Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus. musculus, продуцирующий моноклональные антитела, специфичные к пептиду, обладающему апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека

Изобретение относится к биотехнологии. Описан штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus RIM9 - продуцент моноклональных антител, специфичных к пептиду молока человека - лактаптину и его рекомбинантным аналогам, обладающим апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека. Изобретение позволяет получать моноклональные антитела, распознающие общую линейную антигенную детерминанту рекомбинантного и природного лактаптина, что позволяет разрабатывать на их основе чувствительные и специфичные тест-системы для определения лактаптина, антител к нему и для выделения лактаптина из молока человека методом аффинной хроматографии. 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии, и представляет собой новый штамм гибридных клеток животных Mus. Musculus, продуцирующих в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (МКА) к пептиду молока человека, являющемуся фрагментом κ-казеина и обладающему апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека (лактаптин). Изобретение может быть использовано в научных исследованиях и перспективно для создания различных тест-систем для определения лактаптина, антител, специфичных к нему, для выделения лактаптина из молока человека.

Известным и широко распространенным общебиологическим механизмом, ответственным за поддержание постоянства численности клеток, формообразование и выбраковку дефектных клеток, является запрограммированная гибель клеток или апоптоз. Он может быть индуцирован как внешними факторами - проапоптотическими цитокинами, контактом с мембраной активированных цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров, так и внутриклеточными событиями, такими как истощение метаболитов, разобщение цепи окислительного фосфорилирования, накопление нерепарируемых повреждений ядерной ДИК и т.д. [1].

Физиологическими модуляторами метаболизма могут выступать регуляторные пептиды (бетта-казоморфины и фосфопептиды), образующиеся при протеолитическом расщеплении казеина молока человека. Так, казеинфосфопептиды обладают цитомодулирующими эффектами, стимулируя активность иммунокомпетентных клеток [2]. В то время как казоморфины участвуют в обеспечении всасывания питательных веществ и последующем синтезе гормонов, иммунопептиды и казокинины обеспечивают иммунную защиту и перенос информации между эндокринной и нервной системой.

В настоящее время выделен и описан новый пептид видоспецифичной фракции белка молока человека [3], отличающийся по функциональному назначению от наиболее близких аналогов. Пептид представляет собой фрагмент κ-казеина человека длиной 74 аминокислотных остатка, имеет молекулярную массу около 8.6 кДа и установленную аминокислотную последовательность (лактаптин). Этот пептид подобно мультимерным формам альфа-лактальбумина молока [4], которые в присутствии свободных жирных кислот молока индуцируют апоптотическую гибель клеток мышиной лимфобластоидной лейкемии L1210 и саркомы легкого человека А549, не влияя на жизнеспособность "нераковых" клеток первичной культуры фибробластов почки человека oo(HRTEC) [5], обладает цитотоксическим действием по отношению к раковым клеткам человека в культуре. Однако в отличие от мультимерной формы альфа-лактальбумина молока человека лактаптин вызывает апоптотическую гибель раковых клеток человека самостоятельно, в отсутствии ненасыщенных жирных кислот молока, необходимых альфа-лактальбумину [6].

К настоящему времени получены моноклональные антитела (МКА), специфичные к молекуле казеина молока коровы: alpha-, beta-, κ-казеину и их протеолитическим фрагментам [7, 8, 9, 10].

Наиболее ближайшим к заявляемому штамму - прототипом является штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus LICR-LON-14.1, продуцирующий моноклональные антитела, специфичные к κ-казеину молока человека [11].

Недостатком известного штамма является то, что секретируемые им МКА взаимодействуют с детерминантой цельной молекулы κ-казеина, однако не взаимодействуют с фрагментом κ-казеина молока человека, обладающим апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека.

Технической задачей настоящего изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus, продуцирующего моноклональные антитела, специфичные к пептиду молока человека, обладающему апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека.

Поставленная техническая задача достигается предлагаемым штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus RIM9, продуцирующим моноклональные антитела, обладающие высоким сродством к антигенной детерминанте пептида, обладающего апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека (лактаптин).

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии Balb/c иммунизируют рекомбинантным аналогом лактаптина, выделенным из Echerichia Coli. Антиген вводят в подушечки лап, подкожно и внутрибрюшинно. Клетки селезенки и лимфатических узлов иммунной мыши гибридизуют с клетками миеломы Sp-2/0 в присутствии полиэтиленгликоля. Для культивирования и селекции гибридных клеток используют среду с добавлением азасерина и гипоксантина. Гибриды-продуценты отбирают с помощью ИФА с использованием в качестве антигена как лактаптина, выделенного из молока человека, так и его рекомбинантого аналога. Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают RIM9.

Штамм депонирован в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (г.Санкт-Петербург) под регистрационным номером РККК (П) 722Д.

Сущность изобретения состоит в том, что в результате слияния миеломы мыши линии Sp-2/0 и спленоцитов и лимфоцитов мышей BALB/c, иммунизированных рекомбинантным лактаптином, при использовании в качестве слияющего агента полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 и последующего клонирования методом предельных разведений получают гибридому RIM9, продуцирующую МКА к пептиду молока человека (лактаптину), обладающему апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека. Для оценки специфичности вырабатываемых гибридомой антител используют метод иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием рекомбинантного аналога лактаптина и иммуноблоттинг с применением лактаптина или его рекомбинантного аналога. МКА, секретируемые штаммом RIM9, позволяют проводить специфичное выявление лактаптина методами ИФА, иммуноблоттинга и выделять лактаптин из молока человека методом аффинной хроматографии.

Конечный продукт - моноклональные антитела подкласса IgG1 (согласно методу радиальной иммунодиффузии) обладают высокой специфичностью к линейной детерминанте лактаптина (согласно иммуноблоттингу).

При культивировании штамма используют питательную среду IMDM с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина Б. Клетки культивируют при 37°С в атмосфере 100% влажности с 5% CO₂. Для культивирования используют пластиковые планшеты или флаконы объемом 50 мл.

Штамм RIM9 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Культура клеток состоит из слабо прикрепившихся к поверхности культуральных флаконов округлых клеток одинаковой величины с крупными ядрами.

Культуральные признаки. Культура полусуспензионная. Посевная доза составляет 150 тыс. кл на мл. Время субкультивирования - 2-3 суток, кратность рассева 1:5-1:6. Метод снятия клеток - встряхивание. Штамм продуцирует антитела на протяжении 15 пассажей в культуре.

Характеристика культивирования в организме животного. Для выращивания гибридом в асцитной форме клетки в количестве 10⁶ клеток на мышь вводят в брюшную полость мышей линии BALB/c, сенсибилизированных за 14-90 дней вазелиновым маслом. Рост серозной опухоли отмечают на 8-12 день. Общий выход асцитной жидкости составлял 5-10 мл на мышь. Штамм может перевиваться. К моменту депонирования он проходил 2 пассажа на животных.

Контаминация штамма. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Контроль на контаминацию микоплазмой и вирусами не проводился.

Видовая принадлежность Mus. Musculus.

Онкогенность Гибридома при внутрибрюшинном введении вызывает серозные опухоли у мышей.

Характеристика полезного продукта. Моноклональные антитела относятся к классу IgG (по данным метода ИФА), подклассу IgG1 (иммунодиффузии по Уохтерлони), комплементарны к линейным антигенным детерминантам лактаптина и его рекомбинантного аналога (по данным иммуноблоттинга).

Биотехнологическая характеристика. Штамм продуцирует МКА к пептиду молока человека, обладающему апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека (лактаптину). Секретируемые гибридомой МКА имеют титр около 1:10² в культуральной жидкости и титр 1:10⁶ в асцитной жидкости (по данным ИФА для рекомбинантого белка) и 1:100 в культуральной и 1:1000 асцитной жидкостях (по данным иммуноблотинга для лактаптина и его рекомбинантного аналога). Стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 15 пассажей в культуре и 2 пассажей на животных.

Криоконсервирование. Клетки замораживают в ростовой среде с 40% содержанием эмбриональной сыворотки теленка, 10% диметилсульфоксидом при температуре -70°С, хранят в жидком азоте. Жизнеспособность после размораживания составляет 50-70%.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения

Пример 1. Получение штамма RIM9

Мышей линии Balb/c иммунизировали рекомбинантным лактаптином, выделенным из Echerichia Coli. Антиген вводили в количестве 12,5 мкг на мышь в подушечки лап, подкожно и внутрибрюшинно по следующей схеме: первая иммунизация в полном адъюванте Фреинда, 2-ая иммунизация через 2 недели в неполном адъюванте Фреинда, 3-ья - через 3 недели после второй в неполном адъюванте Фреинда, 4-ая - через 3 недели после третьей. Через 3 дня после последней иммунизации вводили бустерную дозу рекомбинантного лактаптина - 12,5 мкг/мышь в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) внутрибрюшинно. Через 3 дня после введения бустерной дозы клетки селезенки и лимфатических узлов иммунной мыши гибридизовали с клетками миеломы Sp-2/0 (соотношение 10:3) в присутствии полиэтиленгликоля (М.В. 1500). После гибридизации клетки высевали в 96-луночные планшеты по 3×10⁵ клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридных клеток использовали среду IMDM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка (ЭТС), 5,7 µМ азасерина и 20 мМ гипоксантина. Гибриды-продуценты отбирали с помощью ИФА с использованием рекомбинантного аналога лактаптина и иммуноблоттинга, с использованием в качестве антигена как лактаптина молока человека, так и его рекомбинантного аналога. В результате получен штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus RIM9 - продуцент моноклональных антител к пептиду молока человека, обладающему апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека (лактаптин). Дважды проведенное клонирование полученных гибридом методом лимитирующих разведений путем рассева клеток в лунки 96-луночного планшета и последующее тестирование на секрецию антител показало, что доля клонов, сохраняющих продукцию антител заданной специфичности, составляет 100%.

Пример 2. Выявление иммобилизованного рекомбинантного антигена лактаптина.

Клетки штамма помещают в пластиковый флакон с площадью дна 25 см² по 1×10⁶ в 7 мл среды IMDM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 40 мкг/мл гентамицина, 2,5 мкг/мл амфотерицин Б. Клетки культивируют 3-4 дня при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО₂. Культуральную среду вместе с клетками собирают, центрифугируют 10 мин при 200 g при 4°С, клетки отмывают 1 раз солевым раствором Хэнкса и в количестве 10⁶ клеток в 0,5 мл ЗФР внутрибрюшинно вводят мышам линии Balb/c, сенсибилизированным за 14-90 дней вазелиновым маслом. Через 8-12 дней образующуюся асцитную жидкость забирали, центрифугировали 10 мин при 300 g и 4°С. Полученные супернатанты культуральной и асцитной жидкостей используют как реагенты для изучения специфичности взаимодействия антител с лактаптином с помощью пятенного ИФА. На нитроцеллюлозные фильтры (диаметром пор 0,45 мкм) размером 4×4 мм с помощью микрошприца сорбируют 40 нг очищенного рекомбинантного аналога лактаптина в объеме 0,2 мкл. Для уменьшения неспецифического связывания фильтры инкубируют несколько минут в буфере TBS (0,02 М трис-HCl, рН 7,5, 0,15 М NaCl) с 0,08% желатинолем, разносят по лункам 96-луночного планшета и инкубируют в течение 4 часов при комнатной температуре с 50 мкл супернатантов культуральной или асцитной жидкости, разбавленных буфером TBS с 0,08% желатинолем, 0,05% твин-20. Фильтры отмывают буфером TBS с 0,05% твин-20, вносят антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные 1:5000 в ЗФР с 0,08% желатинолем и 0,05% твин-20. По окончании инкубации (1 час при комнатной температуре) фильтры отмывают описанным выше способом и проявляют в течение 30 мин раствором субстрата пероксидазы - перикиси водорода в присутствии хромогена - 4-хлор-1-нафтола. Положительный результат в исследуемых образцах оценивают по появлению пятен, окрашенных в темно-синий цвет. Положительным контролем служит иммунная сыворотка мыши. Отрицательными контролями - сыворотка крови неиммунизированной мыши и культуральная среда. Неспецифическую сорбцию метода оценивают по пробам, где использовали буфер вместо сывороток или культуральной среды. Результаты определения иммобилизованного антигена лактаптина методом ИФА представлены в таблице 1.

Таблица 1
Разведение культуральной жидкости	Интенсивность окраски пятна	Разведение асцитной жидкости	Интенсивность окраски пятна
1:2	++++	1:10	++++
1:3	++++	1:100	++++
1:10	++++	1:1000	++++
1:100	++	1:10000	+++
1:1000	-	1:100000	++
1:10000	-	1:1000000	-

Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о высокой специфичности МКА, вырабатываемых клетками штамма RIM9 к лактаптину и показывают возможность применения антител для выявления иммобилизованного рекомбинантного аналога лактаптина с помощью иммуноферментного метода. Достоверное определение рекомбинантного аналога лактаптина возможно при разбавлении культуральной жидкости 1:100, асцитной жидкости 1:100000.

Пример 3. Выявление иммобилизованного лактаптина методом иммуноблоттинга.

Для выявления лактаптина или его рекомбинантного аналога проводят электрофорез образцов в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, с последующим электропереносом антигенов на нитроцеллюлозную мембрану. Нитроцеллюлозу после переноса блокируют 0,08% желатинолем в ЗФР, разрезают на полоски и проводят ИФА, как описано в примере 2. Присутствие антител определяют по наличию и степени интенсивности полосы необходимой молекулярной массы. Титры антител, секретируемые штаммом RIM9, при которых выявляются лактаптин и его рекомбинантный аналог методом иммуноблоттинга, представлены в таблице 2.

Таблица 2
Антиген	МКА (штамм RIM9)	Поликлональные антитела (ИСК мыши)
	КЖ	ИАЖ
Соотношение титров
Лактаптин	1:100	1:1000	1:1000
Рекомбинантный лактаптин	1:100	1:1000	1:1000
КЖ - культуральная жидкость, ИАЖ - иммунная асцитная жидкость, ИСК - иммунная сыворотка крови.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о высокой специфичности МКА, вырабатываемых клетками штамма RIM9 к лактаптину, и показывают возможность применения МКА для выявления как натурального лактаптина, так и его рекомбинантного аналога. Достоверное определение лактаптина возможно при разбавлении культуральной жидкости до 1:100, асцитной жидкости до 1:1000 раз, при этом количество рекомбинантного аналога лактаптина в полосе составляет 1 мкг на дорожку, шириной 2 мм.

Пример 4. Использование МКА штамма RIM9 для выделения лактаптина из молока человека.

Обезжиренное молоко человека наносили на колонку размером 1×1 см со специфичными моноклональными антителами штамма RIM9, иммобилизованными на BrCN сефорозе 4В, в количестве 12 мг на 1 мл осадка геля, которую предварительно уравновешивали 150 мМ NaCl, 200 мМ Трис-HCl буфером, рН 7,5. Не связавшиеся белки элюировали буфером, используемым для уравновешивания колонки. Элюцию связавшегося с аффинным сорбентом пептида проводили 100 mM глицин-HCl, буфером рН 2,5. Значение рН во фракциях, собранных при элюции кислым буфером, доводили до 7-7.5 с помощью 1 М Tris-HCl буфера рН 8,0. Идентификацию пептида проводили иммуноблоттингом, как описано в примере 2. Согласно результатам иммуноблоттинга количество лактаптина, выделенного из 20 мл молока человека, составляло около 10 мкг.

Таким образом, полученный штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus RIM9 является продуцентом моноклональных антител, специфичных к пептиду молока человека, обладающему апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека (лактаптину). Моноклональные антитела, продуцируемые заявляемым штаммом, распознают линейную антигенную детерминанту лактаптина и его рекомбинантного аналога и могут быть использованы для разработки на их основе чувствительных и специфичных тест-систем для определения лактаптина, антител к нему и для выделения лактаптина из молока человека методом аффинной хроматографии.

Источники информации

1. Самуилов В.Д., Алескин А.В., Лагунова Е.М. Биохимия. 2000. Т.65. Вып.8. С.1029-1046.

2. Meisel H., FitzGerald R.J. Curr. Pharm. Des. 2003. V.9. P.1289-1295.

3. Некипелая В.В., Семенов Д.В., Потапенко М.О., Кулигина Е.В., Кит Ю.Я., Романова И.В., Рихтер В.А. «Лактаптин - белок человеческого молока, индуцирующий апоптоз клеток аденокарциномы MCF-7» Доклады академии наук, 2008, т.419, №2, стр.268-271.

4. Ramakrishnan В., Boeggeman E., Qasba P.K., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V.291(5). P.1113-1118.

5. Hakansson A., Andreasson J., Zhivotovsky В., et. al. Exp. Cell Res. 1999. V.246(2). P.451-460.

6. Svensson M., Hakansson A., Mossberg A.-K., et. al. PNAS. 2000. V.97(8). P.4221-4226.

7. Kuzmanoff, К. M., Andresen, J., Beattie С.W. J-Dairy-Sci. 1991 Mar; 74(3):803-10.

8. Zhi-Kun Feng, С.Cunningham-Rundles. Hybridoma., 1989, 8(2): 223-230.

9. Kuzmanoff, К.M., Andresen, J.W., Beattie, C.W. J-Dairy-Sci.

10. US Patent 5846732, December 8,1998.

11. Earl HM, McIlhinney RA. Mol Immunol. 1985,22(8):981-91.

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus RIM9, депонированный в Коллекции культур клеток позвоночных Института цитологии РАН под регистрационным номером РККК(П) 722Д, продуцирующий моноклональные антитела, специфичные к пептиду молока человека - лактаптину и его рекомбинантным аналогам, обладающим апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека.