Способ измерения резистентности или чувствительности к доцетакселу

Изобретение относится к области медицины и касается способа измерения резистентности к доцетакселу. Сущность изобретения включает отбор образца для тестирования из области злокачественного поражения у данного пациента, страдающего раком толстой кишки, отбор контрольного образца, измерение уровня одного или нескольких генетических маркеров, выбранных из группы, сопоставление измеренных уровней в опытных образцах с контрольными, при этом снижение уровней одного или нескольких генетических маркеров по сравнению с контрольным образцом указывает на повышенную резистентность к доцетакселу. Также приводятся наборы, которые позволяют прогнозировать или осуществлять мониторинг реакции пациента на на доцетаксел. Преимущество изобретения заключается в идентификации генетических маркеров, по которым можно осуществлять реакцию пациента на химиотерапию доцетакселом. 6 н. и 12 з.п. ф-лы, 3 табл., 16 ил.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым, полезным и до сих пор не известным способам, которые могут предсказывать или обеспечивать мониторинг реакции пациента на молекулы таксоидного семейства посредством измерения увеличения или уменьшения специфических генетических маркеров по сравнению с контролем. В настоящем изобретении также приводятся наборы, которые позволяют прогнозировать или осуществлять мониторинг реакции пациента на молекулу таксоидного семейства посредством изменения уровня нуклеиновой кислоты или белка для отдельных генетических маркеров и сопоставления их уровней с контролем или контрольными маркерами.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Доцетаксел относится к антимитотическим препаратам, широко используемым для лечения рака молочной железы, легких и яичников и в меньшей степени используемым для лечения карцином головы и шеи, а также желудка и простаты (Hong, Oncology 16:9, 2002). Доцетаксел ингибирует динамику микроканальцев, связываясь с бета-тубулином и блокируя разделение гетеродимеров альфа- и бета-тубулина, тем самым подавляя рост опухоли (Ringel and Horwitz, J Natl Cancer Inst 83:288, 1991). Противоопухолевая активность доцетаксела и родственного таксана паклитаксела возникает в результате их действия на микроканальцы митотического веретена, с тем чтобы воспрепятствовать выстраиванию и расщеплению хромосом, блокировать цикл клеточного деления и активировать пути апоптоза (Wang et al., Cancer 88:2619, 2000). Проапоптозная активность паклитаксела связывалась с фосфорилированием и инактивацией Bcl-2 через процессы передачи клеточных сигналов, которые включают p53/p21waf1/Cip1, raf/ras и митоген-активируемые протеинкиназы (MAPK) (Wang et al., Cancer 88:2619, 2000). Хотя доцетаксел является более мощным противораковым препаратом, чем паклитаксел, механизмы его цитотоксичности определены менее точно (Katsumata, Br J Cancer 89:S9, 2003). Вызванный доцетакселом апоптоз наблюдался у выборочных клеточных линий по механизму, включающему фосфорилирование Bcl-2 и активацию каспазы-3 (Kolfschoten et al., Biochem Pharmacol 63:733, 2002). К другим белкам, которые модулируют индуцированное таксанами уничтожение клеток в различных культивируемых линиях, относятся Aurora-A в клетках HeLa (Anand et al., Cancer Cell 3:51, 2003), HER-2 в клетках рака молочной железы (Tanabe et al., Int J Oncol 22:875, 2003), p21waf1/Cip1 в клетках глиобластомы (Li et al., J Biol Chem 277:11352, 2002) и JNK/MKK1 в клетках рака яичников (Lee et al., J Biol Chem 273:28253, 1998).

В этой области сохраняется потребность идентифицировать белки, которые опосредуют резистентность доцетаксела и могут использоваться в качестве лекарственных препаратов, что могло бы привести к их применению для разработки лекарств, с тем чтобы найти реагенты (малые молекулы, миРНК и пр.), которые препятствуют их функции «in vivo» и потенциально сенсибилизируют клетки для противоопухолевой лекарственной химиотерапии. Сохраняется и потребность в данной области в анализе, который мог бы с высокой достоверностью, до химиотерапевтического лечения, прогнозировать, кто из пациентов будет, а кто не будет реагировать на противоопухолевую химиотерапию на основе доцетаксела. В настоящем документе заявители описывают новый анализ, который позволяет предсказывать резистентность или чувствительность к доцетакселу, и приводят методы скринингового анализа для разработки новых подходов к терапии, исключающей лекарственную резистентность при лечении рака.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с настоящим изобретением предоставляются полезные и до сих пор не известные способы мониторинга и/или прогнозирования реакции пациента на молекулы таксоидного семейства посредством сравнения уровней активации и/или экспрессии специфических генетических маркеров у пациентов и контрольной группы.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится способ прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента на молекулу таксоидного семейства, включающий следующие стадии:

a) отбор образца для тестирования из области злокачественного поражения у данного пациента;

b) отбор контрольного образца;

c) измерение уровня одного или нескольких генетических маркеров и

d) сопоставление измеренных уровней упомянутого одного или нескольких генетических маркеров в образце для тестирования и контрольном образце;

при этом снижение уровня упомянутого одного или нескольких генетических маркеров, измеренного в образце для тестирования, по сравнению с контрольным образцом указывает на повышенную резистентность к молекуле таксоидного семейства.

К конкретным генетическим маркерам, приводимым в данном аспекте настоящего изобретения, относятся:

BubR1, иРНК Homo sapiens, подобный протеинкиназе (BUBR1), полный код (номер в каталоге GenBank: AF046079);

Mad2, иРНК Homo sapiens для белка MAD2 (номер в каталоге GenBank: AJ000186);

Mps1, иРНК Homo sapiens протеинкиназа TTK (TTK) (номер в каталоге GenBank: NM_003318);

GEFT для Rac1/CDC42, фактор обмена Homo sapiens RAC/CDC42 (GEFT), вариант транскрипта 2, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_133483);

Bub1, гомолог 1 (дрожжи) Homo sapiens BUB1 почкование, неингибированное бензимидазолами (BUB1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_004336);

hSepharase, дополнительные полюсы веретена подобно 1 Homo sapiens (S. cerevisiae) (ESPL1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_012291);

CamKIId, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (CaM киназа) II дельта (CAMK2D), вариант транскрипта 3, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001221);

CDK6, циклин-зависимая киназа 6 (CDK6), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001259); и

GRB2, фактор роста Homo sapiens, белок 2, связанный с рецептором (GRB2), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002086).

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента на молекулу таксоидного семейства, включающему следующие стадии:

a) отбор образца для тестирования из области злокачественного поражения у данного пациента;

b) отбор контрольного образца;

c) измерение уровня одного или нескольких генетических маркеров и

d) сопоставление измеренных уровней упомянутого одного или нескольких генетических маркеров в образце для тестирования и контрольном образце;

при этом снижение уровня упомянутого одного или нескольких генетических маркеров, измеренного в образце для тестирования, по сравнению с контрольным образцом указывает на повышенную чувствительность к молекуле таксоидного семейства.

В данном аспекте изобретения один или несколько генетических маркеров могут выбираться из группы, включающей:

P21(Waf1), ингибитор циклин-зависимой киназы 1А Homo sapiens (p21, Cip1) (CDKN1A), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_000389);

Pim-1, pim-1 онкоген Homo sapiens (PIM1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002648); GBP-1, гуанилат-связывающий белок 1 Homo sapiens, индуцируемый интерфероном, 67 кДа (GBP1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002053);

RXRA, ретиноид Х-рецептор Homo sapiens, альфа (RXRA), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002957);

SPF45, белок 17 с РНК-связывающим мотивом Homo sapiens (RBM17), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_032905);

Hec1, связанный с центромером 2 Homo sapiens (KNTC2), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006101);

Raf1, человеческая иРНК для онкогена raf (номер в каталоге GenBank: X03484);

Aurora A, киназа 1 семейства Аurora Homo sapiens (ARK1), иРНК, полный код (номер в каталоге GenBank: AF008551);

TACC3, трансформирующий кислый биспиральный белок 3 Homo sapiens (TACC3), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006342);

RelB, гомолог В вирусного онкогена ретикулоэндотелиоза v-rel Homo sapiens, ядерный фактор ген-энхансера легкой цепи полипептида каппа в В-клетках 3 (птиц) (RELB), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006509);

PRKCD, протеинкиназа С Homo sapiens, дельта (PRKCD), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006254);

BRAF35, высокоподвижная группа Homo sapiens 20B (HMG20B), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006339);

HSPA1L, белок теплового шока 70 кДа 1А Homo sapiens (HSPA1A), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_005345);

STK11, серин-треонинкиназа 11 Homo sapiens (полипоз кишечника II) (STK11), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_000455); и

MKK3, MAP киназа киназа 3 Homo sapiens (MKK3), иРНК, полный код (номер в каталоге GenBank: L36719).

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента на молекулу таксоидного семейства, включающему следующие стадии:

a) отбор образца для тестирования из области злокачественного поражения у данного пациента;

b) измерение уровня одного или нескольких генетических маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

BubR1, иРНК Homo sapiens, подобный протеинкиназе (BUBR1), полный код (номер в каталоге GenBank: AF046079);

Mad2, иРНК Homo sapiens для белка MAD2 (номер в каталоге GenBank: AJ000186);

Mps1, иРНК Homo sapiens протеинкиназа TTK (TTK) (номер в каталоге GenBank: NM_003318);

GEFT для Rac1/CDC42, фактор обмена Homo sapiens RAC/CDC42 (GEFT), вариант транскрипта 2, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_133483);

Bub1, гомолог 1 (дрожжи) Homo sapiens BUB1 почкование, неингибированное бензимидазолами (BUB1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_004336);

hSepharase, дополнительные полюсы веретена, подобно 1 Homo sapiens (S. cerevisiae) (ESPL1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_012291);

CamKIId, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (CaM киназа) II дельта (CAMK2D), вариант транскрипта 3, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001221);

CDK6, циклин-зависимая киназа 6 (CDK6), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001259); и

GRB2, фактор роста Homo sapiens, белок 2, связанный с рецептором (GRB2), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002086).

c) измерение уровня одного или нескольких контрольных генетических маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа Homo sapiens (GAPD), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002046); и

RPS9, клон кДНК Homo sapiens IMAGE:6647283, частичный код (номер в каталоге: BC071941);

d) сопоставление измеренных уровней упомянутого одного или нескольких генетических маркеров и упомянутого одного или нескольких контрольных генетических маркеров в образце для тестирования;

при этом снижение уровня упомянутого одного или нескольких генетических маркеров по сравнению с уровнем одного или нескольких контрольных генетических маркеров указывает на повышенную резистентность к молекуле таксоидного семейства.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента на молекулу таксоидного семейства, включающему следующие стадии:

a) отбор образца для тестирования из области злокачественного поражения у данного пациента

b) измерение уровня одного или нескольких генетических маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

P21(Waf1), ингибитор циклин-зависимой киназы 1А Homo sapiens (p21, Cip1) (CDKN1A), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_000389);

Pim-1, pim-1 онкоген Homo sapiens (PIM1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002648);

GBP-1, гуанилат-связывающий белок 1 Homo sapiens, индуцируемый интерфероном, 67 кДа (GBP1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002053);

RXRA, ретиноид Х-рецептор Homo sapiens, альфа (RXRA), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002957);

SPF45, белок 17 с РНК-связывающим мотивом Homo sapiens (RBM17), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_032905);

Hec1, связанный с центромером 2 Homo sapiens (KNTC2), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006101);

Raf1, человеческая иРНК для онкогена raf (номер в каталоге GenBank: X03484);

Aurora A, киназа 1 семейства Аurora Homo sapiens (ARK1), иРНК, полный код (номер в каталоге GenBank: AF008551);

TACC3, трансформирующий кислый биспиральный белок 3 Homo sapiens (TACC3), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006342);

RelB, гомолог В вирусного онкогена ретикулоэндотелиоза v-rel Homo sapiens, ядерный фактор ген-энхансера легкой цепи полипептида каппа в В-клетках 3 (птиц) (RELB), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006509);

PRKCD, протеинкиназа С Homo sapiens, дельта (PRKCD), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006254);

BRAF35, высокоподвижная группа Homo sapiens 20B (HMG20B), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006339);

HSPA1L, белок теплового шока 70 кДа 1А Homo sapiens (HSPA1A), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_005345);

STK11, серин-треонинкиназа 11 Homo sapiens (полипоз кишечника II) (STK11), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_000455) и

MKK3, MAP киназа киназа 3 Homo sapiens (MKK3), иРНК, полный код (номер в каталоге GenBank: L36719).

c) измерение уровня одного или нескольких контрольных генетических маркеров, выбранных из группы, состоящей из:

GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа Homo sapiens (GAPD), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002046); и

RPS9, клон кДНК Homo sapiens IMAGE:6647283, частичный код (номер в каталоге: BC071941);

d) сопоставление измеренных уровней упомянутого одного или нескольких генетических маркеров и упомянутого одного или нескольких контрольных генетических маркеров в образце для тестирования;

при этом снижение уровня упомянутого одного или нескольких генетических маркеров по сравнению с уровнем одного или нескольких контрольных генетических маркеров указывает на повышенную чувствительность к молекуле таксоидного семейства.

Настоящее изобретение относится к способам прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента на молекулу таксоидного семейства. Таким образом, еще одно применение настоящего изобретения включает молекулы таксоидного семейства - паклитаксел, доцетаксел XRP9881 и XRP6258.

Генетические маркеры, описанные в настоящем изобретении, могут оцениваться по измерению уровней РНК, ДНК или белка с использованием разнообразных методик, которые подробно описаны ниже. Другие применения настоящего изобретения относятся к наборам для прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента на молекулу таксоидного семейства.

Упомянутые выше аспекты и другие аспекты, особенности и преимущества настоящего изобретения будут более понятны из последующих подробных описаний, рассматриваемых в совокупности с сопроводительными чертежами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлена характеристика генов, снижение функциональной активности которых обеспечивает резистентность к доцетакселу. Полученные в присутствии доцетаксела кривые дозовой зависимости приводятся для клеток HCT116, трансфицированных миРНК RB1, BubR1, Mad2 и Mps1 (заштрихованные квадратики), по сравнению с контрольной миРНК (незаштрихованные квадратики). RB1 была примером миРНК, которая не дала результатов при скрининге. Жизнеспособность клеток измерялась по поглощению на 450 нМ после добавления WST-1. Минимальное отношение (MR) представляет собой значение WST-1 для гена по сравнению с контролем при 40 нМ доцетаксела.

На фиг.2 приводятся кривые дозовой зависимости для коротких РНК-шпилек BubR1 и Mps1 (заштрихованные квадратики) по сравнению с контрольной короткой РНК-шпилькой (незаштрихованные квадратики).

На фиг.3 представлены результаты анализа ПЦР TaqMan в режиме реального времени уровней иРНК BubR1 и Mps1 в клетках, содержащих короткие РНК-шпильки BubR1 и Mps1 соответственно.

На фиг.4 приводятся жизнеспособность и морфология клеток, продемонстрированные для клеток HCT116, трансфицированных миРНК Mad2, BubR1 и Mps1 при обработке доцетакселом и в его отсутствие. Через двадцать четыре часа после трансфекции клетки оставались необработанными (-доцетаксел) или обрабатывались 200 нМ доцетаксела (+доцетаксел) и окрашивались Calcein-AM для визуализации живых клеток через 16 и 72 часа после обработки.

На фиг.5 показаны митотические индексы для клеток HCT116, трансфицированных Mad2, BubR1, Mps1 и контрольной миРНК после обработки доцетакселом. Через двадцать четыре часа после трансфекции к клеткам добавляли 200 нМ доцетаксела на 16 и 72 часа, после чего производилась их обработка. Митотические клетки детектировали по фосфорилированным гистон Н3 антителам, которые показаны здесь красным пунктиром вокруг ядра клеток (набор для митотических индексов, Cellomics). Ядра окрашивались в голубой цвет красителем Hoechst.

На фиг.6 представлены результаты анализа ПЦР TaqMan в режиме реального времени уровней иРНК Mps1, BubR1 и Mad2 в клетках HCT116, трансфицированных миРНК Mps1, BubR1 и Mad2 соответственно.

Фиг.7 отражает анализ клеточного цикла для клеток HCT116, трансфицированных тремя миРНК митотических контрольных генов. После трансфекции миРНК Mps1, BubR1 и Mad2 клетки оставляли необработанными (-доцетаксел) или обрабатывали 200 нМ доцетаксела (+доцетаксел) в течение 24 часов. Через семьдесят два часа после добавления доцетаксела клетки инкубировали и анализировали с точки зрения клеточного цикла. Числа над пиками указывают содержание ДНК, например 2N, 4N, 8N, 16N или 32N.

На фиг.8 приводятся результаты анализа выживания клоногенных клеток с помощью стабильных клеточных линий после нокдауна. Клетки HCT116, содержащие BubR1 или векторные контрольные короткие РНК-шпильки, высевались в чашки диаметром 10 см и выдерживались в 5 нМ доцетаксела в течение 10 дней. Колонии отмывали PBS и окрашивали кристаллическим фиолетовым.

На фиг.9 приводится несколько кривых дозовой зависимости для генов, снижение функциональной активности которых обеспечивает повышенную чувствительность к доцетакселу. Полученные в присутствии доцетаксела кривые дозовой зависимости приводятся для клеток HCT116, трансфицированных миРНК RB1, Pim-1, p21, Aurora A и TACC3 (заштрихованные квадратики), по сравнению с контрольной миРНК (незаштрихованные квадратики). Минимальное отношение (MR) представляет собой значение WST-1 для гена по сравнению с контролем при 40 нМ доцетаксела. Отношение IC50 (IR) представляет собой отношение IC50 для гена по сравнению с контролем.

На фиг.10 приводятся кривые дозовой зависимости для коротких РНК-шпилек Aurora A (заштрихованные квадратики) по сравнению с векторным контролем (незаштрихованные квадратики).

На фиг.11 представлены результаты анализа ПЦР TaqMan в режиме реального времени уровней иРНК Aurora A в клетках, содержащих короткие РНК-шпильки Aurora A.

На фиг.12 приводятся различия в пролиферации клеток HCT116, трансфицированных миРНК Pim-1 и TACC3 (заштрихованные квадратики), по сравнению с контрольной миРНК (незаштрихованные квадратики). Число клеток, сохраняющихся в 6-ячеечных планшетах в различные моменты времени после трансфекции Pim-1, TACC3 и контрольной миРНК.

На фиг.13 отражены результаты анализа TaqMan уровней Pim-1 и TACC3 иРНК после трансфекции миРНК.

На фиг.14 приводятся уровни активной каспазы-3 в клетках HCT116, трансфицированных миРНК Pim-1 и BubR1. Уровни активной каспазы-3 отображаются как интенсивность флуоресценции, измеряемая с помощью набора для анализа активной каспазы-3 на колонке с гранулами (Upstate). Анализировались три концентрации доцетаксела, 0, 5 и 40 нМ, и три точки по времени, 24, 48 и 72 часа после добавления доцетаксела.

На фиг.15 приводятся уровни фосфорилирования АКТ в клетках HCT116, трансфицированных миРНК Pim-1 и BubR1. Отношение уровней фосфорилированного и суммарного АКТ определялось с использованием анализа на колонке с гранулами (Biosource). Через двадцать четыре часа после трансфекции клетки оставляли необработанными или обрабатывали 5 и 40 нМ доцетаксела. Через сорок восемь часов после обработки доцетакселом анализировались лизаты клеток. Уровень фосфорилирования рассчитывался как отношение фосфорилированного AKT (p-AKT) к суммарной АКТ (t-AKT).

На фиг.16 приводится вестерн-блоттинг, демонстрирующий сниженные уровни Pim-1 и BubR1 через 48 часов после трансфекции.

ПОЛНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в общем основано на идентификации заявителями генных маркеров, которые могут предсказывать, является ли проверяемый объект резистентным или чувствительным к лекарствам таксоидного семейства. С использованием клеточного скрининга интерференции РНК (РНКи) заявители установили, что лекарственная резистентность или чувствительность к доцетакселу была связана с конкретными генными маркерами.

Отмечается, что различные термины и ключевые фразы используются в подробном описании и формуле изобретения. Определения этих терминов и ключевых фраз приводятся ниже.

Используемый в настоящем документе термин «прогноз» относится к предсказанию или к вероятности связанной с раком смерти или прогрессии, в том числе лекарственной резистентности, а также рецидивов, распространения метастазов и неопластического заболевания.

Используемый в настоящем документе термин «прогнозирование» относится к вероятности того, что пациент будет благоприятно или неблагоприятно реагировать на лекарство или набор лекарств, а также масштабы таких реакций, например выживет ли пациент после хирургического удаления первичной опухоли и/или химиотерапии в течение определенного периода времени без рецидива онкологии. Способы прогнозирования, представленные в настоящем изобретении, могут быть клинически использованы для принятия решений о лечении посредством выбора наиболее подходящих терапевтических подходов для любого конкретного пациента, в частности химиотерапии таксоидным семейством. Способы прогнозирования настоящего изобретения представляют собой важные инструменты для предсказания вероятности благоприятной реакции пациента на схему лечения, например химиотерапии с использованием конкретного препарата или сочетания препаратов, и/или радиационную терапию, или же насколько вероятна долгосрочная выживаемость пациента после прекращения химиотерапии или лечения другими методами.

Используемый в настоящем документе термин «опухоль» относится ко всем формам роста и пролиферации неопластических клеток как злокачественных, так и доброкачественных, и всех предраковых и раковых клеток и тканей.

Используемый в настоящем документе термин «рак» и «раковый» относится к физиологическому состоянию у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака, среди прочего, включают: рак молочной железы; рак толстой кишки; рак легких; рак простаты; гепатоцеллюлярный рак; рак желудка; рак поджелудочной железы; рак матки и яичников; рак печени; рак мочевого пузыря; рак мочевыводящих путей; карцинома; меланома; рак мозга, в том числе глиобластомы и медуллобластомы; рак желчных путей; хориокарцинома; рак пищевода; рак желудка; гематологические неоплазмы, включая острую лимфоцитарную и миелогенную лейкемию; множественную миелому; связанную со СПИДом лейкемию и лейкемию/лимфому зрелых Т-клеток; внутриэпителиальные неоплазмы, включая чечевицеобразный дискоидный дискератоз и болезнь Педжета; лимфомы, в том числе болезнь Ходжкина и лимфоцитарные лимфомы; нейробластомы; рак полости рта, в том числе плоскоклеточная карцинома, саркомы, в том числе лейомиосаркома, рабдомиосаркома, липосаркома, фибросаркома и остеосаркома; рак кожи, в том числе меланома, саркома Капоши, базально-клеточный рак и плоскоклеточный рак; рак яичек, в том числе герминомы, например семинома, несперматогениомальные опухоли (тератомы, хориокарциномы), стромальные опухоли и гоноцитомы; рак щитовидной железы, в том числе аденокарцинома щитовидной железы и медуллярная карцинома; и рак почек, в том числе аденокарцинома и опухоль Вильмса.

Использованный в настоящем документе термин «пациент», предпочтительно, относится к человеку, но может также включать нечеловекообразных приматов, коров, лошадей, свиней, овец, коз, собак, кошек или грызунов. Предпочтительным объектом является человек либо с подозрением на рак, либо с поставленным диагнозом рака, либо относящийся к категории высокого риска развития рака, например, имеющий семейную историю заболевания раком. В предпочтительном применении изобретения под раком понимается рак молочной железы. Методы идентификации пациентов, предположительно страдающих раком, могут включать мануальное обследование, биопсию, историю болезней семьи пациента, историю болезней пациента или ряд методов медицинской визуализации, например маммография, магнито-резонансная томография, спектроскопия магнитного резонанса или позитронная эмиссионная томография. Методы диагностики рака и клинические описания диагнозов рака хорошо известны специалистам в области медицинских наук.

Используемый в настоящем документе термин «образец» представляет собой ткань, полученную методами, которые хорошо известны специалистам в смежных медицинских науках. Такие методы, как биопсия, включают общее разделение массы, микродиссекцию, лазерную микродиссекцию или другие известные в данной области методы разделения клеток. По причине вариабельности клеточных типов в пораженном заболеванием биоптате тканей и вариабельности в чувствительности используемых диагностических методов размер образца, необходимого для анализа, может составлять от 1, 10, 50, 100, 200, 300, 500, 1000, 5000, 10000 до 50000 или более клеток. Подходящий размер образца можно определить на основании клеточной структуры и условий биопсии, а стандартная препаративная процедура для его определения и последующего выделения нуклеиновой кислоты для применения в изобретении хорошо известна специалистам в данной области. Например, биоптата может быть достаточно для оценки экспрессии РНК без амплификации. Напротив, недостаток необходимого количества клеток в малой области биопсии может требовать использования методов конверсии и/или амплификации РНК или других методов, улучшающих разделение молекул нуклеиновых кислот. Такие методы, которые позволяют использовать ограниченный объем биоптатов, хорошо известны специалистам в данной области. Некоторые примеры, среди прочих, включают прямую амплификацию РНК, обратную транскрипцию РНК в кДНК, амплификацию кДНК или генерацию радиоактивно-меченных нуклеиновых кислот.

Используемый в настоящем документе термин «тест» в отношении образца означает образец, взятый из пораженной раком области организма или из области организма, которая демонстрирует определенную стадию или характеристики рака. Используемый в настоящем документе термин «контроль» в отношении образца означает образцы, которые применяются в целях сопоставления. Предпочтительно, такие образцы представляют собой «контроль» с той точки зрения, что образцы не проявляют или считаются не проявляющими никаких признаков какой-либо болезни или заболевания, которые могли бы повлиять на экспрессию генов, особенно в отношении заболевания, в связи с которым их предполагается использовать в качестве стандарта. В альтернативном случае, очевидно, что есть возможность сопоставлять различные стадии заболевания или состояния здоровья, и в таких случаях «контрольный» образец соответствует наиболее ранней стадии заболевания или состояния здоровья. Например, контрольным может быть образец, взятый с не пораженного раком, но сопоставимого участка организма. Кроме того, контрольным образцом может быть сопоставимый участок организма у того же пациента или не пораженный раком участок организма у второго пациента, который по существу подобен первому (те же или близкие виды, возраст, вес, пол и пр.). Наконец, контрольный образец также может быть взят из пораженного раком участка у второго пациента, который эффективно реагирует на лечение с использованием молекулы таксоидного семейства.

Термин «молекула нуклеиновой кислоты» относится к фосфоэфирной полимерной форме рибонуклеозидов (аденозина, гуанозина, уридина или цитидина; «молекулы РНК») или дезоксирибонуклеозидов (дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дезокситимидина или дезоксицитидина; «молекулы ДНК») или к их любым фосфоэфирным аналогам, например фосфоротиоатам и тиоэфирам как в одноцепочечной форме, так и в двухцепочечной спирали. Возможны двухцепочечные спирали ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК. Термин «молекула нуклеиновой кислоты» и, в частности, молекула ДНК или РНК относится только к первичной или вторичной структуре молекулы и не ограничивает ее какими-либо конкретными третичными формами. Таким образом, данный термин распространяется на двухцепочечную ДНК, которая, кроме всего прочего, также присутствует в линейных или кольцевых молекулах ДНК (например, фрагменты рестрикции), плазмидах и хромосомах. При обсуждении структуры конкретных двухцепочечных молекул ДНК для описания последовательностей в настоящем документе используется стандартная договоренность, в соответствии с которой указывается только последовательность в направлении от 5' до 3' по нетранскрибированной цепочке ДНК (то есть цепочке, имеющей последовательность, гомологичную иРНК). «Молекулой рекомбинантной ДНК» называют молекулу ДНК, которая была обработана в соответствии с принципами молекулярной биологии.

Используемый в настоящем документе термин «часть» выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует конкретный белок, относится к части или фрагменту выделенной молекулы нуклеиновой кислоты, которая включает достаточное число последовательных нуклеотидов, которые кодируют пептид или полипептид. Естественно, «часть» выделенной молекулы нуклеиновой кислоты больше одного нуклеотида, и пептид или полипептид, кодируемый такой частью, содержит множество аминокислотных остатков, как это указано ниже в определении пептида или полипептида. Используемый в настоящем документе термин «пептид» относится к двум или более аминокислотам, ковалентно связанным пептидными связями. В конкретном осуществлении пептид включает по крайней мере 10, предпочтительно, по крайней мере 20, и еще более предпочтительно, по крайней мере 30, и даже еще более предпочтительно, по крайней мере 40, а наиболее предпочтительно, 50 или более аминокислот.

Используемый в настоящем документе термин «полипептид» относится к линейному полимеру, состоящему из множества последовательно связанных аминокислот. В частности, полипептид может иметь молекулярный вес более 100 кДа.

Используемый в настоящем документе термин «генетический маркер» относится к физиологическому составу, для которого измеренный уровень РНК, ДНК или белка в образце служит для прогнозирования резистентности или чувствительности испытуемого к препаратам таксоидного семейства. Более того, генетический маркер может кодировать конкретный белок или, в качестве альтернативы, может служить «суррогатным» маркером для белка, активность которого связана с уровнем генетического маркера во взятом в организме образце. Такая взаимосвязь может быть прямой, при которой снижение уровня активности белка соответствует снижению уровня генетического маркера, или, в альтернативном случае, отношение может быть обратным, при этом снижение уровня активности белка соответствует увеличению уровня генетического маркера. К подобным физиологическим составам, среди прочих, относятся клеточные белки (например, стволовых клеток-предшественников), полипептиды, ДНК, РНК, углеводы или жирные кислоты. В конкретном применении настоящего изобретения измеренные уровни определенных генных маркеров могут предсказывать, является ли испытуемый резистентным или чувствительным к препаратам таксоидного семейства. Примеры таких генетических маркеров, среди прочих, включают:

BubR1, иРНК Homo sapiens, подобный протеинкиназе (BUBR1), полный код (номер в каталоге GenBank: AF046079);

Mad2, иРНК Homo sapiens для белка MAD2 (номер в каталоге GenBank: AJ000186);

Mps1, иРНК Homo sapiens протеинкиназа TTK (TTK) (номер в каталоге GenBank: NM_003318);

GEFT для Rac1/CDC42, фактор обмена Homo sapiens RAC/CDC42 (GEFT), вариант транскрипта 2, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_133483);

Bub1, гомолог 1 (дрожжи) Homo sapiens BUB1 почкование, не ингибированное бензимидазолами (BUB1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_004336);

hSepharase, дополнительные полюсы веретена, подобно 1 Homo sapiens (S. cerevisiae) (ESPL1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_012291);

CamKIId, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (CaM киназа) II дельта (CAMK2D), вариант транскрипта 3, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001221);

CDK6, циклин-зависимая киназа 6 (CDK6), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001259); и

GRB2, фактор роста Homo sapiens, белок 2, связанный с рецептором (GRB2), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002086).

P21(Waf1), ингибитор циклин-зависимой киназы 1А Homo sapiens (p21, Cip1) (CDKN1A), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_000389);

Pim-1, pim-1 онкоген Homo sapiens (PIM1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002648);

GBP-1, гуанилат-связывающий белок 1 Homo sapiens, индуцируемый интерфероном, 67 кДа (GBP1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002053);

RXRA, ретиноид Х-рецептор Homo sapiens, альфа (RXRA), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002957);

SPF45, белок 17 с РНК-связывающим мотивом Homo sapiens (RBM17), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_032905);

Hec1, связанный с центромером 2 Homo sapiens (KNTC2), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006101);

Raf1, человеческая иРНК для онкогена raf (номер в каталоге GenBank: X03484);

Aurora A, киназа 1 семейства Аurora Homo sapiens (ARK1), иРНК, полный код (номер в каталоге GenBank: AF008551);

TACC3, трансформирующий кислый биспиральный белок 3 Homo sapiens (TACC3), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006342);

RelB, гомолог В вирусного онкогена ретикулоэндотелиоза v-rel Homo sapiens, ядерный фактор ген-энхансера легкой цепи полипептида каппа в В-клетках 3 (птиц) (RELB), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006509);

PRKCD, протеинкиназа С Homo sapiens, дельта (PRKCD), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006254); BRAF35, высокоподвижная группа Homo sapiens 20B (HMG20B), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_006339);

HSPA1L, белок теплового шока 70 кДа 1А Homo sapiens (HSPA1A), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_005345);

STK11, серин-треонинкиназа 11 Homo sapiens (полипоз кишечника II) (STK11), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_000455) и

MKK3, MAP киназа киназа 3 Homo sapiens (MKK3), иРНК, полный код (номер в каталоге GenBank: L36719).

Используемый в настоящем документе термин «контрольный генетический маркер» относится к физиологическому составу, для которого измеренный уровень РНК, ДНК или белка в образце остается неизменным до, в течение или после воздействия препаратов таксоидного семейства. «Контрольные генетические маркеры» называются облигатными генами. К ним относятся гены, которые выбираются на основе сравнительно неизменных уровней экспрессии в анализируемой системе, например, при конкретном заболевании таком, как рак. Облигатные гены используются для нормализации результатов экспрессии. Примеры таких генетических маркеров, среди прочих, включают:

GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа Homo sapiens (GAPD), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002046) и

RPS9, клон кДНК Homo sapiens IMAGE:6647283, частичный код (номер в каталоге: BC071941).

Используемый в настоящем документе термин «молекула таксоидного семейства» относится к классу химиотерапевтических соединений, принадлежащих к таксоидному семейству. Отдельными представителями таксоидного семейства, среди прочих, являются паклитаксел (таксол), доцетаксел (таксотер) и их аналоги (т.е. XRP9881 и XRP6258; см. Ojima and Geney, Curr Opin Investig Drugs 4:737, 2004). Поскольку данный класс молекул связывает бета-тубулин и стабилизирует полимерную форму микроканальцев, подобно доцетакселу, ожидается, что клиническая экспрессия биомаркера, описанная в настоящем документе, будет отражать похожие состояния ответной реакции на данные лекарства.

Использованные в настоящем документе термины «молекула», «соединение» или «агент» обозначают любой состав, который известен в настоящий момент или будет открыт в будущем. К примерам соединений или агентов, применяемых в настоящем изобретении, относятся органические соединения (например, искусственного или природного происхождения и оптически активные), пептиды (искусственного или природного происхождения и оптически активные, то есть D или L аминокислоты), углеводы, молекулы нуклеиновых кислот и пр.

Используемый в настоящем документе термин «жесткость гибридизации» или «гибридизация в жестких условиях» относится к условиям, которые без труда определит специалист в данной области и которые обычно зависят от эмпирических расчетов с учетом длины образца, температуры промывки и концентрации солей. Как правило, более длинные образцы требуют более высоких температур для надлежащей ренатурации, тогда как более коротким образцам необходимы более низкие температуры. Гибридизация обычно зависит от способности денатурированной ДНК к повторной ренатурации при наличии комплементарных цепочек в среде с температурой ниже их температуры плавления. Чем выше степень желаемой гомологии между образцом и гибридизуемой последовательностью, тем выше относительная температура, которая может быть использована. В результате, можно сделать вывод, что более высокие относительные температуры обычно будут определять более жесткие условия реакции, а более низкие - менее жесткие. Дополнительную информацию и пояснения в отношении жесткости реакций гибридизации см. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

Использованный в настоящем документе термин «жесткие условия» или «условия с высокой жесткостью» относятся к таким условиям, при которых: (1) используется низкая ионная сила и высокая температура отмывки, например, 0,015 M хлорид натрия/0,0015 M цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°C; (2) в процессе гибридизации используется денатурирующий агент, такой как формамид, например 50% (об.) формамид с 0,1% альбумином бычьей сыворотки/0,1% Ficoll/0,1% поливинилпирролидон/50 мМ буфер фосфата натрия при pH 6,5 с 750 мМ хлоридом натрия, 75 мМ цитратом натрия при 42°C; или (3) гибридизация за ночь в растворе, который содержит 50% формамида, 5x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5× раствора Денхардта, обработанная ультразвуком ДНК из молок лосося (50 мкг/мл), 0,1% натрий додецил сульфат, и 10% декстрансульфат при 42°C с 10-минутной отмывкой при 42°C в 0,2× SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) с последующей 10-минутной отмывкой в жестких условиях с использованием 0,1× SSC, содержащего EDTA при 55°C. Умеренно жесткие условия могут определяться в соответствии с описанием, приведенным в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, и предусматривать использование промывного раствора и менее жесткие условия гибридизации (например, температура, ионная сила и % SDS) по сравнению с описанными выше. Примером умеренно жестких условий является инкубирование в течение ночи при 37°C в растворе, содержащем 20% формамид, 5× SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (pH 7,6), 5× раствор Денхардта, 10% декстрансульфат и 20 мг/мл денатурированной фрагментированной ДНК из молок лосося, с последующей промывкой фильтров в 1× SSC примерно при 37-50°C. Специалисту в данной области известно, каким образом следует регулировать температуру, ионную силу и пр., необходимые для учета таких факторов, как длина образца и пр. Необходимая степень жесткости условий гибридизации нуклеиновых кислот зависит от длины нуклеиновых кислот и уровня комплементарности - параметров, которые хорошо известны специалистам. Чем выше степень сходства или гомология между двумя последовательностями нуклеотидов, тем больше значение T_m для гибридов нуклеиновых кислот, содержащих такие последовательности. Относительная стабильность (соответствующая более высоким T_m) гибридизованных нуклеиновых кислот снижается в следующем порядке: РНК:РНК, ДНК:РНК, ДНК:ДНК. Предпочтительной минимальной длиной для гибридизуемой нуклеиновой кислоты является по крайней мере 12 нуклеотидов, предпочтительно, примерно 16 нуклеотидов; а еще более предпочтительно, по крайней мере, 24 нуклеотида; и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 36 нуклеотидов.

Используемый в настоящем документе термин «метка» или «детектируемая метка» относится к детектируемому маркерному соединению или составу, который напрямую или косвенно конъюгируется с антителом, олигопептидом или иной органической молекулой, с тем чтобы образовать «меченое» антитело, олигопептид или другую органическую молекулу. Метка может быть сама по себе детектируемой (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки), или, в случае ферментативной метки, может катализировать химические изменения субстрата или состава, которые поддаются детектированию.

Используемый в настоящем документе термин «прямая метка» относится к объекту, который в своем природном состоянии легко различим либо невооруженным глазом, либо с помощью оптического фильтра и/или приложенного воздействия, например УФ-излучения, чтобы вызвать флуоресценцию. Примеры, среди прочего, включают цветные метки, частицы металлических золей, частицы золей красителей, окрашенный латекс или липосомы с инкапсулированными красителями (описаны в патентах США № 4313734, 4373932, WO 88/08534), EP-A 0280559, 0281327, патенте США № 4703017). К другим прямым меткам относятся радиоактивные нуклеотиды, рентгеноконтрастные вещества, флуоресцентные или люминесцентные вещества.

Используемый в настоящем документе термин «непрямые метки» относится к ферментам, которые могут также использоваться в соответствии с настоящим изобретением. Специалистам известны различные виды иммуноферментного анализа, например, щелочная фосфатаза и пероксидаза из хрена, лизоцим, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, уреаза - эти и другие ферменты подробно обсуждались в Eva Engvall, Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT in Methods in Enzymology, 70: 419-439, 1980 и в патенте США № 4857453.

Используемый в настоящем документе термин «набор» относится к изделию, содержащему один или несколько контейнеров и этикетку или вкладыш на контейнерах или прилагаемые к ним. В предпочтительном применении контейнеры могут содержать антитела, меченные детектируемой меткой, фрагменты антител, меченных детектируемой меткой, или олигонуклеотиды, меченные детектируемой меткой. В другом применении контейнеры обеспечивают средства извлечения полной РНК из взятого из организма образца, обратную транскрипцию полной РНК для получения кДНК и проведения полимеразной цепной реакции с кДНК с использованием набора праймеров, причем один или оба праймера имеют детектируемую метку. Могут прилагаться дополнительные контейнеры набора, которые содержат, например, разбавители и буферы, контрольные антитела, олигопептиды или малые органические молекулы. Этикетка или вкладыш могут содержать описание состава, а также инструкции по хранению и предлагаемому использованию «in vitro» или в диагностических целях.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением в рамках знаний специалистов в данной области могут использоваться стандартные методики молекулярной биологии, микробиологии и технологии рекомбинантной ДНК. Содержание таких методик подробно изложено в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (в данном документе "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

В общем случае технология РНК-интерференции использует синтетические или векторные двухцепочечные РНК для индуцирования деградации иРНК, содержащей гомологичные последовательности (McManus and Sharp, Nat Rev Genet 3:737, 2002). Скрининг РНК-интерференции использовался для установления функций генов во многих организмах, например, Caenorhabditis elegans (Simmer et al., PloS Biol 1:E12, 2003), Drosophila (Lum et al., Science 299:2039, 2003) и клетках млекопитающих (Aza-Blanc et al., Mol Cell 12:627, 2003).

В настоящем изобретении клетки рака толстой кишки HCT116 использовались для скрининга миРНК, направленных против 101 гена, связанного с раком, главным образом, включающих представителей семейства киназ, и уничтожающее действие доцетаксела количественно определялось по кривым дозовой зависимости высокого разрешения. С использованием такого подхода заявители продемонстрировали, что недостаточная экспрессия 9 генов, в том числе BubR1, Bub1, Mad2, Mps1 и GEFT Rac/CDC, может ингибировать уничтожение с помощью доцетаксела, тогда как недостаточная экспрессия 15 других генов, в том числе Pim1, p21, TACC3 и Aurora-A, может усиливать гибель клеток, вызванную доцетакселом.

Таким образом, настоящее изобретение в целом распространяется на диагностические методы и наборы, которые могут быть использованы, с тем чтобы определить, будет ли лицо, принимающее или рассматривающее возможность принимать доцетаксел, проявлять резистентность или чувствительность к препарату.

Заявители наблюдали резистентность к доцетакселу, причем резистентность к препарату связана с потерей широкого набора контрольных генов, в том числе BubR1, Bub1, Mad2, Msp1 и GEFT Rac/CDC.

Повышенная чувствительность к доцетакселу соответствует потере любого из нескольких генов, в том числе GBP-1, STK11, RXRA, Hec1, SPF45, Raf1, RELB, MKK3, PRKCD, HSPA1A, BRAF35, Aurora-A, Pim-1, TACC3 и p21waf1/Cip1, и ингибиторы таких генов могут служить важным дополнением к терапии доцетакселом.

Митотические контрольные гены служат в качестве безотказного механизма задержки анафазы посредством ингибирования Cdc20-APC (комплекс, стимулирующий анафазу) до тех пор, пока кинетохоры сестринских хроматид не будут надлежащим образом прикреплены к митотическому веретену и выстроятся на экваторе (Zhou et al., J Cell Sci 115:3547, 2002), тем самым давая клеткам возможность надежно выйти из митоза и перейти к дополнительным клеточным циклам с точным комплементом ДНК. В присутствии ингибиторов микроканальцев клетки, выходящие из митоза, больше не в состоянии надлежащим образом разделять свои хромосомы и обычно подвергаются апоптозу сразу же или после нескольких клеточных циклов (Taylor and McKeon, Cell 89:727, 1997). Сочетание ингибиторов микроканальцев с потерей митотических контрольных генов, например BubR1, позволяет клеткам обойти остановку митоза без апоптоза и приводит к хромосомной нестабильности (CIN) и анеуплоидии (Shin et al., Cancer Cell 4:483, 2003). Недавно данные по резистентности к препарату были получены при использовании ингибитора микроканальцев паклитаксела для обработки клеток MCF-7, подавленных при помощи BubR1 и Mad2 (Sudo et al., Cancer Res 64:2502, 2004).

Ген Pim-1 кодирует серин/треонинкиназу, которая относится к небольшому семейству родственных киназ. Функция Pim-1 связана с пролиферацией, дифференциацией, апоптозом, образованием опухолей, гипоксией, ангиогенезом и митозом (Wang et al., Biochim Biophys Acta 1593:45, 2002). Данные микроскопического исследования в сочетании с данными по гипофосфорилированию AKT и измерениями повышенной активности каспазы-3 показывают, что подавление Pim-1 усиливало вызванный доцетакселом апоптоз за счет инактивации передачи сигнала AKT, которая опосредует выживание клеток. Pim-1 и p21 обладают весьма сходными характеристиками в сенсибилизации клеток HCT116 к доцетакселу в соответствии с сообщениями, демонстрирующими, что p21 является субстратом фосфорилирования для Pim-1 (Wang et al., Biochim Biophys Acta 1593:45, 2002). Подавление Pim-1 индуцирует определенный апоптоз в отсутствие доцетаксела, однако было более эффективным в присутствии препарата, тогда как подавление трансформирующего кислого биспирального белка TACC3 не вызывало гибели клеток в отсутствие доцетаксела, указывая на то, что сама по себе РНКи не оказывала воздействия на пролиферацию клеток. Полученные результаты показывают, что снижение уровня различных белков может определять различные механизмы сенсибилизации клеток к доцетакселу.

Соответственно в одном из аспектов изобретения активация одного или нескольких генов, описанных в таблице I и II, и уровня белков для этих генов может использоваться для выбора стратегии терапевтического лечения и мониторинга эффективности избранной стратегии лечения.

В конкретном применении приводится способ, который позволяет производить мониторинг уровня активации одного или нескольких генов, приведенных в таблице I и II, в ходе курса химиотерапии для оценки и прогнозирования эффективности химиотерапии для пациента. Биопсии опухолей (например, опухоли молочной железы, толстой кишки, немелкоклеточного рака легких и опухолей желудка) или быстро приготовленная культура биопсий опухоли пациентов с непоставленным диагнозом рака или пациентов, в данный момент проходящих лечение, проходят обработку для выделения ДНК (Hafner et al., Arch Pathol Lab Med 127:1221, 2003; Rodriguez et al., Clin Cancer Res 10:5785, 2004), информационной РНК (Chang et al., Lancet. 362:340, 2003) и/или белков (Espina et al., J Immunol Methods 290:121, 2004), с тем чтобы оценить уровни активации генов или уровни белков для генов, приведенных в таблице I и II, или для их субпопуляции. Определение характеристик транскрипции генов и экспрессии белков используется для диагноза, прогнозирования терапевтического ответа на потенциальные стратегии лечения и может быть полезным инструментом мониторинга реакции пациента на терапию.

Согласно настоящему изобретению РНК может выделяться из образцов опухолей с использованием любого из доступных методов, которые широко применяются в данной области (Ullmann et al., J Biomol Screen 9:95, 2004; Badiee et al., BMC Biotechnol 3:23, 2003). У испытуемого отбирают одну или несколько клеток и из этих клеток выделяют РНК. В качестве примеров у пациента можно отобрать клетки лейкоцитов периферической крови (PBL), или же имеется возможность получить образец клеток и насытить образец желаемым типом клеток. Клетки могут быть выделены из смеси клеток с помощью различных методов, например выделения клеток с использованием антител, которые связываются с конкретным эпитопом на нужном типе клеток. Если нужные клетки находятся в цельной ткани, отдельные клетки могут быть извлечены препарированием, например микродиссекцией или микродиссекцией с лазерным захватом (LCM) (Bonner et al., Science 278:1481, 1997; Fend et al., Am J Path 154:61, 1999). РНК может извлекаться из ткани или образцов клеток с использованием различных методов, например лизисом в присутствии гуанидин тиоцианата с последующим центрифугированием в CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18:5294, 1979). РНК из единичных клеток можно получать, как это описано в методах подготовки библиотек кДНК, из единичных клеток (Dulac, Curr Top Dev Biol. 36:245, 1998). Для конкретных видов образец РНК может быть дополнительно обогащен. Например, в одном из применений из образца РНК может выделяться поли(A)+РНК. В частности, поли-Т-олигонуклеотиды могут быть иммобилизованы на твердой подложке, чтобы служить в качестве лигандов аффинности для иРНК. Промышленность выпускает наборы для этих целей, например набор MessageMaker (Life Technologies, Grand Island, N.Y.). Обогащение может проводиться, например, посредством синтеза праймер-специфической кДНК или нескольких стадий линейной амплификации на основе синтеза кДНК и направленной матричной транскрипцией «in vitro» (Wang et al., Proc Natl Acad. Sci USA 86:9717, 1989; Dulac et al., выше).

В методах настоящего изобретения пригодны для использования различные методики амплификации, в том числе, например, ПЦР; лигазная цепная реакция (LCR) (Wu and Wallace, Genomics 4:560, 1989); самоподдерживающаяся репликация последовательности (SSR) (Guatelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 87:1874, 1990); амплификация на основе последовательности нуклеиновых кислот (NASBA) и амплификация транскрипции (Kwoh et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:1173, 1989). Методы технологии ПЦР хорошо известны специалистам в данной области (см., например, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, N.Y., N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990).

В РНК может вноситься метка для детектирования с использованием любого из методов, известного специалистам в данной области. Например, с помощью микрочипов, как те, что производит Affymetrix. В РНК вносится метка, и она детектируется по гибридизации с помощью любых широко используемых методов, например прямая метка РНК такими красителями, как Cyanine-3 или Cyanine-5 (Perkin Elmer MPS544001KT). Дополнительные методы включают прямую метку кДНК, которая вводится обратной транскрипцией с использованием нуклеотидов, меченных Cyanine-3 или Cyanine-5 (Badiee A 2003), флуоресцеином, или красителями Alexa (Molecular Probes), или другими флуорофорами. Кроме того, могут использоваться непрямая метка кДНК, например FairPlay™/аминоаллильная метка (кат. № Stratagene: 252002), дендримерная метка 3DNA (Genisphere Inc) или амплификация ферментативного сигнала (MICROMAX TSA, Perkin Elmer). В качестве альтернативы РНК может количественно определяться с помощью образцов РНК, которые детектируются с помощью ферментативных, флуоресцентных, радиоактивных или светоизлучающих методов.

В одном из аспектов настоящего изобретения РНК получают из образца опухоли, и при детектировании генетических маркеров используется технология Taqman. Проводится генерация праймеров для детектирования специфических РНК, указанных в таблице I и II, или их подмноженства, и их амплификация осуществляется с помощью обратной транскриптазы. Детектирование специфического фрагмента, амплифицированного с помощью обратной транскриптазы, осуществляется посредством гель-электрофореза, полимерного электрофореза, прямого секвенирования ДНК, детектирования света, спада сигнала флуоресценции, ферментативной реакции или детектирования по гибридизации с комплементарной РНК. В другом аспекте настоящего изобретения для детектирования олигонуклеотидов используется ПЦР в реальном времени. иРНК, полученная из образца опухоли, подвергается обратной трансляции в кДНК. Проводится генерация праймеров для амплификации специфических РНК, указанных в таблице I и II, или их подмноженства, с помощью технологии полимеразной цепной реакции. Детектирование уровня иРНК производится с помощью гель-электрофореза и окрашивания этидий бромидом или CYBR Green, или же посредством измерения интенсивности флуоресценции от меченных флуорофором образцов, специфичных к последовательности, которые выделяются полимеразой.

Еще в одном аспекте настоящего изобретения используется технология норзерн-блоттинга. РНК получают из образца опухоли и затем разделяют гель-электрофорезом и переносят на мембрану. Содержание РНК определяют по гибридизации с использованием образцов, меченных радиоактивным изотопом, например P³², или хромогенным, или люминесцентным анализом на основе ферментативной реакции.

В еще одном аспекте настоящего изобретения в качестве суррогатного индикатора уровня транскрипта может использоваться доза гена. Доза гена для транскриптов из таблицы I и II или их субпопуляции может определяться количественно и оцениваться на предмет того, будет ли опухоль реагировать на терапию доцетакселом (Rodriguez et al., Clin Cancer Res 10:5785, 2004). Поскольку такая оценка может быть сформулирована до неоадъювантной (лечение до операции) терапии, пациенты могут получать лечение доцетакселом, если они отнесены к категории реагирующих, или же может проводиться лечение другим химиотерапевтическим агентом, если они отнесены к категории нереагирующих.

ДНК экстрагируют из биопсии опухолей пациентов и очищают, с тем чтобы удалить примеси, с использованием методов в соответствии с процедурами, проводимыми специалистами в данной области. Методы, применяемые для определения дозы гена в опухолевой ДНК, среди прочего, включают количественную ПЦР, геномные ДНК-чипы, гибридизацию в момент образования или саузерн-блоттинг (Hafner et al., Arch Pathol Lab Med 127:1221, 2003; Rodriguez et al., Clin Cancer Res 10:5785, 2004). Соответственно эти методы могут использоваться для определения копийности одного или нескольких генов из таблицы I и II и сопоставляться с контрольным образцом или контрольными маркерами.

В еще одном аспекте настоящего изобретения в качестве суррогатного индикатора уровня транскрипта может использоваться уровень белков. Показано, что уровни белков коррелируют с подавлением или повышением уровней транскриптов. Поэтому настоящее изобретение включает методики для измерения уровней белков, которые соответствуют полипептидным продуктам, кодируемым транскриптами из таблицы I и II. Белки детектируются и используются в качестве маркеров прогнозируемого ответа на доцетаксел. Методы определения белков хорошо известны специалистам в данной области. Например, иммуноанализ относится к методам, которые используют антитела для детектирования экспрессии целевого белка. В конкретном применении иммуноанализ используется для детектирования белковых продуктов одного или нескольких генов, перечисленных в таблице I и II. Кроме того, антитела к любому из белков, перечисленных в таблице I и II, могут использоваться в ряде других методов детектирования. К таким методам детектирования, среди прочих, относятся следующие: вестерн-блот, анализы ИФА, сэндвич-ИФА. В альтернативном варианте рассматриваются другие методы анализа, не использующие антитела, и к ним относятся подходы, которые применяют олигонуклеотиды ДНК или полипептиды, которые распознают белки, кодируемые транскриптами из таблиц I и II (например, аптамеры). Может также использоваться масс-спектрометрический анализ биологических образцов, который определяет состав полипептидов по точному молекулярному весу пептидных фрагментов после протеолитического распада.

Настоящее изобретение также включает подходящие метки, к которым относятся ферменты, флуорофоры (например, среди прочих, флуоресцеина изотиоцианат (FITC), фикоэритрин (PE), техасский красный (TR), родамин, свободные или хелатированные соли лантанидов), хромофоры, радиозотопы, хелатирующие агенты, красители, коллоидное золото, частицы латекса, лиганды (например, биотин) и хемилюминесцентные агенты.

В одном из аспектов настоящего изобретения используемой радиоактивной меткой могут быть изотопы, например, ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I и ¹⁸⁶Re. Количественное определение уровней радиоактивности может осуществляться известными в настоящее время и доступными методами подсчета. Могут, напротив, применяться рентгеноконтрастные вещества. В осуществлении изобретения, в котором в качестве метки используется фермент, детектирование может проводиться с помощью любого метода, применяемого в настоящее время в данной области: колориметрического, спектрофотометрического, флуороспектрофотометрического, амперометрического или газометрического метода.

Еще одним аспектом настоящего изобретения является использование связывающих пептиды агентов, например антител или фрагментов антител. К антителам относятся поликлональные и моноклональные антитела, приготовленные в соответствии со стандартной методологией. Лишь небольшая часть молекулы антитела, паратоп, участвует в связывании антитела с его эпитопом (см. в целом Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modem Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Например, области pFc' и Fc являются эффекторами комплементного каскада, но не участвуют в связывании антигена. Антитело, из которого ферментативным способом была удалена область pFc' или которое продуцировалось без области pFc', обозначаемое как фрагмент F(ab')₂, сохраняет оба сайта связывания антигена, которые имеются у интактного антитела. Таким образом, в применении настоящего изобретения используется детектируемый меченый фрагмент антитела, например фрагмент F(ab')₂. Точно так же антитело, из которого ферментативным способом была удалена область Fc или которое продуцировалось без области Fc, обозначаемое как фрагмент Fab, сохраняет один из сайтов связывания антигена, которые имеются у интактного антитела. Фрагменты Fab содержат ковалентно связанную легкую цепь антитела и часть тяжелой цепи антитела, обозначенную Fd. Фрагменты Fd являются основным детерминантом специфичности антитела (единичный фрагмент Fd может связывать до десяти различных легких цепей без изменения специфичности антитела), и выделенные фрагменты Fd сохраняют способность связывания эпитопов.

Как хорошо известно специалистам в данной области, в антигенсвязывающей части антитела существуют области, определяющие комплементарность (CDR), которые непосредственно взаимодействуют с эпитопом антигена и каркасными областями (FR), которые сохраняют третичную структуру паратопа (см. в целом Clark, 1986; Roitt, 1991). В тяжелой цепи фрагмента Fd и легкой цепи иммуноглобулинов IgG отмечаются четыре каркасных области (с FR1 по FR4), соответственно разделенные тремя областями, определяющими комплементарность (с CDR1 по CDR3). Области CDR и, в частности, CDR3, а точнее тяжелая цепь CDR3, в значительной мере ответственны за специфичность антител. В настоящее время точно установлено, что не относящиеся к CDR области антител млекопитающих могут быть заменены аналогичными областями конспецифичных или гетероспецифичных антител при одновременном сохранении специфичности эпитопов исходного антитела. Это наиболее очевидным образом проявилось при разработке и использовании «гуманизированных» антител, в которые негуманизированные CDR ковалентно связываются с человеческими FR и/или Fc/pFc' областями, чтобы получить функциональное антитело (см. патенты США №№ 4816567, 5225539, 5585089, 5693762 и 5859205).

Полностью гуманизированные моноклональные антитела могут быть также приготовлены посредством иммунизации трансгенных мышей значительными отрезками локусов тяжелой и легкой цепи человеческого иммуноглобулина. После иммунизации таких мышей (например, XenoMouse (Abgenix) и мыши HuMAb (Medarex/GenPharm)) с помощью стандартной гибридомной технологии можно приготовить моноклональные антитела. Такие моноклональные антитела будут иметь аминокислотные последовательности человеческого иммуноглобулина, а потому не вызовут реакцию человеческих антимышиных антител (HAMA) при введении человеку.

Поэтому специалистам в данной области будет очевидно, что настоящее изобретение также включает фрагменты F(ab')₂, Fab, Fv и Fd; химерные антитела, в которых Fc, и/или FR, и/или CDR1, и/или CDR2, и/или области легких цепей CDR3 были заменены гомологичными гуманизированными или негуманизированными последовательностями; химерные антитела с фрагментом F(ab')₂, в которых FR, и/или CDR1, и/или CDR2, и/ или области легких цепей CDR3 были заменены гомологичными гуманизированными или негуманизированными последовательностями; химерные антитела с фрагментом Fab, в которых FR, и/или CDR1, и/или CDR2, и/или области легких цепей CDR3 были заменены гомологичными гуманизированными или негуманизированными последовательностями, и химерные антитела с фрагментом Fd, в которых FR, и/или CDR1, и/или CDR2 области были заменены гомологичными гуманизированными или негуманизированными последовательностями. Настоящее изобретение также включает так называемые одноцепочечные антитела.

Для более глубокого понимания настоящего изобретения можно сослаться на следующие предпочтительные, но не единственные примеры, которые приводятся в качестве иллюстрации изобретения. Следующие примеры приводятся в целях более полной иллюстрации предпочтительных осуществлений настоящего изобретения. Вместе с тем его ни в коем случае не следует рассматривать как ограничение широкого охвата настоящего изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1: Скрининг миРНК

В целях идентификации генов, которые обеспечивают более высокую резистентность или чувствительность к доцетакселу, проводили скрининг миРНК по отношению к 101 генам в клетках HCT116 с использованием набора концентраций доцетаксела для получения кривых дозовой зависимости. Линию клеток рака толстой кишки человека HCT116 получали из ATCC и культивировали в McCoy 5A с добавлением 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 4 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки при 37°C в присутствии 95% CO₂ и 5% O₂. Список миРНК включал связанные с раком гены, в том числе те, для которых наблюдается повышенная экспрессия в резистентных к доцетакселу опухолях молочной железы по данным экспериментов по определению характеристик экспрессии генов (Chang et al., Lancet 362:362, 2003). Дополнительным критерием является восприимчивость мишеней к действию препарата. Общая схема формулируется следующим образом. В первый день клетки HCT116 высевали по 5000 клеток на ячейку в планшете на 96 ячеек и на следующий день трансфицировали с пулом 3-4 миРНК на ген. Использованный репрезентативный образец миРНК приведен в таблице I и II. Липофектамин 2000 (Invitrogen) использовали для трансфекции миРНК (Dharmacon) в клетки HCT 116 в планшетах на 96 ячеек. На третий день миРНК удаляли и добавляли доцетаксел в концентрациях от 0 до 40 нМ. На шестой день с помощью анализа WST-1 количественно определяли жизнеспособность клеток. С помощью данного анализа отслеживается активность митохондриальных дегидрогеназ, присутствующих в жизнеспособных клетках, которые приводят к распаду тетразольной соли WST-1 с образованием формазана. В день проведения анализа из планшет на 96 ячеек отбирали среду. Реагент WST-1 (Roche) разбавляли в 10 раз в среде McCoy 5A и в каждую ячейку добавляли 100 ul. Затем планшеты инкубировали в течение 40-80 минут при 37°C перед измерением на SpectroMax (Molecular Devices) при длине волны 450 нм. Значения WST-1 выстраивали иерархически посредством расчета отношения экспериментальной к контрольной миРНК, и всего было охарактеризовано 15 генов как обеспечивающих чувствительность и 9 генов, обеспечивающих резистентность, которые приводятся ниже в таблице III. Чувствительные и резистентные совокупности могут быть далее подразделены на дополнительные группы: 1), где эффект миРНК наблюдался при более низких концентрациях доцетаксела (1-6 нM) при сдвиге IC₅₀, или 2), где основной эффект наблюдался при более высоких концентрациях (>6 нM) при менее заметном сдвиге в IC₅₀.

По сравнению с миРНК Mad2, BubR1 и Mps1 миРНК, нацеленные на Grb2, CDK6, сефаразу и кальций/кальмодулинзависимую протеинкиназу II дельта (CamKIID), продемонстрировали более выраженные эффекты при более низких концентрациях доцетаксела (1-6 нM) с характеристическим сдвигом в IC₅₀. В целом, данная подгруппа продемонстрировала более слабую резистентность, чем митотические контрольные гены, и миРНК CamKIID обеспечила наивысший уровень защиты, который вдвое превышал контрольные клетки. Полученные данные показывают, что потеря четырех митотических контрольных генов наряду с несколькими другими генами может в различной степени увеличивать резистентность к доцетакселу.

Данные на фиг.1 демонстрируют несколько характерных кривых дозовой зависимости для клеток, трансфицированных миРНК, с последующим воздействием нескольких концентраций доцетаксела. миРНК к четырем митотическим контрольным генам, в том числе BubR1, Bub1, Mad2 и Mps1 (данные для Bub1 не приводятся), а также фактору обмена гуанин нуклеотида (GEFT) для Rac/Cdc42 продемонстрировали значительную резистентность к доцетакселу с более выраженным эффектом при более высоких концентрациях доцетаксела (>6 нM). Более высокий уровень резистентности наблюдался для Mad2, где жизнеспособность клеток возросла в пять раз по сравнению с контрольными клетками, трансфицированными миРНК. Большинство миРНК не дали результатов скрининга, и в качестве репрезентативного примера приводится ретинобластома человека 1 (RB1).

В целом, полученные результаты показывают, что скрининг миРНК в состоянии обеспечить представление о том, каким образом подавление экспрессии генов сенсибилизирует или защищает клетки от обработки доцетакселом, и в зависимости от концентраций приводит в действие различные механизмы модулирования опосредованной доцетакселом гибели клеток.

Таблица I Последовательности миРНК, определяющие повышенную чувствительность к доцетакселу
Наименование гена	Последовательность миРНК	Идент. номер последова-тельности	Последовательность миРНК	Идент. номер последова-тельности
P21(Waf1)	GCGAUGGAACUUCGACUUU	1	AGACCAUGUGGACCUGUCA	3
	UGGAACUUCGACUUUGUCA	2
Pim-1	CCUUCGAAGAAAUCCAGAA*	4	UAUUCCUUUCGAGCAUGAC	6
	UGGUGUGUGGAGAUAUUCC	5
GBP-1	CGAAAGGCAUGUACCAUAA	7	GAACAGGAGCAACUACUAA	9
	GAUACAGGCUGAAGAGAUU	8
RXRA	GCAAGGACCUGACCUACAC	10	GACCCUGUCACCAACAUUU	12
	GCAAGGACCGGAACGAGAA	11
SPF45	CAAAUCCGCUGACUGAAAU	13	GACCCUAUGUUUCCUAAUG	15
	GAACAAGACAGACCGAGAU	14
Hec1	GUGUAUUCGACAACUCUGU	16	GUACUCAGUUGCAGACAUU	18
	GAUUGCAAGAUUGGAACAA	17	GUAUCACAAAUUGGCUAGA	19
Raf1	GCACGGAGAUGUUGCAGUA	20	GACAUGAAAUCCAACAAUA	22
	GCAAAGAACAUCAUCCAUA	21	GGAAUGAGCUUGCAUGACU	23
Aurora A	GAGAACUGCUACUUAUAUA	24	GAAGGUCGGAUGCAUGAUG	26
	GAAUAUGCACCACUUGGAA	25	GUAAAGGAAAGUUUGGUAA	27
TACC3	GCACCUCGCUUCCCACAAG	28	GAACGAAGAGUCACUGAAG	30
	GAGCGGACCUGUAAAACUA	29
RelB	GCAGAAAGAGGACAUAUCA	31	GCCCGUCUAUGACAAGAAA	33
	GCAGCGAGCCAUUGCCUUU	32
PRKCD	GGACGUGGAUUGCAAACAA	34	GAAAGAACGCUUCAACAUC	36
	GCAUGAAUGUGCACCAUAA	35
BRAF35	GGGCGUACCAGCAGUCUGA	37	GUCUGAAGCCUAUAAGAUG	39
	GCUCUGGGCUCAUGAACAC	38
HSPA1L	GAGAUCGACUCCCUGUUUG	40	GAUCAACGACGGAGACAAG	42
	UGGAGGAGUUCAAGAGAAA	41
STK11	GAAGAAGGAAAUUCAACUA	43	GAAACAUCCUCCGGCUGAA	45
	GAGAAGCGUUUCCCAGUGU	44
MKK3	GGUGGAGGCUGAUGACUUG	46	GGAGGGCCAUGUGAAGAUG	48
	GGAGAUUGCUGUGUCUAUC	47	GAUGUGAAGCCCUCCAAUG	49
*Отдельные последовательности, продемонстрировавшие эффективный нокдаун

Таблица III Гены, влияющие на реакцию на доцетаксел
Последовательности миРНК, определяющие повышенную чувствительность к доцетакселу:
Наименование гена	Идент. номер последова-тельности	Кат. №	отн. IC 50	p(отн. IC 50 )	Мин. отн.	p(Мин. отн.)
P21(Waf1)	90	NM_000389	0,70	0,0004	0,25	0,0000
Pim-1	91	NM_002648	0,80	0,0011	0,30	0,0000
GBP-1	92	NM_002053	0,59	0,0000	0,25	0,0000
RXRA	93	NM_002957	0,64	0,0011	0,36	0,3098
SPF45	94	NM_032905	0,72	0,0000	0,47	0,0000
Hec1	95	NM_006101	0,64	0,0000	0,31	0,0121
Raf1	96	X03484	0,90	0,0059	0,30	0,0000
Aurora A	97	AF008551	0,73	0,0000	1,37	0,0018
TACC3	98	NM_006342	0,29	0,0000	0,85	0,0077
RelB	99	NM_006509	0,56	0,0000	0,77	0,0052
PRKCD	100	NM_006254	0,46	0,0683	0,59	1,0000
BRAF35	101	NM_006339	0,44	0,0000	1,29	0,1361
HSPA1L	102	NM_005345	0,60	0,0404	1,08	1,0000
STK11	103	NM_000455	0,94	0,4544	0,27	0,0000
MKK3	104	L36719	0,51	0,0000	0,82	0,0553
Последовательности миРНК, определяющие повышенную резистентность к доцетакселу:
Наименование гена	Идент. номер последова-тельности	Номер в каталоге	отн. IC 50	p(отн. IC 50 )	Мин. отн.	p(Мин. отн.)
BubR1	105	AF046079	1,88	0,2207	3,01	0,5663^
Mad2	106	AJ000186	3,22	0,0076	5,06	1,0000^
Mps1	107	NM_003318	3,55	0,0008	2,92	1,0000^
GEFT для Rac1/CDC42	108	NM_133483	3,50	1,0000	2,42	1,0000^
Bub1	109	NM_004336	1,38	0,0007	2,45	0,0000
hSeparase	110	NM_012291	1,99	0,0000	0,88	1,0000
CamKIID	111	NM_001221	2,03	0,0016	1,29	1,0000
CDK6	112	NM_001259	1,99	0,0000	1,14	1,0000
GRB2	113	NM_002086	1,97	0,0000	1,16	1,0000
миРНК, не оказывающие воздействия на реакцию на доцетаксел:
Наименование гена	Идент. номер последова-тельности	Номер в каталоге	отн. IC 50	p(отн. IC 50 )	Мин. отн.	p(Мин. отн.)
RB1	114	NM_000321	0,87	0,0061	1,03	0,4863
GAPDH	115	NM_002046	nd	nd	nd	nd
RPS9	116	BC071941	nd	nd	nd	nd
Примечания: Мин. отн.: Отношение миРНК к контролю при наивысшей дозе доцетаксела Чем меньше значение р, тем более значимы различия между образцом и контролем Значения p, обозначенные ^, высоки вследствие плохой аппроксимации кривой на кривых дозовой зависимости, даже невзирая на значимость и воспроизводимость различий nd = не определено

ПРИМЕР 2: Перекрестная проверка для субпопуляции миРНК на повышенную резистентность к доцетакселу

Потенциальный недостаток методов скрининга миРНК исходит из того, что наблюдалась возможность ренатурации миРНК с транскриптами с частичной идентичностью или инициирования трансляционных блоков микро-РНК (мкРНК), что затрудняет разграничение между специфическими и неспецифическими к мишени эффектами (вне сайта) (Jackson et al., Nat Biotechnol 21:635, 2003). Чтобы подтвердить резистентность с использованием независимого подхода второй последовательности, для BubR1 и Mps1 были получены стабильные клеточные линии после нокдауна посредством инфицирования клеток HCT116 ретровирусным вектором, несущим олигонуклеотиды ДНК, кодирующие короткую РНК-шпильку. Короткая РНК-шпилька содержала иную последовательность по сравнению с миРНК, нацеленную на отличающуюся область открытой рамки считывания. Ретровирусная линия клеток с дефектом упаковки GP2-293 была получена от Clontech. Клетки содержались в DMEM с добавлением 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 4 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки. Вирус генерировали транзиторной трансфекцией клеток GP2-293. Всего 3,6×10⁶ клеток высевали в 10 см чашки за 24 часа до трансфекции. Среду заменяли за 4 часа до трансфекции на DMEM, содержащую 10% ФБС без антибиотиков. Клетки трансфицировали 6 мкг векторной ДНК, 6 мкг оболочечной плазмиды VSV-G (Clontech) и 72 мкл липфектамина-2000. Среду заменяли через 14-16 часов; вирусный супернатант собирали через 24 часа, фильтровали через 0,45 мкм фильтр и использовали для инфицирования клеток HCT116 при множественности заражения 5 в присутствии 8 мкг/мл полибрена. Через сорок восемь часов после инфекции клетки отбирали в 0,5 мкг/мл пуромицина в течение 7 дней или до момента гибели фоновых клеток. Кривые дозовой зависимости, полученные для BubR1 и Mps1 клеточных линий после нокдауна, вновь демонстрировали повышенную резистентность, которая была более выраженной при более высоких концентрациях доцетаксела (фиг.2), подобно результатам, полученным при промежуточных трансфекциях миРНК. Чтобы проверить, снижают ли миРНК уровни иРНК, использовали ПЦР в реальном времени для выявления эндогенных транскриптов и подтвердили, что уровни РНК снижались в BubR1 и Mps1 стабильных клеточных линиях после нокдауна по сравнению с векторной контрольно стабильной линией (фиг.3).

Клетки лизировали и РНК экстрагировали с помощью RNAqueous-96 (Ambion). Образцы Taqman™ и прямые и обратные праймеры разрабатывали с использованием программного обеспечения Primer Express™ (PE Applied Biosystems, UK). Поиск в BLAST последовательностей образцов и праймеров не выявил особой идентичности другим последовательностям, кроме специфических проверяемых генов. Для ПЦР в реальном времени в каждую ячейку помещали 20 мкл основной смеси TaqMan™: 4,825 мкл воды без РНКаз, 12,5 мкл 2× универсальной основной смеси для ПЦР и 0,625 мкл 40× смеси MultiscribeTM и ингибитора РНКаз (Applied BioSystems), 0,9 мкл прямого и обратного праймеров (100 мкM), 0,25мкл образца (100 мкM). В каждую ячейку добавляли 5 мкл образца РНК (примерно 1нг/мкл). Планшеты анализировали на TaqMan™ ABI Prism 7700 Sequence Detector™ (Perkin-Elmer, UK). Параметры цикла были 48°C в течение 30 минут, 95°C в течение 10 минут, 40 циклов 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 1 минуты. Значения для тестового гена иРНК экстраполированы из стандартной кривой и представлены в остаточных процентах.

ПРИМЕР 3: Подавление Mad2, BubR1 и Mps1 защищает клетки от гибели, индуцированной доцетакселом, за счет ухода от остановки митоза в сочетании с формированием анеуплоидии

Как было определено с помощью анализа WST-1, потеря митотических контрольных генов в присутствии доцетаксела коррелировала с повышенной жизнеспособностью клеток, подчеркивающей резистентность (фиг.1). Для дополнительной проверки достоверности измерений WST-1 проводились цитологические эксперименты для изучения морфологии и жизнеспособности клеток (фиг.4). Клетки отслеживали с помощью конфокальной микроскопии и Calcein-AM, витального красителя, который обеспечивает зеленую флуоресценцию в результате реакции с внутриклеточной эстеразой, выполняя функцию индикатора метаболически активных клеток. Фиг.4 показывает, что через 16 часов после добавления доцетаксела клетки, трансфицированные миРНК Mad2, BubR1 и в меньшей степени Mps1 преждевременно выходили из митоза в очевидно интерфазное состояние, которое сочеталось с уплощенной морфологией клетки, тогда как большинство клеток, трансфицированных контрольной миРНК, останавливались в митозе с круглой клеточной морфологией. Фенотип плоской клетки был ранее описан для других ингибиторов микроканальцев и относится к способности клеток выходить из остановки митоза в, очевидно, интерфазное состояние без фактического завершения митоза (Kung et al., Proc Natl Acad Sci 87:9553, 1990; Lanni and Jacks, Mol Cell Biol 18:1055, 1998). Через 72 часа после обработки наиболее поразительным наблюдением для клеток с подавлением миРНК Mad2, BubR1 или Mps1 было наличие гораздо большего числа клеток и их очень большого размера по сравнению с клетками, трансфицированными контрольной РНК, которые были практически уничтожены при обработке доцетакселом. В отсутствие доцетаксела клетки с подавленными митотическими контрольными генами выглядели подобно контрольным клеткам в два различных по времени момента, и возросшее число клеток через 72 часа указывает на то, что клетки активно росли в присутствии миРНК.

Клетки с подавленными митотическими контрольными генами могут избежать остановки митоза и предварительно выйти из него после обработки ингибиторами микроканальцев, например кольцемидом, нокодазолом и паклитакселом (Taylor and McKeon, Cell 89:727, 1997; Shin et al., Cancer Cell 4:483, 2003; Masuda et al., Am J Pathol 163:1109, 2003; Sudo et al., Cancer Res 64:2502, 2004). Чтобы установить, насколько преждевременным оказывается выход из митоза у клеток HCT116 после подавления трех специфических контрольных генов Mad2, BubR1 или Mps1, измеряли митотические индексы трансфицированных клеток. Соответственно клетки, трансфицированные миРНК Mad2, BubR1 или Mps1, отбирали без обработки (0) или через 8, 16, 24, 36, 48 и 72 часа после обработки доцетакселом, затем фиксировали и инкубировали с поликлональными антителами, которые обнаруживают фосфорилирование гистона H3 как признак митоза (Mitotic Index Kit, Cellomics). Графическое представление для всех точек по времени приводится на фиг.5. Митотический индекс достигал своего пика в промежутке между 16 и 24 часами, указывая на то, что во всех случаях регистрировалась остановка митоза. Митотический индекс достигал наивысшего значения для клеток, трансфицированных контрольной миРНК, тогда как клетки, трансфицированные миРНК Mad2 и BubR1, демонстрировали значительное снижение митотического индекса. Эффекты миРНК Mps1 были не столь серьезными по сравнению с Mad2 и BubR1. Полученные результаты однозначно показывают, что клетки с подавлением митотических контрольных генов могут выходить из состояния остановки митоза, вызванного доцетакселом, и что миРНК BubR1 была наиболее эффективной по сравнению с Mad2 и Mps1.

Чтобы исключить возможность того, что изменения в митотическом индексе совпадали со значительными различиями в эффективности нокдауна, для измерения уровней митотического контрольного транскрипта использовали ПЦР в реальном времени. Эксперимент, приведенный на фиг.6, демонстрирует, что уровни иРНК уменьшались до сопоставимых уровней в клетках, трансфицированных Mad2, BubR1 и Mps1 миРНК, указывая на то, что различие в митотических индексах в большей степени отражало функцию генов.

Из данных микроскопии было очевидно, что очень крупные клетки могут содержать аномальные количества ДНК. С тем, чтобы дополнительно исследовать, могут ли такие клетки с пораженными митотическими контрольными генами преодолеть остановку клеточного цикла, индуцированную доцетакселом, и вновь перейти в S-фазу для генерации анеуплоидных клеток, авторы провели FACS анализ для измерения содержания ДНК. Клетки, трансфицированные Mps1, BubR1, Mad2 и контрольной миРНК, культивировали в отсутствие и в присутствии доцетаксела, фиксировали и окрашивали пропидий-иодидом и анализировали с помощью FACS. Данные собирали при нескольких различных точках по времени после добавления доцетаксела (данные не показаны), и на фиг.7 приводятся гистограммы для точки 72 часа. Через 72 часа после добавления доцетаксела трансфекция Mps1, BubR1, Mad2 и миРНК вызвала накопление клеток с содержанием ДНК 8N, 16N, а в случае BubR1 - 32N. При использовании только контрольной миРНК в присутствии доцетаксела регистрировалась популяция клеток 8N, но величины 8N были гораздо больше для клеток с подавленными митотическими контрольными генами. В более ранний момент времени после добавления доцетаксела (данные не приводятся) большинство контрольных клеток останавливалось при 4N, тогда как клетки, трансфицированные миРНК Mps1, BubR1 и Mad2, продолжали рост от 4N до 8N. Полученные результаты показывают, что нокдаун митотических контрольных генов позволяет клеткам быстрее накапливать аномальные уровни ДНК и пересекать более высокий порог плоидии по сравнению с немутантными клетками. Данные результаты демонстрируют роль Mad2, BubR1 и Mps1 в регулировании митотического индекса и протекания клеточного цикла в присутствии ранее неохарактеризованного ингибитора микроканальцев доцетаксела.

ПРИМЕР 4: Образование колоний, резистентных к доцетакселу, в клетках с подавлением BubR1

Апоптозная функция BubR1 представляется важной для регулирования соответствия хромосом с учетом того, что недостаточная экспрессия BubR1 в сочетании с агентами, противодействующими микроканальцам, была связана с анеуплоидией, а восстановление BubR1 связывалось с активированной контрольной точкой и апоптозом анеуплоидных клеток (Shin et al., Cancer Cell 4:483, 2003). Чтобы установить, способствует ли постоянное подавление митотических контрольных генов предоставлять возможность клеткам расти с более высоким пролиферативным потенциалом, стабильные клеточные линии BubR1 и Mps1 после нокдауна (фиг.4) проверялись с точки зрения их способности к пролиферации и образованию колоний в постоянном присутствии доцетаксела. Не удавалось генерировать стабильные клеточные линии Mad2 после нокдауна, поскольку подавление Mad2 было смертельно для клеток (Michel et al., Proc Natl Acad Sci 101:4459, 2004). Стабильные клеточные линии после нокдауна BubR1, Mps1 и с контрольной короткой РНК-шпилькой обрабатывали 5 нМ доцетаксела в течение 10 дней и после этого окрашивали кристаллическим фиолетовым. На фиг.8 показано, что клеточная линия после нокдауна BubR1 продуцировала гораздо больше крупных колоний, чем контрольная клеточная линия. Клеточная линия после нокдауна Mps1 была не в состоянии образовать колонии в присутствии 5 нМ доцетаксела. После того как планшеты инкубировали в течение 17 дней, наблюдались колонии на контрольных планшетах, но их было все же меньше по количеству, чем по сравнению с линией после нокдауна BubR1. Полученные результаты связывают низкие уровни BubR1, но не

Mps1, с активным ростом клеток в присутствии химиотерапевтического препарата доцетаксела.

ПРИМЕР 5: Перекрестная проверка миРНК, которая определяет повышенную чувствительность к доцетакселу

Кроме идентификации миРНК, которые защищают клетки от вызванной доцетакселом гибели, скрининг выявил миРНК, которые сенсибилизируют клетки к гибели. В таблице III Pim-1, p21^waf1/Cip1, GBP-1, RXRA, Hec1, SPF45, Raf1 представляют собой группу миРНК, которые приводят к выраженной гибели при более высоких концентрациях доцетаксела (>6 нM) при очень небольшом сдвиге IC₅₀. Кривые дозовой зависимости миРНК для онкогенной серин/треонинкиназы Pim-1 и ингибитора клеточного цикла p21^waf1/Cip1 были очень схожими (фиг.9), что может отражать перекрывающуюся или общую роль для канала передачи сигнала; и ранее опубликованные сообщения показали, что p21^waf1/Cip1 является субстратом Pim-1 (Wang et al., Biochim Biophys Acta 1593:45, 2002). Дополнительный интерес представляют данные по повышенной экспрессии Pim-1 в эпителиальных клетках простаты, что приводит к интерференции митотических контрольных генов и генетической нестабильности (Roh et al., Cancer Res 63:8079, 2003). Полученные результаты находятся в соответствии с данными по недостаточной экспрессии Mad2, BubR1 и

Mps1, указывающими на сопоставимый фенотип с противоположными уровнями экспрессии (см. фиг.1). Другой миРНК, которая обеспечивала чувствительность к доцетакселу, была Hec1.

В таблице III TACC3, RELB, Aurora-A, PRKCD (PKC), HSPA1A и BRAF35 представляют собой миРНК, которые увеличивают чувствительность при более низких концентрациях доцетаксела (1-6 нM) с характерным сдвигом в IC₅₀. Aurora-A является серин/треонинкиназой, которая функционирует в начале митоза и участвует в созревании центросом и формировании веретена (в обзоре Meraldi et al., Curr Opin Genet Dev 14:29, 2004). Особый интерес представляют опубликованные данные, показывающие, что повышенная экспрессия Aurora-A в клетках HeLa, защищенных от доцетаксела, находится в соответствии с нашими результатами, где недостаточная экспрессия Aurora-A усиливала гибель при воздействии доцетаксела (Anand et al., Cancer Cell 3:51, 2003). Правда, это было незначительное снижение IC₅₀ для Aurora-A, которое представляло 25% снижения выживаемости; тем не менее, результаты были точно воспроизведены с использованием ретровирусной доставки короткой РНК-шпильки, вызывающей стабильный нокдаун Aurora-A в клетках HCT116 (ср. фиг.9 с фиг.10 и 11).

ПРИМЕР 6: Pim1 ингибирует пролиферацию клеток HCT116 в отсутствие доцетаксела

Для дальнейшей оценки положительных результатов скрининга было важно различать миРНК, которые воздействуют на жизнеспособность клеток в отсутствие доцетаксела, а также те, которые действуют вместе с доцетакселом, усиливая гибель. Чтобы провести различия между такими возможностями, исследовались воздействия трансфекции на пролиферацию с использованием эксклюзионного анализа с окрашиванием трипановым синим с подсчетом клеток, чтобы определить число жизнеспособных клеток в 6-ячеечных планшетах через 24, 48 и 72 часа после трансфекции. Наши результаты показывают, что миРНК Pim-1 ингибирует рост клеток HCT116, тогда как миРНК TACC3 не оказывают воздействия на рост (фиг.12; количественные данные по нокдауну приведены на фиг.13), хотя обе миРНК усиливают гибель клеток, индуцированную доцетакселом (фиг.9).

ПРИМЕР 7: Проверка субпопуляций резистентных и чувствительных генов с использованием анализа отношения выживших к погибшим

Для визуального сопоставления миРНК, которые определяют чувствительность и резистентность к доцетакселу, использовали микроскопию, чтобы определить отношение выживших клеток к погибшим, при этом для окраски живых клеток в зеленый цвет использовали Calcein-AM, а для окраски ядра погибших клеток в красный цвет применяли пропидий-иодид (PI). После добавления доцетаксела (72 часа) клетки BubR1, трансфицированные миРНК, демонстрировали наибольшее количество жизнеспособных клеток, тогда как Pim-1 и TACC3, трансфицированные миРНК, приводили к наибольшему числу погибших клеток, а контрольные клетки занимали промежуточное положение (данные не показаны). Хотя только одни миРНК BubR1 демонстрировали повышенную гибель клеток через 72 часа, в конечном счете, клетки становились более резистентными к доцетакселу. Одна миРНК Pim-1 вызывала гибель клеток в течение 24 часов, тогда как миРНК TACC3 вообще не приводила к гибели. Полученные результаты показывают, что подавление BubR1 было связано с повышенной жизнеспособностью клеток и резистентностью к препаратам, тогда как подавление Pim-1 и TACC3 было связано с повышенной гибелью клеток и чувствительностью к препаратам. И Pim-1, и TACC3 демонстрировали более высокие показатели гибели в присутствии доцетаксела, но такой анализ не позволял провести разграничение между аддитивными эффектами и синергической гибелью.

ПРИМЕР 8: Индуцированная доцетакселом активность каспазы-3 уменьшалась посредством подавления BubR1 и усиливалась при подавлении Pim-1

Доцетаксел может вызывать гибель клеток посредством индукции апоптоза (Kim et al., Int J Mol Med 11:799, 2003). Чтобы определить, могут ли миРНК Pim-1 и BubR1 модулировать канонический апоптозный путь в отсутствие и в присутствии доцетаксела, исследовались уровни активированной каспазы-3 в клетках HCT116 (с помощью анализа биокомплекса) (фиг.14). Через 48 часов после введения 40 нМ доцетаксела в контрольных клетках индуцировалась активность каспазы-3, и такая индукция дополнительно усиливалась подавлением Pim-1 и снижалась при подавлении BubR1 (средние и нижние панели). В отсутствие доцетаксела подавление Pim-1 вызвало незначительное снижение активности каспазы-3 в момент времени 24 часа, но через 48 и 72 часа (верхняя панель) наблюдался возврат к контрольному уровню, указывая на активацию другого механизма апоптоза для поддержания повышенного уничтожения клеток, наблюдавшегося в момент времени 72 часа по данным WST-1 и анализа отношения ВЫЖИВШИЕ/ПОГИБШИЕ. Подавление BubR1 в отсутствие доцетаксела вызывало весьма незначительное повышение активности каспазы-3, что находится в соответствии с наблюдением, сделанным при анализе ВЫЖИВШИЕ/ПОГИБШИЕ через 72 часа, о первоначальной гибели клеток, вызванной нокдауном BubR1. Полученные результаты дополнительно указывают на Pim-1 и BubR1 как эффекторы гибели при воздействии доцетаксела посредством модуляции активности каспазы-3.

ПРИМЕР 9: Пути передачи сигнала, задействованные в вызванной доцетакселом чувствительности, связанной с Pim-1, и резистентности, связанной с BubR1

Функции, приписываемые Pim-1, настоятельно указывают на то, что она играет центральную роль в блокировании передачи сигнала, который приводит к гибели клеток, при одновременном стимулировании сигналов, которые способствуют выживанию клеток. Чтобы попытаться определить молекулярные основы для повышенной гибели клеток, связанной с нокаутом Pim-1, изучалось состояние активации ключевого клеточного пути, задействованного в выживаемости клеток, AKT. HCT116 высевались по 4×10⁵ клеток/ячейку в 6-ячеечные планшеты и на следующий день трансфицировались миРНК в концентрации 16 нM с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen). Через 24 часа клетки оставляли необработанными или обрабатывали 5 и 40 нМ доцетаксела. Клетки лизировали через 24, 48 и 72 часа после добавления доцетаксела ледяным лизисным буфером (50 мМ буфер HEPES (PH7,4), 1% NP40, 2,5 мМ EDTA, 100 мМ фторид натрия, 10 мМ натрий-PP_I, таблетка смеси ингибиторов протеазы (Roche), 2 мМ ортованадата натрия) и центрифугировали при 12000g в течение 10 минут. Затем в лизатах количественно определяли уровень суммарного белка с использованием анализа белка DC (BioRad). Уровни активной каспазы-3 определяли с использованием набора для анализа активной каспазы-3 на колонке с гранулами (Upstate) и системы Luminex 100^TM с протоколами, предложенными изготовителем. Уровни суммарной и фосфорилированной AKT определяли с использованием набора нанесенных на гранулы антител суммарной АКТ и набора нанесенных на гранулы антител фосфоспецифичной AKT ^S473 (Biosource) и системы Luminex 100^TM с протоколами, предложенными изготовителем.

Эксперимент, приведенный на фиг.15, показывает, что подавление Pim-1 снижает базисное фосфорилирование АКТ по сравнению с контролем, и эффект в значительной мере усиливался при увеличении концентраций доцетаксела. При сравнении подавление BubR1 увеличивало базисное фосфорилирование АКТ, и эффект усиливался при более низких, а не более высоких концентрациях доцетаксела, указывая на возможность активации альтернативных путей передачи сигнала при более высоких дозах.

Заявители провели вестерн-блоттинг с использованием антител к Pim-1 и BubR1 для измерения уровней белка в момент времени 48 часов. Равные количества белков загружались в гели NuPAGE Novex Bis-Tris (Invitrogen). Антитела к Pim-1 (Santa Cruz biotechnology), BubR1 (BD bioscience) и α-тубулину (Sigma) использовались в соответствии с указаниями изготовителя. Вторичные антитела конъюгировали с HRP (BioRad) и детектировали с помощью ECL Western Blot Detection System (Amhersham Biosciences) с последующим воздействием Hyperfilm ECL (Amhersham Biosciences). Эксперимент, приведенный на фиг.16, показал, что уровни белка Pim-1 и BubR1 сокращались по сравнению с контролем, указывая на соответствие пониженных уровней белка функциональным изменениям (фиг.15). Полученные данные показывают, что подавление уровней белка Pim-1 может блокировать фосфорилирование и активацию AKT, так чтобы обречь клетки на апоптоз. Pim-1, очевидно, опосредует выживаемость клеток за счет активации каналов, способствующих выживаемости.

Настоящее изобретение не ограничивается в объеме теми конкретными осуществлениями, которые описаны в данном документе. В самом деле, различные модификации изобретения, кроме уже описанных в настоящем документе, будут очевидны для специалистов из приведенного выше описания и приложенных чертежей. Предполагается, что такие модификации попадают в сферу охвата прилагаемой формулы изобретения.

Все ссылки, цитируемые в настоящем документе, полностью включаются в настоящий документ.

Anand S, Penrhyn-Lowe S, Venkitaraman AR. (2003) AURORA-A amplification overrides the mitotic spindle assembly checkpoint, inducing resistance to Taxol. Cancer Cell. 3:51-62.

Aza-Blanc P, Cooper CL, Wagner K, Batalov S, Deveraux QL, Cooke MP. (2003) Identification of modulators of TRAIL-induced apoptosis via RNAi-based phenotypic screening. Mol Cell. 12:627-37.

Chang JC, Wooten EC, Tsimelzon A, Hilsenbeck SG, Gutierrez MC, Elledge R, Mohsin S, Osborne CK, Chamness GC, Allred DC, O'Connell P. (2003) Gene expression profiling for the prediction of therapeutic response to docetaxel in patients with breast cancer. Lancet. 362:362-9.

Hong, WK (2002) The current status of docetaxel in solid tumors. Oncology 16:9-15.

Jackson AL, Bartz SR, Schelter J, Kobayashi SV, Burchard J, Mao M, Li B, Cavet G, Linsley PS. (2003) Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21:635-7.

Katsumata N. (2003) Docetaxel: an alternative taxane in ovarian cancer. Br J Cancer. 89 Suppl 3:S9-S15.

Kim R, Tanabe K, Uchida Y, Emi M, Toge T. (2003) Effect of Bcl-2 antisense oligonucleotide on drug-sensitivity in association with apoptosis in undifferentiated thyroid carcinoma. Int J Mol Med. 11:799-804.

Kolfschoten GM, Hulscher TM, Duyndam MC, Pinedo HM, Boven E. (2002) Variation in the kinetics of caspase-3 activation, Bcl-2 phosphorylation and apoptotic morphology in unselected human ovarian cancer cell lines as a response to docetaxel. Biochem Pharmacol. 63:733-43.

Kung AL, Sherwood SW, Schimke RT. (1990) Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87:9553-7.

Lanni JS, Jacks T. (1998) Characterization of the p53-dependent postmitotic checkpoint following spindle disruption. Mol Cell Biol. 18:1055-64.

Lee LF, Li G, Templeton DJ, Ting JP. (1998) Paclitaxel (Taxol)-induced gene expression and cell death are both mediated by the activation of c-Jun NH2-terminal kinase (JNK/SAPK). J Biol Chem. 273:28253-60.

Li Y, Dowbenko D, Lasky LA. (2002) AKT/PKB phosphorylation of p21Cip/WAF1 enhances protein stability of p21Cip/WAF1 and promotes cell survival. J Biol Chem. 277:11352-61.

Lum L, Yao S, Mozer B, Rovescalli A, Von Kessler D, Nirenberg M, Beachy PA. (2003) Identification of Hedgehog pathway components by RNAi in Drosophila cultured cells. Science. 299:2039-45.

Masuda A, Maeno K, Nakagawa T, Saito H, Takahashi T. (2003) Association between mitotic spindle checkpoint impairment and susceptibility to the induction of apoptosis by anti-microtubule agents in human lung cancers. Am J Pathol. 163:1109-16.

McManus MT, Sharp PA. (2002) Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3:737-47.

Meraldi P, Honda R, Nigg EA. (2004) Aurora kinases link chromosome segregation and cell division to cancer susceptibility. Curr Opin Genet Dev. 14:29-36.

Michel L, Diaz-Rodriguez E, Narayan G, Hernando E, Murty VV, Benezra R. (2004) Complete loss of the tumor suppressor MAD2 causes premature cyclin B degradation and mitotic failure in human somatic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101:4459-64.

Ojima, I. and Geney, R. 109881 Aventis (2004) Curr Opin Investig Drugs 4:737-40.

Ringel I, Horwitz SB. (1991) Studies with RP 56976 (taxotere): a semisynthetic analogue of taxol. J Natl Cancer Inst. 83:288-91.

Roh M, Gary B, Song C, Said-Al-Naief N, Tousson A, Kraft A, Eltoum IE, Abdulkadir SA. (2003) Overexpression of the oncogenic kinase Pim-1 leads to genomic instability. Cancer Res. 63:8079-84.

Shin HJ, Baek KH, Jeon AH, Park MT, Lee SJ, Kang CM, Lee HS, Yoo SH, Chung DH, Sung YC, McKeon F, Lee CW. (2003) Dual roles of human BubR1, a mitotic checkpoint kinase, in the monitoring of chromosomal instability. Cancer Cell. 4:483-97.

Simmer F, Moorman C, Van Der Linden AM, Kuijk E, Van Den Berghe PV, Kamath R, Fraser AG, Ahringer J, Plasterk RH. (2003) Genome-Wide RNAi of C. elegans Using the Hypersensitive rrf-3 Strain Reveals Novel Gene Functions. PLoS Biol. 1:E12.

Sudo T, Nitta M, Saya H, Ueno NT. (2004) Dependence of paclitaxel sensitivity on a functional spindle assembly checkpoint. Cancer Res. 64:2502-8.

Tanabe K, Kim R, Inoue H, Emi M, Uchida Y, Toge T. (2003) Antisense Bcl-2 and HER-2 oligonucleotide treatment of breast cancer cells enhances their sensitivity to anticancer drugs. Int J Oncol. 22:875-81.

Taylor SS, McKeon F. (1997) Kinetochore localization of murine Bub1 is required for normal mitotic timing and checkpoint response to spindle damage.Cell. 89:727-35.

Wang TH, Wang HS, Soong YK (2000) Paclitaxel-induced cell death: where the cell cycle and apoptosis come together. Cancer. 88:2619-28.

Wang Z, Bhattacharya N, Mixter PF, Wei W, Sedivy J, Magnuson NS. (2002) Phosphorylation of the cell cycle inhibitor p21Cip1/WAF1 by Pim-1 kinase. Biochim Biophys Acta. 1593:45-55.

Zhou J, Yao J, Joshi HC. (2002) Attachment and tension in the spindle assembly checkpoint. J Cell Sci. 115:3547-55.

1. Способ прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента, страдающего раком толстой кишки, на доцетаксел, включающий следующие стадии:
a) отбор образца для тестирования из области злокачественного поражения у данного пациента;
b) отбор контрольного образца;
c) измерение уровня одного или нескольких генетических маркеров; и
d) сопоставление измеренных уровней указанного одного или нескольких генетических маркеров в образце для тестирования и контрольном образце;
при этом снижение уровня указанного одного или нескольких генетических маркеров, измеренного в образце для тестирования по сравнению с контрольным образцом, указывает на повышенную резистентность к доцетакселу, где
указанный один или несколько генетических маркеров выбраны из группы, включающей
BubR1, иРНК Homo sapiens, подобный протеинкиназе (BUBR1), полный код (номер в каталоге GenBank: AF046079);
Mad2, иРНК Homo sapiens для белка MAD2 (номер в каталоге GenBank: AJ000186); Mps1, иРНК Homo sapiens протеинкиназа ТТК (ТТК) (номер в каталоге GenBank: NM_003318);
GEFT для Rac1/CDC42, фактор обмена Homo sapiens RAC/CDC42 (GEFT), вариант транскрипта 2, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_133483);
Bub1, гомолог 1 (дрожжи) Homo sapiens BUB1 почкование, неингибированное бензимидазолами (BUB1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_004336);
hSepharase, дополнительные полюсы веретена, подобно 1 Homo sapiens (S. cerevisiae) (ESPL1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_012291);
CamKIId, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (СаМ киназа) II дельта (CAMK2D), вариант транскрипта 3, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001221);
CDK6, циклин-зависимая киназа 6 (CDK6), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001259); и
GRB2, фактор роста Homo sapiens, белок 2, связанный с рецептором (GRB2), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002086).

2. Способ по п.1, в котором указанный уровень одного или нескольких генетических маркеров измеряется по иРНК, ДНК или белку.

3. Способ по п.2, в котором указанная иРНК измеряется с использованием способа, выбранного из группы, включающей гибридизацию в момент образования, полимеразную цепную реакцию обратной транскриптазы, гибридизацию нуклеиновой кислоты, электрофорез, норзерн-блоттинг и масс-спектрометрию.

4. Способ по п.2, в котором указанная ДНК измеряется с использованием метода, выбранного из группы, включающей количественную полимеразную цепную реакцию, геномные ДНК-чипы, гибридизацию в момент образования, электрофорез, саузерн-блоттинг и масс-спектрометрию.

5. Способ по п.2, в котором указанный белок измеряется с использованием метода, выбранного из группы, включающей иммуноанализ, вестерн-блоттинг, ИФА и масс-спектрометрию.

6. Набор для прогнозирования или мониторинга реакции страдающего раком толстой кишки пациента на доцетаксел в соответствии со способом по п.1, где в набор входят антитела, меченные детектируемой меткой, фрагменты антител, меченные детектируемой меткой, или олигонуклеотиды, меченные детектируемой меткой, включающие нуклеиновые кислоты, способные к гибридизации в жестких условиях, с образованием указанного или указанных генетических маркеров, выбранных из группы, в состав которой входят
BubR1, иРНК Homo sapiens, подобный протеинкиназе (BUBR1), полный код (номер в каталоге GenBank: AF046079);
Mad2, иРНК Homo sapiens для белка MAD2 (номер в каталоге GenBank: AJ000186);
Mps1, иРНК Homo sapiens протеинкиназа ТТК (ТТК) (номер в каталоге GenBank: NM_003318);
GEFT для Rac1/CDC42, фактор обмена Homo sapiens RAC/CDC42 (GEFT), вариант транскрипта 2, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_133483);
Bub1, гомолог 1 (дрожжи) Homo sapiens BUB1 почкование, неингибированное бензимидазолами (BUB1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_004336);
hSepharase, дополнительные полюсы веретена, подобно 1 Homo sapiens (S.cerevisiae) (ESPL1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_012291);
CamKIId, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (СаМ киназа) II дельта (CAMK2D), вариант транскрипта 3, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001221);
CDK6, циклин-зависимая киназа 6 (CDK6), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001259); и GRB2, фактор роста Homo sapiens, белок 2, связанный с рецептором (GRB2), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002086).

7. Набор по п.6, где детектируемая метка выбрана из группы, включающей фермент, радиоактивный изотоп или химическое соединение, которое флуоресцирует, хемилюминесцентную молекулу, рентгеноконтрастные вещества, липосомы и гаптеновые молекулы.

8. Набор для прогнозирования или мониторинга реакции страдающего раком прямой кишки пациента на доцетаксел в соответствии со способом по п.1, где в набор входят средства
a) получения суммарной РНК из взятого из организма образца для тестирования;
b) обратной транскрипции суммарной РНК с получением кДНК; и
c) проведения полимеразной цепной реакции с кДНК с использованием набора праймеров,
при этом один или оба праймера имеют детектируемую метку, и оба праймера извлекаются из нуклеотидной последовательности одного или нескольких генетических маркеров, выбранных из группы, состоящей из
BubR1, иРНК Homo sapiens, подобный протеинкиназе (BUBR1), полный код (номер в каталоге GenBank: AF046079);
Mad2, иРНК Homo sapiens для белка MAD2 (номер в каталоге GenBank: AJ000186);
Mps1, иРНК Homo sapiens протеинкиназа ТТК (ТТК) (номер в каталоге GenBank: NM_003318);
GEFT для Rac1/CDC42, фактор обмена Homo sapiens RAC/CDC42 (GEFT), вариант транскрипта 2, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_133483);
Bub1, гомолог 1 (дрожжи) Homo sapiens BUB1 почкование, неингибированное бензимидазолами (BUB1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_004336); hSepharase, дополнительные полюсы веретена, подобно 1 Homo sapiens (S.cerevisiae) (ESPL1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_012291);
CamKIId, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (СаМ киназа) II дельта (CAMK2D), вариант транскрипта 3, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001221);
CDK.6, циклин-зависимая киназа 6 (CDK6), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001259); и
GRB2, фактор роста Homo sapiens, белок 2, связанный с рецептором (GRB2), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002086).

9. Набор по п.8, где детектируемая метка выбрана из группы, включающей фермент, радиоактивный изотоп или химическое соединение, которое флуоресцирует, хемилюминесцентную молекулу, рентгеноконтрастные вещества, липосомы и гаптеновые молекулы.

10. Способ прогнозирования или мониторинга реакции онкологического пациента, страдающего раком прямой кишки, на доцетаксел, включающий следующие стадии:
a) отбор образца для тестирования из области злокачественного поражения у данного пациента;
b) измерение уровня одного или нескольких генетических маркеров из группы, включающей
BubR1, иРНК Homo sapiens, подобный протеинкиназе (BUBR1), полный код (номер в каталоге GenBank: AF046079);
Mad2, иРНК Homo sapiens для белка MAD2 (номер в каталоге GenBank: AJ000186);
Mps1, иРНК Homo sapiens протеинкиназа ТТК (ТТК) (номер в каталоге GenBank: NM_003318);
GEFT для Rac1/CDC42, фактор обмена Homo sapiens RAC/CDC42 (GEFT), вариант транскрипта 2, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_133483); Bub1, гомолог 1 (дрожжи) Homo sapiens BUB1 почкование, неингибированное бензимидазолами (BUB1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_004336);
hSepharase, дополнительные полюсы веретена, подобно 1 Homo sapiens (S.cerevisiae) (ESPL1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_012291);
CamKIId, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (СаМ киназа) II дельта (CAMK2D), вариант транскрипта 3, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001221);
CDK6, циклин-зависимая киназа 6 (CDK6), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001259); и
GRB2, фактор роста Homo sapiens, белок 2, связанный с рецептором (GRB2), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002086);
c) измерение уровня одного или нескольких контрольных генетических маркеров, выбранных из группы, состоящей из
GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа Homo sapiens (GAPD), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM__002046); и RPS9, клон кДНК Homo sapiens IMAGE: 6647283, частичный код (номер в каталоге: ВС071941);
d) сопоставление измеренных уровней указанного одного или нескольких генетических маркеров и указанного одного или нескольких контрольных генетических маркеров в образце для тестирования,
при этом снижение уровня указанного одного или нескольких генетических маркеров по сравнению с уровнем одного или нескольких контрольных генетических маркеров указывает на повышенную резистентность к доцетакселу.

11. Способ по п.10, в котором указанный уровень одного или нескольких генетических маркеров измеряется по иРНК, ДНК или белку.

12. Способ по п.11, в котором указанная иРНК измеряется с использованием метода, выбранного из группы, включающей гибридизацию в момент образования, полимеразную цепную реакцию обратной транскриптазы, гибридизацию нуклеиновой кислоты, электрофорез, норзерн-блоттинг и масс-спектрометрию.

13. Способ по п.11, в котором указанная ДНК измеряется с использованием метода, выбранного из группы, включающей количественную полимеразную цепную реакцию, геномные ДНК-чипы, гибридизацию в момент образования, электрофорез, саузерн-блоттинг и масс-спектрометрию.

14. Способ по п.11, в котором указанный белок измеряется с использованием метода, выбранного из группы, включающей иммуноанализ, вестерн-блоттинг, ИФА и масс-спектрометрию.

15. Набор для прогнозирования или мониторинга реакции страдающего раком прямой кишки пациента на доцетаксел в соответствии со способом по п.10, где в набор входят антитела, меченные детектируемой меткой, фрагменты антител, меченные детектируемой меткой, или олигонуклеотиды, меченные детектируемой меткой, включающие нуклеиновые кислоты, способные к гибридизации в жестких условиях, с образованием указанного или указанных генетических маркеров и указанного или указанных контрольных генетических маркеров, выбранных из группы, в состав которой входят
BubR1, иРНК Homo sapiens, подобный протеинкиназе (BUBR1), полный код (номер в каталоге GenBank: AF046079);
Mad2, иРНК Homo sapiens для белка MAD2 (номер в каталоге GenBank: AJ000186);
Mpsi, иРНК Homo sapiens протеинкиназа ТТК (ТТК) (номер в каталоге GenBank: NM_003318);
GEFT для Rac1/CDC42, фактор обмена Homo sapiens RAC/CDC42 (GEFT), вариант транскрипта 2, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_133483); Bub1, гомолог 1 (дрожжи) Homo sapiens BUB1 почкование, не ингибированное бензимидазолами (BUB1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_004336);
hSepharase, дополнительные полюсы веретена, подобно 1 Homo sapiens (S. cerevisiae) (ESPL1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_012291);
CamKIId, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (СаМ киназа) II дельта (CAMK2D), вариант транскрипта 3, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001221);
CDK6, циклин-зависимая киназа 6 (CDK6), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001259); и
GRB2, фактор роста Homo sapiens, белок 2 связанный с рецептором (GRB2), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002086);
GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа Homo sapiens (GAPD), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002046); и
RPS9, клон кДНК Homo sapiens IMAGE:6647283, частичный код (номер в каталоге: ВС071941).

16. Набор по п.15, где детектируемая метка состоит из фермента, радиоактивного изотопа или химического соединения, которое флуоресцирует, хемилюминесцентной молекулы, рентгеноконтрастных веществ, липосом и гаптеновых молекул.

17. Набор для прогнозирования или мониторинга реакции страдающего раком прямой кишки пациента на доцетаксел в соответствии со способом по п.10, где в набор входят средства
a) получения суммарной РНК из взятого из организма образца для тестирования;
b) обратной транскрипции суммарной РНК с получением кДНК; и
c) проведения полимеразной цепной реакции с кДНК с использованием набора праймеров, при этом один или оба праймера имеют детектируемую метку, и оба праймера извлекаются из нуклеотидной последовательности одного или нескольких генетических маркеров, выбранных из группы, состоящей из
BubR1, иРНК Homo sapiens, подобный протеинкиназе (BUBR1), полный код (номер в каталоге GenBank: AF046079);
Mad2, иРНК Homo sapiens для белка MAD2 (номер в каталоге GenBank: AJ000186);
Mps1, иРНК Homo sapiens протеинкиназа ТТК (ТТК) (номер в каталоге GenBank: NM_003318);
GEFT для Rac1/CDC42, фактор обмена Homo sapiens RAC/CDC42 (GEFT), вариант транскрипта 2, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_133483);
Bub1, гомолог 1 (дрожжи) Homo sapiens BUB1 почкование, не ингибированное бензимидазолами (BUB1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_004336);
hSepharase, дополнительные полюсы веретена, подобно 1 Homo sapiens (S.cerevisiae) (ESPL1), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_012291);
CamKIId, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа (СаМ киназа) II дельта (CAMK2D), вариант транскрипта 3, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001221);
CDK6, циклин-зависимая киназа 6 (CDK6), иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_001259);
GRB2, фактор роста Homo sapiens, белок 2, связанный с рецептором (GRB2), вариант транскрипта 1, иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002086);
GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа Homo sapiens (GAPD),
иРНК (номер в каталоге GenBank: NM_002046); и
RPS9, клон кДНК Homo sapiens IMAGE:6647283, частичный код (номер в каталоге: ВС071941).

18. Набор по п.17, где детектируемая метка состоит из фермента, радиоактивного изотопа или химического соединения, которое флуоресцирует, хемилюминесцентной молекулы, рентгеноконтрастных веществ, липосом и гаптеновых молекул.