возможно, неблагоприятной для конкурирующих организмов. В данной методике параметры роста, включая питательную среду для культивирования, условия контролируют, чтобы они были благоприятными для развития специфического организма или группы организмов.

Первый цикл обогащения проводят путем добавления 5 г почвы к 100 мл среды и инкубируют колбу при 30°С в условиях встряхивания. Цикл обогащения повторяют четыре раза, используя вышеупомянутую минимальную солевую среду и кислый гудрон в качестве единственного источника углерода.

Подходящая питательная среда для использования в процессе обогащения должна как минимум включать источник азота, такой как соль аммония, и источник фосфора, такой как соединение фосфата щелочного металла. Желательно, чтобы система питательных веществ, используемая во время процесса акклимации смешанной бактериальной культуры к углеводородным соединениям, включала источник магния, такой как соль магния, и она может необязательно включать другие питательные вещества, такие как соли натрия, кальция и железа. Подходящая система питательных веществ, которая может быть эффективно использована в процессе обогащения, включает соль аммония и соединение фосфата вместе с минимальными количествами других обычных питательных веществ, где молярное соотношение элементарного азота к фосфору составляет от приблизительно 5:1 до приблизительно 15:1 и более предпочтительно от приблизительно 8:1 до приблизительно 12:1. Особенно предпочтительная система питательных веществ для применения в процессе обогащения включает хлорид аммония, от приблизительно 5 до приблизительно 20 частей по массе гидратированного сульфата магния (MgSO₄·7H₂O) на 100 частей по массе хлорида аммония, от приблизительно 5 до приблизительно 20 частей по массе хлорида натрия на 100 частей по массе хлорида аммония и от приблизительно 15 до приблизительно 50, и более предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 30 частей по массе дигидрофосфата калия (КН₂РО₄) на 100 частей по массе хлорида аммония и следовые количества витаминов и микроэлементов. Поддерживают кислый рН среды предпочтительно 3. Вышеуказанные питательные вещества растворяют в количестве воды, подходящем для того, чтобы растворить питательные вещества, и смешивают с соответствующими количествами подходящего исходного основного источника питания и смешанной бактериальной культурой. Подходящий исходный основной источник питания представляет собой, в основном, общий кислый гудрон или его общие нефтяные углеводороды, или его насыщенные, ароматические асфальтеновые фракции. В частности, рекомендовано, чтобы процесс акклимации осуществлялся путем добавления к смешанной микробной культуре образцов почвы, которая подлежит восстановлению.

Выделение чистых желательных изолятов осуществляют посевом штрихом на минимальную солевую агаризованную среду, включающую 0,05-5% кислого гудрона в качестве источника углерода, и поддерживают рН среды 3,0. Данные чашки инкубируют при 30°С. В конце цикла обогащения из осадка кислого гудрона получают восемь микробных штаммов.

Два изолята, разлагающие кислый гудрон, демонстрирующие лучший рост и разлагающую активность, идентифицированы как Candida digboigensis (dig.boi.en'sis) L. Номенклатура Fem. Adj. digboigenesis относится к населенному пункту Дигбой в штате Ассам в Индии. Данные культуры депонированы в МТСС (Microbial Type Culture Collection and Gene Bank (Коллекция типовых культур и Банк генов микрорганизмов)) в Институте микробной технологии (Institute of Microbial Technology), Чандигарх, под номером МТСС 4371 и 4372, соответственно. Типовой штамм С.digboigenesis представляет собой штамм МТСС 4371, и он также депонирован в коллекции Отдела дрожжей Центрального бюро плесневых культур (Central bureau voor Schimmelcultures), Утрехт, Нидерланды. Два микроорганизма смешивают, чтобы получить микробную смесь для биопереработки, и используют в настоящем изобретении.

Изоляты оценивают раздельно и в комбинации на их активность разложения кислого гудрона и его фракций при кислом рН. Для этого индивидуальным изолятом или смесью инокулируют 5 мл минеральной солевой среды. Через 48 часов роста данные 5 мл культуры переносят в 20 мл свежей среды. Через 48 часов роста данные 20 мл культуры переносят в 80 мл минимальной солевой среды, которая содержит кислый гудрон или его толуоловую или гексановую растворимую фракцию (1%) в качестве источника углерода. Все эксперименты проводят при рН 3 и температуре 30°С в условиях встряхивания. После инкубирования в течение 10 дней измеряют остаточный субстрат. Кроме того, исследуют также способность чистых штаммов расти раздельно на различных фракциях кислого гудрона при рН 3.

После успешного выделения и тестирования эффективности в лабораторных масштабах микробную консорцию/смесь выращивают в биореакторе. Инокулюм для биореактора смешанной культуры, соответствующей настоящему изобретению, готовят путем изначального выращивания индивидуального микроорганизма на отдельных чашках с агаром обычным образом. После достижения достаточного роста индивидуального микроорганизма оба микроорганизма можно перенести на чашку со свежим агаром для одновременного роста обоих микроорганизмов вместе в смешанной культуре. После того, как смешанная культура продемонстрирует успешный рост, ее можно перенести в подходящую емкость, содержащую питательный раствор. Емкость предпочтительно должна содержать устройства для контроля температуры, рН, взбалтывания, аэрации и перемешивания. Особенно предпочтительная система питательных веществ для роста включает (г/л) KH₂PO₄ 0,5-1,0, К₂НРО₄ 0,5-1,0, MgSO₄ 0,5-1,0, (NH₄)₂SO₄ 0,25-0,75, KNO₃ 0,25-0,75, от 5 мл до 20 мл раствора микроэлементов и 0,5-5 мл раствора поливитаминов, ферментируемые сахара в качестве источника углерода 1-5%.

Состав раствора микроэлементов (г/л) включает нитрилтрехуксусную кислоту 1-1,5, FeSO₄·7H₂O 0,05-0,15, MnCl₂·4H₂O 0,005-0,015, CoCl₂·6H₂O 0,15-0,2, CaCl₂·2H₂O 0,05-0,15, ZnCl₂ 0,05-0,15, CuCl₂·H₂O 0,01-0,03, Н₃ВО₃ 0,01-0,02, Na₂MoO₄ 0,01-0,02, Na₂SeO₃ 0,015-0,02, NiSO₄ 0,01-0,03, SnCl₂ 0,01-0,03. Состав раствора поливитаминов (г/л) включает биотин 0,001-0,003, фолиевую кислоту 0,001-0,003, пиридоксин HCl 0,05-0,02, тиамин HCl 0,002-0,008, рибофлавин 0,001-0,01, никотиновую кислоту 0,002-0,01, Са-пентотонат 0,002-0,01, липоевую кислоту 0,0025-0,0075, витамин В₁₂ 0,0005-0,0015, ПАБК (парааминобензойную кислоту) 0,0025-0,0075.

Надлежащим образом выращенную смешанную микробную культуру, соответствующую изобретению, адсорбируют на подходящем носителе. В изобретении микроорганизмы, способные разлагать углеводородные загрязняющие вещества, диспергируют в почве, когда они поддерживаются на носителе, т.е. фиксированы в нем.

К качестве носителя для поддерживания микроорганизмов в данном случае может быть использован любой известный материал, пока он может быть применен в загрязненной почве вместе с микроорганизмами, которые он поддерживает. С точки зрения эффективной поддержки полезных микроорганизмов материалы носителя, которые могут прочно адсорбировать микроорганизмы на своей поверхности, полезны в плане транспорта и распространения конечного агента для биопереработки.

Носитель выполнен из материалов, которые могут удерживать на себе микроорганизмы относительно мягко, и тем самым обеспечивает легкое высвобождение микроорганизмов, размноженных таким образом. Носитель дешев и может служит в качестве источника питания для микроорганизмов, используемых таким образом, в особенности источником азота, который может постепенно высвобождаться, обеспечивая преимущество.

Кроме того, образование носителя из биоразлагаемого материала имеет преимущество в том, что при этом можно избежать любых проблем, возникающих в связи с вторичным загрязнением остаточным носителем или с эффектом используемых микроорганизмов на почвенную экологическую систему. Предпочтительно, когда в качестве данного биоразлагаемого носителя используют материал, который постепенно разлагается и исчезает после восстановления почвы нанесенными на него микроорганизмами. При использовании такого носителя нанесенные на него микроорганизмы, которые выходят в почву после исчезания носителя, оказываются тогда в условиях окружающей среды, которые затрудняют рост, таких как конкуренция с преобладающими нативными микроорганизмами в почве и хищничество простейших животных. Затем микроорганизмы вытесняются из почвы и их число постепенно уменьшаются до вымирания. В результате, экологическая система в почве может быть восстановлена до исходного состояния.

Предпочтительные примеры материала биоразлагаемого носителя, используемого в данном контексте, включают листовую обвертку кукурузного початка, отходы сахарного производства или любые сельскохозяйственные отходы.

Содержание воды в носителе составляет от 1% до 99% по массе, предпочтительно от 5% до 90% по массе, более предпочтительно от 10% до 85% по массе. При слишком низком содержании воды в носителе микроорганизмы с трудом выживают. Напротив, когда содержание воды в носителе слишком высокое, полученный в результате носитель демонстрирует ухудшенную физическую прочность, что затрудняет работу с ним.

Микробную смесь, адсорбированную на носителе, тестируют на эффективность в жидкой среде, а также в экспериментах с почвой в лабораторных масштабах. После успешной аттестации на лабораторном уровне способ оптимизируют в полевых условиях. Параметрами полевых исследований являются объем почвенного слоя, дозирование и перемешивание гудрона, дозирование микробной смеси, состав и дозирование питательных веществ, а также дозирование и обработка почвы и содержание влаги. Участок земли замащивают кирпичом и цементируют, и на дно кладут непроницаемый пластмассовый лист. Данную площадь отделяют цементированным ограждением предпочтительно высотой 45 см. В данном углублении готовят однородный слой почвы предпочтительно в 15 см.

На участке равномерно распределяют около 5-40%, предпочтительно 10% (мас./мас.) кислого гудрона и тщательно перемешивают со слоем почвы.

После перемешивания слой инокулируют микробными смесями в количестве приблизительно 0,1-5% мас./мас. в пересчете на концентрацию гудрона. Количество инокулюма предпочтительно составляет 0,2%.

Питательные вещества также вносят на уровне от 10 мг до 100 мг/100 кг гудрона после получения их 5-25% раствора в воде.

В качестве питательных веществ предпочтительно используют материалы, содержащие углерод, азот и фосфор. Можно использовать раствор для культивирования, пригодный для роста микроорганизмов. В качестве данного раствора для культивирования широко используют материал, содержащий мясной сок, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, бактопептон, глюкозу, неорганические соли, минералы и т.п.в смеси в подходящем соотношении. Данные компоненты могут быть смешаны в подходящем соотношении в зависимости от вида микроорганизмов. В качестве питательных веществ для применения в изобретении могут быть использованы любые питательные вещества, содержащие подходящие органические и неорганические питательные вещества, кроме вышеупомянутого раствора для культивирования. Предпочтительным питательным веществом является смесь дрожжевого экстракта и нитрата калия в соотношении 1:1.

Участок снова перепахивают, чтобы перемешать содержимое, т.е. кислый гудрон и микробную смесь вместе с питательными веществами, на глубину 7-10 см. Перепахивание и полив участка осуществляют для усиления роста внесенных микробов. Содержание влаги в смеси почвы и гудрона более предпочтительно должно составлять от 30% до 80% способности смеси почвы с гудроном удерживать воду. При слишком низком содержании воды появляются трудности в плане выживаемости микроорганизмов. Напротив, при слишком высоком содержании воды прекращается аэрация.

Важный аспект восстановительной обработки состоит в механическом перемешивании и перепахивании смеси почвы с гудроном в начале обработки и во время обработки. Это способствует аэрации, которая, главным образом, требуется микроорганизму, соответствующему настоящему изобретению, для роста и выживания. Предпочтительно, чтобы перепахивание осуществляли с интервалом 15 дней и предпочтительно на глубину до пластмассового листа, положенного на дно. Имеется несколько преимуществ механического перемешивания для того, чтобы способствовать образованию смеси. Перепахивание смеси создает улучшенный контакт между загрязняющими органическими соединениями и микроорганизмами, который способствует повышенной скорости реакции и увеличению вероятности того, что реакции разложения будут протекать до конца. Во-вторых, тщательное смешивание, осуществляемое путем механического перемешивания, помогает контролировать и затем рассеивать тепло, образующееся при микробном росте.

Необходимо, чтобы температура, при которой происходит восстановление почвы, подходила для действия микроорганизмов, т.е. составляла от 3°С до 50°С, предпочтительно от 10°С до 45°С, более предпочтительно от 18°С до 40°С. Для того чтобы поддерживать микроорганизмы в данном температурном интервале, можно производить нагревание, такое как распыление или впрыскивание горячей воды, в зависимости от ситуации. В холодных районах проводник тепла можно поместитить в почву, чтобы тепло от источника тепла можно было перенести в почву. Альтернативно проводник тепла, помещенный в почву, может быть подсоединен к источнику электроэнергии для того, чтобы нагревать почву. В качестве такого проводника тепла может быть использован любой материал, который может проводить тепло, такой как металл и керамика.

Следовательно, настоящее изобретение представляет безопасные, эффективные и недорогостоящие средства для удаления кислого нефтяного гудрона из окружающей среды.

Для дальнейшей иллюстрации настоящего изобретения делают ссылку на следующие примеры.

Пример 1

Выделение и характеризация микроорганизма, разлагающего кислый гудрон

Питательная среда (среда на основе минеральных солей, MSM), используемая для процесса обогащения, включает 1,0% КН₂РО₄, 1,0% K₂HPO₄, 0,5% MgSO₄, 0,75% NH₄Cl, 2,0% NaCl₂ 0,2% (об./об.) раствора микроэлементов и 0,01% (об./об.) раствора витаминов. Микроэлементы содержат 0,15% нитрилтрехуксусной кислоты, 0,001% FeSO₄·7H₂O, 0,005% MnCl₂·4H₂O, 0,01% CaCl₂·2H₂O, 0,05%-0,05% ZnCl₂, 0,01% CuCl₂·Н₂О. В состав поливитаминов входит 0,01% биотина, 0,03% фолиевой кислоты, 0,02% тиамина HCl, 0,01% рибофлавина, 0,02% никотиновой кислоты и 0,005% витамина В12. Вышеуказанные питательные вещества растворяют в количестве воды, подходящем для растворения питательных веществ. В данной среде 5% кислого гудрона используют в качестве инокулюма и полного источника углерода. Поддерживают кислый рН среды, предпочтительно 3. Первый цикл обогащения осуществляют путем добавления 5 г почвы в 100 мл среды и инкубируют колбу при 30°С при встряхивании. Культуры мониторируют на присутствие микроорганизмов посредством окрашивания по Граму и микроскопирования и субкультивируют в свежей среде, когда определяют рост. После получения 3-4 субкультур бактерии высевают на чашки с агаризованной средой MSM, содержащие тот же субстрат, что при обогащении.

Смешанную культуру, полученную путем обогащения, оценивают на способность разлагать кислый гудрон. Для этого смешанной культурой инокулируют 5 мл среды MSM. Через 48 часов роста данные 5 мл культуры переносят в 20 мл среды. Через 48 часов роста 20 мл культуры переносят в 80 мл минимальной солевой среды, которая содержит толуоловый и гексановый экстракт кислого гудрона (1%) в качестве источника углерода. Все эксперименты проводят при рН 3. После инкубирования в течение 10 дней измеряют остаточный субстрат. Чистые желательные изоляты из смешанной культуры выделяют посевом штрихом на минимальной солевой агаризованной среде (MSM), содержащей 0,05-5% кислого гудрона в качестве источника углерода, и поддерживают рН среды 3,0. Данные чашки инкубируют при 30°С. В конце цикла обогащения из массы кислого гудрона получают восемь микробных штаммов.

Кроме того, исследуют также способность чистых штаммов расти раздельно на различных фракциях кислого гудрона при рН 3. Два разлагающих кислый гудрон изолята, демонстрирующих самый высокий уровень роста и разложения, идентифицируют с помощью МТСС (Коллекция типовых культур и Банк генов микроорганизмов (Microbial Type Culture Collection and Gene Bank)) в Институте микробной технологии (Institute of Microbial Technology), Чандигарх. Их идентифицируют как Candida digboigensis (dig,boi.en'sis) L. Номенклатура Fern. Adj. digboigenesis относится к населенному пункту Дигбой в штате Ассам в Индии. Данные культуры депонированы в МТСС под номером МТСС 4371 и 4372, соответственно. Типовой штамм С.digboigenesis представляет собой штамм МТСС 4371, и он депонирован также в коллекции Отдела дрожжей Центрального бюро плесневых культур (Central bureau voor Schimmelcultures), Утрехт, Нидерланды.

Пример 2

Крупномасштабное культивирование и смешивание с носителем

Инокулюм смешанной культуры, соответствующей настоящему изобретению, готовят путем первоначального выращивания индивидуального микроорганизма на отдельных чашках с агаризованной средой Luria принятым образом. После достижения достаточного роста индивидуального микроорганизма оба микроорганизма переносят на чашку со свежей агаризованной средой для одновременного роста обоих организмов вместе в смешанной культуре. После проявления успешного роста смешанной культуры ее переносят в подходящую емкость, содержащую питательный раствор. Предпочтительно, чтобы емкость имела устройства для контроля температуры, рН, взбалтывания, аэрации и перемешивания. Поддерживают температуру 30°С, рН 3, скорость перемешивания 200 об./мин и аэрацию 5 л/мин. Используемая питательная среда для роста включает (г/л) КН₂РО₄ 0,5-1,0, K₂HPO₄ 0,5-1,0, MgSO₄ 0,5-1,0, (NH₄)₂SO₄ 0,25-0,75, KNO₃ 0,25-0,75, микроэлементы от 5 мл до 20 мл раствора и 0,5-5 мл раствора поливитаминов, 10% сахарозы в качестве источника углерода. В состав раствора микроэлементов (г/л) входит нитрилтрехуксусная кислота 1-1,5, FeSO₄·7H₂O 0,05-0,15, MnCl₂·4H₂O 0,005-0,015, CoCl₂·6H₂O 0,15-0,2, CaCl₂·2H₂O 0,05-0.15, ZnCl₂ 0,05-0,15, CuCl₂·H₂O 0,01-0,03, Н₃BО₃ 0,01-0,02, Na₂MoO₄ 0,01-0,02, Na₂SeO₃ 0,015-0,02, NiSO₄ 0,01-0,03, SnCl₂ 0,01-0,03. В состав раствора поливитаминов входит (г/л) биотин 0,001-0,003, фолиевая кислота 0,001-0,003, пиридоксин HCl 0,05-0,02, тиамин HCl 0,002-0,008, рибофлавин 0,001-0,01, никотиновая кислота 0,002-0,01, пентотеонат Са 0,002-0,01, липоевая кислота 0,0025-0,0075, витамин В12 0,0005-0,0015, ПАБК (пара-аминобезойная кислота) 0,0025-0,0075.

Надлежащим образом выращенную смешанную бактериальную культуру, соответствующую изобретению, адсорбируют на предварительно простерилизованном УФ (ультрафиолетом) субстрате из кукурузного материала в соотношении 1:6 (об./мас.). Данный материал упаковывают в простерилизованные УФ пластиковые мешки, оставляя 80% объема для воздуха, и запечатывают.

Пример 3

Биоразложение в жидких средах

Среды, используемые для биоразложения, состоят из MSM с добавлением 0,25% дрожжевого экстракта. Серии опытов для определения биоразложения гудрона относительно времени инкубирования проводят в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды и 5 г гудрона. Колбы инокулируют 3 г микробной смеси, адсорбированной на материале носителя, вышеуказанные колбы инкубируют при 30°С при 220 об./мин.

Остаточное содержание общих нефтяных углеводородов (ТРН) определяют эстракцией смесью 1:1 гексана и толуола. Слой растворителя отделяют в делительной воронке и переносят в предварительно взвешенный флакон. Растворитель выпаривают в вытяжном шкафу и остаточную нефть взвешивают для того, чтобы определить общее содержание нефтяных углеводородов.

Получают следующие результаты:

Таблица 1
Биоразложение кислого гудрона в почве в жидкой среде
Время инкубирования (дни)	Разложение ТРН (%)
7	22
14	41
21	63
28	78
56	92

Показано, что за период 56 дней происходит разложение 92% ТРН.

Пример 4

Разложение гудрона в почве

Размечают участок площадью 200 м² и замащивают цементированным кирпичом и на дно поверх кирпича кладут непроницаемый пластмассовый лист. Данную площадь отделяют цементированным ограждением предпочтительно высотой 45 см. В данном углублении готовят однородный слой почвы предпочтительно толщиной 15 см. На участке равномерно распределяют около 5 МТ кислого гудрона. Его тщательно перемешивают со слоем почвы.

После перемешивания слой инокулируют 80 кг микробных смесей вместе с 3 кг питательных веществ (KNO₃ и дрожжевой экстракт в соотношении 1:1 (мас./мас.)), растворенных в 100 л водопроводной воды. Участок снова вспахивают, чтобы перемешать содержимое. Механическое вспахивание проводят каждый 15 дней. Осуществляют полив с целью поддержания соответствующего уровня влажности.

Остаточное содержание общих нефтяных углеводородов (ТРН) определяют следующим образом: В заданные интервалы времени 10 г репрезентативной смеси почвы с гудроном нагревают с обратным холодильником с 50 мл гексана. Затем остаточный материал нагревают с обратным холодильником с 50 мл толуола. Слои растворителя разделяют в делительной воронке и объединяют, и переносят в предварительно взвешенный флакон. Растворитель выпаривают в вытяжном шкафу и остаточную нефть взвешивают для того, чтобы определить общее содержание нефтяных углеводородов.

Получены следующие результаты:

Таблица 2
Биоразложение кислого гудрона в почве
Дни	Разложение ТРН (%)
30	23
60	36
90	52
120	76
150	91

Для определения рН образцов 25 г репрезентативного и гомогенизированного образца смеси гудрона с почвой помещают в лабораторный стакан, содержащий 25 мл ультрачистой воды, и дают перемешаться в ротационном шейкере при скорости 180 об./мин в течение четырех часов. Содержимому дают осесть и отфильтровывают. рН супернатанта измеряют с помощью рН-метра в нулевые дни, а затем каждые 30 дней биопереработки.

Получают следующие результаты:

Таблица 3
Профиль рН почвы, смешанной с кислым гудроном после обработки
Дни	РН
30	2,9
60	3,6
Дни	РН
90	4,3
120	5,2
150	5,7

1. Способ переработки кислого гудрона, отличающийся тем, что гудрон смешивают с почвой, к полученной смеси почвы с гудроном добавляют на носителе, обеспечивающим питание и равномерное распределение микроорганизмов в почве, смешанную культуру микроорганизмов, состоящую из штамма Candida digboiensis MTCC 4371 и Candida digboiensis MTCC 4372, способных разлагать углеводороды, и систему питательных веществ для указанных микроорганизмов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные микроорганизмы обладают способностью к разложению ароматической, алифатической, нафтеновой и другой фракции гудрона при кислом значении рН.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что носитель является биоразлагаемым.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что носитель обеспечивает возможность удерживания и высвобождения размноженных таким образом микроорганизмов.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что носитель представляет собой природный материал, например листовую обвертку кукурузного початка.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что содержание воды в носителе составляет от 10 до 88% по массе.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что система питательных веществ для роста микоорганизмов содержит соединения, которые могут быть ими использованы в качестве источников азота и фосфора.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что система питательных веществ дополнительно включает источник магния.

9. Способ по п.7, отличающийся тем, что система питательных веществ необязательно включает соли натрия, кальция и железа.

10. Способ по п.7, отличающийся тем, что источник азота представляет собой соли аммония.

11. Способ по п.7, отличающийся тем, что источник фосфора представляет собой соединения фосфата щелочного металла.

12. Способ по п.7, отличающийся тем, что молярное соотношение элементного азота к фосфору составляет 5:1-15:1.

13. Способ по п.7, отличающийся тем, что молярное соотношение элементного азота к фосфору составляет 8:1-12:1.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что система питательных веществ имеет следующий состав: гидратированный сульфат магния (MgSO₄·7H₂O) от приблизительно 5 до приблизительно 20 мас.ч.; хлорид натрия от приблизительно 5 до приблизительно 20 мас.ч.; и дигидрофосфат калия (KH₂PO₄) от приблизительно 15 до приблизительно 50 и более предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 30 мас.ч. на 100 мас.ч. хлорида аммония соответственно и следовые количества витаминов и микроэлементов.

15. Способ переработки кислого гудрона, отличающийся тем, что гудрон смешивают с почвой на непроницаемом листе материала и в смесь почвы с гудроном добавляют смешанную культуру микроорганизмов, состоящую из штамма Candida digboiensis MTCC 4371 и Candida digboiensis MTCC 4372, способную разлагать гудрон при кислом значении рН, вместе с системой питательных веществ, содержащей источник азота и источник фосфора.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что периодически проводят аэрацию, поддерживают содержание влаги, которое составляет от 30 до 80% способности смеси почвы с гудроном удерживать воду и периодически определяют количество углеводородных загрязняющих веществ, содержащихся в почве.