Человеческие антитела к рецептору эпидермального фактора роста

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложено изолированное человеческое антитело или его фрагмент, которое связывается с человеческим EGFR. Антитело содержит соответствующие CDR участки легкой и тяжелой цепи. Описан его конъюгат с анти-неопластическим средством или маркером. Раскрыты также: кодирующая нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, рекомбинантная клетка-хозяин для получения антител и способ ингибирования роста опухоли, экспрессирующей EGFR на основе антитела. Использование изобретения обеспечивает антитела с аффинностью, сравнимой или выше чем у IMC-C225, которое нейтрализует активацию EGFR, что может найти применение в медицине для лечения опухолей. 7 н. и 29 з.п. ф-лы, 14 ил., 6 табл.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к моноклональным антителам, которые являются специфическими к рецептору эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR). Эти антитела могут использоваться, помимо прочего, при лечении неопластических заболеваний и гиперпролиферативных нарушений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В то время как обычные клетки размножаются путем тщательно контролируемой активации тирозин-киназного рецептора фактора роста (receptor tyrosine kinases, RTKs) соответствующими им лигандами, раковые клетки также размножаются путем активации рецепторов фактора роста, но с потерей надежного контроля нормального размножения. Потеря контроля может быть вызвана многими причинами, такими как сверхэкспрессия факторов роста и/или рецепторов, и автономная активация биохимических путей, регулируемых факторами роста. Некоторыми примерами RTKs, вовлеченных в онкогенез, являются рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR), тромбоцитарного фактора роста (platelet-derived growth factor, PDGFR), инсулиноподобного фактора роста (insulin-like growth factor, IGFR), фактора роста нервов (nerve growth factor, NGFR) и фибробластного фактора роста (fibroblast growth factor, FGF). Связывание этих факторов роста их рецепторами на поверхности клетки приводит к активации рецептора, что инициирует и модифицирует пути передачи сигнала и приводит к клеточному размножению и дифференциации.

Члены группы рецепторов эпидермального фактора роста (epidermal growth factor, EGF) являются особенно важными тирозин-киназными рецепторами фактора роста, связанными с онкогенезом эпидермальных клеток. Первым обнаруженным членом группы EGF рецепторов был EGFR, экспрессируемый на многих типах опухолевых клеток. Было обнаружено, что EGFR участвует в регуляции роста и деления опухолевых клеток, в их репарации и выживании, ангиогенезе, инвазии и метастазировании опухоли.

EGFR является мембранным гликопротеином с молекулярным весом 170 kD, имеющим внеклеточный связывающий лиганды домен, трансмембранную часть и цитоплазматический белковый тирозин-киназный домен. Примеры лигандов, стимулирующих EGFR, включают эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста-а(transforming growth factor-a, TGF-a), гепаринсвязанный фактор роста (heparin-binding growth factor, HBGF), бетацеллюлин и Cripto - 1 фактор. Связывание специфичных лигандов приводит к автофосфорилированию EGFR рецептора, активации его цитоплазматического тирозин-киназного домена и инициации множественных путей передачи сигнала, которые регулируют выживание и рост опухоли. EGFR влияет также на продукцию в опухоли некоторых других ангиогенных факторов, таких KaKVEGF фактор и базовый фибробластный фактор роста (basis fibroblastic growth factor, bFGF).

Считается, что факторы роста, активирующие EGFR, участвуют в ангиогенезе опухоли. Ангиогенез, означающий процесс формирования капилляров из уже имеющихся сосудов в эмбриональных и взрослых организмах, известен как ключевой элемент процесса роста опухоли, ее выживания и местастазирования. Сообщалось, что стимулирование опухолевых клеток посредством EGFR приводит к увеличению экспрессии ангиогенных факторов: васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF), интерлейкина-8 (IL-8) и базового фибробластного фактора роста (bFGF), что может послужить причиной активации васкулярных эндотелиальных клеток, связанных с опухолью. Стимуляция васкулярных эндотелиальных клеток, связанных с опухолью, также возможна посредством активации их собственных EGF рецепторов факторами, продуцируемыми опухолью, такими как TGF-α и EGF.

Сообщалось, что многие человеческие опухоли экспрессируют или сверхэкспрессируют EGFR. Экспрессия EGFR соотносится с плохим прогнозом, пониженным выживанием и/или повышенным метастазированием. По причине своего участия в онкогенезе, EGFR является особым объектом противораковой терапии. Такие виды терапии преимущественно включают либо моноклональные антитела, которые блокируют связывание лиганда внеклеточным доменом рецептора, либо синтетический тирозин-киназный ингибитор, действующий непосредственно на внутриклеточную часть и предотвращающий передачу сигнала.

Например, Cetuximab Mab (ERBITUX®) является рекомбинантным человеческо-мышиным гибридным моноклональным антителом, которое специфически связывается внеклеточным доменом человеческого EGFR. Cetuximab является антагонистом EGFR, блокирующим связывание лиганда с EGFR, предотвращающим активацию рецептора и замедляющим рост опухолевых клеток, экспрессирующих EGFR. Cetuximab зарекомендовал себя в использовании совместно с иринотеканом, или в его отсутствие, при лечении пациентов с метастатическим колоректальным раком, сопровождающимся производством рецепторов эпидермального фактора роста, которые являлись невосприимчивыми к иринотекановой химиотерапии, или к которым она не могла быть применена. Cetuximab также эффективен при лечении псориаза.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение представляет моноклональные антитела или их фрагменты, специфичные к EGFR, предпочтительно к внеклеточной части EGFR, содержащие в себе от одного до шести участков, определяющих комплементарность (complementarity determining regions, CDRs), выбранных из следующей группы: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14. Антитела предпочтительно являются человеческими. Еще более предпочтительно, антитела из данного изобретения или их фрагменты содержат SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6. Альтернативным образом, но также предпочтительно, антитела из данного изобретения или их фрагменты содержат SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14. Более предпочтительным образом антитела из данного изобретения или их фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:8 и/или вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:16. Такие антитела или их фрагменты из данного изобретения обладают разнообразными свойствами, включая способность к нейтрализации EGFR и предотвращению связывания лиганда EGFR его рецептором.

Также данное изобретение представляет выделенные полинуклеотиды, кодирующие описанные антитела или их фрагменты, а также экспрессионные векторы, содержащие эти цепи полинуклеотидов, сшитые как функционирующие с экспрессируемой последовательностью. Также в данном изобретении представлены рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие вектор экспрессии или его продукты, где экспрессируются вышеописанные антитела или их продукты. Также представлены способы получения антител или их фрагментов в культуре этих клеток при условиях, обеспечивающих экспрессию антител или их фрагментов. Антитела или их фрагменты могут быть очищены из клеток или клеточной среды.

Также данное изобретение представляет методы воздействия на рост опухолей у млекопитающих, включая введение млекопитающим эффективных количеств описанных антител. Описанные антитела могут сочетаться с антителами, связываемыми другими RTKs. Эти методы также могут включать введение млекопитающим анти-неопластических средств или обработку, включая, например, химиотерапевтические средства и/или облучение. В некоторых случаях рост опухоли подавляется. Предпочтительным образом, лечение приводит к регрессии опухоли.

Данное изобретение также представляет методы лечения у млекопитающих гиперпролиферативных заболеваний неонкологического характера, например псориаза, включая введение млекопитающим эффективных количеств описанных антител.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1А и 1B изображены векторы экспрессии для клонирования генов иммуноглобулинов pDEC и pEE12.1L. На фиг.1С изображена конечная векторная плазмида pGS-11F8, содержащая одно полностью человеческое анти-EGFR антитело.

На фиг.2 изображен профиль расщепления рестриктазами pGS-11F8. Метки размера ДНК отмечены на ДНК маркере в килобазах.

Фиг.3 изображает in vitro связывание IMC-C11F8 и IMC-C225 с EGFR по данным измерения ELISA.

На фиг.4 изображены результаты in vitro конкурирования IMC-11F8 и IMC-C225 с меченным 125I EGF при связывании EGFR.

На фиг.5 демонстрируется эффект действия IMC-11F8 и IMC-C225 на фосфорилирование EGFR в клетках ВхРС3. Использовалось контрольное антитело IMC-1C11.

Фиг.6 демонстрирует ингибирование фосфорилирования EGFR с помощью IMC-11F8 и IMC-C225 в клетках А431.

На фиг.7 показан Вестерн Блот анализ фосфорилирования EGFR в присутствии нестимулированных контрольных клеток (дорожка 1), EGF (дорожка 2), IMC-C225 (дорожка 3), IMC-11F8 (дорожка 4), и контрольного антитела (дорожка 5). На фиг.5А с помощью анти-фосфатиразиновых антител показан фосфорилированный EGFR и на фиг.5В показан общий EGFR в стимулированных клетках.

На фиг.8 показано ингибирование EGF-стимулированного фосфорилирования EGFR различными концентрациями IMC-11F8. Фиг.8А изображает Вестерн Блот анализ анти-фосфотиразиновых антител EGFR в нестимулированных контрольных клетках (дорожка 1), в стимулированных клетках, обработанных без антител IMC-11F8 (дорожка 2), 15 мкг/мл (дорожка 3), 3 мкг/мл (дорожка 4) и 0,6 мкг/мл (дорожка 3) IMC-11F8. На фиг.8В показан суммарный EGFR.

Фиг.9 демонстрирует ингибирование пролиферации DiFi клеток с помощью IMC-11F8, IMC-C225 и контрольным антителом и IMC-1С11 по оценке метода МТТ.

Фиг.10 демонстрирует специфический лизис 51Cr-меченных DiFi клеток, обработанных с помощью IMC-11F8 или IMC-C225 (ERBITUX™).

Фиг.11 показывает рост опухолевых клеток А431 у мыши, обработаных с помощью IMC-11F8 или IMC-C225 (Cetuximab). Для контроля роста опухоли использовались необработанные животные.

Фиг.12 показывает рост опухолевых клеток ВхРСЗ у мыши, обработаных с помощью IMC-11F8 или IMC-C225 (Cetuximab). Для контроля роста опухоли использовались необработанные животные.

На фиг.13 показано иммуногистохимическое окрашивание ксенотрансплантированных из голой мыши клеток человеческой опухоли, обработанной салином или IMC-11F8. Секции А и В изображают ксенотрансплантат А431 из голой мыши, обработанный с помощью салина (А) или IMC-11F8 (В). Секции С и D изображают ксенотрансплантат ВхРСЗ из голой мыши, обработанный с помощью салина (С) или IMC-11F8 (D). Секции Е и F изображают Ki-67 окрашивание ксенотрансплантата ВхРСЗ из голой мыши, обработанного с помощью салина (Е) или IMC-11F8 (F).

Фиг.14 демонстрирует ингибирование ксенотрансплантированной в голую мышь человеческой колоректальной карциномы с помощью IMC-11F8 в комбинации с СРТ-11. Голые мыши, несущие ксенотрансплантаты человеческой колоректальной опухоли GEO (график A), DLD-1 (график В) или НТ-29 (график С) обрабатывались путем интраперитонеальной инъекции салина или IMC-11F8 дважды в неделю по 0,3 мг или 1,0 мг на иньекцию, в чистом виде или в смеси с СРТ-11 в количестве 100 мг/кг раз в неделю. Размер опухоли замерялся два раза в неделю. Данные представляют среднее значение ±SE измерений опухоли у десяти животных из каждой группы. График D представляет регрессию опухоли вследствие обработки с помощью IMC-11F8 в чистом виде или в смеси с СРТ-11. Каждая группа состоит из 10 зараженных опухолью животных.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение представляет моноклональные антитела и их фрагменты, которые являются специфичными к EGFR, а также выделенные или очищенные полинуклеотидные последовательности, кодирующие антитела. Антитела по данному изобретению являются предпочтительно человеческими и могут использоваться для лечения неопластических заболеваний, включая солидные и не солидные опухоли, а также для лечения гиперпролиферативных нарушений.

Природные антитела состоят обычно из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, при этом каждая легкая цепь ковалентно присоединена к тяжелой цепи с помощью промежуточной дисульфидной связи, при этом множественные дисульфидные связи соединяют, в свою очередь, две тяжелые цепи одну с другой. Индивидуальные цепи могут складываться в домены, характеризуемые схожими размерами (110-125 аминокислот) и структурами, но обладающие различными функциями. Легкая цепь может содержать один вариабельный домен (VL) и/или один константный домен (CL). Тяжелая цепь также может содержать один вариабельный домен (VH) и/или, в зависимости от класса или изотипа антитела, три или четыре константных домена (CH1, CH2, CH3 и CH4). У людей присутствуют изотипы IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, причем IgA и IgG далее подразделяются на подклассы или подтипы (lgA1-2 и lgG1-4).

В целом, вариабельные домены демонстрируют существенное разнообразие аминокислотной последовательности от одного антитела к другому, особенно в области нахождения сайта связывания антигенов. В каждом из VL и VH имеются три зоны, называемые гипервариабельными участками или участками, определяющими комплементарность (complementarity-determining regions, CDRs), при этом они сопровождаются менее вариабельными областями, которые называются каркасными вариабельными областями (framework variable regions).

Часть антитела, состоящая из доменов VL и VH, обозначается Fv (fragment variable) и составляет область связывания антигенов. Fv одиночной цепи (single chain Fv, scFv) представляет собой фрагмент антитела, содержащий VL домен и VH домен на одной полипептидной цепи, при этом N-конец одного домена и С-конец другого домена соединяются подвижным линкером (см., например, патент США N 4 946 778 (Ladner et al.); WO 88/09344 (Huston et al.). WO 92/01047 (McCafferty et al.) описывает дисплей scFv фрагментов на поверхности растворимых рекомбинантных генетических экспонирующих методов, таких как бактериофаги.

Пептидными линкерами, используемыми для получения одноцепочечных антител, могут быть гибкие пептиды, выбранные таким образом, чтобы обеспечить правильное трехмерное сворачивание VL и VH доменов. Линкер состоит, в общем виде, из 10-50 аминокислотных остатков. Предпочтительно, линкер состоит из 10-30 аминокислотных остатков. Еще более предпочтителен линкер, состоящий из 12-30 аминокислотных остатков. Самым предпочтительным является линкер, состоящий из 15-25 аминокислотных остатков. Пример такого пептидного линкера включает (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 (SEQ ID NO:19).

У одноцепочечных антител отсутствуют некоторые или все из константных доменов целых антител, из которых они происходят. Поэтому они способны обойти некоторые из проблем, связанные с использованием целых антител. Например, одноцепочечные антитела в целом свободны от некоторых нежелательных взаимодействий между константными участками тяжелых цепей с другими биологическими объектами. Помимо этого, одноцепочечные антитела обладают существенно меньшими размерами, чем целые антитела, и могут обладать большей способностью к проницаемости, чем целые антитела, что позволяет одноцепочечным антителам обнаруживать и присоединяться к целевым антиген-связывающим областям более эффективно. Более того, относительно небольшие размеры одноцепочечных антител делают менее вероятным возникновение нежелательной иммунной реакции у реципиента, по сравнению с целыми антителами.

Несколько одноцепочечных антител, каждая одиночная цепь которых обладает одним VH и одним VL доменом, ковалентно связанными первым пептидным линкером, могут ковалентно связываться с помощью одного или нескольких пептидных линкеров с образованием мультивалентных одноцепочечных антител, которые могут быть моноспецифичными или мультиспецифичными. Каждая цепь мультивалентного одноцепочечного антитела содержит фрагмент вариабельной области легкой цепи и фрагмент вариабельной области тяжелой цепи, и с помощью пептидного линкера связывается с еще как минимум одной другой цепью. Пептидный линкер состоит из по крайней мере пятнадцати аминокислотных остатков. Максимальное число аминокислотных остатков составляет около одной сотни.

Два одноцепочечных антитела могут объединяться с образованием димерного антитела, также известного как бивалентный димер. Димерные антитела состоят из двух цепей и двух связывающих областей и могут быть моноспецифичными или биспецифичными. Каждая цепь димерного антитела содержит VH домен, соединенный с VL доменом. Домены соединены с помощью линкеров, которые достаточно коротки для того, чтобы предотвратить спаривание между доменами одной и той же цепи, способствуя, таким образом, спариванию комплементарных доменов на разных цепях, создавая две антиген-связывающие области.

Три одноцепочечных антитела могут объединяться с образованием тримерных антител, также известных как тривалентные тримеры. Тримерные антитела построены таким образом, что аминокислотные окончания VH и VL доменов напрямую связаны с карбоксильными окончаниями VH и VL доменов, т.е. безо всяких линкерных последовательностей. Тримерное антитело обладает тремя Fv фрагментами с полипептидами, расположенными циклическим образом, «голова к хвосту». Возможной конформацией тримерного антитела является планарная конформация, при которой три области связывания находятся в одной плоскости под углами в 120° одна к другой. Тримерные антитела могут быть моноспецифичными, биспецифичными и триспецифичными.

Термин Fab (Fragment, antigen binding) относится к фрагментам антитела, состоящим из VH VL VH и CH1 доменов. Те, что образуются при расщеплении папаином, обозначаются просто Fab и не содержат шарнирный участок в тяжелой цепи. При расщеплении пепсином, образуется много различных Fab-фрагментов, содержащих шарнирный участок в тяжелой цепи. Те дивалентные фрагменты, в которых присутствуют межцепочные дисульфидные связи, обозначаются F(ab')2, тогда как моновалентные Fab' образуются в том случае, если дисульфидные связи не сохранились. F(ab')2 фрагменты обладают большей авидностью к антигенам, чем моновалентные Fab фрагменты.

Fc (Fragment crystallization) является обозначением той части или фрагмента антитела, который содержит спаренные константные домены тяжелой цепи. Например, у IgG антитела, Fc содержит СН2 и CH3 домены. Fc антител IgA и IgM содержит дополнительно СН4 домен. Fc имеет отношение к Fc рецепторному связыванию, к активации комплемент-опосредованной цитотоксичности и антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (antibody-dependent cellular-cytoxicity, ADCC). Для таких антител, как IgA и IgM, которые представляют собой комплексы нескольких IgG-подобных протеинов, для комплексообразования необходимо наличие константных доменов Fc.

Наконец, шарнирная область разделяет Fab и Fc части антитела, предоставляя мобильность Fab-доменам относительно друг друга и относительно Fc, а также обладая несколькими дисульфидными связями для ковалентного связывания двух тяжелых цепей.

Таким образом, антитела по данному изобретению включают, но не ограничиваются, следующими: природные антитела, бивалентные фрагменты, такие как (Fab')2, моновалентные фрагменты, такие как Fab, одноцепочечные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), однодоменные антитела, мультивалентные одноцепочечные антитела, димерные антитела, тримерные антитела, и подобные, которые специфично связываются с антигенами.

Антитела и их фрагменты по данному изобретению являются специфичными к EGFR. Под специфичностью антитела понимается специфичное распознавание антитела определенным эпитопом антигена. Антитела и их фрагменты по данному изобретению могут быть, например, моноспецифичными или биспецифичными. Биспецифичные антитела (BsAbs) - это такие антитела, которые обладают двумя различными антиген - связывающими специфичностями или областями. В случае, когда антитело обладает более чем одной специфичностью, опознаваемые эпитопы могут относиться к одному антигену, или более чем к одному антигену. Таким образом, данное изобретение представляет биспецифичные антитела или их фрагменты, которые связываются с двумя различными антигенами, и с минимум одной специфичностью к EGFR.

Специфичность данных антител или их фрагментов к EGFR может быть определена, основываясь на аффинности и/или авидности. Аффинность, представляемая константой равновесия диссоциации антигена с антителом (Krf), измеряет силу связывания между антигенной детерминантой и областью связывания антигена. Авидность - это мера силы связывания антитела с его антигеном. Авидность связана как с аффинностью между эпитопом и его областью связывания антигена на антителе, так и с валентностью антитела, под которой понимается количество областей связывания антигена для определенного эпитопа. Антитела обычно связываются с константой диссоциации (Kd) порядка от 10-5 до 10-11 л/моль. Любая меньшая чем 10-4 л/моль, в целом считается обозначающей неспецифическое связывание. Чем меньше значение Kd, тем больше сила связывания между антигенной детерминантой и областью связывания антигена.

Как указывается, «антитела» и «фрагменты антител» включают модификации, которые сохраняют специфичность к EGF рецептору. Такие модификации включают, но не ограничаваются этим, соединение с эффекторной молекулой, такой как химиотерапевтическое средство (например, цисплатин, таксол, доксорубицин) или цитотоксин (например, белковое или небелковое органическое химиотерапевтическое средство). Антитела могут быть модифицированы путем конъюгирования с детектируемыми репортерными молекулами. Также включенными являются антитела с изменениями, затрагивающими не-связывательные характеристики, такие как период полувыведения (например, пегилирование).

Белковые и не-белковые средства могут быть соединены с антителами с помощью способов, известных в этой области. Способы соединения включают прямое присоединение, присоединение через ковалентно присоединенные линкеры и специфично соединенные парные члены (например, авидин-биотин). Такие методы включают, например, описанные в Greenfield et al., Cancer Research 50, 6600-6607 (1990) для присоединения доксорубицина, а также описанные в Arnon et al., Adv. Exp.Med. Biol. 303, 79-90 (1991) и в Kiseleve et al., Mol. Biol. (USSR)25, 508-514 (1991) для присоединения платиновых соединений.

Эквиваленты антител или их фрагментов по данному изобретению также включают полипептиды с аминокислотными последовательностями, в значительной степени эквивалентными аминокислотным последовательностям вариабельных или гипервариабельных участков полноразмерных анти-EGFR антител, включенных в данное изобретение. Под в значительной степени эквивалентной аминокислотной последовательностью здесь понимается последовательность с, по меньшей мере, 70%-ной, предпочительно, по меньшей мере, 80%-ной, и более предпочтительно, по меньшей мере, 90%-ной гомологией, по определению поисковым методом FASTA в соответствии с Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444-8 (1988)), включая последовательности, которые на, по меньшей мере, 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% идентичны.

Такие антитела будут обладать одинаковым или похожим связыванием, лигандной блокировкой и рецептор-нейтрализующей активностью по отношению к антителам данного изобретения, включая SEQ ID NO:8 и 16, особенно в случае консервативной замены аминокислот. Консервативная замена аминокислот определяется как изменение в аминокислотном составе путем замены одной или более аминокислот в пептиде, полипептиде или протеине, или их фрагментах. Замена производится аминокислотами с похожими в целом свойствами (например, кислотность, основность, ароматичность, размер, позитивный или негативный заряд, полярность, неполярность) таким образом, что эти замены не вызывают существенного изменения соответствующих пептидных, полипептидных или протеиновых характеристик (например, заряда, изоэлектрической точки, аффинности, авидности, конформации, растворимости) или активности. Типичные консервативные замены выбираются в группах аминокислот, которые включают, но не ограничиваются, следующими:

(1) гидрофобные: метионин (М), аланин (А), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I);

(2) гидрофильные: цистеин (С), серин (S), треонин (Т), аспаргин (N), глютамин (Q);

(3) кислотные: аспартамовая кислота (D), глютаминовая кислота (Е);

(4) щелочные: гистидин (Н), лизин (К), аргинин (R);

(5) ароматические: фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W);

(6) остатки, влияющие на ориентацию цепи: gly, pro.

Антитела по данному изобретению дополнительно включают такие, у которых характеристики связывания были улучшены путем прямых мутаций, способами развития аффинности, фагового дисплея или перемешивания цепи. Аффинность и специфичность могут быть изменены или улучшены путем мутации участков CDR и отбором областей связывания антигенов с требуемыми характеристиками (смотреть, например, Yang et al., J. Mol. Biol., 254: 392-403 (1995)). CDR мутируют разными способами. Один из способов заключается в том, чтобы рандомизировать индивидуальные остатки или комбинации остатков таким образом, что в популяции изначально идентичных областей связывания антигена все двадцать аминокислот находятся на определенных местах. Иным образом, мутации вносятся в набор CDR остатков методом error-prone PCR (смотреть, например, Hawkins et. al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)). Например, векторы фагового дисплея, содержащие гены вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, могут размножаться в мутационных штаммах Е.coli (смотреть, например, Low et al., J. Mol. Biol., 250: 359-368 (1996)). Эти методы мутагенеза иллюстрируют лишь некоторые из тех методов, которые известны специалистам в данной области.

Каждый домен антител по данному изобретению может быть полным доменом иммуноглобулина (например, вариабельным или константным доменом тяжелой или легкой цепи), или может быть функциональным эквивалентом или мутантом или производным природного домена, или синтетическим доменом, созданным, например, in vitro с помощью способа, такого, какие описаны в WO 93/11236 (Griffiths et al.). Например, является возможным соединить вместе домены, соответствующие вариабельным доменам антитела, у которых отсутствует хотя бы одна аминокислота. Важной характеристической особенностью антител является наличие области связывания антигена. Термины фрагмент вариабельной области тяжелой цепи и фрагмент вариабельной области легкой цепи не должны быть истолкованы таким образом, чтобы исключить варианты, не имеющие существенного влияния на специфичность.

Антитела по данному изобретению или их фрагменты являются человеческими антителами, обладающими одним, двумя, тремя, четырьмя и/или шестью участками, определяющими комплементарность (CDR), выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14.

Предпочтительно, антитела (или их фрагменты) по данному изобретению обладают участками CDR из группы SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6. Альтернативно, и также предпочтительно, данные антитела или их фрагменты, обладают участками CDR из группы SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14. Последовательности аминокислот участков CDR приведены в Таблице 1.

ТАБЛИЦА 1
Тяжелая цепь
CDR1 SGDYYWS SEQ ID N0:2
CDR2 YIYYSGSTDYNPSLKS SEQ ID N0:4
CDR3 VSIFGVGTFDY SEQ ID N0:6
Легкая цепь
CDR1 RASQSVSSYLA SEQ ID N0:10
CDR2 DASNRAT SEQ ID N0:12
CDR3 HQYGSTPLT SEQ ID N0:14

В другом варианте осуществления изобретения, данные антитела или их фрагменты могут обладать вариабельной областью тяжелой цепи SEQ ID N0:8 и/или вариабельной областью легкой цепи SEQ ID N0:16. IMC-11F8 является особенно предпочтительным антителом по данному изобретению. Это антитело обладает человеческими VH и VL областями структуры (framework regions, FWs), а также участками CDR. Вариабельный домен VH IMC-11F8 (SEQ ID N0:8) обладает тремя участками CDR (SEQ ID NO:2, 4 и 6) и четырьмя FW, и VL домен (SEQ ID NO:16) обладает тремя участками CDR (SEQ ID NO:10, 12 и 14) и четырьмя FW.

Предпочтительно, антитела или их фрагменты по данному изобретению нейтрализуют EGFR. Связывание лиганда, например, EGF или TGF-a, с внешним, внеклеточным доменом EGFR стимулирует димеризацию рецептора, автофосфорилирование EGFR, активацию внутреннего рецепторного цитоплазменного тирозин-киназного домена и инициацию множественных путей передачи сигнала и трансактивации, участвующих в регулировании синтеза ДНК (генная активация), а также развитии клеточного цикла или делении клеток. Также предпочтительно, анти-EGFR антитела (или их фрагменты) из данного изобретения являются специфичными к внеклеточной области EGFR. Данные антитела или их фрагменты дополнительно, предпочтительно, предотвращают связывание лиганда EGFR с его рецептором. В таком варианте осуществления изобретения, антитела по данному изобретению, или их фрагменты, связывают EGFR по крайней мере так же сильно, как природные лиганды EGFR (EGF и TFG-α).

Нейтрализация EGFR включает ингибирование, диминуцию, инактивацию и/или прерывание одной или более видов активности, связанных с передачей сигнала. Таким образом, нейтрализация EGFR влечет за собой множество эффектов, включая ингибирование, диминуцию, инактивацию и/или прерывание роста (пролиферации и дифференциации), ангиогенеза (восстановления, инвазии и метастазирования кровеносных сосудов), а также клеточной активности и метастазирования (клеточной адгезии и инвазивности).

Одной из мер при нейтрализации EGFR является ингибирование тирозин-киназной активности рецептора. Тирозин-киназное ингибирование можно определить с использованием широко известных методов, например, путем измерения уровня автофосфорилирования рекомбинантного киназного рецептора, и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Таким образом, анализы фосфорилирования полезны при определении нейтрализующих антител, в контексте данного изобретения. Фосфорилирование может быть обнаружено, например, с помощью использования антитела, специфичного к фосфотиразину, в ELISA анализе или Вестерн Блот анализом. Некоторые анализы для тирозин-киназной активности описаны в Panek et al., I. Pharmacol. Exp.Thera. 283:1433-44 (1997) и Batley et al., life Sci.62: 143-50 (1998).

Кроме того, методы обнаружения экспрессии белка могут использоваться для определения EGFR-нейтрализации, в том случае, если эти белки или белковая активность, или активированные состояния, регулируются тирозин-киназной активностью EGFR. Эти методы включают иммуногистохимию (IHC) для определения белковой экспрессии, флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) для определения амплификации генов, конкурентно-связывающий радиолигандный анализ, техники блотов на твердой основе, такие как нозерн-блот и саузерн-блот (Northern and Southern blots), полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) и ELISA. Смотреть, например, Grandis et al., Cancer, 78:1284-92 (1996); Shimizu et al., Japan J. Cancer Res., 85:567-71 (1994); Sauteretal., Am. J. Path., 148:1047-53 (1996); Collins, Glia, 15:289-96(1995); Radinsky et al., Clin. Cancer Res., 1:19-31 (1995); Petrides et al., Cancer Res., 50:3934-39 (1990); Hofmiann et al., Anticancer Res., 17:4419-26 (1997); Wikstrand et al., Cancer Res., 55:3140-48 (1995).

In vivo анализы также могут быть использованы при определении нейтрализации EGFR. Например, тирозин-киназное ингибирование рецептора можно наблюдать с помощью митогенного анализа с использованием клеток, стимулированных рецепторным лигандом в присутствии и отсутствие ингибитора. Например, клетки А431 (American Type Culture Collection (АТСС), Rockville, MD), стимулированные при помощи EGF, могут быть использованы для анализа ингибирования EGFR. Другой метод включает проверку на ингибирование роста экспрессирующих EGFR опухолевых клеток, используя, например, человеческие опухолевые клетки, внедренные в мышей. См., например, патент США No. 6 365 157 (Rockwell et al.).

Данное изобретение не ограничено никаким конкретным механизмом нейтрализации EGFR. Анти-EGFR антитела по данному изобретению могут наружно связываться с поверхностным рецептором клеток EGF, блокировать связывание лигандов (например, EGF или TGF-a) и соответствующую передачу сигнала, происходящую при участии связанной с рецептором тирозин-киназы, а также препятствовать фосфорилированию EGFR и других последующих белков в каскаде передачи сигнала. Рецепторно-антительный комплекс также может быть поглощен и разрушен, что приводит к ослаблению активности рецептора на поверхности клетки. Активность матриксных металлопротеиназ, которые участвуют в инвазии и метастазировании опухолевых клеток, также может быть ослаблена антителами по данному изобретению. Более того, антитела по даннму изобретению могут способствовать ингибированию продукции фактора роста и ангиогенеза.

Фрагменты антител могут быть получены путем разделения целого антитела или экспрессией ДНК, которая кодирует фрагмент. Возможные методы получения фрагментов антител описаны в Lamoyi et al., J. Immunol. Methods, 56: 235-243 (1983) и Parham, I. Immunol. 131:2895-2902 (1983). Такие фрагменты могут содержать один или оба Fab фрагмента из F(ab')2 фрагмента. Такие фрагменты могут также содержать одноцепочечные фрагменты вариабельных областей антител, например scFv, димерные антитела, или другие фрагменты антител. Методы получения таких функциональных эквивалентов раскрыты в заявке РСТ WO 93/21319, европейской патентной заявке No. ЕР 239400; заявке РСТ WO 89/09622; европейской патентной заявке ЕР 338745 и европейской патентной заявке ЕР 332424.

Предпочтительными клетками-хозяевами для трансформации векторов и экспрессии рецепторных антагонистов являются клетки млекопитающих, например клетки COS-7, клетки яичника китайского хомяка (Chinese hamster ovary, СНО), и колонии клеток лимфоидного происхождения, такие как клетки лимфомы, миеломы (например, NSO) или гибридомы. Альтернативно, могут использоваться другие эукариотические реципиенты, такие как дрожжи.

В случае если желательно экспрессировать генную конструкцию в дрожжах, подходящим выбором гена для использования в дрожжах является ген trpl, присутствующий в дрожжевой плазмиде YRp7. Stinchcomb et al. Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979). Ген trpl предоставляет селекционный маркер для мутационнного дрожжевого штамма, лишенного возможности к росту в триптофане, например, АТСС No. 44076 или РЕР4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). Наличие повреждения trpl в геноме дрожжевой клетки-хозяина, таким образом, предоставляет удобную среду для определения трансформации при росте в отсутствие триптофана. Похожим образом, дрожжевые штаммы с недостатком Leu2 (АТСС 20, 622 или 38, 626) дополняются известными плазмидами, несущими ген Leu2.

Трансформированные клетки-хозяева культивируются с помощью методов, известных в этой области, в жидкой среде, содержащей ассимилируемые источники углерода (углеводороды, такие как глюкоза или лактоза), азота (аминокислоты, пептиды, белки или продукты их деградации, такие как пептоны, аммониевые соли и подобные), и неорганических солей (сульфаты, фосфаты и/или карбонаты натрия, калия, магния и кальция). Среда, кроме того, содержит, например, вещества, способствующие росту, такие как микроэлементы, например железо, цинк, марганец и подобные).

Как описано в примерах ниже, высокоспецифичные анти-EGFR антитела, в соответствии с данным изобретением, могут быть выделены из библиотеки фагового дисплея, составленной из генов вариабельных областей человеческих легких и тяжелых цепей. Например, вариабельный домен по данному изобретению может быть получен из лимфоцита периферической крови, который содержит перегруппированный ген вариабельной области. Альтернативным образом, части вариабельного домена, такие как CDR и FW участки, могут быть получены из различных человеческих последовательностей. Более 90% полученных клонов после трех повторов селекции специфичны к EGFR. Аффинность к связыванию с EGFR для исследованных Fab находится в наномолярном диапазоне, что является таким же высоким значением, как для нескольких бивалентных анти-EGFR моноклональных антител, созданных по гибридомной технологии.

Антитела и фрагменты антител по данному изобретению могут быть получены, например, из природных антител, или библиотек фаговых дисплеев Fab или scFv. Принимается во внимание, что для создания однодоменного антитела из антитела, содержащего VH и VL домены, могут быть желательны определенные замены аминокислот вне участков CDR, для повышения связывания, эспрессии или растворимости. Например, может быть желательным модифицировать аминокислотные остатки, которые в противном случае окажутся скрытыми при VH-VL взаимодействии.

Дополнительно антитела и фрагменты антител по данному изобретению могут быть получены по стандартной технологии гибридом (Harlow & Lane, ed., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 211-213 (1998), включается в виде ссылки) с использованием трансгенных мышей (например, мыши КМ от Medarex, San Jose, Calif.), которые продуцируют гамма тяжелые и каппа легкие цепи человеческого иммуноглобулина. Предпочтительным образом, значительная часть человеческого генома, кодирующего антитело, внедряется в геном мыши и компенсирует недостаток продукции эндогенных мышиных антител. Такие мыши могут быть подкожно (subcutaneously, s.c.) иммунизированы с использованием KDR (VEGFR-2) в полном адъюванте Фрейнда.

Белок, используемый для идентификации EGFR-связываемых антител по данному изобретению, преимущественно представляет собой EGFR и, более преимущественно, внеклеточный домен EGFR. Внеклеточный домен EGFR может быть свободным, или связанным с другой молекулой.

Данное изобретение также предоставляет изолированные полинуклеотиды, кодирующие антитела или их фрагменты, описанные ранее. Изобретение включает нуклеиновые кислоты, обладающие последовательностью, кодирующей один, два, три, четыре, пять и/или все шесть участков CDR. Таблица 2 демонстрирует последовательности нуклеиновых кислот.

ДНК, кодирующая человеческие антитела, может быть получена путем рекомбинации ДНК, кодирующей константные и вариабельные области человека, отличные от участков CDR, происходящих по существу или исключительно из соответствующих областей человеческих антител, и ДНК, кодирующих участки CDR, происходящие от человека (SEQ ID NO:1, 3 и 5 для участков CDR вариабельного домена тяжелой цепи и SEQ ID NO:9, 11 и 13 для участков CDR вариабельного домена легкой цепи).

Подходящие источники ДНК, которые кодируют фрагменты антител, включают любые клетки, такие как гибридомы и клетки селезенки, которые экспрессируют полноразмерные антитела. Фрагменты могут быть использованы сами по себе, в качестве эквивалентов антител, или могут быть рекомбинированы в эквиваленты, как описано выше. Удаление и рекомбинация ДНК, описанные в этой части, могут быть произведены известными способами, такими как описанные в перечисленных выше публикациях, с учетом эквивалентности антител, и/или другими стандартными приемами рекомбинации ДНК, такими как описаны ниже. Другим источником ДНК могут служить одноцепочечные антитела, полученные из библиотек фаговых дисплеев известными в данной области способами.

Кроме того, данное изобретение представляет вектора экспрессии, содержащие вышеописанные последовательности нуклеотидов, функционально связанные с экспрессирующейся последовательностью, промоторной и энхансерной последовательностью. Были разработаны разнообразные экспрессионные векторы для эффективного синтеза полипептидов антител в прокариотах, например бактериях и эукариотических системах, включая, но не ограничиваясь этим, дрожжи и системы клеточных культур млекопитающих. Векторы по данному изобретению могут содержать сегменты хромосомальных, не-хромосомальных и синтетических последовательностей ДНК.

Может быть использован любой подходящий вектор экспрессии. Например, прокариотические клонирующие векторы, включая плазмиды из Е.coli, такие, как co1EI, pCRI, pBR322, рМВ9, pUC, pKSM и RP4. Прокариотические векторы также включают производные ДНК-фагов, таких как М13 и ДНК других одноцепочечных филаментных фагов. Примером подходящего вектора дрожжей является плазмида 2µ. Подходящие векторы для экспрессии в клетках млекопитающих включают хорошо известные производные SV40, аденовирусы, ДНК-последовательности, произведенные от ретровирусов, и челночные векторы, происходящие от комбинаций функциональных векторов млекопитающих, таких как описаны выше, а также функциональных плазмид и ДНК-фагов.

В данной области известны и другие эукариотические векторы экспрессии (например, P.J. Southern and P. Berg, J. Mol. Appl. Genet, 1, 327-341 (1982); Subramani et al., Mol. Cell. Biol., 1: 854-864 (1981); Kaufmann and Sharp, "Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene," J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982); Kaufmann and Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601-664 (1982); Scahill et al., "Expression And Characterization of the Product of a Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells," Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 80, 4654-659 (1983); Urlaub and Chasin, Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 77, 4216-4220, (1980).

Векторы экспрессии по данному изобретению содержат как минимум одну последовательность контроля экспрессии, которая функционально связана с экспрессируемой ДНК-последовательностью или фрагментом. Контрольная последовательность внедряется в вектор для контроля и регулирования экспрессии клонированной ДНК-последовательности. Примерами подходящих последовательностей для контроля экспрессии являются lac система, trp система, tac система, trc система, главные операторные и промотерные участки лямбда фага, контрольный участок белка оболочки fd, гликолитические промотеры дрожжей, например промотер 3-фосфоглицерат киназы, промотеры дрожжевой кислой фосфотазы, например, Pho5, промотеры дрожевых альфа-факторов скрещивания, и промотеры, произведенные от полиномы, аденовируса, ретровируса и обезьяннего вируса, например, ранние и поздние промотеры или SV40, и другие последовательности, известные тем, что контролируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток и их вирусов, или их комбинаций.

Данное изобретение также представляет рекомбинантные клетки-хозяева, содержащие вышеописанные векторы экспрессии. Антитела по данному изобретению могут экспрессироваться в линиях клеток, отличных от гибридом. Нуклеиновые кислоты, содержащие последовательности, кодирующие полипептиды, в соответствии с изобретением, могут использоваться для трансформации подходящих клеток-хозяев млекопитающих.

Линии клеток, представляющие особенный интерес, выбираются на основании высокого уровня экспрессии, конститутивной экспрессии интересующего протеина и минимальной загрязненности белками хозяина. Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в этой области и включают многие иммортализованные линии клеток, в том числе такие, как клетки яичника китайского хомяка (Chinese Hamster Ovary, СНО), почечные клетки детенышей хомяков (Baby Hamster Kidney, ВНК) и многие другие. Дополнительные подходящие эукариотические клетки включают дрожжи и другие грибы. Подходящие прокариотические хозяева включают, например, Е. coli, такие как Е. coli SG-936, Е. coli НВ 101, Е coli W3110, Е.coli XI776, Е.coli Х2282, Е.coli DHI и Е. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, такие как Bacillus subtilis и Streptomyces.

Представленные рекомбинантные клетки-хозяева могут использоваться для получения антитела или его фрагментов путем культивирования этих клеток в условиях, обеспечивающих экспрессию антитела или его фрагментов, и очищения антитела или его фрагментов от клетки-хозяина или среды, окружающей клетку-хозяина. Нацеливанию экспрессируемого антитела или фрагмента на секрецию в рекомбинантных клетках-хозяевах может способствовать внедрение сигнальной или секреторной последовательности, кодирующей лидерный пептид (см. Shokri et al., Appl Microbiol Biotechnol. 60(6):654-64 (2003), Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6 (1997) и von Heinje et al., Nucl. Acids Res. 14:4683-690 (1986)) на 5'-конце интересующего гена, кодирующего антитело. Эти элементы секреторного лидерного пептида могут быть выведены как из прокариотических, так и из эукариотических последовательностей. Соответственно подходящим образом используются секреторные лидерные пептиды, которые являются аминокислотами, присоединенными к N-терминальному концу полипептида, для того, чтобы направлять движение полипептида вовне цитозоля клетки-хозяина и секретировать в среду.

Антитела по данному изобретению могут быть слиты с дополнительными аминокислотными остатками. Таким аминокислотным остатком может быть пептидный tag, возможно для облегчения выделения. Также рассматриваются и другие аминокислотные остатки для направления антител к определенным органам и тканям.

В другом варианте осуществления изобретения, антитело по данному изобретению получают путем экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, в трансгенном животном, таким образом, что антитело экспрессируется и может быть извлечено. Например, антитело может экспрессироваться ткане-специфическим образом, что способствует извлечению и очистке. В одном из вариантов осуществления изобретения, антитело по данному изобретению экспрессируется в молочной железе для секреции во время лактации. Примеры трансгенных животных включают, но не лимитируются, мышами, козами и кроликами.

Данным изобретением также предложен способ лечения роста опухолей у млекопитающих путем введения млекопитающим эффективного количества вышеописанных антител. Подходящими для лечения опухолями, в соответствии с данным изобретением, являются предпочтительно те, которые экспрессируют EGFR. При том что болезни и состояния, которые можно лечить или предотвращать представленными методами, не подразумевают быть привязанными к какому-либо конкретному механизму, они включают, например, таковые, при которых рост опухоли или патогенный ангиогенез стимулируется посредством паракринного и/или аутокринного цикла EGFR. Это означает, что опухоли, экспрессирующие EGFR, характеристично чувствительны к присутствию EGFR в их окружении и дальнейшая продукция может стимулироваться посредством EGF и/или TGF-ct в аутокринном стимуляторном цикле. Лечение таких опухолей в соответствии с данным изобретением включает полное или частичное ингибирование роста опухоли. Примечательно, что в определенных вариантах, ингибирование включает дополнительно регрессию опухоли.

Экспрессия EGFR наблюдалась во многих человеческих опухолях как in vitro, так и in vivo, и уровни экспрессии EGFR широко варьируют в зависимости от типа опухоли. EGFR экспрессируется на разных уровнях на клеточной поверхности значительной части человеческих опухолей, таких как колоректальная, головная и шейная (эпидермоидная), панкреатическая, легочная, опухоль молочной железы и почечная карциномы, а также глиобластомы. Для некоторых типов опухолей экспрессия EGFR очень распространена (например, для от 35% до 70% случаев рака яичников и приблизительно для от 25% до 77% случаев колоректального рака). Высокие уровни экспрессии EGFR могут достигаться при корелляции с продукцией рецепторных лигандов (например, EGF и TGF-α). Экспрессия EGFR также кореллирует с повышенной сопротивляемостью определенным химиотерапевтическим средствам и радиотерапии. Экспрессия EGFR может также служить предвещающим фактором при некоторых видах опухолей, ввиду того, что она ассоциирует с пониженной выживаемостью, плохим прогнозом и/или повышенным риском метастазирования. Кроме того, повышенная экспрессия EGFR присутствует во многих видах опухолей.

Опухоли, подлежащие лечению, включают первичные и метастатические опухоли, а также трудноизлечимые опухоли. Трудноизлечимые опухоли включают опухоли, которые не реагируют или являются устойчивыми к обработке отдельно химиотерапевтическими средствами, отдельно антителами, отдельно радиационными методами, или их комбинациями. К трудноизлечимым опухолям относятся также такие, которые ингибируются обработкой такими способами, но рецидивируют в течение пяти лет, иногда в течение десяти или более лет после прекращения лечения.

Опухоли, которые можно лечить антителами по данному изобретению, включают такие, которые неваскуляризированы, или несущественно васкуляризированы, а также и васкуляризированные опухоли. Примеры солидных опухолей, которые могут быть подвержены лечению, включают карциному молочной железы, карциному легких, колоректальную карциному, карциному поджелудочной железы, глиому и лимфому. Некоторые примеры таких опухолей включают эпидермоидные опухоли, сквамозные опухоли, такие как опухоли головы и шеи, колоректальные опухоли, опухоли простаты, опухоли молочной железы, опухоли легких, включая мелкоклеточные и немелкоклеточные опухоли легких, опухоли поджелудочной железы, опухоли щитовидной железы, опухоли яичников и опухоли печени. Другие примеры включают саркому Капоши, неоплазмы CNS, нейробластомы, капиллярные гемангиобластомы, менингиомы и церебральные метастазы, меланому, желудочно-кишечные и почечные карциномы и саркомы, рабдомиосаркому, глиобластому, предпочтительно полиморфную глиобластому и лейомиосаркому.

В другом аспекте данного изобретения, анти-EGFR антитела ингибируют ангиогенез, связанный с опухолями. EGFR-стимуляция васкулярного эндотелия ассоциирует с васкуляризацией опухоли. Обычно васкулярный эндотелий стимулируется паракринным образом, посредством, например, EGF и/или TGF-α от других источников (например, опухолевых клеток).

В соответствии с этим человеческие анти-EGFR антитела эффективны для лечения субъектов с васкуляризированными опухолями или неоплазмами или ангиогенными заболеваниями. Такие опухоли и неоплазмы включают, например, злокачественные опухоли и неоплазмы, такие как бластомы, карциномы и саркомы, а также высоковаскуляризированные опухоли и неоплазмы. Раковые заболевания, которые могут подвергаться лечению способами, представленными в данном изобретении, включают, например, рак мозга, генитоуринального тракта, лимфатической системы, желудка, почек, толстой кишки, гортани, легких и костей. Не ограничивающие примеры далее включают эпидермоидные опухоли, сквамозные опухоли, такие как опухоли головы и шеи, колоректальные опухоли, опухоли простаты, опухоли молочной железы, опухоли легких, включая аденокарциному легких и мелкоклеточные и не-мелкоклеточные опухоли легких, опухоли поджелудочной железы, опухоли щитовидной железы, опухоли яичников и опухоли печени. Метод также используется для лечения васкуляризированных раков кожи, включая сквамозную клеточную карциному, базально-клеточную карциному, а также раковые заболевания кожи, которые могут подвергаться лечению путем подавления роста злокачественных кератиноцитов. Другие раковые заболевания, которые могут подвергаться лечению, включают саркому Капоши, неоплазмы CNS (нейробластомы, капиллярные гемангиобластомы, менингиомы и церебральные метастазы), меланому, желудочно-кишечные и почечные карциномы и саркомы, рабдомиосаркому, глиобластому, включая полиморфную глиобластому и лейомиосаркому.

Данное изобретение также представляет способ лечения нераковых гиперпролиферативных заболеваний у млекопитающих, включая введение млекопитающим эффективного количества антител по данному изобретению. Здесь имеется в виду, что «гиперпролиферативное заболевание» определяется как состояние, вызываемое чрезмерным ростом нераковых клеток, которые экспрессируют некоторые из семейства EGFR-рецепторов. Избыточные клетки, генерируемые в результате гиперпролиферативного заболевания, экспрессируют EGFR на нормальном уровне, или же могут сверхэкспрессировать EGFR.

Видами гиперпролиферативных нарушений, которые могут подвергаться лечению в соответствии с данным изобретением, являются любые гиперпролиферативные нарушения, которые стимулируются EGFR лигандами или мутациями таких лигандов. Примеры гиперпролиферативных заболеваний включают псориаз, старческие кератозы и себоррейные кератозы, бородавки, келоидные рубцы и экзема. Также включенными являются гиперпролиферативные заболевания, вызванные вирусными инфекциями, такими как вирусная инфекция папилломы. Псориаз, например, может возникать в различных формах и с различной степенью тяжести. Различные виды псориаза проявляются в виде гнойных пузырьков (пустулезный псориаз), множественного некротического отторжения кожи (эритродермический псориаз), каплевидных точек (капельный псориаз) и гладких воспалительных поражений (инверсный псориаз). Данным изобретением рассматривается лечение всех видов псориаза (например, psoriasis vulgaris, psoriasis pustulosa, psoriasis erythrodermica, psoriasis arthropathica, parapsoriasis, palmoplantar pustulosis).

В рамках методов данного изобретения, терапевтически эффективное количество антител по изобретению вводится млекопитающему в случае необходимости. Термин «вводится» используется здесь как обозначающий предоставление антител по данному изобретению млекопитающему любым способом, обеспечивающим необходимый результат. Они могут быть введены, например, внутривенно или внутримышечно. Несмотря на то, что человеческие антитела по данному изобретению являются особенно пригодными для введения людям, они также могут вводиться и другим млекопитающим. Термин «млекопитающие» в данном контексте подразумевает включение (не ограничиваясь этим) людей, лабораторных животных, а также домашних и сельскохозяйственных животных. «Терапевтически эффективное количество» означает такое количество антитела из данного изобретения, которое, будучи введенным млекопитающему, эффективно приводит к желаемому эффекту, такому, как ингибирование киназной активности или ингибирование роста опухоли.

Идентификация подобных заболеваний определяется способностями и знаниями специалистов в данной области. Например, человеческие индивидуумы, страдающие от клинически значительных проявлений неопластических или ангиогенных заболеваний или которые подвержены риску проявления клинически значительных симптомов, являются подходящими кандидатами для введения данных EGFR-антител. Клинический врач, являющийся специалистом в данной области, способен без труда определить, например, по результатам клинических тестов, исследования физического состояния и медицинской и семейной истории, является ли индивидуум кандидатом для такого лечения.

Данные анти-EGFR антитела могут вводиться для терапевтического лечения пациенту, страдающему опухолью или патологическим состоянием, ассоциированным с ангиогенезом, в количествах, достаточных для предотвращения, ингибирования или уменьшения прогрессии опухоли или патологического состояния. Прогрессия включает, например, рост, инвазивность, метастазирование и/или рецидив опухоли или паталогического состояния. Количество, достаточное для достижения этой цели, определяется как терапевтически эффективная доза. Количества, эффективные для этой цели, будут зависеть от тяжести заболевания и от общего состояния собственной иммунной системы пациента. Расписание дозировки также будет различным в зависимости от стадии заболевания и состояния пациента и обычно варьируется от одной ударной дозы или непрерывного вливания до нескольких введений в день (например, каждые 4-6 часов), или в соответствии с указаниями лечащего врача и состоянием пациента. Следует, однако, заметить, что данное изобретение не ограничивается никакой определенной дозировкой.

Смесь EGFR-антагонистов, например, моноклональных антител, является особенно эффективным способом лечения для ингибирования роста опухолевых клеток. Смесь может включать не-антительные EGFR-антагонисты в количестве от 2, 3 или 4 рецепторных антагонистов до 6, 8 или 10.

В варианте осуществления изобретения, анти-EGFR антитела могут вводиться в комбинации с одним или более анти-неопластическими средствами. Для примеров комбинированной терапии см., например, U.S. Patent No. 6,217,866 (Schlessinger et al.) (анти-EGFR антитела в комбинации с анти-неопластическими средствами); WO 99/60023 (Waksal et al.) (анти-EGFR антитела в комбинации с облучением). Могут использоваться любые подходящие анти-неопластические средства, такие как химиотерапевтические средства, облучение, или их комбинации. Анти-неопластическое средство может быть алкилирующим средством или анти-метаболитом. Примеры алкилирующих средств включают, но не ограничиваются, следующими: цисплатин, циклофосфамид, мелфалан и дакарбазин. Примеры анти-метаболитов включают, но не ограничиваются, следующими: доксорубицин, даунорубицин, паклитаксель, иринотекан (СРТ-11) и топотекан. В случае, если анти-неопластическим средством служит облучение, источник радиации может быть как внешним (внешнелучевая радиационная терапия, external beam radiation therapy - EBRT), так и внутренним (брахитерапия, brachytherapy - ВТ) по отношению к пациенту. Дозировка назначенного анти-неопластического средства определяется многими факторами, включая, например, вид средства, тип и тяжесть опухоли, подлежащей лечению, а также способ введения средства. Однако следует особо подчеркнуть, что данное изобретение не ограничивается никакой определенной дозировкой.

При лечении гиперпролиферативных заболеваний, введение антител из данного изобретения описанными выше способами может сочетаться с введением любых традиционных лечебных средств. Например, в случае, когда гиперпролиферативным заболеванием является псориаз, известно большое количество доступных средств общего и местного действия. Общие средства при псориазе включают метотрексат и оральные ретиноиды, такие как ацитреин, этретинат и изотретиноин. Прочие общие препараты при псориазе включают гидроксимочевину, NSAIDS, сульфасалазин и 6-тиогуанин. Антибиотики и антимикробные препараты могут быть использованы для предотвращения инфекций, которые могут вызывать обострение и ухудшение псориаза. Местные средства при псориазе включают антралин, кальципотриен, угольную смолу, кортикостероиды, ретиноиды, кератолитики и тазаротен. Стероиды местного применения являются одним из наиболее обычных средств терапии, назначаемых при легком и среднем псориазе. Стероиды местного применения наносятся на поверхность кожи, но некоторые из них вводятся в область псориатического поражения путем инъекции.

Лечение гиперпролиферативных заболеваний далее включает введение анти-EGFR антител совместно с фототерапией. Фототерапия включает обработку светом любой длины волны, которая понижает симптомы гиперпролиферативного заболевания, а также фотоактивацию химиотерапевтических средств (фотохимиотерапия). Для дальнейшей дискуссии по лечению гиперпролиферативных расстройств смотреть WO 02/11677 (Teufel et al.) (лечение гиперпролиферативных расстройств с помощью антагонистов рецепторов эпидермального фактора роста).

Анти-EGFR антитела по данному изобретению можно вводить вместе с EGFR антагонистами и/или антагонистами других RTK, такими как антитела, блокирующие RTK лиганды или нейтрализующие RTK другими способами. Лиганды EGFR включают, например, EGF, TGF-α амфирегулин, гепарин-связывающий EGF (HB-EGF) и бетацеллюлин. EGF и TGF-α считаются главными эндогенными лигандами, вызывающими стимуляцию при посредстве EGFR, хотя было показано, что TGF-α является более сильным промотером ангиогенеза. Соответственно, EGFR-антагонисты включают антитела, которые связываются такими лигандами и таким образом блокируют связывание с EGFR и его активацию.

Другим примером такого RTK является VEGFR. В варианте осуществления данного изобретения, анти-EGFR антитело используется в комбинации с антагонистом VEGFR. В одном варианте осуществления данного изобретения, анти-EGFR антитело используется в комбинации с рецепторным антагонистом, который специфично связывается с VEGFR-2/KDR рецептором (PCT/US92/01300, filedFeb. 20,1992; Terman et al., Oncogene 6; 1677-1683 (1991)). В другом варианте осуществления данного изобретения, анти-EGFR антитело используется в комбинации с рецепторным антагонистом, который специфично связывается с рецептором VEGFR-1/Flt-l (Shibuya М. et al., Oncogene 5, 519-524 (1990)). Особенно предпочтительны антиген-связывающие белки, которые связываются внеклеточными доменами VEGFR-1 или VEGFR-2 и блокируют связывание лигандами (VEGF или P1GF) и/или нейтрализуют активацию посредством VEGF или PIGF. Например, Mab IMC-1121 связывается растворимым и производимым на поверхность клетки KDR. Mab IMC-1121 содержит VH и VL домены, полученные из человеческой библиотеки фагового дисплея Fab (см. WO 03/075840). В другом примере ScFv 6.12 связывается растворимым и производимым на поверхность клетки Flt-1. ScFv 6.12 содержит VH и VL домены мышиного моноклонального антитела МАb 6.12. Линия клеток гибридомы, продуцирующая МАb 6.12. депонирована под АТСС номером РТА-3344.

Другим примером такого RTK служит рецептор инсулиноподобного фактора роста (insulin-like growth factor receptor, IGFR). В некоторых видах опухолевых клеток ингибирование функции EGFR может компенсироваться усилением сигнальных путей других рецепторов фактора роста, в особенности стимуляцией IGFR. Далее, ингибирование сигнальности IGFR приводит к повышению чувствительности опухолевых клеток к определенным терапевтическим средствам. Стимуляция как EGFR, так и IGFR приводит к фосфорилированию молекул общего каскада передачи сигнала, включая Akt и р44/42, хотя и в различной степени. Соответственно, в варианте осуществления данного изобретения, антагонист IGFR (например, антитело, которое связывается IGF или IGFR и нейтрализует рецептор) вводится совместно с антителом по данному изобретению, блокируя, таким образом, второй вход в общий каскад сигнального пути (например, ингибирование активации Akt и/или р44/42). Примером человеческого антитела, специфичного к IGFR, служит IMC-A12 (см. WO 2005/016970).

Другие примеры рецепторов фактора роста, вовлеченных в онкогенез, включают рецепторы тромбоцитарного фактора роста (platelet-derived growth factor, PDGF), фактора роста нервов (NGF) и фибробластный фактор роста (FGF).

Анти-EGFR антитела могут также вводиться с внутриклеточными антагонистами RTK, которые ингибируют активность RTK или элементов ассоциированных с ними сигнальных каскадов, которые вовлечены в рост опухоли или в ассоциированный с опухолью ангиогенез. Внутриклеточные антагонисты RTK являются преимущественно малыми молекулами. Некоторые примеры малых молекул включают органические соединения, металлоорганические соединения, соли органических и металлоорганических соединений и неорганические соединения. Атомы в малых молекулах соединяются посредством ковалентных и ионных связей, первые типичны для малых органических соединений, таких как небольшие молекулы тирозин-киназных ингибиторов, а вторые типичны для небольших молекул неорганических веществ. Расположение атомов в небольшой органической молекуле может представлять собой цепочку, например, углерод-углеродную цепочку или углерод-гетероатомную цепочку, или включать циклы из атомов углерода, например, бензол или полициклические системы, или комбинации из углерода и гетероатомов, например гетероциклы, такие как пиримидин или хиназолин. Хотя малые молекулы могут обладать любым молекулярным весом, в целом они включают молекулы, которые могли бы считаться биологическими молекулами, если бы их молекулярный вес не был бы меньше 650Д. Малые молекулы включают как соединения, встречающиеся в природе, такие как гормоны, нейротрансмиттеры, нуклеотиды, аминокислоты, сахара, липиды и их производные, так и получаемые традиционным органическим синтезом, биосинтезом или их комбинациями. См. например, Ganesan, DrugDoscov. Todayl(1): 47-55 (Jan. 2002); Lou, Drug Discov. Today, 6(24): 1288-1294 (Dec. 2001).

Более предпочтительно, малые молекулы для использования в качестве внутриклеточных RTK антагонистов, в соответствии с настоящим изобретением, являются внутриклеточными EGFR антагонистами, конкурирующими с АТР в связывании с внутриклеточным участком EGFR для связывания имеющим киназный домен, или с белками, вовлеченными в пути передачи сигнала активации EGFR. Примерами таких путей передачи сигнала служат рас-митоген-активированный протеин-киназный (ras-mitogen activated protein kinase, МАРК) путь, фосфатидилиноситал-3 киназный (phosphatidylinosital-3 kinase, (P13K)-Akt)) путь, стресс-активированный протеин-киназный (stress-activated protein kinase, SAPK) путь и путь передатчиков сигнала и активаторов транскрипции (signal transducers and activators of transcription, STAT). He лимитирующими примерами протеинов, вовлеченных в такие пути (и к которым могут присоединяться малые молекулы EGFR-антагонистов в соответствии с данным изобретением), служат GRB-2, SOS, Ras, Raf, МЕК, МАРК и матриксные металлопротеиназы (MMPs).

Одним из примеров EGFR антагониста с малым размером молекулы служит IRESSA™ (ZD1939), который представляет собой производное хинозалина, которое работает как АТР-миметик, чтобы ингибировать EGFR. Смотреть U.S. Patent No. 5,616,582 (Zeneca Limited); WO 96/33980 (Zeneca Limited) at p.4; см. также Rowinsky et al, Abstract 5 presented at the 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001; Anido et al., Abstract 1712 presented at the 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001. Другим примером EGFR-антагониста с малым размером молекулы служит TARCEVA™ (OSI-774), который представляет собой 4-(замещенное фениламино) хиназолин производное [6,7-бис(2-метокси-этокси)-хиназолин-4-ил]-(3-этинил-фенил)амин гидрохлорид] EGFR-ингибитор. Смотреть WO 96/30347 (Pfizer Inc.) на, например, стр.2, строчка 12 до стр.4, строчка 34 и стр.19, строчки 14-17. См. также Moyeref al, Cancer Res., 57:4838-48 (1997); Pollack et al, J. Pharmacol, 291: 739-8 (1999). TARCEVA™ может работать посредством ингибирования фосфорилирования EGFR и его каскадных PI3/AJkt и MAP (митоген активированный протеин) киназных путей передачи сигнала, приводя к прекращению клеточного цикла при посредстве р27. Смотреть Hidalgo et al, Abstract 281 presented at the 37th Annual Meeting of ASCO, San Francisco, CA, 12-15 May 2001.

Сообщалось о других малых молекулах, ингибирующих EGFR, многие из которых через тирозин-киназный домен EGFR. Некоторые примеры таких EGFR-антагонистов с малым размером молекулы описаны в WO 91/116051, WO 96/30347, WO 96/33980, WO 97/27199 (Zeneca Limited). WO 97/30034 (Zeneca Limited), WO 97/42187 (Zeneca Limited), WO 97/49688 (Pfizer Inc.), WO 98/33798 (Warner Lambert Company), WO 00/18761 (American Cyanamid Company) и WO 00/31048 (Warner Lambert Company). Примеры специфичных EGFR-антагонистов с малым размером молекулы включают CI 033 (Pfizer), который представляет собой ингибитор тирозин-киназ хиназолин (N-[4-(3-хлор-4-фтор-фениламино)-7-(3-морфолин-4-ил-пропокси) хиназолин-6-ил]-акриламид), особенно EGFR, и описан в WO 00/31048 на стр.8, строчки 22-6; PKI 66 (Novartis), который является пирролопиримидиновым ингибитором EGFR и который описан в WO 97/27199 на стр.10-12; GW2016 (GlaxoSmithKline), который является ингибитором EGFR и HER2; ЕКВ569 (Wyeth), который, по сообщениям, ингибирует рост опухолевых клеток, сверхэкспрессирующих EGFR или HER2 in vitro и in vivo; AG-1478 (Tryphostin), который является хиназолином с мальм размером молекулы, который ингибирует передачу сигнала как от EGFR, так и erbB-2; AG-1478 (Sugen), который является бисубстратным ингибитором, который также ингибирует протеин киназу СК2; PD 153035 (Parke-Davis), который, по сообщениям, ингибирует EGFR-киназную активность и рост опухолей, вызывает апоптоз клеток культуры и повышает цитотоксичность цитотоксических химиотерапевтических средств; SPM-924 (Schwarz Pharma), который является тирозин-киназным ингибитором, использующимся для лечения рака простаты; СР-546,989 (OSI Pharmaceuticals), который, по сообщениям, является ингибитором ангиогенеза и используется для лечения солидных опухолей; ADL-681, который является EGFR-киназным ингибитором и используется для лечения рака; PD 158780, который является пиридопиримидином и который, по сообщениям, ингибирует опухолевый рост ксенотрансплантатов А4431 у мышей; СР-358,774, который является хиназолином и который, по сообщениям, ингибирует автофосфорилирование в HN5 ксенотрансплантатах у мышей; ZD1839, который является хиназолином и который, по сообщениям, обладает противоопухолевой активностью на мышиных ксенотрансплантатных моделях, включая рак женских наружных половых органов, NSCLC, простаты, колоректальный и яичников, CGP 59326А, который является пирролопиримидином, который, по сообщениям, ингибирует рост EGFR-позитивных ксенотрансплантатов у мышей; PD 165557 (Pfizer); CGP54211 и CGP53353 (Novartis), которые являются дианилнофталимидами. Природные тирозин-киназные ингибиторы EGFR включают генистеин, гербимицин А, кверцетин и эрбстатин.

Прочими малыми молекулами, которые, по сообщениям, ингибируют EGFR и, таким образом, попадающие в рамки данного изобретения, являются трициклические соединения, такие как соединения, описанные в патенте США No. 5679683; производные хиназолина, такие как описаны в патенте США No. 5616582; а также индольные соединения, такие как описаны в патенте США No. 5196446.

В другом варианте антагонист EGFR может вводиться в комбинации с одним или более адъювантами, такими как, например, цитокины (например (IL-10 и IL-13) или другие иммунные стимуляторы, такие как, хемокин, опухолеспецифические антигены и пептиды. Смотреть, например, Larrivee et al., выше. Однако следует принимать во внимание, что введение только EGFR-антител достаточно для терапевтически эффективного предотвращения, ингибирования или уменьшения прогрессирования опухоли.

При комбинированной терапии, анти-EGFR антитело вводится до, во время или после начала терапии другим средством, также как и в любой комбинации, например, до и во время, до и после, во время и после, или до, во время и после начала терапии анти-неопластическим средством. Например, анти-EGFR антитело может вводиться между 1 и 30 днями, предпочтительно 3 и 20 днями, более предпочтительно между 5 и 12 днями до начала радиационной терапии. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, химиотерапия назначается одновременно или, более предпочтительно, следом за терапией антителом.

В рамках данного изобретения, любой доступный способ или путь может использоваться для введения анти-EGFR антител по данному изобретению, и необязательно, для совместного введения анти-неопластических средств и/или антагонистов других рецепторов. Режимы приема анти-неопластических средств, в соответствии с данным изобретением, включают любой режим, считающийся наиболее подходящим для лечения неопластического состояния пациента. Различные злокачественные образования могут требовать использования специфических противоопухолевых антител и специфических анти-неопластических средств, что определяется для каждого пациента в отдельности. Способы назначения включают, например, пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Назначаемая доза антагониста зависит от многих факторов, включая, например, вид антагониста, вид и тяжесть опухоли, подлежащей лечению, и способ введения антагониста. Однако следует особо отметить, что данное изобретение не ограничивается каким-либо конкретным способом или путем введения.

Следует заметить, что анти-EGFR антитело по данному изобретению может вводиться в виде конъюгата, который специфично связывается рецептором и оказывает токсичное, летальное действие, с последующей интернализацией комплекса лиганд-токсин.

Конъюгат антитело-медикамент/малая молекула может быть образован напрямую или посредством линкера, пептида или не-пептида.

В другом аспекте данного изобретения, анти-EGFR антитело по данному изобретению может быть химически или биосинтетически связано с одним или более анти-неопластическим или анти-ангиогенным средством.

Данное изобретение дополнительно включает анти-EGFR антитела с присоединенными фрагментами в роли мишени или метки. Мишень служит первым членом связываемой пары. Анти-неопластические средства, например, конъюгируются со вторым членом такой пары и, таким образом, ориентируются по направлению к области, где находится анти-EGFR антитело. Общим примером такой связующей пары являются авидин и биотин. В предпочтительном варианте, биотин конъюгируется с анти-EGFR антителом и, таким образом, является мишенью для анти-неопластического средства или другой субстанции, конъюгированной с авидином или стрептавидином. Альтернативным образом, биотин или другое подобное вещество присоединено к анти-EGFR антителу по данному изобретению и используется как метка, например в диагностической системе, в которой определяемое средство, генерирующее сигнал, конъюгировано с авидином или стрептавидином.

Предполагается, что анти-EGFR антитела по данному изобретению, в случае применения в отношении млекопитающих с целью профилактики или лечения, вводятся в форме состава, дополнительно включающего фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, например, один или более из следующих: вода, салин, фосфатный буферный солевой раствор, декстроза, глицерол, этанол и подобные, а также их комбинации. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать некоторые количества вспомогательных веществ, таких как увляжняющие или эмульгирующие средства, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность связанных протеинов. Инъекционные составы, как это хорошо известно в данной области, могут быть подобраны таким образом, чтобы обеспечить быстрое, постоянное или задержанное высвобождение активного ингредиента после введения млекопитающему.

Данное изобретение также включает наборы для ингибирования роста опухолей и/или ассоциированного с опухолями ангиогенеза, включающие терапевтически эффективное количество человеческого анти-EGFR антитела. Набор может также содержать любой подходящий антагонист для, например, другого рецептора фактора роста, вовлеченного в онкогенез или ангиогенез (например, VEGFR-l/Flt-1, VEGFR-2, PDGFR, IGFR, NGFR, FGFR и т.д., как описано выше). Альтернативно, или в дополнение к этому, наборы по данному изобретению могут также содержать анти-неопластическое средство. Примеры подходящих анти-неопластических средств, в контексте данного изобретения, были описаны выше. Наборы по данному изобретению могут также содержать адъюватны, примеры также были описаны выше.

Кроме того, в пределах данного изобретения включенным также является применение данных антител in vivo и in vitro в исследовательских и диагностических методах, известных в данной области. Диагностические методы включают наборы, содержащие антитела по данному изобретению.

Соответственно, данные рецепторные антагонисты, таким образом, могут использоваться in vivo и in vitro в исследовательских, диагностических, профилактических и лечебных методах, известных в данной области. Разумеется, является понятным и ожидаемым то, что специалистами в данной области могут производиться изменения в элементах данного изобретения, и подразумевается, что такие изменения являются включенными в объем данного изобретения.

Повышенная активация EGFR иногда ассоциирует с состояниями, которые подвергаются лечению в соответствии с данным изобретением. Высокий уровень концентрации лиганда, амплификации гена EGFR, повышенная транскрипция рецептора или мутации, которые вызывают нерегулируемую рецепторную передачу сигнала, могут быть причиной повышенной EGFR активации. Амплификация гена, кодирующего EGFR, также вызывает повышение количества лигандов, связываемых EGFR, что в дальнейшем может стимулировать пролиферацию клетки. EGFR может сверхэкспрессироваться при отсутствии амплификации гена, предположительно посредством мутаций, повышающих транскрипцию EGFR, трансляцию mRNA или стабильность протеина. Мутанты EGFR были идентифицированы в глиомах, не-мелкоклеточных карциномах легких, карциномах яичников и простаты, обладающих конститутивно активной тирозин-киназой, что скорее значимо для высокоуровневой активности EGFR, чем сверхэкспрессии EGFR при этих видах рака. Смотреть, например, Pedersen et al., Ann. Oncol., 12(6):745-60 (2001). (Мутация EGFR третьего типа - называемая в разных случаях EGFRvlll, de2-7 EGFR или AEGFR - отсутствие части внеклеточного связывающего участка лиганда, кодированного экзонами 2-7.); см. также Wikstrand et al., Cancer Res., 55:3140-3148 (1995).

ПРИМЕРЫ

Нижеследующие примеры служат для дальнейшей иллюстрации изобретения, но не должны быть истолкованы как какое-либо ограничение объема изобретения. Подробные описания стандартных методов, таких как те, которые применяются для создания векторов и плазмид, введения генов, кодирующих полипептиды, в такие векторы и плазмиды, внедрения плазмид в клетки-хозяина, а также производства и исследования генов и генных продуктов, могут быть получены из ряда публикаций, включая Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (198 9). Все упомянутые здесь литературные ссылки являются включенными во всем объеме.

Пример 1 - Выделение человеческих анти-EGFR антител

В целом, человеческие антитела выделялись из бактериофаговой библиотеки натуральной человеческой Fab, полученной от Dyax, Cambridge, MA, методом биообогащения (многократной аффинной селекции) по активности к растворимым человеческим EGFR, выделенным из клеток опухолей, его вырабатывающих. Бактериофаговая библиотека натуральной Fab, содержащая вариабельные области тяжелых и легких цепей антител, производимых человеческими клетками, (периферические лимфоциты В), составлена из натуральных, неиммунизированных человеческих клеток и клеток безопухолевой селезенки пациента с желудочной карциномой, с помощью реакций амплификации в первичных PCR с использованием прямых и обратных праймеров, специфичных для V гена, и клонируя индивидуальные VH and VL гены в отдельные векторы (WO 00/70023).

Исходная Fab библиотека был выращена до лог-фазы, обработана фагом-помощником М13К07 и амплифицирована в течение ночи в среде 2YTAK (2YT с 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицина) при 30°С. Фаговый препарат был осажден в 4% PEG/0,5M NaCl и повторно ресуспендирован в 3% обезжиренном молоке/PBS для блокировки неспецифического связывания.

Приблизительно 1×1012 pfu предварительно блокированных фагов инкубировали с 106 клеток А431, сверхэкспрессирующих EGFR, в 1 мл чистой среды DMEM при 4°С в течение 1 ч, после чего клетки промыли 15 раз с помощью PBS. Связанные фаги были извлечены инкубацией при комнатной температуре в течение 30 минут в 1 мл PBS с содержанием 0,5 мг/мл МС-С225. Извлеченные фаги инкубировались в 10 мл достигнувших половины лог-фазы клеток TG1 при 37°С в течение 30 минут стационарно и в течение 30 минут со встряхиванием. Инфицированные клетки TG1 были пеллетированы и помещены на несколько больших 2YTAG планшетов и инкубировались в течение ночи при 30°С. Все выросшие на планшете колонии были соскоблены в 3-5 мл 2YTA среды, смешаны с глицеролом (конечная концентрация 10%), аликвотированы и хранились при - 70°С. Для следующего круга селекции, 100 мкл фагового штамма было добавлено к 25 мл 2YTAG среды и выращено до половины лог-фазы. Культура была обработана с помощью фага-помощника М13К07, амплифицирована, осаждена и использована для селекции описанным выше способом.

Индивидуальные клоны TG1, выделенные на каждом уровне селекции, были произвольно выбраны и выращены при 37°С на 96-луночном планшете и обработаны с помощью фага-помощника М13К07 как описано выше. Препарат фагов был блокирован с помощью 1/6 объема 18% смеси молоко/PBS при комнатной температуре в течение 1 часа и добавлен на 96-луночный Maxi-sorp планшет (Nunc), покрытый рекомбинантным EGFR (1 мкг/мл на 100 мкл). После инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч, планшет был трижды промыт с помощью PBST и инкубирован с мышиным анти-М13 конъюгатом фаг-HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Планшет был промыт пять раз, добавлен субстрат ТМВ пероксидазы (KPL, Gaithersburg, MD) и с помощью планшетного считывателя (Molecular Devices, Sunnyvale, СА) было определено поглощение при 450 нм.

Идентифицированные клоны были далее тестированы на блокирование связывания EGF. Для дифференцирования уникальных клонов использовался метод фингерпринтинга ДНК клонов. Репрезентативные клоны из каждого варианта расщепления выбирались и подвергались секвенированию ДНК.

Пример 2 - Экспрессия и очистка растворимых фрагментов Fab

Плазмиды, содержащие гены, кодирующие 11F8 Fab, использовались для трансформации нон-суппрессорного Е. coli хозяина НВ2151. Экспрессию фрагментов Fab в НВ2151 стимулировали культивированием клеток в 2YTA среде, содержащей 1 ммоль изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозида (IPTG, Sigma) при 30°С. Периплазменный экстракт pf клеток был приготовлен повторным ресуспендированием клеточной таблетки в 25 ммоль Tris (рН 7,5), содержащем 20% (вес/объем) сахарозы, 200 ммоль NaCl, ImM EDTA, и 1 ммоль PMSF, с последующей инкубацией при 4°С с осторожным встряхиванием в течение 1 ч. После центрифугирования растворимый Fab протеин был очищен от надосадочной жидкости аффинной хроматографией с использованием Protein G колонки, следуя инструкции производителя (Amersham Pharmacia Biotech).

Пример 3 - Конструирование человеческих анти-EGFR IgGl антител

Человеческий анти-EGFR Fab был преобразован в полный человеческий IgGI. Выбранный Fab кандидат был выделен из человеческой натуральной Fab-фаговой библиотеки благодаря высокой аффинности и активности по блокированию лигандов человеческого EFGR (ErbB). Последовательности ДНК генов 11F8 Fab, кодирующие вариабельные участки легких (SEQ ID NO:15) и тяжелых цепей, были получены (SEQ ID NO:7) путем PCR амплификации и клонированы в вектор экспрессии, содержащий константный домен человеческого lgG1, с использованием зкспрессионной системы глютамин синтазы от Lonza Biologies, Inc.

Амплификация PCR была произведена в две стадии с использованием набора Expand PCR (Boehringer Mannheim, Inc.) в соответствии с инструкциями производителя и примерами, приведенными в таблице 3.

В целом, PCR продукты тяжелых и легких цепей были амплифицированы с использованием 25 нг C11F8 Fab плазмидной ДНК в качестве модели и пары прямых и обратных праймеров тяжелых (C11F8HF и C11F8HR) и легких (C11F8LF и C11F8LR) цепей в 50 мкл Expand Buffer System #3 в следующих условиях циклов, см. Таблицу 4:

Таблица 4
1 цикл 94°С 2 минуты
5 циклов 94°С 20 секунд
48°С 2 минуты
68°С 20 секунд
20 циклов 94°С 20 секунд
65°С 60 секунд
68°С 2 минуты
1 цикл 65°С 5 минут

Образовавшиеся PCR продукты добавляют в последовательность из 57 пар оснований к 5'-концу 19-ти аминокислотной сигнальной последовательности гена мышиной тяжелой цепи иммуноглобулина (MGWSCHLFLVATATGVHS, SEQ ID NO:25), что обеспечивает эффективное образование и секрецию иммуноглобулина. Для эффективного инициирования трансляции генов в клетках млекопитающих, добавляется консенсусная последовательность "Kozak" (J.Mol. Biol 196:947) путем амплификации тяжелой и легкой цепи во вторичной PCR реакции, с использованием прямого праймера OSEF в комбинации с CH11F8HR или C11F8LR соответственно. Этот PCR продукт также предоставляет место расщепления рестриктазой 5' Hind III для клонирования амплифицированного продукта в подходящий вектор экспрессии.

Очищенный в агарозном геле Hind 111-Nhe I фрагмент тяжелой цепи был клонирован в управляемый промотером CMV вектор pDFc (фиг.1А) с целью создания непрерывного участка кДНК, кодирующего вариабельную и константную область последовательности ДНК. Hind Ill-Xba I фрагмент легкой цепи был клонирован во второй управляемый промотером CMV вектор p12.1L (фиг.1В). Образовавшаяся структура содержит один интрон, разделяющий вариабельный легкий и каппа константный участки, который эффективно выщепляется из образующегося РНК-транскрипта. Рекомбинантные плазмиды были трансформированы в компетентные Е.coli, и отобранные плазмидные штаммы подвергались скринингу на предмет транзиторной коэкспрессии тяжелых и легких цепей в клетках COS.

Пример 4 - Экспрессия человеческих анти-EGFR IgGI антител

Для стабильной трансфекции единый плазмидный вектор был генерирован клонированием Not1-Sal1 фрагмента из экспрессионной кассеты, содержащей тяжелую цепь под CMV промотером, в вектор p12.1L, содержащий легкую цепь. Образовавшийся плазмидный вектор pGS-11F8 был рестрикционно картирован (фиг.1С). Рестрикционный анализ показан на фиг.2.

Рекомбинантная клеточная линия, использованная для производства 11F8 моноклональных антител, происходит от несекретирующей клеточной линии мышиной миеломы, NS0 (в соответствии с Barnes et al., Cytotechnology 32:109 (2000)). Клеточная линия NS0 была получена от Lonza Biologies, Inc. (Slough, Berkshire, UK).

Клеточная линия миеломы NSO была трансфицирована плазмидой pGS-11F8 путем электропорации с использованием BioRad Gene Pulser II, при напряжении 250 В с емкостью 400 мкФ и константой времени 9,0 мсек. Электропорированные клетки были повторно ресуспердированы в DMEM (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS), содержащем 10% диализированной фетальной телячьей сыворотки, dFCS (HyClone, Logan, UT) и 2 ммоля глютамина (InVitrogen/Life Technologies, Paisley, PA). 50 мкл повторно ресуспендированных клеток были посеяны на 96-ти луночный планшет с плотностью 5000-10000 клеток на лунку. Глютамин синтетаза (GS)-no3HTHBHbie трансфектанты были выбраны добавлением DMEM среды, не содержащей глютамина, содержащей 10% dFCS с дополнительной 1×GS (JRH Biosciences, Inc.) двадцатичетырехчасовой пост-трансфекцией. Клетки культивировали 2-4 недели при 37°С с 5% CO2 для обеспечения роста и развития колоний перед скринингом на предмет клонов, экспрессирующих антитело.

Клоны, экспрессирующие анти-EGFR антитело, были определены методом скрининга с использованием ELISA-анализа на основе конъюгата античеловеческого Fc (гамма) и пероксидазы хрена обыкновенного, детектирование осуществлялось при А450нм. Позитивные клоны были размножены и перепроверены через 3-5 дней культивационного периода. Наиболее позитивные (продукция антител на уровне 25 мкл/мг и более) были размножены для дальнейших анализов. Основываясь на продукции антитела в 24 9 мкг/мл, клон номер 34 был выбран для субклонирования с ограниченным разбавлением и перепроверки. Клон 34-5 был выбран, основываясь на постоянном уровне продукции, соответствующем или превышающем уровень исходной клеточной линии (производство серии 310 мкг/мл, с подпиткой 0,75-0,8 г/л). Клон 34-5-3 был выделен после второго этапа субклонирования и согласно результатам анализа клон 34-5-3 продуцирует антитело на высоком уровне (производство серии 324 мкг/мл, с подпиткой 1,0-1,2 г/л). В последующих примерах было произведено дальнейшее исследование характеристик этого клона.

Пример 5 - In Vitro связывание антител с EGFR

Антитела сканировались с помощью ELISA-анализа на твердой поверхности при сравнении IMC-11F8 и IMC-C225 по характеристикам связывания. Девяностошестилуночный микротитровочный планшет был покрыт на ночь с концентрацией EGFR 1 мкг/мл в карбонатном буфере при 4°С. Планшет был блокирован с помощью солевого фосфатного буфера (phosphate buffered saline, PBS) с добавлением 10% сыворотки новорожденного теленка в течение часа при 37°С. Различные количества IMC-11F8 или IMC-C225 добавлялись на планшет и инкубировались при комнатной температуре еще 60 минут с последующим промыванием с помощью PBS. Далее добавляли конъюгат мышиного анти-человеческого Fc с пероксидазой хрена обыкновенного (horse radish peroxidase, HRP) и инкубировали 60 дополнительных минут при комнатной температуре с последующим интенсивным промыванием с помощью PBS. Затем планшет инкубировали с субстратом HRP в течение 30 сек - 2 мин, и реакцию останавливали с помощью 0,1 М H2SO4. Планшет считывали с помощью ELISA-анализа при OD450нм.

Фиг.3 показывает связывание IMC-11F8 и IMC-C225 антител с EGFR. Как IMC-11F8, так и IMC-C225 обнаруживают сравнимое связывание с EGFR.

Пример 6 - Кинетика связывания анти-EGFR антител

Кинетика сязывания IMC-11F8 и IMC-C225 IgG антител и их соответствующих Fab фрагментов измерялась с помощью BIAcore sensor (Pharmacia Biosensor). Гибридный белок EGFR-AP иммобилизовали на сенсорный чип и вводили растворимые IMC-11F8 и IMC-C225 антитела в концентрациях от 1,5 нМ до 100 нМ. Сенсорограммы считывали при каждой концентрации и анализировали с помощью BIA Evaluation 2.0, программы для определения констант скорости процесса, кon и koff. Константу аффинности, Kd, вычисляли из соотношения этих констант и koff/kon.

Кинетика связывания анти-EGFR антител из данного изобретения проиллюстрирована в Таблице 5. Как видно, оба IgG антитела обладают схожей кинетикой связывания с EGFR.

ТАБЛИЦА 5
Антитело Формат кon (105M-1 c-1) koff (10-4c-1) kd (нм)
IMC-11F8 Fab 22,9±9,9 36,7±8,5 1,78±0,5
IMC-11F8 IgG 18,6±7,7 5,8±2,2 0,32±0,06
IMC-C225 Fab 23,1±4,8 11,7±3,4 0,53±0,17
IMC-C225 IgG 21,3±7,3 5,4±1,0 0,3±0,2
Результаты представляют среднее значение ± статистическая погрешность из как минимум трех измерений

Пример 7 - Специфичность антител к EGFR

Связываемость антител с EGFR была оценена с помощью 125I-EGF конкурентного анализа. Клетки НТ29 были посеяны с концентрацией 2×104 клеток на лунку на 24-луночном планшете COSTAR™ (Fisher Scientific, U.S.A.) в среде McCoy's 5а с добавкой 1,5 ммоль L-глютамина, 10% CS и антибиотиками при 37°С. Затем клеточный монослой инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с разными концентрациями немеченых EGF, 11F8 или IMC-C225, которые были смешаны с разными количествами 125I-меченной EGF. Клетки промыли холодным PBS и измеряли клеточную радиоактивность с помощью счетчика гамма-излучения.

На фиг.4 демонстрируется ингибирование связывания 125I-EGF с EGFR в клетках НТ29. При концентрациях между 10 и 100 нмоль, IMC-11F8 эффективен так же, как и IMC-C225 в ингибировании связывания 125I-EGF с EGFR в клетках НТ29. Оба антитела успешнее в связывании, чем EGF, который является натуральным лигандом EGFR. Схожие результаты были получены для ингибирования связывания 125I-EGF с EGFR в клетках А431.

Пример 8 - Активация EGFR

В целом, анализ активации киназного рецептора (kinase receptor activation assay, KIRA assay) проводили с использованием клеток ВхРСЗ или А431. Первоначально клетки выращивали до 90% покрытия монослоем в DME с добавлением до 4 ммоль L-глютамина и содержанием 1,5 г/л бикарбоната натрия и 4,5 г/л глюкозы, 10% CS при 37°С. Перед экспериментом клетки помещали на 24 ч в DME с содержанием 0,5% CS. Для оценки эффекта антител, IMC-11F8, IMC-C225 и IMC-1 С11 на активацию EGFR, вызванную с помощью EGF, различные концентрации антител предварительно связывали при комнатной температуре в течение 30 минут, с последующей стимуляцией EGF с концентрацией 8 нг/мл в течение дополнительных 15 минут. После стимуляции клеточные монослои промывали ледяным PBS, содержащим 1 ммоль ортованадата натрия. Клетки лизировали в лизирующем буфере (20 ммоль Tric-HCl, рН 7,4, 1% Triton Х-100, 137 ммоль NaCl, 10% глицерол, 10 ммоль EDTA, 2 ммоль ортованадата натрия, 100 ммоль NaF, 100 ммоль пирофосфата натрия, 5 ммоль PEFABLOC®SC (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN), 100 мкг апротинина и 100 мкг/мл лейпептина) и центрифугировали при 14000 g в течение 10 минут. Очищенный клеточный лизат добавили в лунки 96-луночных планшетов, покрытые поликлональными анти-EGFR антителами. Планшеты промыли для удаления неспецифически связанных белков и определили уровень фосфорилирования EGFR добавлением анти-фосфотирозиновых антител. После экстенсивного промывания количество связанного анти-фосфотирозинового антитела было измерено с момощью ELISA-анализа при OD450нм.

Результаты свидетельствуют о заметном уменьшении фосфорилирования EGFR антителом IMC-11F8 как в клетках ВхРСЗ (фиг.5), так и в А431 (фиг.6) по сравнению с контрольным антителом IMC-1C11.

Ингибирование EGF-стимулированного фосфорилирования EGFR было далее оценено с помощью анализа в Вестерн Блоте иммунопреципитированного EGFR. Клетки А431 были предварительно связаны с антителами с последующей стимуляцией с EGF, как было описано выше. Использовалось контрольное антитело, которое связывается с EGFR, но не ингибирует фосфорилирование EGFR. Белок (EGFR) иммунопреципитировали из очищенных лизатов с использованием поликлональных анти-EGFR антител и затем гранул Protein A Sepharose. Гранулы были затем однократно промыты с помощью 0,2% Triton Х-100, 10 ммоль Tris-HCl, рН 8,0, 150 ммоль NaCl, 2 ммоль EDTA (буфер А), дважды буфером А, содержащим 500 ммоль NaCl и дважды с помощью Tris-HCl, рН 8,0. Высушенные гранулы смешали с 30 мкл 2×SDS загрузочным буфером, прокипятили и нанесли надосадочную жидкость на SDS-PAGE. После разделения белков электрофорезом, белковую зону перенесли на нитроцеллюлозные фильтры для анализа в Вестерн Блоте. Фильтры были блокированы в течение ночи блокирующим буфером, 50 ммоль Tris-HCl, рН 7,4, 150 ммоль NaCl (TBS), содержащим 5% бычьего сывороточного альбумина и 10% обезжиренного сухого молока. Для определения фосфорилированного рецептора, блоты были обработаны анти-фосфотиразиновым антителом в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого блоты были интенсивно промыты с помощью 0,5×TBS с содержанием 0,1% Tween-20 (TBS-T) и проинкубированы с козьим анти-мышиным Ig конъюгированным с HRP (Amersham, Little Chalfont, U.K.). Блоты были промыты с TBS и инкубировались 1 минуту с хемолюминисцентным реагентом (ECL, Amersham, Little Chalfont, U.K.). Анти-фосфатирозин, реагирующий с фосфорилированными белками, был обнаружен экспонированием на высокоэффективной пленке для обнаружения люминесценции (Hyperfilm-ECL, Amersham, Little Chalfont, U.K.) в течение от 0.5 до 10 минут.

Анализ в Вестерн Блоте на фиг.7А демонстрирует, что IMC-11F8, также как IMC-C225, ингибирует фосфорилирование EGFR. Ни EGF-антитело, ни клетки, обработанные контрольными антителами, не ингибируют EGFR полностью. Фиг.7В показывает, что синтез EGFR не ингибируется при добавлении антител в клетки. Фиг.8 показывает, что фосфорилирование EGFR ингибируется IMC-11F8. Более чем 70% ингибирование наблюдалось для трех опухолевых клеточных культур разного происхождения (А431, В×РСЗ, НТ-29) при самой низкой из проверявшихся концентраций антитела (0,8 нмоль).

Также было проверено влияние IMC-11F8 на одни из главных сигнальных молекул каскада EGFR, киназы MAP р44/р42. IMC-11F8 блокировал фосфорилирование р44/42 MAP киназ, следующее за стимулированием EGF, в клетках В×РСЗ и НТ-29 с эфективностью, зависящей от дозировки (фиг.8).

Пример 9 - Ингибирование пролиферации клеток

Анализ клеточной пролиферации МТТ проводили цветометрически как результат восстановления желтого тетразолия, МТТ (3-(4, 5-диметилтиазолил-2)-2, 5-фенилтетразолий бромид) метаболически активной клеткой до внутриклеточного пурпурного формазанового продукта, который может быть растворен и оценен количественно спектрофотометрическими средствами. В целом, клетки DiFi культивировались в течение ночи в DMEM-10% CS. Антитела, IMC-11F8, IMC-C225 или IMC-1 С11, добавляли каждое в три лунки и инкубировали дополнительные 72 часа при 37°С с 5% СO2. Для измерения роста клеток в каждую лунку добавляли аликвоты по 20 мкл тетразолиевого красителя и клетки инкубировали в течение 3 ч при 37°С. Когда пурпурный осадок становилось отчетливо видно под микроскопом, клетки лизировали добавлением 100 мкл детергента. Абсорбцию формазанового продукта измеряли при OD570 нм в качестве количественного показателя пролиферации.

Как показано на фиг.9, в отличие от контрольного антитела IMC-1C11, IMC-11F8 является таким же эффективным ингибитором клеточной пролиферации, как и IMC-C225.

Пример 10 - Антитело-зависимая клеточная цитотоксическая (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity, ADCC) активность

Одним из методов оценки смертности клеток является анализ антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), в котором обычно используется радиоизотоп 51Cr. Целевые клетки, меченные с помощью 51Cr, смешивали с антителом и оценивали степень смертности по высвобождению 51Cr. Обычно приблизительно 3×106 DiFi клеток суспендировали в 0,5 мкл культурной среды и добавляли 0,5 mCi Na51CrO4. Смесь инкубировали в течение 1 ч при 37°С с периодическим встряхиванием. Затем клетки трижды промыли холодной культурной средой. Затем меченые клетки суспендировали в 100 мкл культурной среды, содержащей различные концентрации анти-EGFR антител (IMC-11F8 или IMC-C225) и инкубировали 30 минут при 4°С. После этого клетки трижды промывали культурной средой с использованием центрифугирования. После добавления кроличьего комплемента обрабатываемые клетки снова инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Затем добавили 50 мкл холодной среды и отцентрифугировали. Отделили надосадочную жидкость и измерили с помощью гамма-счетчика радиоактивность, выделенную клетками в эту жидкость. Максимальное выделение радиоактивности было зарегистрировано в случае добавления к исследуемым клеткам 1% Triton X. Процент цитотоксичности был вычислен как срт, выделенное в ходе эксперимента минус срт фона, умноженное на 100%, деленное на срт максимального выделения минус срт фона.

Фиг.10 показывает смертность клеток при посредстве IMC-11F8 и IMC-C225 (или ERBITUX™) при активации антитело-зависимой клеточной цитотоксичности, или ADCC активности.

Пример 11 - Ингибирование роста опухолевых клеток у мышей in vivo

Антиопухолевые исследования in vivo проводили с целью определения способности IMC-11F8 блокировать рост опухолевых клеток по ксенотрансплантатной модели. Лишенной вилочковой железы мыши (nu/nu; Charles River Lab, Wilmington, MA) подкожно вводили в бок 1-2 миллиона клеток А431 или В×РС-3. Анти-EGFR антитела (IMC-11F8 и IMC-C225) или контрольное антитело вводили интраперитонеально в количестве 1 мг на дозу или 0.3 мг на дозу трижды в неделю. Размер опухоли измеряли по крайней мере трижды в неделю с помощью штангенциркуля и вычисляли объем опухоли (см, например Baselga et al., J Natl. Cancer Inst. (1993) 85:1327-1333).

Фиг.11 демонстрирует анти-опухолевую активность IMC-11F8 на А431 ксенотрансплантатную модель. При дозе в 1 мг (фиг.11, правая панель), IMC-11F8 эффективен так же, как и IMC-C225 (CETUXIMAB) в подавлении или ингибировании роста опухоли по сравнению с контрольными животными. При понижении дозы до 0.3 мг, прогрессирование роста опухоли замедлялось. Подобным образом, на фиг.12 показан эффект IMC-11F8 и IMC-C225 на второй опухолевой модели (ксенотрансплантат В×РС-3). Кинетика роста опухоли ВхРСЗ аналогична наблюдавшейся в случае опухолевой модели А431. При уровне дозы в 1,0 мг на мышь на инъекцию, в случае IMC-11F8 наблюдалось 6 случаев регрессии опухоли из 8 животных с А431 и 5 случаев регрессии опухоли из 8 мышей с В×РС-3.

Иммуногистохимическое окрашивание как А431, так и В×РС-3 ксенотрансплантата показало, что обработка с IMC-11F8 заметно понижает плотность опухолевых клеток и увеличивает площадь некротических неклеточных остатков внутри опухоли (фиг.13). Далее, IMC-11F8 понижает процентное количество Ki-67-позитивных клеток по всему опухолевому участку, что означает уменьшение клеточной пролиферации в опухоли (фиг.13).

Пример 12 - IMC-11F8 комбинированная терапия

Голых мышей, с ксенотрансплантированной человеческой колоректальной опухолью GEO, DLD-1, или НТ-29, размером приблизительно 200-300 мм3, обрабатывали интерперитонеальными инъекциями IMC-11F8 дважды в неделю по 0,3 мг или 1,0 мг на инъекцию, в чистом виде или в комбинации с иринотеканом (СРТ-11) в размере дозы 100 мг/кг раз в неделю. Замер опухоли производился раз в неделю.

Обработка с помощью IMC-11F8 в количестве 0,3 мг или 1,0 мг на мышь на инъекцию оказала существенное ингибирующее воздействие на рост всех трех колоректальных ксенотрансплантатов (GEO, DLD-1 и НТ-29; фиг.14А-С). При введении в комбиации с СРТ-11 мыши с GEO ксенотрансплантатом, IMC-11F8 существенно увеличивал ингибиторное воздействие на рост опухоли, в сравнении с СРТ-11 в чистом виде (фиг.14А, р<0,01 для обеих доз IMC-11F8). Более того, в то время, как СРТ-11 в чистом виде не вызывал регрессии опухоли в этой модели, в 4 из 10 и в 9 из 10 случаев регрессия опухоли была достигнута при использовании СРТ-11 в комбинации с IMC-11F8 в количестве 0,3 мг или 1,0 мг на мышь на инъекцию, соответственно (р=0,004 и р<0,0001, соответственно). Подобные комбинированные антиопухолевые эффекты наблюдались и в двух других ксенотрансплантатах, DLD-1 (фиг.14В) и НТ-29 (фиг.14С) с эквивалентной статистической значительностью опухолевой регрессии в группе с повышенной дозой антитела (1,0 мг). Фиг.14D иллюстрирует значительное увеличение количества опухолевых регрессий в случае комбинирования СРТ-11 с IMC-11F8 на этих трех моделях ксенотрансплантированной колоректальной карциномы.

Пример 13 - Фармакинетика IMC-11F8

Фармакинетику IMC-11F8 изучали на яванских макаках (cynomolgus monkeys) и сравнивали с фармакинетикой IMC-C225. Разовую дозу для фармокинетического исследования в 20,5 мг/кг 125I-меченных IMC-11F8 и МС-С225 раздельно вводили обезьянам, внутривенно и по пробе крови определяли уровень антител, оставшихся в плазме животного. В Таблице 6 приведено фармакинетическое сравнение IMC-11F8 и IMC-C225 у яванских макак.

Таблица 6
IMC-11F8 IMC-C225
Cmax (мг/л) 1213 1161
Тмах (ч) 0,75 0,117
T1/2 (ч) 116 117
AUC (мг×ч/л) 115400 97871
CI (мл/ч) 0,736 0,636

Является понятным и ожидаемым, что специалистом в данной области могут быть произведены модификации описанных принципов данного изобретения, и подразумевается, что такие модификации являются включенными в объем данного изобретения.

1. Изолированное человеческое антитело или фрагмент антитела, связывающееся с EGFR и содержащее определяющие комплементарность участки SEQ ID NO:2 на CDRH1; SEQ ID NO:4 на CDRH2; SEQ ID NO:6 на CDRH3; SEQ ID NO:10 на CDRL1; SEQ ID NO:12 на CDRL2 и SEQ ID NO:14 на CDRL3.

2. Антитело или фрагмент антитела по п.1, содержащее SEQ ID NO:8.

3. Антитело или фрагмент антитела по п.1, содержащее SEQ ID NO:16.

4. Антитело или фрагмент антитела по п.1, содержащее SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:16.

5. Антитело или фрагмент антитела по пп.1-4, селективно связывающееся с EGFR.

6. Антитело или фрагмент антитела по пп.1-4, ингибирующее связывание EGFR с лигандом EGFR.

7. Антитело или фрагмент антитела по пп.1-4, нейтрализующее EGFR.

8. Антитело или фрагмент антитела по пп.1-4, выбранное из группы, состоящей из одноцепочечного антитела, Fab, одноцепочечного Fv, димерного антитела и тримерного антитела.

9. Конъюгат антитела, охарактеризованного в пп.1-4, или его функционального фрагмента с анти-неопластическим средством или маркером для специфичного связывания с рецептором EGFR.

10. Изолированный полинуклеотид, кодирующий антитело или фрагмент антитела и содержащий нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1 на CDRH1; SEQ ID NO:3 на CDRH2; SEQ ID NO:5 на CDRH3; SEQ ID NO:9 на CDRL1; SEQ ID NO:11 на CDRL2; и SEQ ID NO:13 на CDRL3.

11. Изолированный полинуклеотид по п.10, содержащий SEQ ID NO:7.

12. Изолированный полинуклеотид по п.10, содержащий SEQ ID NO:15.

13. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по пп.10-12.

14. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п.13.

15. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.14, производящая полипептид, содержащий SEQ ID NO:8, и полипептид, содержащий SEQ ID NO:16.

16. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.14, производящая полипептид, содержащий SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:16.

17. Способ ингибирования роста опухоли, экспрессирующей EGFR, у млекопитающих, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела по пп.1-8.

18. Способ по п.17, в котором опухоль сверхэкспрессирует EGFR.

19. Способ по п.17, в котором опухоль является первичной раковой опухолью.

20. Способ по п.17, в котором опухоль является метастатической раковой опухолью.

21. Способ по п.17, в котором опухоль является невосприимчивой раковой опухолью.

22. Способ по п.17, в котором опухоль является васкуляризованной раковой опухолью.

23. Способ по п.17, в котором опухоль выбрана из группы, состоящей из колоректальной раковой опухоли, раковой опухоли головы или шеи, раковой опухоли поджелудочной железы, раковой опухоли легких, раковой опухоли молочной железы, почечной карциномы и глиобластомы.

24. Способ по п.17, в котором антитело или фрагмент антитела вводится в комбинации с анти-неопластическим средством.

25. Способ по п.24, в котором анти-неопластическое средство является химиотерапевтическим средством.

26. Способ по п.24, в котором анти-неопластическое средство является иринотеканом (СРТ-11).

27. Способ по п.24, в котором анти-неопластическое средство представляет собой облучение.

28. Способ по п.17, в котором антитело или фрагмент антитела вводят с EGFR-антагонистом.

29. Способ по п.28, в котором EGFR-антагонист является внутриклеточным EGFR антагонистом.

30. Способ по п.17, дополнительно включающий введение терапевтически эффективного количества антагониста рецептора васкулярного эндотелиального фактора (vascular endothelial factor receptor, VEGFR).

31. Способ по п.17, включающий введение терапевтически эффективного количества антагониста рецептора инсулиноподобного фактора роста (insulin like growth factor receptor, IGFR).

32. Способ лечения гиперпролиферативного заболевания, вызываемого чрезмерным ростом нераковых клеток, экспрессирующих EGFR, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела по пп.1-8.

33. Способ по п.32, в котором гиперпролиферативным заболеванием является псориаз.

34. Способ по п.33, в котором антитело или фрагмент антитела вводят в сочетании с местным или системным средством для псориаза.

35. Способ по п.33, в котором антитело или фрагмент антитела вводят в сочетании с кортикостероидом.

36. Способ по п.33, в котором антитело или фрагмент антитела вводят в сочетании с ретиноидом.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой мутантный фотопротеин для определения внутриклеточного кальция одновременно в разных органеллах клетки, обладающий светоизлучающей функцией и характеризующийся аминокислотной последовательностью кальций-регулируемого фотопротеина дикого типа, в которой природные остатки фенилаланина, относящиеся к консервативным областям названной последовательности и соответствующие остатку 119 фотопротеина обелина Obelia longissima, а также остатку 88 обелина Obelia longissima заменены другими остатками, отличными от фенилаланина, замены которых приводят к тому, что чувствительность кальций-регулируемого фотопротеина к ионам кальция уменьшается по сравнению с фотопротеином дикого типа и изменяется длина волны испускаемого света по сравнению с фотопротеином дикого типа.

Изобретение относится к анти-М-СSF-специфическим антителам, полученным на основе RX1 или происходящим от RX1, и которые более чем на 75% конкурируют с моноклональными антителами RX1, МС1 и/или МС3 за связывание с M-CSF (макрофагальному колониестимулирующему фактору).

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой клетку мицелиального гриба, принадлежащего к роду Penicillium, трансформированную плазмидой. .

Изобретение относится к биотехнологии и касается фермента транс-сиалидазы. .

Изобретение относится к анти-М-СSF-специфическим антителам, полученным на основе RX1 или происходящим от RX1, и которые более чем на 75% конкурируют с моноклональными антителами RX1, МС1 и/или МС3 за связывание с M-CSF (макрофагальному колониестимулирующему фактору).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к множественной RT-PCR с удлинением цепи путем перекрывания. .

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. .

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. .

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. .

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии

Наверх